PC-12-клетки феохромоцитомы

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ
НАУЧНЫЙ ЦЕНТР НЕВРОЛОГИИ РАМН
На правах рукописи
Коновалова Евгения Викторовна
Защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, в
условиях окислительного стресса in vitro и in vivo
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
03.01.04 – биохимия
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
Федорова Татьяна Николаевна
Москва
2013
0
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Окислительный стресс и антиоксиданты
1.1.1. Роль активных форм кислорода в нормальных и патологических
условиях
1.1.1.2. Кислородные радикалы и их повреждающее действие на
клетку
1.1.1.3. Окисление и продукция свободных
1.1.2. Антиоксидантная система клеток
1.1.3. Карнозин и родственные ему соединения
1.1.4. Нанопрепараты и их применение
1.1.5. Окислительный стресс и мозг
1.1.6. Апоптоз и некроз как возможные пути гибели нервных клеток
1.1.7. Свободнорадикальное окисление липидов и антиоксидантная
терапия при заболеваниях ЦНС.
1.2. Возможности изучения механизмов развития окислительного стресса на
разных биологических объектах, включая клеточные культуры.
1.2.1. Экспериментальные модели окислительного стресса.
1.2.2. Клеточные культуры для изучения ОС.
1.2.2.1. Гранулярные клетки мозжечка.
1.2.2.2. Клеточная культура PC-12
1.3.NMDA рецепторы и клеточный сигналинг.
1.4.Индукторы окислительного стресса.
1
1.4.1. NMDA
1.4.2. Гомоцистеиновая кислота
1.4.3. Полиамины
1.4.4. Пероксид водорода
1.4.5. Акролеин
1.5.Проточная цитометрия
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Моделирование окислительного стресса на культуре клеток РС12 in vitro.
2.1.1. Характеристика клеточной культуры.
2.1.1.1. Культивирование клеток.
2.1.1.2. Подготовка клеток для анализа.
2.1.1.3.
Дифференцировка
клеточной
культуры
с
помощью
дексаметазона и NGF-β
2.1.2. Определение уровня активных форм кислорода и клеточной
смерти методом проточной цитометрии
2.1.2.1. Проточная цитометрия.
2.1.2.2. Определение уровня активных форм кислорода (АФК).
2.1.2.3. Определение доли мертвых клеток
2.1.3. Определение экспрессии NMDA-рецепторов методом непрямого
иммунофлуоресцентного окрашивания антителами.
2.2.Способы индукции окислительного стресса
2.2.1. Пероксид водорода
2
2.2.2. N-метил-D-аспартат
2.2.3. Гомоцистеиновая кислота
2.2.4. Полиамины
2.2.5. Акролеин
2.3. Введение карнозина и нанолипосомальных конструкций на его основе в
клеточную культуру PC-12 при моделировании ОС.
2.3.1. Схема экспериментов.
2.3.2. Приготовление нанолипосом, содержащих карнозин
2.3.2.1. Измерение размеров
2.3.2.2. Выбор оптимальной липидной композиции
2.3.3. Карнозинсодержащие нанолипосомы
2.3.4. Определение содержания карнозина в составе нанолипосом по
диазореакции
2.4. Приготовление растворов.
2.5. Экспериментальные исследования in vitro и in vivo на быстро стареющих
мышах линии SAM
2.5.1. Окислительный стресс in vitro
2.5.2. Выделение гранулярных клеток мозжечка.
2.5.3. Окислительный стресс in vivo
2.5.4. Устойчивость мышей к гипоксии
2.5.5. Определение общей антиоксидантной
2.6. Статистическая обработка результатов
3
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Оценка защитного действия карнозина в составе нанолипосом в условиях
окислительного стресса in vitro и in vivo
3.1.
Морфологическая
характеристика
клеточной
культуры
PC12,
дифференцированной дексаметазоном и фактором роста нервов rHuNGF.
3.2. Анализ экспрессии NMDA рецепторов в клетках культуры PC-12,
активированных дексаметазоном или фактором роста нервов NGF.
3.3. Индукция окислительного стресса различными химическими агентами в
недифференцированных и дифференцированных клетках PC12.
3.3.1. Индукция окислительного стресса при действии NMDA и Н2О2
3.3.1.1. Интактные клетки PC12.
3.3.1.2. Интактные клетки PC12 в условиях окислительного стресса.
3.3.1.3. Влияние H2O2 и NMDA на рост АФК в клетках РС12,
дифференцированных по нейрональному типу
3.3.2. Влияние гомоцистеиновой кислоты на клетки PC-12
3.3.2.1.
Влияние
гомоцистеиновой
кислоты
на
развитие
окислительного стресса в недифференцированных клетках PC-12
3.3.2.2. Влияние гомоцистеиновой кислоты на рост АФК в клетках
PC-12, дифференцированных по нейрональному типу
3.3.3. Влияние полиаминов на клетки PC-12
3.3.3.1.
Влияние
спермина,
спермидина
и
путресцина
на
недифференцированную клеточную культуру PC-12.
3.3.3.2. Влияние полиаминов на рост АФК и гибель клеток РС12,
дифференцированных по нейрональному типу
4
3.3.4.Токсическое действие акролеина на клетки РС-12 в зависимости от
его дозы и времени инкубации
3.3.4.1. Влияние акролеина на рост АФК.
3.3.4.2. Влияние акролеина на гибель клеток PC-12
3.3.4.3. Влияние акролеина на морфологические изменения клеток
РС-12.
3.4. Защитное действие карнозина на клетки PC-12, в условиях
окислительного стресса, индуцированного акролеином.
3.4.1. Защитное влияние карнозина на рост АФК.
3.4.2. Защитное влияние карнозина на гибель клеток.
3.5. Защитное действие карнозина на клетки PC-12,
дифференцированные
по нейрональному типу
3.5.1.
Исследование
влияния
карнозина
на
клетки
РС12,
инкубированные с перекисью водорода.
3.5.2. Влияние карнозина на дифференцированные клетки PC-12 в
условиях окислительного стресса, индуцированного гомоцистеиновой
кислотой.
3.5.3. Оценка антиоксидантной активности карнозина в составе
нанолипосом.
3.6.
Защитное
действие
карнозина
в
составе
нанолипосом
на
дифференцированные клетки РС12 в условиях ОС, индуцированного
полиаминами.
3.6.1. Влияние карнозина
и нанокарнозина, включенного в состав
нанолипосом на уровень АФК клеток РС12, при инкубации их с
полиаминами.
3.6.2. Влияние карнозина
и нанокарнозина, включенного в состав
нанолипосом на гибель клеток РС12, индуцированную полиаминами.
5
3.7. Защитное действие нанолипосомальных структур, содержащих карнозин
на нейроны головного мозга мышей линии SAMP1/SAMR1 в условиях
окислительного стресса
3.7.1. Окислительный стресс in vitro
3.7.2. Окислительный стресс in vivo
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
6
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АФК- активные формы кислорода
ВЖ- время жизни
ВПП- время до потери позы
ВР- время реституции
ГЦ- гомоцистеин
ГЦК-гомоцистеиновая кислота
ДФПГ- 2,2’-дифенил-1-пикрилгидразил
КСЛ- карнозинсодержащие липосомы
ОГГ-острая гипобарическая гипоксия
ОС- окислительный стресс
ЦНС- ценральная нервная система
DCF-dichlorfluoresceine
NGF –nerve growth factor
NMDA –N-methyl-D-aspartate
PC-12-клетки феохромоцитомы
PI- propidium iodide
SAMP- senescence accelerated mice (prone)
SAMR- senescence accelerated mice (resistant)
7
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время развитие окислительных реакций в различных
биологических
структурах
рассматривается
как
один
из
основных
повреждающих механизмов. Особенно значимыми эти процессы являются
для нервной системы, что связано с избирательной чувствительностью
клеток возбудимых тканей к окислительной деструкции. (Karnaukhov V., et
al., 2008). Показано, что развитие окислительного стресса (ОС) активирует
каскадный механизм саморазрушения нейронов по пути апоптоза или
некроза (Luk'ianova L., et al., 1989; Majno G., and Joris I., 1995; Nicotera P. and
Lipton S., 1999) Окислительные повреждения мозга рассматриваются
современной наукой как значимый фактор патогенеза заболеваний ЦНС. В
связи с этим, разработка новых антиоксидантных препаратов сохраняет
высокую актуальность и имеет хорошие фармакологические перспективы. В
последние годы, как в России, так и за рубежом проводятся исследования по
возможности
применения
ферригидрита,
нанокострукций.
нанокомплексов
синтетических
полимеров
Принципиально
на
основе
фуллеренов,
и
липосом
значимыми
являются
и
других
данные
о
способности различных наноструктур преодолевать гематоэнцефалический
барьер, проявлять антиоксидантные и нейропротекторные свойства, а также
возможность их адресной доставки в мозг. Физико-химические особенности
наноразмерных структур делают их перспективными для создания новых
лекарственных препаратов (Сейфулла Р.Д., 2012; Amstad, E. et al. 2011; Heng
H.et al.2010)
Природным протектором клеток и тканей от окислительного стресса
является дипептид карнозин - антиоксидант прямого и непрямого действия.
Его
существенной
особенностью
является
легкое
включение
в
метаболические процессы с образованием используемых в обмене веществ
метаболитов, гистидина и β-аланина. ( Болдырев А.А. и соавт. 2002; Boldyrev
A., 2012; Boldyrev A et al. 2013).
8
Повысить эффективность действия карнозина можно путем его
модификации,
обеспечивающей
устойчивость
дипептида
к
действию
карнозиназ, или связав его в структуру, недоступную для активного центра
фермента. В данной работе на биологических моделях in vitro и in vivo
впервые предпринята попытка использовать карнозин, включенный в состав
фосфолипидных наноструктур, для защиты от окислительного повреждения.
В настоящее время для решения целого ряда научных задач в условиях
in vitro используется клеточная культура линии РС-12. Опухолевая клеточная
линия PC-12 была впервые получена в 1976 г. из хромаффинных клеток
мозгового
вещества
надпочечников
(Greene
L.,Tischier
A.,1976).
Особенностью этих клеток является их способность к образованию нейритов
в ответ на действие фактора роста нервов NGF (Greene L., Tischier A.,1976).
Дифференцировка клеток сопровождается такими характерными признаками,
как формирование нейронального фенотипа, экспрессия нейрональных
маркеров
и
секреция
нейротрансмиттеров,
а
также
определённая
последовательность событий в клетке во время пролиферации, (Vandry et.al.,
2002; Wesering, Ewing, 2008).
В условиях in vivo для оценки нейропротекторного действия изучаемых
соединений
разрабатываются
различные
экспериментальные
модели
заболеваний ЦНС на здоровых животных, что ограничивает обьективность
получаемых результатов. С этой точки зрения одним из наиболее
перспективных обьектов являются мыши линии SAMP1, характеризующиеся
ускоренным темпом старения и сниженным уровнем антиоксидантной
защиты (Stvolinskii S, et al., 2003; Федорова Т.Н. и соавт, 2005). Оценка
протекторного действия наноразмерных биологически активных композиций
в
условиях
моделирования
патологических
процессов
в
мозге,
развивающихся под действием ОС, является актуальной задачей.
9
Цель
работы:
оценка
защитного
действия
карнозина
и
его
наноструктурного аналога в условиях индуцированного ОС in vitro (нейроны
и клетки РС12) и in vivo (мыши с ускоренным темпом старения)
Задачи работы:
1.
Охарактеризовать морфологические и функциональные свойства
клеток PC-12, полученных в результате дифференцировки под действием
фактора роста нервов NGF.
2.
Выявить экспрессию мембранных белков: NMDA-рецепторов в
клетках PC-12, дифференцированных под действием фактора роста нервов
NGF.
3.
Оценить действие индукторов окислительного стресса (H2O2,
гомоцистеиновая
кислота,
NMDA-специфический
агонист
NMDA-
рецепторов, полиамины и акролеин) на продукцию активных форм
кислорода и гибель клеток РС-12.
4.
Оценить действие наностуктурного аналога карнозина
на
нейроны, выделенные из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным
темпом старения, в условиях ОС, индуцированного H2O2.
5.
Оценить действие карнозина на рост АФК и гибель клеток PC-12
в условиях токсического влияния акролеина в зависимости от концентрации
и времени инкубации.
6.
Оценить
действие
карнозина,
включённого
в
состав
нанолипосом, на рост АФК и гибель клеток PC-12 (дифференцированных по
нейрональному типу) в условиях токсического влияния полиаминов
(спермина, спермидина и путресцина).
7.
На модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с
ускоренным
темпом
старения
(SAMP1/SAMR1)
выявить
эффекты
наностуктурного аналога карнозина на физиологические (время потери позы,
время «жизни на высоте», время до остановки дыхания, время реституции,
10
способность к обучению) и нейрохимические (общая антиоксидантная
активность) параметры.
Научная новизна:
Впервые на суспензии нейроно, выделенных из мозжечка 10-12 дневных
мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1) в условиях ОС,
индуцированного H2O2, показано протекторное действие наностуктурного
аналога карнозина в сопоставлении с карнозином.
Впервые выявлено защитное действие карнозина и его наностуктурного
аналога
в
условиях
токсического
действия
полиаминов
(спермина,
спермидина и путресцина), а также продукта их распада акролеина на рост
АФК и гибель клеток PC12.
Впервые в условиях in vivo на модели острой гипобарической гипоксии
у взрослых мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1/SAMR1)
выявлены позитивные эффекты наностуктурного аналога карнозина in vivo,
проявляющиеся в улучшении физиологических параметров и повышении
антиоксидантного статуса животных.
Теоретическая и практическая значимость: полученные результаты
послужат обоснованием для разработки и применения высокоэффективных и
специфичных препаратов, обладающих способностью к контролируемому
транспорту в зону повреждения мозга.
Положения выносимые на защиту:
1.
Полученные в результате дифференцировки под действием фактора
роста нервов NGF клетки PC-12 по морфологии имеют сходство с
нейронами, по
функциональным свойствам характеризуются наличием
NMDA рецепторов и могут быть использованы в качестве модели для
изучения патологических процессов, происходящих в ЦНС.
11
2.
Карнозин в составе нанолипосом оказывает более выраженное
протекторное действие на уровень АФК и гибель нейрон-подобных клеток
PC-12 относительно карнозина в условиях токсического влияния полиаминов
(спермина, спермидина и путресцина).
3.
Защитное действие карнозина в составе нанолипосом на нейроны,
выделенные из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом
старения, проявляется в условиях ОС, индуцированного H2O2.
4.
Защитное действие карнозина в составе нанолипосом выявляется на
модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с ускоренным
темпом старения (SAMP1) на физиологических (время потери позы, время
«жизни на высоте», время до остановки дыхания, время реституции,
способность к обучению) и нейрохимических (общая антиоксидантная
активность) параметрах.
Апробация работы:
Результаты исследований были доложены на 7 международных
конференциях.
1.
«Expression
of
Na/K-pump
and
N-methil-D-aspartat
receptors
in
pheochromocytoma cells, activated by dexamethasone and nerve growth factor»
Konovalova E., Dizhevskaya A., Boldyrev A // Membrane Proteins: Abstracts.Italy.-Florence.- 2009.- P.69.
2.
«Dexamethasone and rhu-NGF as differentiation factors of PC-12 cells»
Konovalova E., Dizhevskaya A., Boldyrev A // Neurological congress: Abstracts.Slovakia.- Martin.- 2009.- P.63.
3.
«Carnosine containing nanoliposomes protect PC-12 cells and neurons from
oxidative stress in vitro» Konovalova E., Karpova L., Stvolinsky S., Boldyrev A. //
Carnosine in exercise and disease. Abstracts.- Belgium.- Ghent.- 2011. –P45.
4.
Е.В.
«Нейропротекторные эффекты нанолипосом, содержащих карнозин»
Коновалова,
О.А.Шадрина,
О.А.Трунова,
С.Л.Стволинский
//
12
International Congress «neuroscience for Medicine and Psychology» Тезисы–
Украина.- Крым.- Судак.- 2012.- С.210-211.
5.
«Моделирование
биохимических
процессов
нейродегенерации
и
способы её коррекции» М.Г.Маклецова, Е.В. Коновалова, С.Л. Стволинский,
Т.Н.Федорова
//
Материлы
XVI
Международной
конференции
по
нейрокибернетике – Россия.- Ростов-на Дону.- 2012. -С.28-31.
6.
«New mechanisms of neuroprotective carnosine action: role of polyamine
system». Konovalova E., Kulikova O., Stvolisky S., Makletsova M., Rikhereva G.,
Fedorova T. // 5th Conference on Advances in Molecular Mechanisms Underlying
Neurological Disorders. Abstract book- Bath. - UK. - 2013. -P31.
7.
«Polyamines neurotoxicity at the brain and ways of its correction».
Konovalova E., Kulikova O., Stvolisky S., Makletsova M., Rikhereva G.,
Fedorova
T.
//
The 38th
FEBS Congress.FEBS Journal.Abstracts-Saint
Petersbourg.- Russia.- 2013.-P576.
Публикации
Материалы диссертации изложены в 2 публикациях
1. Коновалова Е.В., Федорова Т.Н., Маклецова М.Г., Березов Т.Т.
Влияние карнозина на гибель клеток РС-12, индуцированную токсическим
действием
акролеина.
//
Вопросы
биологической,
медицинской
и
фармакологической химии.- 2013.- №6.-С.43-48 .
2. Березов Т.Т., Маклецова М.Г., Сяткин С.П., Рихирева Г.Т., Куликова
О.И., Коновалова Е.В., Федорова Т.Н. Роль обмена полиаминов в
функциональной активности мозга в норме и при патологии. // Журнал
неврология и психиатрия им. С.С.Корсакова.- 2013.-№7.-С. 65-70.
13
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.
1.1.
Окислительный стресс и антиоксиданты
1.1.1. Роль
активных
форм
кислорода
в
нормальных
и
патологических условиях.
1.1.1.1 Кислородные радикалы и их повреждающее действие на
клетку
Молекулярный
кислород
является
широко
распространенным
окислителем в живых системах. Особенностью строения его молекулы
является наличие двух неспаренных электронов с параллельным состоянием
их спинов, в то время как электроны в молекулах стабильных органических
соединений организованы в пары с антипараллельными спинами. По этой
причине в ходе взаимодействия кислорода с окисляемыми им соединениями
возможно образование короткоживущих комплексов.
Для полного исчерпания окислительной способности молекулярного
кислорода и образования двух молекул воды необходимо присоединить к
нему 4 электрона.
ее-, 2Н+
ее-, 2 Н+
О2 → О-2 → Н2О2 → ОН˙ + ОН- → 2 Н2О
При
кислороду
постадийном
образуются
присоединении
электронов
супероксид-анион
радикал,
к
молекулярному
гидропероксид
и
гидроксид-радикал. Изменение спинового состояния электронов в молекуле
кислорода может происходить и без присоединения электронов, например,
при поглощении кванта света. При этом образуется синглетный кислород,
также обладающий свойствами окислителя (Болдырев А.А., 2001, табл. 1).
Гидропероксид (Н2О2), образующийся при восстановлении супероксиданиона кислорода, является практически инертной молекулой, достоинством
которой является ее гидрофобность. По этой причине гидропероксид
относительно
легко
предшественником
покидает
клетки.
гидроксид-радикала,
Однако
он
может
сильнейшего
являться
окислителя,
разрушающего разнообразные структуры живой клетки, включая ДНК и
14
белки.
Гидроксид-радикал
способен
также
атаковать
ненасыщенные
мембранные липиды, что приводит к развитию свободнорадикального
перекисного окисления липидов (ПОЛ). Финалом этой цепи превращений
может стать клеточная смерть.
Гидроксид-радикал генерируется в реакции Хабера-Вайса (HaberWeiss):
Fe2+
Н2О2 + О2‾ → ОН• + ОН‾ + Fe3+
Fe3+ + О‾2 → Fe2+ + О2
и в реакции Фентона (Fenton):
Н2О2 + Fe2+ → ОН• + ОН‾ + Fe3+
Эта
реакция
катализируется
ионами
металлов
с
переменной
валентностью, преимущественно Fe2+ и Cu2+, которые высвобождаются из
белковых структур и становятся доступными только в условиях ацидоза.
Таблица 1. Активные формы кислорода и родственных соединений
Соединения
Название
Формул Относительная
а
активность
Радикальные
Супероксид анион
02ˉ
0
ГидропероксиНОО˙
1
радикал
ОН˙
107
Гидроксид-радикал
LO˙
104
Алкоксил-радикал
LOO˙
1
Липоперокси-радикал NO˙
Не измерена
NO-радикал
H2O2
0
1
Нерадикальные Пероксид водорода
O2
1
Синглетный
OClˉ
103
кислород
ONOOˉ 102
Гипохлорит-анион
Пероксинитрит
В табл. 1 и 2 приведены данные о наиболее важных видах активных
форм кислорода (Болдырев А.А., 2001). Они имеют разную реакционную
способность, и, соответственно, характеризуются
различным временем
жизни.
15
Таблица 2. Некоторые характеристики активных форм кислорода
Форма
Хим.
символ
Полупериод
существовани
o
я при 37 С, с
Свойства
Супероксид
анион
кислорода
О2.-
10-6
Хороший восстановитель,
плохой окислитель
Гидроксид–
радикал
OH.
10-9
HO3.
10-8
Пероксильный
радикал
ROO.
10-2
Алкоксильный
радикал
RO.
10-6
Пероксид
водорода
H2O2
10-100
Гидропероксиль
-ный радикал
Синглетный
кислород
Молекулярный
кислород
1
O2
10-6
O2
>102
Чрезвычайно реактивен в
реакциях акцепции,
донирования и переноса
электронов; диффундирует на
очень малое расстояние
Более сильный окислитель и
сильнее растворяется в
липидах, чем супероксид;
может инициировать ПОЛ
Низкая окислительная
активность по сравнению с
OH., но более высокая
диффузия
Эффективность взаимодействия
с липидами промежуточная
между
ROO. и OH.
Оксидант, но с малыми
скоростями взаимодействия с
органическим субстратом.
Обладает высокой
диффузионной способностью
Мощный окислитель
Умеренный окислитель
1.1.1.2. Окисление и продукция свободных радикалов является
неотьемлемой частью метаболизма живых организмов (Papas A., 1996).
Активные
формы
биологических
митохондрий
кислорода
системах
(Boveris
A.,
в
(АФК)
ходе
1977),
генерируются
нормального
в
процессе
в
различных
аэробного
дыхательного
дыхания
взрыва
фагоцитирующих клеток (реализации функций макрофагов), липидного
16
переокисления, в процессе метаболизма арахидоновой кислоты (по цикло - и
липооксигеназному пути), во время аутоокисления катехоламинов, а также
реакций, катализируемых железом. (Sies H., 1991; Halliwell B. et al., 1995;
Thomas M., 1995, Henry et al., 2001; Пономарев Т.М., 2005).
Эндогенными источниками АФК в организме являются митохондрии.
Большая часть внутриклеточных активных форм кислорода образуется в
митохондриях в электрон-транспортной
дыхательной цепи. Компоненты
дыхательной цепи встроены в митохондриальную мембрану в виде 4
белково-липидных
комплексов:
НАДН-КоQН2-редуктаза
(комплекс
I),
сукцинат-КоQ-редуктаза (комплекс II), КоQН2-цитохром c - редуктаза
(комплекс III) и цитохром а - цитохромоксидаза (комплекс IV). В
нормальных
условиях,
комплекс
III
является
главным
источником
образования АФК (Chen J. et al., 2003). АФК появляются в клетке в качестве
побочного продукта, если кислород в дыхательной цепи митохондрий
восстанавливается не полностью.
АФК образуются также за счет работы некоторых водорастворимых
мембранносвязанных ферментов клеточных органелл, например, в случае
ксантиноксидазы, в качестве побочного продукта. Кроме того, существуют
ферменты, единственное назначение которых - генерация активных форм
кислорода (NOX - восстанавливает молекулярный кислород во внеклеточном
пространстве до супероксида) (Bedard K., Krause K., 2007).
Экзогенными
источниками
АФК
являются
УФ-радиация,
хемотерапевтические агенты, окислительный стресс, провоспалительные
цитокины, факторы роста, а также инфекционные агенты (вирусы, бактерии
и паразиты). (Lo, Y. and Cruz T., 1995)
В норме свободные радикалы участвуют в выполнении важнейших
физиологических процессов в организме (Болдырев А.А., Куклей М.Л., 1996;
Болдырев А.А., 2001). Супероксид-анион, гидроксид-радикал и перекись
17
водорода
могут
участвовать
в
поддержании
вазоконстрикторного-
вазодилятаторного баланса, обусловливающего органного кровотока.
Чрезвычайно велика роль активных форм кислорода в воспалительных
реакциях, которые имеют место практически при всех типах повреждений
тканей, в том числе и при ишемии. Продуцируемые свободные радикалы и
АФК выполняют важные биологические функции в процессе фагоцитоза,
когда активированные фагоциты продуцируют АФК и используют их затем
для уничтожения таких патогенных факторов, как бактерии и вирусы
(Bogdan C. et al., 2000).
Свободнорадикальное окисление является одним из естественных
механизмов
модификации
липидного
состава
клеточных
мембран,
обусловливающим изменения их функциональных характеристик .
Вместе с тем, в настоящее время особую значимость приобрела роль
АФК в нормальных физиологических процессах. Одним из весомых
доказательств того, что АФК вовлекаются в нормальный метаболизм
нейронов, является внутриклеточная генерация свободных радикалов
(главным образом, супероксид-аниона, гидроксид- и NO-радикалов) в ответ
на активацию глутаматных рецепторов, осуществляющуюся в нормальных
условиях (Oyama H. et al., 1996; Boldyrev A. et al., 1999). Таким образом,
АФК регулируют клеточный рост и участвуют во внеклеточной сигнальной
системе, где они являются
внутриклеточными сигнальными молекулами
(Finkel T., 1998).
Низкий
пролиферации.
уровень
АФК
Высокое
функционировании
необходим
значение
иммунной
для
отводится
системы.
поддержания
АФК
Продукция
в
клеточной
нормальном
простациклина
эндотелиальными клетками в метаболических реакциях арахидоновой
кислоты обусловливает важную сосудистую функцию, включающую
агрегацию тромбоцитов, регуляцию сосудистого тонуса и регуляцию
слипания нейтрофилов.
18
1.1.2. Антиоксидантная система клеток
В живых организмах имеется антиоксидантная система, необходимая
для контроля за продукцией активных форм кислорода и предотвращения
некомпенсированного развития свободнорадикальных реакций. В ее состав
входят
как
ферменты,
так
и
многочисленные
низкомолекулярные
антиоксиданты или соединения, препятствующие образованию свободных
радикалов (Табл. 3). Их согласованная работа держит под постоянным
контролем как образование, так и превращение АФК в клетках.
Антиоксиданты делятся на две подгруппы: жирорастворимые и
водорастворимые. Первые играют важную роль в защите основных
структурных компонентов биологических мембран – фосфолипидов и
белков, вторые – действуют в цитоплазме клетки и плазме крови.
Среди жирорастворимых антиоксидантов, наиболее известным является
α – токоферол/ витамин Е, расположенный в клеточной мембране. α –
токоферол содержит фенольное кольцо с системой сопряженных двойных
связей, поэтому он легко отдает электрон, восстанавливая свободные
радикалы до стабильных продуктов. Известно, что витамин Е участвует в
биосинтезе гема и белков, пролиферации клеток, защищает клетки от
повреждения,
замедляя окисление липидов и формирование свободных
радикалов, улучшает циркуляцию крови, необходим для регенерации тканей
(Singh et al., 2006). Кроме того, этот витамин защищает другие растворимые
жирами витамины от разрушения кислородом (витамин А). Витамин Е
участвует
в
формировании
коллагеновых
и
эластиновых
волокон
межклеточного матрикса, может замедлять старение (Li-Weber, 2002)
Кроме витамина Е, к жирорастворимым антиоксидантам относятся
каротиноиды. Представитель этой группы веществ -
β-каротин, который
является предшественником витамина А. Известно, что каротиноиды
являются «ловушками» синглетного кислорода.
19
К водорастворимым антиоксидантам относятся различные тиоловые
соединения, биофлавоноиды и аскорбиновая кислота (витамин С). Известно,
что аскорбиновая кислота
является мощным восстановителем и играет
важную роль в регуляции окислительно-восстановительных процессов,
участвует в синтезе коллагена, обмене фолиевой кислоты и железа, а также
синтезе стероидных гормонов и катехоламинов (Bobko et al., 2007).
Ключевым
ферментом
антирадикальной
защиты
является
супероксиддисмутаза (СОД), которая, по-видимому, представляет наиболее
важный уровень клеточной защиты. У эукариот известно несколько изоформ
фермента, в числе которых митохондриальная Мn-СОД, цитозольная Cu/ZnСОД и отличная от нее Cu/Zn-СОД, определяемая во внеклеточной среде.
Растительные объекты содержат в дополнение к ним еще и Fe-зависимую
форму СОД. Прокариоты (Streptomices) содержат разнообразные сочетания
указанных форм, а также недавно описанную Ni-СОД.
Многие
патологии
человека,
сопровождающиеся
и,
возможно,
вызываемые ростом АФК, протекают на фоне генетически обусловленного
дефицита СОД. Таковы боковой амиотрофический склероз, болезнь
Альцгеймера и другие нейродегенеративные заболевания (Olanov C., 1993).
Восстановление активности мозга после перенесенного инсульта, вероятно,
также протекает на фоне пониженного уровня СОД, хотя попытки лечения
пациентов введением этого фермента не привели к положительному
результату.
Таблица 3. Антиоксиданты в живых системах
Антиоксиданты
Сu/Zn-СОД
Mn-СОД
Внеклеточная СОД
Каталаза
Локализация
Ферменты и белки
Эритроциты,
цитоплазма
Митохондрии
Плазма крови,
стенки сосудов
Пероксисомы
Функция
Тушение O2.Тушение O2.Тушение O2.Тушение H2O2
20
Глутатионпероксидаза
Цитоплазма,
Деградация H2O2 и перекисей
митохондрии
липидов
Клеточные
мембраны,
ГлутатионДеградация H2O2 и перекисей
митохондрии,
трансфераза
липидов
эндоплазматичес
-кий ретикулум
Ферритин
Цитоплазма
Хелатор Fe2+
Внеклеточная
Трансферрин
Хелатор Fe2+
среда
Внеклеточная
Лактоферрин
Хелатор Fe2+
среда
Внеклеточная
Хелатор Сu2+, окисление Fe2+,
Церулоплазмин
среда
тушение O2.Внеклеточная
Хелатор Сu2+, тушитель OH. ,
Альбумин
среда
LOO. , НОCl
Низкомолекулярные соединения
Витамин Е
Биомембраны
Тушение OH. , LOO. , НОCl и т. п.
Убихинол
Биомембраны
Тушение OH. , LOO. , НОCl и т.п.
Каротиноиды
Биомембраны
Тушение OH. , LOO. , НОCl, 1O2
Витамин С
Цитоплазма
Тушение OH., O2.Тушение OH., O2.-, нейтрализация
Карнозин
Цитоплазма
гипохлорита
N-ацетил-цистеин
Цитоплазма
Неизбирательное тушение АФК
Таурин
Цитоплазма
Нейтрализация гипохлорита
Цитоплазма,
Глутатион
Тушение OH., O2.митохондрии
Предотвращение перекисного
Мочевая кислота
Кровь
окисления липидов
Предотвращение перекисного
Билирубин
Кровь
окисления липидов
СОД локализована преимущественно в нейронах (Delacourte A et al.,
1988), а глутатионпероксидаза и глутатион - в астроцитах (Benzi G. and
Moretti A., 1995).
Глутатион-зависимые
антиоксидантные
ферменты
глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы принимают участие в
нейтрализации
перекисей,
субстратом
для
которых
являются
как
гидроперекиси липидов, так и Н2О2.
21
В мозге антиоксидантная ферментная система представлена в основном
суперокисддисмутазой и глутатион-зависимыми ферментами (Болдырев и
соавт., 2001).
Для мозга характерно низкое содержание основных компонентов
антиоксидантной защиты (Halliwell B.et al., 1999; Зенков Н.К и соавт., 2001)
(Табл. 4). В целом, дефицит антиоксидантной системы в мозговой ткани
объясняет ее особую чувствительность к продукции свободнорадикальных
соединений.
Таблица 4. Активность ферментов антиоксидантной защиты в мозге
Мозг (серое вещество)
Печень
3.7
4.7
7
1400
68
155
умеренное
Высокое
2
7-8
Cu/Zn-СОД
г/мг белка
Каталаза
Ед/мг белка
Глутатион-пероксидаза
Ед/мг белка
Глутатион-редуктаза
(наличие)
Глутатион (восст)
мМ
Для ткани мозга млекопитающих характерен высокий уровень аскорбата
(витамина С) и глутатиона (трипептид глутамил-цистеинил-глицин) –
низкомолекулярных водоростворимых антиоксидантов (Lyrer P et al., 1991;
Rice M.E. 1995, 2000). Наиболее важной функцией этих соединений является
нейтрализация
реактивных
свободных
радикалов
и
поддержание
нормального red/ox статуса нервной клетки (Cohen G., 1994).
Важной
функцией аскорбата является защита клеток мозга от
кислородных радикалов, генерируемых активацией глутаматных рецепторов,
22
поскольку как каинат, так и NMDA могут быть причиной деполяризации
митохондрий и увеличения ими продукции супероксид-аниона
(Prehn J.,
1998; Lafon-Cazal M. et al., 1993). Аскорбат, как и антагонисты глутаматных
рецепторов, способен предотвратить формирование отека мозга.
Антиоксидантные свойства способны проявлять стероидные гормоны,
они входят в состав естественных антиоксидантных систем организма. Так,
эстрогены относятся к группе истинных антиоксидантов, которые участвуют
в защите клеточных мембран от ПОЛ. Антиоксидантное действие эстрогенов
считают
одним
из
компонентов
(противоатеросклеротического
и
их
вазопротекторного
противоишемического)
эффекта.
Экспериментально выявлено ингибирование эстрадиолом процессов ПОЛ в
сердце, крови и аорте (Караченцев А.Н, Мельниченко И.А., 1997).
В
настоящее
время
список
низкомолекулярных
антиоксидантов
дополнен рядом других соединений, в числе которых N-ацетилцистеин,
таурин, дигидролипоевая кислота, карнитин, мочевая кислота,
дипептид
карнозин (Packer L.et al., 1997; Naleez K.А. et al., 1997: Luo X. et al, 1999;
Болдырев А.А., 1999).
1.1.3.
Карнозин и родственные ему соединения.
Карнозин был впервые выделен В.С. Гулевичем, который изучал состав
мясного фарша. Он и назвал это соединение карнозином (от лат. сaro, carnis
– мясо). Пептид не выводится из организма нерасщеплённым, а, значит,
претерпевает
ряд превращений. Он не расщепляется протеолитическими
ферментами такими как пепсин и трипсин, не гидролизуется кишечной
флорой. Работами лаборатории С.Е. Северина (1938, 1940) было показано,
что в почках, селезёнке эритроцитах и печени содержится фермент
карнозиназа, расщепляющий карнозин. Этот фермент был впервые выделен
из почек свиньи (Hanson, Smith, 1949). В отсутствие ионов металла в
окружающей среде карнозиназа расщепляет карнозин и анзерин, а в
присутствие ионов кобальта может гидролизовать и другие дипептиды.
23
Процесс синтеза карнозина был изучен в 1975 г. Разиной, которая проводила
исследование с помощью метки 14С и показала, что карнозин синтезируется в
реакции конденсации фермента β-аланина и гистидина, причём оба вещества
встраиваются целиком, а не отдельным фрагментом. Реакция является
обратимой, из чего следует, что карнозин служит источником гистидина в
организме.
Дефицит гистидина в пище вызывает снижение концентрации карнозина
в мышцах крыс, что было показано в работе Фуллера (Fuller et al., 1947).
Наивысшая активность метаболизма карнозина была найдена в обонятельном
эпителии: 0,5 мкмоль/г белка в час. В обонятельной луковице активность
этого фермента составляет 1/5 активности в эпителии, а в коре мозга и
мозжечке-1/50. (Болдырев, 1998). Скорость обмена в обонятельном эпителии
в 10 раз выше, чем в мышце, хотя обе ткани имеют сравнимые концентрации
карнозина (Margolis et al., 1985).
Существует очень много работ, посвящённых карнозину, в которых
показано, что он способен проявлять различные биологические свойства.
Впервые карнозин как мембранопротектор изучался Севериным (1958), в
котором он отметил мембранотропный эффект карнозина на митохондрии.
Позднее было обнаружено благотворное влияние карнозина на АТФзависимый
транспорт
парамагнитного
Ca2+
резонанса
фрагментами
(ЭПР)
а
также
методом
ионов
Na
электронного
и
K
через
плазматическую мембрану, что означает благотворное действие карнозина на
мембраны клеток, сохраняющих способность осуществлять без утечки
активный транспорт ионов H+, Ca2+, Na+, K+ (Boldyrev, 1987).
Антиоксидантные
свойства
карнозина
были
впервые
продемонстрированы в опытах на ткани печени. В этих экспериментах,
крысам делали инъекции карнозина и через разные промежутки времени
после инъекции животных забивали и исследовали микросомы печени. В
эксперименте ткань печени исследовали на устойчивость к перекисному
24
окислению липидов, индуцированному совместным введением аскорбата и
ионов Fe2+. Было установлено, что наименьшее образование перекисных
продуктов в печени выявлялось в тот промежуток времени, когда в ней
регистрировался наименьший прирост карнозина (15-30 мин) (Болдырев,
1997). Антиоксидантные свойства карнозина были также показаны на
атерогенных
липопротеинах, выделенных из донорской крови (Фёдорова
Т.Н., 2003).
Показано, что в условиях усиленной эмоциональной или физической
нагрузки, а также с возрастом и при развитии нейродегенеративных
заболеваний, содержание карнозина в возбудимых тканях снижается, и
потребности в нём не могут обеспечиваться внутренними ресурсами
(собственной системой синтеза, представленной карнозинсинтазой) (Hipkiss
A., 2009).
В
настоящее
время
биологические
эффекты
этого
дипептида
значительно расширены. Установлено, что карнозин (-alanyl-L-histidine),
является эффективным протектором от окислительного стресса, сочетающий
как прямое антиоксидантное действие, так и модулирующие эффекты на
активность вовлеченных в развитие ОС ферментов и NMDA-рецепторов
(Boldyrev A., 2012). Кроме того, он обладает свойствами антигликирующего
агента, хелатора ионов, промотора ранозаживления, перехватчика радикалов,
молекулярного шаперона и индуктора антиоксидантных систем в условиях
окислительного стресса (Bellia F., 2011). Все эти свойства привлекли к
карнозину пристальное внимание как к полезному пищевому и биологически
активному соединению (Hipkiss A. , 2009). В последние десятилетия в России
интенсивно исследовались позитивные эффекты карнозина на различных
экспериментальных моделях заболеваний ЦНС (болезнь Паркинсона,
гипоксия/ишемия головного мозга и др.) (Федорова Т.Н., 2005; Boldyrev A.,
2012). В пилотных клинико-биохимических исследованиях было показано,
что карнозин повышает эффективность базисной терапии у пациентов с
25
дисциркуляторной энцефалопатией (Fedorova, T. et al., 2009) и болезнью
Паркинсона (Boldyrev A. et al.,
2008). В настоящее время карнозин
применяется как биологическая добавка, которая используется в качестве
поддерживающего лечения при болезни Паркинсона, Альцгеймера и др.
(Фёдорова и соавт., 2002; Fonteh A. et al., 2006; Calabrese J. et al., 2008).
В то же время, эффективность действия карнозина
в организме
лимитирована его гидролизом, осуществляемым специфическим ферментом
– карнозиназой (Margolis, F. et al., 1983; Lenny, J.,1990). Для достижения
стабильного протекторного эффекта карнозина требуется введение его
избыточных
доз,
чтобы
компенсировать
гидролиз
под
действием
специфических дипептидаз – тканевой и сывороточной карнозиназы (Lenny,
J.,
1990).
Повысить
модификации,
эффективность
обеспечивающей
карнозина
устойчивость
можно
дипептида
путем
к
его
действию
карнозиназ, или связав его в структуру, недоступную для ферментов. Ранее
были описаны производные карнозина, полученные путем его конденсации с
Тролоксом®,
обладающие
основными
биологическими
свойствами
карнозина, но при этом характеризующиеся высокой устойчивостью к
карнозиназе
(Stvolinsky et al., 2010). Другим подходом к этой проблеме
может быть включение карнозина в наноструктурные конструкции, наиболее
распространенными среди которых являются нанолипосомы.
1.1.4. Нанопрепараты и их применение
Нанолипосомы определяются как липосомы в пределах нанометрных
размеров, везикулы которых образованы одно - или мультибислойными
оболочками из амфифильных липидных молекул и содержат одно или
несколько водных отделений (Rockville M., 2002). В последние годы как в
России, так и за рубежом проводятся исследования по возможности
применения
синтетических
нанокомплексов
полимеров,
на
основе
липосом
и
фуллеренов,
других
ферригидрита,
нанокострукций.
Принципиально значимыми являются данные о способности наноструктур
26
преодолевать гематоэнцефалический барьер и проявлять заданные свойства
при их адресной доставке в мозг. Физико-химические особенности
наноразмерных структур делают эти конструкции перспективными для
создания
новых
лекарственных
препаратов.
Уже
утвержден
ряд
липосомальных препаратов для лечения онкологических заболеваний и
различных инфекций (Zolnik B. and Sadrieh N., 2009). Выявлена перспектива
использования липосом в лечении заболеваний ЦНС, включая опухоль мозга,
ишемию, инфекции и энцефалиты (Zhong Y. and Bellamkonda R., 2008; Reddy
M. and Labhasetwar V., 2009). В то же время, оценка протекторного действия
наноразмерных
биологически
активных
композиций
в
условиях
моделирования патологических процессов в мозге, развивающихся под
действием многофакторного ОС, является актуальной задачей. С этой точки
зрения создание наноструктурных комплексов на основе карнозина в составе
фосфолипидных структур – липосом – является актуальной задачей.
В настоящей работе впервые предпринята попытка использовать
карнозин,
включенный
в
состав
фосфолипидных
наноструктур
на
биологических моделях in vitro и in vivo в условиях окислительного стресса.
Нанопрепараты являются шагом в будущее для решения вопросов в
области научного знания, направленного на решение технологических
проблем, связанных с манипуляцией материей (атомами и молекулами) в
диапазоне от 1 до 100нм (Суздалев И.П. 2009). При уменьшении размера
изучаемого объекта до масштабов 100нм и менее на смену классическим
физическим законом и взаимодействиям приходят квантовые, например,
туннельные переходы и поверхностынй плазменный резонанс (Сейфула Р.Д.,
2012). В первую очередь, разрабатываемые в настоящее время лекарства
применяются в онкологии. Для этого нанолипосомы снабжаются так
называемым «молекулярным компасом», в качестве которого могут
выступать различные структуры, способные определить избирательное
направление движение наноструктур к поражённым клеткам в орнанизме
27
больного, а отличае от пассивного равномерного распределения по органам и
тканям. Ранее применялись такие подходы, как доставка лекарств с помощью
моноклональных антител, однако адресная доставка в составе наноструктур
позволяет решить ряд принципиально значимых проблем:
 защитить лекарства от деградации метаболизирующими ферментами,
 увеличить селективную абсорбцию лекарств опухолевыми клетками,
 контролировать фармакокинетику лекарств,
 увеличить биодоступность лекарств внутри опухолевых клеток.
В настоящее время разработано более 200 систем адресной доставки
противоопухолевых и других лекарств.
Нанопрепарат, применяемый нами в данной работе не содержит
молекулярного компаса, однако выполняет все функции по защите вещества,
упакованного в нанолипосому, а также облегчает транспорт и поглощения
клеткой
карнозина
обусловленного
химическим
составом
оболочки
липидной структуры. Он равномерно распределяется по организму, проходя
через ГЭБ (67%), и высвобождает карнозин в области, где происходит
перекисное окисление липидов.
1.1.5.
Окислительный стресс и мозг
Окислительный стресс - это нарушение баланса между продукцией
свободных радикалов и механизмов антиоксидантного контроля за их
содержанием.
Окислительный
стресс
сопровождается
повышенной
скоростью образования свободных радикалов и снижением активности АО
системы, что приводит к увеличению уровня радикальных соединений и
возможной гибели клетки (Halliwell B., Gutteridge J.M.C., 1999; Ланкин В.З.и
соавт., 2000). Массированная атака АФК несет сигнал о клеточной смерти,
поскольку молекулярной мишенью для действия свободных радикалов
являются липиды, белки и ДНК (Carney J. et al., 1996; Chan P., 1996; Hayashi
T. et al., 1999).
По ряду причин мозг высоко чувствителен к окислительному стрессу
28
(Halliwell B. and Gutteridge J., 1999; Aruoma O. and Halliwell B., 1999), что
объясняется высокой интенсивностью обменных процессов в ткани мозга,
отсутствием в ней запасов энергии, большим содержанием ПНЖК в
нейрональных мембранах и катализаторов свободнорадикальных реакций ионов металлов с переменной валентностью, в основном железа и меди
(Halliwell B, Gutteridge J., 1984), а также особенностями кровоснабжения и
относительно
недостаточной
активностью
защитной
антиоксидантной
системы. Так, составляя всего 2% от общей массы тела, мозг утилизирует 2025% получаемого кислорода. И этот уровень так велик, что превращение в
супероксид-анион радикал даже только 0,1% метаболизируемого нейронами
кислорода окажется токсичным для ткани (O’Brien J. and Sampson E., 1965;
Ansell J., 1973). Окислительный стресс является одним из основных
повреждающих
факторов
мозга,
обусловленных
нарушением
его
кровоснабжения.
Таким образом, свободные радикалы являются медиаторами тканевого
повреждения и могут индуцировать каскад патофизиологических процессов,
приводящих к дисфункции и клеточной смерти (Kehrer J., 1993) при
различных патологических состояниях.
1.1.6. Апоптоз и некроз как возможные пути гибели нервных
клеток
Основным
показателем
гибели
нервной
ткани
можно
считать
необратимую потерю ее морфологических и функциональных характеристик
(Nedergaard M., 1987). Существуют два разных пути гибели клетки (Clarke P.,
1990; Majno G., and Joris I., 1995) - апоптоз или некроз. Апоптоз - это
запрограммированный физиологический процесс.
Морфологические и
биохимические признаки апоптоза после ишемического повреждения
обнаруживаются как в нейронах, так и в глии (Linnic M. et al., 1993). Апоптоз
может индуцироваться с помощью различных стимулов и в разных условиях,
однако ишемия является превалирующим фактором для его протекания,
29
включающим усиленную генерацию свободных радикалов (Jacobson M.,
1996; Patel T. et al., 1996), в том числе NО-радикала (Nicotera P. et al., 1995);
нарушение митохондриальной функции (Jacobson N. et al., 1994; Wolvertang
E. et al., 1994), увеличение концентрации свободных ионов кальция в
цитоплазме поврежденных клеток (Nicotera P et al., 2000), активацию
кальпаина, активацию каспаз - специализированных цистеиновых протеаз –
непосредственных инициаторов апоптоза (Chan S. et al, 1999, 1999а) и,
наконец, фрагментацию ядерной ДНК. Активация каспаз блокируется как in
vivo,
так
и
in
vitro
низкомолекулярными
пептидами,
ковалентно
связывающимися с ними и инактивирующими их, что приводит как к
уменьшению объема погибших ишемических клеток, так и к снижению
неврологического дефицита.
Апоптические нейроны характеризуются уменьшением тела клетки,
конденсацией ядерного хроматина и фрагментацией ДНК. Наиболее
примечательным в процессе нейронального апоптоза является фрагментация
дендритов и аксонов, которая начинается на последующих этапах этого
процесса.
В
дальнейшем
апоптические
нейроны
распознаются
и
поглощаются микроглией, такая «очистка» от апоптических клеток не вредна
для соседних клеток и не вызывает воспаления (Mattson M. et al., 1998, 2000).
Критическую роль в стимулировании апоптоза играет снижение
эндогенных антиоксидантов (Mignotte B. and Vayssiere J., 1998), поскольку
нарушение
баланса
между
АФК
и
антиоксидантами,
соотношения
АТФ/АДФ, индуцирует деполяризацию митохондрий в результате чего
высвобождаются
проапоптотические
белки,
активируются
каспазы,
непосредственные медиаторы апоптоза (Rathmell J. and Thompson C., 1999).
Исчерпывающие экспериментальные доказательства того, что апопотоз
критичен для развития нервной системы возник из экспериментов in vivo на
мышах, которые имели незначительные мутации различных генов, таких как
Bcl-xL, каспазы 3 и 9 и гена Apaf-1. (Kuida K. et al. 1996; Motoyama N. et al.,
1995). Во всех таких случаях рост образования аномалий в развитии ЦНС
30
приводил к пренатальной смертности. Соответственно, в отсутствии гена
Bcl-xL, подавляющая смертность нейронов возникала в спинном и головном
мозге. Эмбриональные мыши с мутациями генов каспазы 3 и 9 выявили
морфологические
нарушения
развития
ЦНС,
такие
как
увеличение
вентрикулярной зоны и изменения формы, возникновения выпуклостей в
мозге. Такие исследования доказывают, что механизмы, ответственные за
раннюю гибель нейронов могут отличаться от таковых у пост- митотических
нейронов, у которых ген Bcl-xL действует в направлении противоположном
генам каспаз. Более того, гиперэкспрессия Bcl-2 в состоянии защитить
против Ab-индуцированного апоптоза в клетках PC-12 а также в первичных
кортикальных нейронах. (Behl С. et al., 1993).
Апоптотические пути также активируются через нейрональную гибель,
которая возникает при острых и хронических нейродегенеративных
заболеваниях, например активированные формы каспаз выявляются при
дегенерации нейронов при инсульте, а также при болезни Паркинсона и
болезни Альцгеймера
(Su J. et al., 1994). Недифференцированные,
пролиферирующие клетки PC-12 подвергаются клеточной смерти при
изъятии сыворотки из среды инкубации. Тем не менее, этот процесс можно
остановить добавлением различных факторов выживания, таких как
инсулиноподобный фактор-1 или фактор роста нервов или при помощи
управления геном BT2cAMF (Yao R. and Cooper G.M., 1995, Science 267,
2003-2006).
Некроз также обусловлен стойкой генерацией свободных радикалов,
повышением цитозольного уровня Са2+ и Nа+, который поддерживается за
счет внеклеточного повышения уровня глутамата. Индукция некроза АФК
(Troy C. and Shelanski M., 1994; Bonfoco E et al., 1995; Greenlund L. et al.,
1995) показана на культуре нейронов, когда введение антиоксидантов
эффективно предотвращало этот процесс (Krohn A. et al., 1998).
31
Гибель клеток является неотъемлемой частью развития нервной
системы, где нейрогенные предшественники клеток вырабатываются в
избытке и затем ликвидируются через определенное время путём миграции и
дифференцировки отдельных популяций нейронов (Oppenheim R., 1991; Raff
M. et al. 1993; Pettman B. and Henderson.C, 1998). Напротив, подавление
клеточной гибели жизненно необходимо для поддержания неделящихся
нейронов после конечной дифференцировки.
Доказано, что в экспериментальных условиях ишемии мозга нейроны
могут гибнуть как по пути апоптоза, так и по пути некроза (Nicotera P. and
Lipton S., 1999). Умрет ли нейрон, когда подвергнется инсульту, повидимому, зависит от того, по какому пути он пойдет - апоптозу или некрозу,
что во многом зависит от состояния митохондрий (Zaidan E., and Sims N.,
1994; Kohno K. et al, 1997; Brorson J. et al., 1999).
1.1.7.
Свободнорадикальное окисление липидов и антиоксидантная
терапия при заболеваниях ЦНС.
Особенностью перекисного окисления липидов следует считать его
цепную реакцию с разрушением ненасышенных жирных кислот, входящих в
состав фосфолипидов мембран (Капелько В.И., 2000; Владимиров Ю.А. и др.,
2000) условно делят эту реакцию на несколько стадий, которые получили
название «инициирование», «продолжение», «разветвление» и «обрыв» цепи
(Владимиров Ю.А., 2000).
Инициирование цепной реакции начинается с внедрения свободного
радикала в липидный слой мембран или липопротеинов. Чаще всего это
радикал гидроксила. Являясь небольшой незаряженной частицей, он
способен проникнуть в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в
химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами,
входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови,
образуя при этом липидные радикалы: НО*+LH→ Н2О+L*
32
Липидный радикал (L*) вступает в реакцию с растворенным в среде
молекулярным кислородом, при этом образуя новый свободный радикал –
радикал липоперекиси (LОО*):
L* +О2→ LОО*
Образовавшийся
радикал
атакует
одну
из
соседних
молекул
фосфолипида с образванием гидроперекиси липида LООН и нового радикала
L*:
LОО*+ LН→ LООН+ L*
Чередование двух последних реакций является цепной реакцией
пероксидации (перекисного окисления) липидов. Значительное ускорение
пероксидации липидов наблюдается в присутствии небольших количеств
Fe+2. В результате взаимодействия ионов двухвалентного железа с
гидроперекисями липидов происходит разветвление цепей:
Fe+2+ LООН→ Fe+3 +НО- +LО*
Образующиеся радикалы инициируют новые цепи окисления липидов:
LО*+ LН→ LОН
Обычно в биологических мембранах цепи состоят из десятка и более
звеньев. В конечном счете, цепь обрывается в результате взаимодействия
свободных радикалов с антиоксидантами (InH), ионами металлов переменной
валентности или друг с другом:
LОО*+ Fe+2+Н+→ LООН,
LОО*+ InH→In*
LОО*+ LОО*→ молекулярные продукты.
Последняя реакция интересна тем, что она сопровождается свечением,
интенсивность
которого
отражает
скорость
липидной
пероксидации
(Владимиров Ю.А., 2000).
+ L*; L*+О2→ LОО* и т.д.
33
В результате ПОЛ происходит уменьшение стабильности липидного
слоя, следствием которого является электрический пробой мембраны
собственным мембранным потенциалом, то есть под действием разности
электрических
потенциалов,
существующих
на
мембранах
функционирующей клетки. Описанные процессы ведут к полной утрате
мембраной ее барьерных функций (Владимиров Ю.А., 2000).
Активация свободнорадикального окисления липидов
отмечена при
различных заболеваниях, вызванных как эндогенными, так и экзогенными
причинами. Особое значение в настоящее время придается нарушению
регуляции в системе ПОЛ при неврологических заболеваниях. Так, активация
процесса ПОЛ отмечена у больных с черепно-мозговой травмой (Зацепина
С.Н.
и
др.,
1983),
с
инфекционно-токсическим
поражением
ЦНС,
прогрессирующих мышечных дистрофий (Бадалян Л.О. и др., 1984), при
боковом амиотрофическом склерозе (Захарова М.Н., 2001).
некоторых
исследователей,
некомпенсированная
По данным
активация
свободнорадикальных реакций в нервной ткани является важным звеном
эпилептогенеза. (Крыжановский Г.Н. и др., 1984; Никушкин Е.В., 1991).
Выявлено участие свободнорадикальных реакций и аутоантител к фактору
роста нервов в патогенезе рассеянного склероза (Переседова А.В.,1999).
Интенсификация процесса ПОЛ и снижение активности антиоксидантных
ферментов, была обнаружена при развитии болезни Паркинсона (Cаdet J. and
Brannock C., 1998; Савищева О.С. и др., 2000). Особую патогенетическую
значимость эти процессы приобретают при острых (ОНМК) и хронических
(ДЭ) сосудистых заболеваниях головного мозга (Суслина З.А., Максимова
М.Ю., 1996, 2007; Федорова Т.Н., 2004). Несколько последних обзоров
освещают роль АФК в патофизиологии таких нейродегенеративных
заболеваний как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. (Trompier D. et
al., 2013; Rao V., Carlson E. and Yan S. 2013).
34
1.2.
Возможности изучения механизмов развития окислительного
стресса на разных биологических объектах, включая клеточные
культуры.
1.2.1. Экспериментальные модели окислительного стресса.
Механизм
развития
нейропротекторного
окислительного
действия
стресса,
резличных
а
препаратов,
также
оценка
изучается
на
различных биологических объектах как в экспериментальных исследованиях
на различных животных (таких как нокаутированные мыши, крысы), а также
на многочисленных клеточных культурах, включая первичные культуры
нейронов, имеющие свойства стволовых клеток.
Исследование гипоксических/ишемических повреждений мозга крыс
осложняется тем, что после гипоксического/ишемического эпизода у
животных, как правило, не выявляется неврологической симптоматики, что
затрудняет как сопоставительную оценку метаболических нарушений, так и
эффективности нейрофармакологических препаратов.
Комбинация гипобарической гипоксии, отягощенной нарушением
энергетического метаболизма в результате действия нейротоксина 3нитропропионовой кислоты (3-НПК), приводит к более выраженным
нарушениям
двигательной
активности
и
выявлению
характерной
неврологической симптоматики. Введение карнозина повышало активность
митохондриальной
супероксиддисмутазы
и
предотвращало
развитие
окислительного стресса в ткани мозга, что коррелировало с улучшением
неврологической симптоматики, снижением смертности и восстановлением
двигательной активности, а также с улучшением процессов памяти
животных. (Boldyrev et al, 1996; Stvolinsky et al, 2000).
Глобальная (3-х сосудистая) ишемия головного мозга, отягощенная
систематическим введением 3-НПК, позволила выявить выраженную
неврологическую
симптоматику,
коррелирующую
со
значительными
метаболическими сдвигами и высокой смертностью животных. Курсовое
35
введение карнозина в постишемическом периоде на фоне 7-14 дневной
реперфузии
защищает
мозг
от
окислительных
повреждений,
что
сопровождается снижением неврологической симптоматики и смертности
животных (Федорова Т.Н. и др., 2002).
Для исследования окислительного стресса применяются различные
подходы, позволяющие выяснять молекулярные механизмы этого процесса,
одним из таких подходов является использование линии животных, для
метаболизма которых характерен стационарно высокий уровень АФК,
приводящий к ускоренному накоплению старческих признаков и уменьшению
продолжительности жизни (Hosokawa M., 2002; Bulygina E. et al. 1999). Эта
уникальная линия животных, выведенная
путем близкородственного
скрещивания, носит название SAM (Senescence Accelerated Mice - клон Prone
(SAMP) и контрольная к ней линия SAMR1 (Resistant), выведенные из одной
и той же линии JR/K путем близкородственного отбора) (Takeda et al., 1994).
Характерной особенностью животных этой линии является то, что они
нормально развиваются до 4-месячного возраста, после чего наступает
стадия ускоренного накопления старческих признаков. В их мозге
активирована МАО В и подавлена активность СОД, причем это подавление
связано с повреждением как цитозольной Cu/Zn-содержащей СОД, так и
(главным образом) Mn-содержащей (митохондриальной) СОД, в то время как
активность пероксисомальной Cu/Zn-содержащей СОД не отличается от
этого показателя у мышей контрольной линии. Таким образом, в мозге этих
мышей был выявлен дисбаланс между образованием и нейтрализацией АФК,
приводящий к окислительному стрессу.
Получены
новые
данные
о
патогенезе
нейродегенерации
при
исследовании этой уникальной экспериментальной модели паркинсонизма у
быстростареющих мышей линии SAMP1 (Senescence Accelerated Mice,
Prone). Эта модель отличается ускоренной динамикой развития возрастных
изменений и четко выраженной симптоматикой в ответ на введение МРТР.
36
Установлено, что у мышей
SAMP1 после введения МРТР имеют место
выраженные нейрохимические нарушения, сопровождающиеся развитием
окислительного стресса в мозге. Нарушение поведенческих реакций в
результате
воздействия
МРТР
свидетельствует
о
возникновении
повреждений в области черной субстанции и в связанной с ней
дофаминергической системе мозга (Сорокина Е.В., 2003) .
Окислительный стресс и его патофизиологические проявления в ткани
мозга быстростареющих мышей с экспериментальным паркинсонизмом
предотвращается
курсовым
введением
карнозина,
препятствующего
угнетению двигательной активности животных и развитию мышечной
ригидности.
Нейропротекторный
эффект
карнозина
позволяет
компенсировать дефицит антиоксидантной системы мозга, а также защищать
белки и липиды от окислительной модификации (Сорокина Е.В. и др., 2003;
Багыева Г.Б., 2009).
1.2.2. Клеточные культуры для изучения ОС.
1.2.2.1. Гранулярные клетки мозжечка.
Изучение повреждения нервной ткани в результате окислительного
стресса часто проводят на гранулярных клетках мозжечка, потому что
являются самой большой гомогенной нейрональной популяцией мозга
млекопитающих.
Исследования, проводимые на гранулярных клетках
мозжечка, выявляют механизмы и факторы способствующие выживанию или
гибели
гранулярных
клеток
мозжечка,
молекулярные
основы
взаимоотношений на уровне генной экспрессии, которую играют некоторые
нейротрофические факторы, а также NMDA подтип глутаматных рецепторов
(Joe N,2013; Frilot C 2nd et al., 2013)
Роль некоторых ключевых генов семейства Bcl, некоторых киназ и
транскрипционнох факторов продолжает изучаться на этой культуре и
появляются всё новые и новые данные, открывающие новый взгляд на
37
изучаемую
проблему
(Mincheva-Tasheva
S
et
al.,
2013).
Наконец,
использование гранулярных нейронов первичной культуры нацелено на
изучение причины нейродегенерации и фармакологической нейропротекции,
отдельное внимание обращается на так называемую «разделительную
полосу» между некрозом и апоптозом, на экзайтотоксическое нейрональное
повреждение.
Исходя
гранулярные
нейроны
из
вышеизложенного,
мозжечка
занимают
можно
заключить,
особенную
позицию
что
в
современной нейронауке как одна из самых удобных моделей для изучения
нейронального развития, функционирования и патологии. (Contestabile A.,
2002)
1.2.2.2. Клеточная культура PC-12
Одной из известных культур, на которых исследуется действие веществ
с различными механизмами действия, является клеточная культура PC-12.
Эта клеточная линия впервые была выделена в 1976 году из опухоли
хромаффинных клеток надпочечника (Greene L., Tischer A., 1967). С тех пор
она стала очень популярным объектом для изучения сигнальных путей при
выживании клеток, пролифирации и дифференцировки. В зависимости от
экспериментальных условий клетки высвобождают такие факторы как
дофамин, норадреналин, ацетилхолин и содержит Na+-, K+- и Ca2+-каналы и
другие мембранные рецепторы, сопряжённые с G-белками. Кроме того, в
процессе дифференцировки в клетках сменяют друг друга различные
подтипы Ca-каналов. Поэтому, клетки PC-12 представляют собой модель для
изучения
нарушения
нейрональной
химических
процессов,
ассоциированных
дифференцировкой, синтезом, запасанием и
с
выбросом
нейротрансмиттеров, функции и регуляции ионных каналов и воздействие
друг на друга внутри- и внеклеточных соединений с мембраносвязанными
рецепторами. Интересной чертой клеток PC-12, которая была описана
учёными в самом начале использования этой культуры в качестве модельной
клеточной линии, является их способность к образования нейритов или
38
нейрон- подобных клеток в ответ на действие фактора роста нервов NGF
(Greene L., Tischer A., 1967). Рост нейритов может быть также спровоцирован
cAMF и он сопровождается кроме обычного нейронального фенотипа такими
признаками как остановка пролифирации, экспрессией нейрональных
маркёров и секрецией нейротрансмиттеров (Vandry D. et al., 2002; Weterlink
R. and Ewing A., 2008). Поскольку PC-12 очень легко культивируется, она
позволяет осуществлять гораздо проще те же задачи, которые выполняются
исследователями на нейрональных культурах.
Клеточная линия PC-12, наряду с культурой симпатических и
кортикальных нейронов, в настоящее время одна из наиболее используемых
моделей для изучения нейронального роста и развития конуса роста. (Varnurn
–Finney B. and Reichard L., 1994; Halloran M., Kalil K., 1994). Например,
культура клеток PC-12 была использована в экспериментах для описания
роли винеулина в присоединении конуса роста к субстрату (Varnum –Finney
B., Reichard L., 1994). А также помогла описать критическую роль Rho
семейства GTP`аз в формировании нейритов и их роста. (Lamourex P. et al.,
1997; Katoh.H. et al., 2000). Еще одной чертой нейритов PC-12 является рост
варикоцитов, содержащих катехоламины. (Greene L., Tischer A., 1967).
Культура клеток PC-12 также является объектом для изучения роли NMDA
рецепторов в экзайтотоксичности и их функциях. Лаборатория университетф
Division of Health Scieces в Австралии провела исследование о наличии
субъединиц NMDAR на мембранах дифференцированных клеток PC-12.
Брали несколько линий PC-12 (ATCC, WEHI, Ordway и Flinders) и с
помощью метода ПЦР определили постоянную экспрессию NR1 и различное
соотношение NR2 субъединиц в зависимости от типа клеточной линии PC12. При действии на культуру фактором роста нервов в концентрации 50
нг/мл они отмечали значительное увеличение количества NR1 субъединиц у
животных линий WEHI и Ordway. Количественные значения возрастали с 2.1
до 13,4 раза. мРНК для NR2A и NR2B не нашли ни в одной из линий PC-12.
39
NR2C была определена в некоторых линиях клеток и её количество также
возрастало
в
присутствии
NGF
в
4
раза.
Иммуногистохимически
подтвердилось наличие NR1, NR2C и NR2D субъединицы. Методом Patchclamp не смогли зафиксировать рабочие NMDA рецепторы. Поэтому Edwards
MA., Loxley RA, Williams AJ, Connor M, Phillips JK в своей статье «Lack of
functional expression of NMDA receptors in PC-12 cells» (Neurotoxicology,
2007) сделали вывод о том, что по сравнению с нейронами ЦНС, клетки PC12 не экспрессируют функциональные NMDA. Это может являться одним из
факторов ограничивающих функциональный ответ на NMDA/глутамат и
соответственно ограничивает возможности использования PC-12 в качестве
нейрональной модели. В данной работе мы исследовали субьединичный
состав NMDA рецепторов культуры PC-12 клона D4.
Было проведено исследование, в котором выяснялась возможность
NMDAR2 субъединицы (NR2) контролировать экспрессию всего рецептора
так же как и NR1, для этого они трансфецировали NR2 (A-D) в PC-12 клетки
используя аденовирусный вектор. Зафиксированные токи, проводимые
NMDA-рецепторами были получены не смотря на то, что в клетках не была
найдена кДНК субъединицы NR1, а кДНК NR2A и NR2B присутствовала.
Амплитуда токов была точно такой же как в случаях, когда к клеткам
добавляли еще и кДНК, копирующую NR1 субъединицы NMDA рецепторов.
В клетках, в которых находилась кДНК NR2C и NR2D субъединиц, токи
также были зафиксированы, однако их интенсивность была намного меньше.
Эти результаты доказывали что NR2 белок, который экспрессировался
благодаря внедрённой с помошью аденовируса ДНК отлично дополнял
эндогенный NR1 и образовывал полноценный NMDA рецептор. (Saito Y.et
al., 2003).
Однако еще в 1995 году в Бостоне методом PCR и методом Nothern
Blotting выявили наличие NMDAR2A, B и D субъединиц в клетках PC-12. И
сделали вывод о том, что данная клеточная культура может быть пригодной
40
моделью
для
изучения
транскрипционной
и
посттранскрипционной
регуляции и экспрессии генов субъединиц NMDA- рецепторов, включая и
альтернативный сплайсинг. (Leclerc C.et al. 1995).
Клетки PC-12 являются идеальной системой для оценки изменения
метаболизма активных форм кислорода при их дифференцировки по
нейрональному
типу.
Эти
клетки
подвергаются
терминальной
дифференцировке или росту, зависящему от типа стимулов или формы
киназного каскада. (Damon D. et al, 1990; Babior B., 1999). NGF селективно
индуцирует долгосрочную активацию ERK1/2, которая является особенно
важной для полноценной дифференцировки. На модели клеток PC-12,
подвергшихся
окислительному
стрессу,
тестируются
различные
антиоксиданты (Liu L, Wang SY., 2013; Im SE et al., 2013). Проведение
экспериментальных исследований на нейрон-подобных клетках культуры
чрезвычайно актуально, поскольку именно нервная ткань является наиболее
чувствительной к окислительному повреждению и требует вмешательства
препаратов, обладающих нейропротекторным действием.
1.3.
NMDA рецепторы и клеточный сигналинг.
NMDA-рецепторы относятся к подклассу ионотропных глутаматных
рецепторов. Глутаматергические нейроны составляют более 50% всех
возбуждающих нейронов ЦНС. Они реализуют такие функции головного
мозга, как обучение, выработка поведенческих реакций, запоминание
(Болдырев A.A. и др., 2004). По механизму передачи сигнала в клетку
глутаматные рецепторы подразделяются на два основных подтипа –
метаботропные и ионотропные.
Метаботропные глутаматные рецепторы действуют через систему
вторичных посредников, сопряженных с G-белками на мембране клеток. По
типу агонистов и внутриклеточных сигнальных механизмов данные
рецепторы подразделяются на три класса. Метаботропные рецепторы класса
41
I осуществляют Ca2+-зависимую передачу возбуждения и действуют
посредством образования инозитол-1,4,5-трисфосфата и диацилглицерола.
Метаботропные рецепторы II и III классов осуществляют Ca2+-независимую
передачу сигнала, вторичными мессенджерами рецепторов II и III классов
являются цАМФ и цГМФ. Основной функцией метаботропных глутаматных
рецепторов является метаболическая регуляция внутриклеточных процессов,
в том числе и регуляция работы ионотропных рецепторов. (Asztely F.,
Gustafsson B., 1996)
Ионотропные рецепторы изменяют мембранную проницаемость для
катионов, что приводит к деполяризации мембраны и возникновению
возбуждающего потенциала. Они делятся на 3 класса (см. табл. 5). По
структуре и
названию специфических
агонистов выделяют NMDA-
активируемые, AMPA-активируемые и каинатные (КА) рецепторы.
Каналы NMDA-рецепторов высоко проницаемы для Ca2+, в то время как
АМРА-рецепторы
практически
непроницаемы
для
Ca2+,
но
высоко
проницаемы для Na+ и К+. AMPA- и KA-рецепторы участвуют в большинстве
видов быстрой синаптической передачи. (Brauner-Osborne H., 2000)
Таблица 5. Классы ионотропных глутаматных рецепторов (BraunerOsborne, 2000).
42
Природным лигандом NMDA-рецепторов является L-глутамат. Для
активации NMDA-рецепторов в качестве ко-агониста требуется также глицин
или D-серин. При десенситизации этих рецепторов нарушается способность
клеток к длительной потенциации, а, следовательно, и к формированию
долговременной
памяти.
В
этом
случае
наблюдается
нарушение
функционирования синаптических контактов, хотя оно и не влечет за собой
гибели нейрональной клетки. При гипеpактивaции данных рецепторов
возникает экзайтотоксический эффект. Его развитие обусловлено резким
увеличением концентрации внутриклеточного Ca2+ в цитоплазме нейронов,
что влечет за собой накопление активных форм кислорода, инициацию
перекисного окисления липидов и клеточную смерть.
На рис. 1.1 показаны основные лиганд-связывающие участки NMDAрецепторного комплекса. (Brose N., 1993).
Рис. 1. 1. Схема строения NMDA-рецептора (Brose, 1993)
Рецептор активируется агонистом только при связывании глицина с
двумя NR1-субъединицами и глутамата - с двумя NR2-субъединицами. При
43
связывании одного из лигандов сродство ко второму лиганду повышается.
Активация приводит к тому, что комплекс становится способен пропускать
ионы натрия и кальция внутрь клетки и ионы калия - наружу. Ионы магния
блокируют активность рецептора.
За счет способности NMDA-рецепторов повышать внутриклеточный
уровень кальция, NMDA-рецепторы влияют на клеточную сигнализацию, как
показано на рис. 1.2.
увеличения
В процессах клеточной сигнализации вследствие
внутриклеточной
концентрации
Ca2+,
активация
NMDA-
рецептора вызывает активацию митоген-активированной протеинкиназы
(MAP-киназы). Увеличение внутриклеточного кальция приводит к активации
Са-кальмодулиновой протеинкиназы II типа (CaMKII), которая способна
активировать PI3-киназу, а та, в свою очередь, активирует Ras-белок, а
следом запускается каскад митоген-активированных киназ.
Рис. 1.2. Участие NMDA-рецепторов в реализации кальциевого
сигнала (Krogsgaard-Larsen P., Hansen J., 1992)
44
Возможен альтернативный путь, когда активация Ras-белка происходит
через RasGRFs (см. рис. 1.3). Одним из результатов процесса становится
фосфорилирование MAP-киназы, что приводит к ее активации. (Wang F. et
al., 2007).
Рис. 1.3. Участие NMDA-рецепторов в процессах клеточной
сигнализации (Wang F. et al., 2007)
1.4.
Индукторы окислительного стресса.
Несмотря на противоречивые мнения учёных по поводу наличия
работающих NMDA рецепторов в клетках изучаемой нами культуры,
исследователи используют
NMDA в качестве индуктора окислительного
стресса на клетках PC-12 (Song Y.et al. 2010; Shen Y et al. 2006)
1.4.1. N-метил-D-аспартат (NMDA)
В экспериментальных исследованиях NMDA используется в качестве
индуктора нейротоксичности. В работе Song Y с соавторами (2006 и 2007гг)
было показано, что введение NMDA в культуру кортикальных нейронов,
45
вызывало окислительный стресс (Ge QF et al.,2006). Было изучено действие
миноциклина, который защищал клетки PC-12 против повреждений,
индуцированных
NMDA,
посредством
ингибирования
активации
5-
липоксигеназы. (Song Y., Wei E. et al., 2006)
В работе, опубликованной Shen Y. et al (2007), дифференцированные
клетки, подвергавшиеся окислительному действию NMDA, предварительно
содержали в растворе карнозина. Карнозин уменьшал экзайтотоксичность
NMDA, которая проявлялась в снижении уровня апоптотических и
некротических клеток. Измерения проводились методом MTT. Содержание
внутри и внеклеточного карнозина, гистидина и гистамина измерялась
методом
высоко-эффективной
жидкостной
хроматографии.
В
работе
использовался ингибитор гистидиндекарбоксилазы, а также антагонисты H1
и H3 рецепторов для доказательства механизма действия карнозина
посредством гистидин- гистаминового пути. Учёные полагают, то карнозин
может участвовать в эффективном ингибировании глутаматного выброса
посредством H1/H3 рецепоров.
Однако в литературе отсутствуют данные об эффекте NMDA на
дифференцированную и недифференцированную культуру PC-12, что
позволило бы определить, работают ли NMDA-рецепторы или в ответе
задействуется нерецепторный механизм действия.
1.4.2. Гомоцистеиновая кислота
Гипергомоцистеинемия
-
независимый
фактор
риска
сердечно-
сосудистых и нейродегенеративных заболеваний. Высокие концентрации
гомоцистеиновой кислоты в крови влияют на систему гомеостаза, повышая
риск развития заболеваний, связанных с повышенной свёртываемостью
крови. Гомоцистеин обнаруживается в мозге пациентов с болезнью
Альцгеймера. Для нейронов и иммунокомпетентных клеток было показано
взаимодействие ГЦ с ионотропными рецепторами глутамата, активируемыми
NMDA, приводящие к эффекту, сходному с экзайтотоксическим эффектом
46
глутамата. (Махро А.В. и др., 2008). В исследованиях, по оценке
экзайтотоксического влияния ГЦ на нейроны, нейтрофилы и лимфоциты,
было продемонстрировано, что эффект ГЦ ингибируется присутствием
антагонистов NMDA-активируемых глутаматных рецепторов- MK-801 и DAP5 (Болдырев А.А., 2009). Таким образом, предполагается, что одним из
путей воздействия ГЦ на данные клетки является его воздействие в качетстве
агониста ионотропных глутаматных рецепторов NMDA-класса. Данных по
нейротоксичности, индуцированной гомоцистеином в клетках PC-12 нет.
Существует несколько работ, имеющих прикладное значение для изучения
механизма действия гомоцистеиновой кислоты в клетках PC-12. В одной из
них
изучается
эффект
гидроген
сульфида,
как
протектора
против
гипергомоцистеинемии вызваной ГЦ. Показано, что NaHS, являющийся
донором
H2S,
защищает
клетки
PC-12
против
ГЦ-индуцированной
цитотоксичности и апоптоза, предотвращая снижение потанциала на
мембрание метохондрий, а также снижение внутриклеточного содержания
АФК, индуцированного гомоцистеином (Tang X. et al. 2009). Активные
формы кислорода вносят свой вклад в нейротоксичность гомоцистеина,
вызывая закисление, приводящее к гибели нейронов. В данной работе мы
хотели проверить, является ли экзайтотоксический эффект ГЦ на нейронподобные клетки PC-12 адекватным ответу нейронов на ГЦ, а также
исследовать взаимодействие ГЦ с его агонистами MK-801 и D-AP5.
1.4.3. Полиамины
Интерес учёных к проблеме изучения полиаминов продолжается в
течение последних 50 лет. Получено много данных об их синтезе и распаде, о
причине повышения их концентрации в клетках, однако до сих пор изучается
роль концентрационных изменений путресцина, спермина и спермидина в
организме человека. Как большинство ключевых веществ, содержащихся в
нашем организме, полиамины могут играть двоякую роль в биохимических
процессах, протекающих с их участием (Schipper G. and Verhofstad A.,2002).
47
Известно, что полиамины поддерживают оптимальную скорость роста
клеток. При этом клетки, характеризующиеся усиленным ростом, имеют
высокий
уровень
полиаминов,
орнитиндекарбоксилазы.
а
Биосинтез
также
фермента
многих
белков
их
распада
стимулируется
полиаминами (Igarashi K. and Kashiwagi K., 2010) В тоже время полиамины
могут проявлять и негативные свойства в организме. Так путресцин, спермин
и спермидин являются индикаторами развития патологических процессов в
организме, сопровождающихся окислительным стрессом (Saiki R. et al., 2009)
и последующей гибелью клеток (Schiller M., et al. , 2005).
При различных патологиях, содержание путресцина, спермина и
спермидина в крови человека изменяется по-разному, т. е. нарушается баланс
в обмене полиаминов. Спектр полиаминов растёт во всех случаях
диабетической нейропатии, хроническом гломерулонефрите, нефросклерозе
(Matsuoka Y et al., 1981; Huang BK et al., 2010). У пациентов, страдающих
почечной недостаточностью повышается уровень путресцина в плазме крови,
а спермина-уменьшается. Также известно, что содержание полиаминов в
крови пациентов зависит от активности ферментов их биосинтеза и распада.
1.4.4. Акролеин
Распад полиаминов (спермина и спермидина) приводит к образованию
высокотоксичного альдегида акролеина, который в настоящее время
рассматривается как один из самых сильных индукторов окислительного
стресса в организме. Акролеин является одним из наиболее значимых
биохимических маркеров диагностики церебрального инсульта, болезни
Альцгеймера и других заболеваний (Ivanova S. et al., 1998; Whiteley W. et al.,
2008; Igarashi K. and Kashiwagi K., 2011). В настоящее время акролеин,
продукт
метаболизма
полиаминов
и
окислительной
деградации
полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), рассматривается как один из
наиболее токсичных альдегидов наряду с другими продуктами
ПОЛ (4-
гидроксиноненаль, малоновый диальдегид) (Bradley M. et al., 2010; Dalle48
Donne R. et al., 2006; Esterbauer H. et.al., 1991; Luo J. and Shi R., 2004).
Акролеин
входит
в
число
патогенетически
значимых
биомаркеров
ишемического инсульта и нейродегенеративных заболеваний (Bradley M. et
al., 2010; Reich E. et al., 2001; Whiteley W. et al., 2008). Акролеининдуцированная гибель клеток, протекающая преимущественно по пути
некроза, сопровождается накоплением в них активных форм кислорода
(АФК) (Luo J., Shi R., 2004; Luo J, Shi R. 2005). В этих условиях становится
целесообразным применение антиоксидантов как «ловушек» свободных
радикалов.
1.4.5. Н2О2
Это
устойчивая
в
растворах
молекула,
образующаяся
при
восстановлении супероксида (О2-) (реакция дисмутации). Из всех продуктов
одноэлектронного восстановления кислорода только перекись водорода
может реагировать не только радикальным, но и безрадикальным путем
(Гамалей И.А., Клюбин И.В., 1996). Более того, вследствие своей
электронейтральности, Н2О2 может свободно преодолевать клеточную
мембрану (Скулачев В.П., 1996). Цепь событий, происходящих при действии
на клетки in vitro Н2О2 в концентрации 0,1-2,5 мМ (и выше), сводится к
следующему:
разрывы цепей ДНК, активация репарирующего фермента
поли (АДФ-рибозил)-полимеразы, уменьшение пула НАД, ЦТФ, ГТФ и УТФ;
снижение
интенсивности
гликолиза
в
результате
инактивации
альдегиддегидрогиназы и уменьшение содержания лактата, увеличение
концентрации внутриклеточного кальция, нарушение полимеризации актина
и далее морфологические изменения плазматической мембраны. Истощение
пула АТФ сопровождается гибелью клетки, а в случае с макрофагами,
лимфоцитами и фибробластами - их лизосом (Гамалей И.А., Клюбин И.В.,
1996).
К другим детально изученным эффектам Н2О2 относится перекисное
окисление липидов, в первую очередь ненасыщенных жирных кислот
49
плазматической
мембраны.
Несмотря
на
наличие,
довольно
емкого
восстановительного буфера перекись водорода в малых дозах оказывает
стимулирующее действие на клетки. В диапазоне концентраций 0,1-50 мкМ
Н2О2 способна активировать К-каналы плазматической мембраны (Kuo S. et
al., 1993; Krippeit-Drews P. et al., 1994,1995); дозозависимо усиливает
окислительный взрыв нейтрофилов и макрофагов в ответ на хемотактический
пептид (Winn S. et al., 1991; Gamaley I. et al., 1994); опосредует хемотаксис
гладкомышечных клеток к тромбоцитарному фактору роста (Sundaresan M. et
al.,
1995);
дозо-зависимо
усиливает
фагоцитоз
макрофагами
частиц
опсонизированного латекса (Gamaley I. et al., 1994); стимулирует адгезию
лейкоцитов к эндотелию (Suzuki J. et al., 1991; Gaboury C. et al., 1994);
самостоятельно вызывает хемотаксис перитонеальных нейтрофилов мыши
(Klyubin I. et al., 1996). Перечисленные эффекты, стимулированные
перекисью водорода, могут быть опосредованы рядом событий внутри
клетки. Показано, что в тех же малых дозах Н2О2 обратимо сдвигает
потенциал плазматической мембраны в сторону гипер- или деполяризации в
зависимости от типа клеток (Гамалей И.А., Клюбин И.В., 1996), вызывает
транзиторный подъем внутриклеточного кальция (Dreher D. et al., 1995).
Следует отметить, что в результате повреждающего действия перекиси
водорода повышение внутриклеточного кальция уже необратимо (Oppenheim
R., 1991; Elliot M. et al., 1992; Roveri A. et al., 1992), а непрерывный поток
данных ионов при действии больших доз Н2О2 приводит в конечном итоге к
лизису клетки (Elliott et al., 1992; Klyubin et al., 1996; Одгаева А. и др., 2007).
Конечный эффект Н2О2, приводящий либо к гибели клетки, либо к ее
активации зависит от ряда факторов, в частности от концентрации
действующего агента.
1.5.
Проточная цитометрия
50
В данной работе в качестве основного метода для оценки уровня АФК и
гибели клеток в опытах in vitro был использован метод проточной
цитометрии.
Метод цитометрии сформировался за последний 30 лет на основе
опытов по подсчёту числа частиц и определению их размеров. В 1965 г.
появилось первое сообщение о клеточном сортере, а в 70х годах cтали
выпускать приборы, способные измерять интенсивность флуоресценции при
двух или более длинах волн, что позволило определять сразу несколько
клеточных параметров.
В настоящее время цитометрию принято подразделять на статическую и
проточную.
В первом варианте цитометрии могут быть использованы
конфокальные микроскопы, а также более простые и дешевые системы
анализа изображений, смонтированные на основе обычных люминесцентных
микроскопов. Наблюдений с помощью второго варианта цитометрии
осществляются с помощью специальных приборов - проточных цитометров и
сортеров.
В основе метода прочной цитометрии лежит измерение оптических
свойств клеток. Клетки в определенном количестве в присутствии
специфического флуоресцирующего
красителя вводятся в ламинарный
поток в прочной кварцевой кювете, где они пересекают сфокусированный
световой пучок, не касаясь стенок кюветы. Источником света могут быть
различные лазеры, ультрафиолетовая лампа или их комбинация. Свет
определенной длины волны возбуждает молекулы флуоресцирующих
красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом
может
происходить
одновременное
возбуждение
нескольких
разных
красителей, что позволяет оценивать сразу несколько клеточных параметров.
Свет, испускаемый красителями, собирается с помощью системы линз и
зеркал, которые раскладывают их на компоненты. Световые сигналы
улавливаются
и
преобразуются
в
электрические
импульсы
51
фотоумножительным устройством. Далее информация отображается на
гистограммах. Современные проточные цитометры позволяют одновременно
измерять несколько (до восьми) параметров: рассеяние света на малые углы
(до 10º), которые ещё называют прямым светорассеянием; рассеяние света на
угол
90º,
так
флуоресценции
называемое
на
разных
боковое
длинах
светорассеяние;
волн.
Параметры
интенсивность
светорассеяния
позволяют проводить разделение клеток по размерам, форме, состоянию
клеточной мембраны и характеристикам цитоплазмы.
Рис. 1.4.Схема работы проточного цитофлуориметра
Методом проточной цитометрии можно получать самые разные данные:
определять количество антигенов, исследовать клеточный метаболизм
(например, измерять внутриклеточный pH), изучать транспорт ионов кальция
и кинетику ферментативных реакций. К области применения проточной
цитометрии
можно
субпопуляционного
отнести
состава
иммунофенотипирование
(анализ
лимфоцитов), диагностику гемобластозов,
определение содержания гемопоэтических стволовых клеток (CD34+) при
трансплантациях костного мозга, анализ плоидности ДНК и анализ
клеточного цикла, исследование экспрессии цитокинов, дифференциальную
52
диагностику
опухолей,
анализ
пролиферативного
статуса
клеток,
определение минимальной остаточной болезни, а также определение
маркёров апоптоза.
В нашей лаборатории используется прибор Facs Calibur, стандартной
конфигурацией которого является цитометр с пятью детекторами, состоящий
из жидкостного, оптического и электронного блоков и встроенного
аргонового лазера с воздушным охлаждением. Собственно система Facs
Calibur состоит из чувствительного блока, компьютера и различного
программного обеспечения.
53
2.
2.1.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Моделирование окислительного стресса на культуре клеток
РС12 in vitro.
2.1.1. Характеристика клеточной культуры.
Работа проведена на клеточной линии феохромоцитомы крыс PC-12 D4. Культура была любезно предоставлена руководителем
лаборатории
генетики соматических клеток д. б. н. И. А. Гривенниковым из Института
молекулярной генетики.
2.1.1.1.
Культивирование клеток.
Клетки культивировали в среде RPMI (Roswell Park Memorial Institute
medium), с добавлением сульфата гентамицина/стрептомицина (0,04 г на 500
мл среды), глутамина (150 мг на 500 мл среды) и 15% эмбриональной
телячьей сыворотки во флакон для культивирования объёмом 25 см3. В
течение всего периода культивирования клетки содержали в СО2 инкубаторе
при температуре 370С и 95% влажности и 5% содержании СО2 в воздухе,
проводя замену среды через каждые 2-3 дня.
Клетки периодически (каждые 3-4 дня) пересевали в зависимости от
интенсивности роста. Смыв клеток осуществляли средой RPMI, с помощью
пипетки, механически смывая их потоком жидкости (вследствие чего они
отрывались от подложки). Затем клетки тщательно суспендировали и
проводили количественную оценку изучаемой популяции клеток в камере
Горяева. Суспензию клеток центрифугировали в течение 8 мин при 1100
об/мин, полученный осадок клеток использовали для работы. Эксперимент
проводился при количестве клеток приблизительно равном 106 в 1 мл.
Внешний вид популяции интактных клеток представлен на рис. 2.1.
54
Рис. 2.1. Клетки феохромоцитомы PC-12 в интактном состоянии.
Изображение получено на микроскопе Nikon Eclipse TS-100F.
Клетки
Замораживанию
замораживали
для
подвергали
клетки,
последующего
плотность
использования.
суспензии
которых
соответствовала достаточному их количеству (когда процент клеток в
монослое составлял примерно 80% от общей площади дна флакона, это
количество примерно соответствует 106 клеток в 1 мл). Клетки собирали,
центрифугировали, затем осадок клеток растворяли в 1 мл телячьей
сыворотки и добавляли 10% ДМСО в качестве криопротектора. Сбор клеток
производился в стерильных условиях в ламинарном боксе с вертикальным
воздушным потоком. В криопробирках (пробирках из специального
пластика, который не разрушается при низких температурах), клетки
переносили в холодильную камеру и оставляли при температуре +4˚С на 1
час. Клетки могут храниться длительное время как в низкотемпературной
камере глубокого охлаждения (-80˚С), так и в жидком азоте.
Размораживание клеток осуществляли путем переноса криопробирки
из сосуда Дьюара, содержащего жидкий азот, или из морозильной камеры, в
55
которой они хранились, в тёплую воду (+37˚С) для того, чтобы клетки
оттаяли. Затем растаявшую суспензию клеток в стерильных условиях
перемешивали пипеткой и переносили во флакон
объёмом 25 см 3 с
приготовленной средой RPMI объёмом 10 см3. После того как клетки оседали
и прикреплялись к нижней стенке флакона (через 3- 4 часа), среду заменяли,
удаляя содержавшийся в замороженной суспензии ДМСО и оставляли в СО2
инкубаторе на несколько дней (3-4 дня) до последующей рассадки или забора
клеток для проведения эксперимента.
2.1.1.2.
Подготовка клеток для анализа.
В опытах использовали клетки феохромоцитомы PC-12 D4, выращенные
по описанному выше протоколу. Кроме интактных клеток, использовали
культуры, стимулированные дексаметазоном и rHu-NGF-β (рекомбинантный
человеческий фактор роста нервов β) .
Дексаметазон – один из факторов, способных дифференцровать клетки
PC-12 по почечному типу, превращая их в обычные хромаффинные клетки.
NGF-β - фактор дифференцировки клеток по нейрональному типу. В
экспериментальных
исследованиях
мы
использовали
как
недифференцированные, так и дифференцированные по нейрональному типу
клетки РС-12.
2.1.1.3.Дифференцировка
клеточной
культуры
с
помощью
дексаметазона и NGF-β
Согласно протоколу, культивированные клетки за два дня до начала
эксперимента переносили в «среду голодания», т.е. не содержащую
сыворотку, через сутки в среду вносились дифференцирующие агенты - NGF
или дексаметазон.
В клеточную среду вносили rHu-NGF-β (к 6 мл добавляли 6 мкл
раствора фактора роста нервов, содержащего 100 нг/мл сухого вещества) или
дексаметазон (к 6 мл добавлял 30 мкл дексаметазона, присутствующего в
56
концентрации 4 мкг/мл). Дексаметазон вносили в среду за 2 дня до
эксперимента в концентрации 20 нг/мл. rHu-NGFβ также вносили в среду за 2
дня до эксперимента в концентрации 0,1 нг/мл.
В день эксперимента клетки отделяли от подложки и переводили в
раствор как описано выше, удаляли супернатант и суспендировали осевшие
клетки в нескольких мл (3-4 мл) бесцветного раствора Хенкса. В течение
всего подготовительного периода клетки содержали в СО2 инкубаторе в
присутствии 5% СО2, 98% влажности и 37˚С. Перед началом эксперимента
проводили подсчет клеток под микроскопом. Количество клеток должно
составлять примерно 106/мл.
На рис. 2.2 представлен вид клеточной культуры РС-12 после
стимуляции фактором роста нервов (слева) и дексаметазоном (справа).
Рис. 2.2. Культура PC-12, стимулированная NGF (слева) и
дексаметазоном (справа). Изображение получено на микроскопе Nikon
Eclipse TS-100F.
57
Из рис. 2.1 и 2.2 видно, что интактные клетки отличаются по
морфологии от клеток, стимулированных дексаметазоном или фактором
роста нервов. Клетки, стимулированные дексаметазоном, в свою очередь
отличаются от клеток, стимулированных фактором роста нервов.
В культуре интактных клеток (см. рис. 2.1) преобладают шарообразные
клетки, некоторые из которых имеют отростки, сопоставимые по длине с
размером клеток. Отростки не сужаются на дистальном конце, а имеют такой
же диаметр, что и на проксимальном конце. Клетки, стимулированные
дексаметазоном (см. рис. 2.2-справа) более распластанные (имеют форму
многогранников) и крупнее, чем интактные клетки. Отростки этих клеток
отличные
по
форме
от
отростков
интактных
клеток.
Клетки,
стимулированные NGF (см. рис. 2.2-слева) напоминают по форме нейроны. У
них есть «аксоны» и «дендриты», а тело самой клетки вытянутое и
многогранное. Клетки этой культуры могут сплетаться в сети, однако могут
существовать и отдельно друг от друга. Этот тип клеток приобретает
видимые различия от интактных клеток уже через 1 сутки. Клетки,
стимулированные дексаметазоном, дифференцируются в клетки почечного
типа только через двое суток: они более тонкие и короткие. Клетки склонны
к агрегации, что выражается в том, что их очень сложно смыть с чашки
Петри для проведения эксперимента. Кроме того, их адгезивные свойства
гораздо более ярко выражены чем свойства клеток, стимулированных NGF и
клеток интактной культуры. Мы не анализировали кривые роста клеток,
поскольку это не входило в задачу работы.
1.2.2. Определение уровня активных форм кислорода и клеточной
смерти методом проточной цитометрии
1.2.2.1. Проточная цитометрия.
В основе метода проточной цитометрии лежит измерение оптических
свойств
индивидуальных
клеток. Суспензию
клеток
под
давлением
58
пропускают через капилляр, где в ламинарном токе жидкости они
выстраиваются друг за другом за счет наличия “обволакивающей” жидкости.
По краям потока создается более высокое давление, чем в центре, вследствие
чего клетки, стремясь попасть в область наименьшего давления, образуют
поток, состоящий фактически из одного ряда клеток, в котором они
подвергаются поочередному анализу с помощью быстродействующих
датчиков.
В качестве источника света в проточном цитометре могут быть
использованы
различные
лазеры,
ультрафиолетовая
лампа
или
их
комбинация. Свет определённой длины волны возбуждает молекулы
флуоресцентных красителей, которыми предварительно нагружают клетки.
Одновременно могут возбуждаться сразу несколько красителей, если они
имеют различные спектральные характеристики. Это позволяет оценивать
одновременно несколько параметров. Свет, испускаемый красителями,
собирается с помощью системы линз и преобразовывается в электрический
импульс
с
помощью
фотоумножителя
(ФЭУ).
Далее
информация
обрабатывается в цифровом режиме.
Рис. 2.3. Клетки феохромоцитомы PC-12 на проточном цитометре.
59
Ось Y – прямое рассеивание (FS), характеризует размер клеток, Ось Х –
боковое рассеивание (SS), характеризует гранулярность клеток. Гейтами R1 и
R2 выделены популяции клеток, параметры которых проанализированы
независимо.
В настоящей работе измерения проводили на проточном цитометре
FACSCalibur (BD Biosciences, USA). В каждом измерении регистрировали
10000 событий. Результаты анализировали с помощью программы WinMDI
2.8 (Scripps Institute, La Jolla, USA). На рис. 2.3. представлен график
распределения светорассеяния - прямое против бокового светорассеяния.
С помощью компьютерной аналитической программы WinMDI 2.7
оценивали распределение интенсивности флуоресценции двух флуорохромов
– DCF и PI (см. ниже). При представлении результатов измерения в виде
гистограмм по шкале абсцисс откладывали интенсивность флуоресценции
данного красителя в логарифмических координатах, а по шкале ординат
число событий для каждой величины сигнала (соответствующее количеству
клеток). Положение максимума полученного распределения характеризует
среднюю интенсивность флуоресценции, присущее основному числу клеток
в данной популяции, а площадь распределения отражает гетерогенность
клеточной популяции по данному параметру.
2.1.2.2. Определение уровня активных форм кислорода (АФК).
Концентрация
АФК
в
клетке
непостоянна.
Известно
развитие
колебательного режима при пероксидазном катализе окисления кислородом
NADH (Kummer J., 1996). Хотя до последнего времени роль АФК, а точнее
сказать, роль радикалов и передачи электронов между ними, в этом процессе
не была изучена. Известно, что в водных растворах карбонильных
соединений (например, глюкозы, рибозы, метилглиоксаля) и аминокислот
происходит восстановление кислорода, появляются свободные радикалы, и
их реакции сопровождаются излучением фотонов (Воейков Ю.В., 2001).
60
Уровень АФК в клеточной популяции на проточном цитометре
определяли
с
помощью
флуоресцентного
красителя
2’,7’-
дихлордигидрофлуоресцеин диацетата, DCFН2-DA (Invitrogen), (ex = 495 нм
и em = 520 нм), который хранили в растворе DMSO в концентрации 100 мМ.
Живые клетки способны аккумулировать и деацетилировать DCFH2-DA
до молекул 2’,7’-дихлордигидрофлуоресцеина (DCFH2), которые сами не
флуоресцируют и не могут покидать клетки. Однако эти молекулы в
присутствии АФК, ферментативно превращаются во флуоресцентный
продукт 2’,7’-дихлорфлуоресцин (DCF), который также аккумулируется
внутри живой клетки, поскольку не может пройти через целую мембрану.
Таким образом, флуоресценция DCF соответствует уровню активных
форм кислорода, имеющихся в клетке, и свидетельствует о внутриклеточном
уровне АФК (Sureda F. et al, 1996; Boldyrev A. et al, 2000).
Суспензию клеток нагружали DCFH2-DA (конечная концентрация в
пробе 100 мкМ) и оставляли на 40-60 мин в темноте. Затем клетки
распределяли в пробирки с различными лигандами и
инкубировали в
течение заданного времени. Затем анализировали на проточном цитометре.
Данные обрабатывали в программе CellQuest Pro (BD, США) рассчитывали
среднее значение интенсивности флуоресценции в Microsoft Exel (Microsoft,
США).
2.1.2.3. Определение доли мертвых клеток
Долю
мертвых
клеток
также
определяли
методом
проточной
цитометрии, используя окрашивание клеток иодидом пропидия, PI, который
является меткой клеток с поврежденной мембраной, то есть некротических.
Иодид пропидия используется для окрашивания ДНК выделенных ядер. PI
интеркалирует в спираль ДНК фиксированных и пермеабилизированных
клеток (Patel D. and Shen C., 1978).
61
Клетки PC-12 D4 окрашивали внесением в среду 10 мкМ иодида
пропидия за 3 мин (в темноте при комнатной температуре) до измерения
доли мертвых клеток (λex =485 нм, и λem =610 нм). Оценивали данные,
полученные из гистограмм, по оси ординат которых отложено количество
событий, а по оси абсцисс – распределение флуоресценции иодида пропидия
(рис. 2.3). Доля клеток в каждом квадранте указана в процентах; 2 нижних
квадранта содержат живые клетки, 2 верхних – мертвые, характеризующиеся
высокой величиной флуоресценции PI. Данные обрабатывали в программе
CellQuest Pro (BD, США) рассчитывали среднее значение интенсивности
флуоресценции в Microsoft Exel (Microsoft, США).
Рис. 2.4. Популяция клеток феохромоцитомы PC-12 в координатах
PI vs DCF (при определении уровня АФК и смертности клеток)
2.1.3 Определение экспрессии NMDA-рецепторов методом
непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания антителами.
Определение экспрессии NMDA-рецепторов на поверхности клеток РС12 проводили методом непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания
62
двумя видами антител к двум субъединицам рецепторов: NR1 а также к NR2b
субъединицам.
Клетки отделяли от дна культурального флакона и центрифугировали 2
раза в растворе Хенкса для отмывания от среды культивирования. После
этого их считали и вносили в цитометрические пробирки по 125 мкл
(примерно по 106 клеток в мл). Добавляли 100 мкл 10% формалина и 275 мкл
раствора
Хенкса
(конечное
содержание
формалина
-
2%).
Клетки
перемешивали и оставляли на 10 мин при 37˚C. Через 10 мин в пробы
добавляли по 2 мл раствора Хенкса для того, чтобы «отмыть» формалин.
После перемешивания центрифугировали при 1100 об/мин в течение 7,5 мин.
Эту процедуру проводили три раза, после чего отбирали надосадочную
жидкость и добавляли 96% спирт (в таком количестве, чтобы в конечном
объёме его концентрация составляла 90%), а также по 500 мкл раствора
Хенкса. Клетки выдерживали 20 мин на холоду при +4оС и затем также
трижды отмывали раствором Хенкса. Следующий этап включал окраску
антителами. Ниже представлен коммерческий протокол окраски антителами
клеток
PC-12.
Таким
же
образом
окрашивались
клетки,
которые
культивировались в присутствии дексаметазона или NGF.
Субъединицы NR1 и NR2 NMDA рецепторов обладают разной
активностью. NR1 субъединица является канальной. Эта субъединица,
встроенная в мембрану, обеспечивает полноценную работу рецептора. на
NR2 субъединица показывает, обладает ли регуляторной активностью белок
или нет. Подробнее о функциях субъединиц NMDA рецепторов см. главу
«Обзор литературы»
В таблице представлена последовательность окрашивания первичными
(I) и вторичными (II) антителами. Контрольные клетки окрашиваются только
вторичными
антителами.
Метод
непрямого
иммунофлуоресцентного
окрашивания предполагает, что метка с флуоресцентным зондом находится
63
на вторичных антителах. Это определяет дополнительную чувствительность
метода.
Таблица 2.1. Протокол окрашивания антителами на субъединицы
NMDA рецепторов пермеабилизованных клеток PC-12
Антитела
Контроль
-
II
Антитела на NR1 субъединицу NMDA рецепторов
I
II
Антитела на NR1 субъединицу NMDA рецепторов
I
II
Антитела на NR1 субъединицу NMDA рецепторов
I
II
Антитела на NR2b субъединицу NMDA рецепторов
I
II
Антитела на NR2b субъединицу NMDA рецепторов
I
II
Антитела на NR2b субъединицу NMDA рецепторов
I
II
К каждой изоформе белка прикрепляются первичные антитела, которые
не
обладают
наличием
флуоресцентной
метки.
Далее
подбираются
вторичные антитела, меченные флуоресцентным красителем. Вторичные
антитела присоединяются к специфическому участку первичных антител.
Таким образом, они не могут прикрепляться к белкам мембраны клетки, так
как не имеют специфического сайта связывания с ними. Поэтому базовая
флуоресценция, которая может детектироваться в проточном цитометре,
является незначительной и принимается равной нулю. Все остальные клетки
окрашиваются первичными антителами, которые связываются с белком
NMDAR. После чего, клетки окрашиваются вторичными антителами,
которые специфически связываются с первичными антителами. Детекция
флуоресценции вторичных антител может быть количественно и качественно
измерена при помощи метода проточной цитометрии.
64
В качестве первичных антител использовали антитела мыши (mouse
antibodies), вторичных - FITC-меченные антитела козы (goat–antimouse
antibodies). Флуорохромы обладают различным спектром эмиссии. Каналы на
цитометре подобраны так, что они примерно соответствуют спектрам
известных флуорохромов. FITC обладает самой короткой длиной волны
эмиссии, поэтому мы измеряли FITC-меченые антитела в первом канале.
Инкубация как с первичными, так и со вторичными антителами происходила
в течение 1 часа, после чего клетки отмывали и проводили измерения.
Обработку результатов проводили по программе WinMDI 2.8 (Scripps
Institute, La Jolla, USA).
2.2. Способы индукции окислительного стресса
2.2.1 Перекись водорода
Перекись водорода при повышенном образовании в клетке вызывает
окислительный стресс. Некоторые ферменты, например глюкозоксидаза,
образуют
в
ходе
окислительно-восстановительной
реакции
перекись
водорода, которая может играть защитную роль в качестве бактерицидного
агента.
В
клетках
млекопитающих
нет
ферментов,
которые
бы
восстанавливали кислород до перекиси водорода. Однако, несколько
ферментных систем (ксантиноксидаза, НАД(Ф)H-оксидаза, циклоксигеназа и
др.) продуцируют супероксид, который спонтанно или под действием
супероксиддисмутазы превращается в перекись водорода. В данной работе
мы использовали перекись водорода для индукции неспецифического
окислительного стресса, т.е. окислительного стресса, индуцированного
внесением эндогенного оксиданта, который закисляет клетку не через
рецепторный механизм действия, а влияет прямым образом, как донор
активных
форм
кислорода.
Клеткам
давали
перекись
водорода
в
концентрации 5 мМ. Время инкубации составляло 30 мин. После инкубации
с перекисью водорода клетки отмывали и измеряли количество активных
форм кислорода, а также долю мёртвых клеток.
65
Протокол эксперимента:
1.
интактные клетки (контроль),
2.
интактные клетки + 1 мМ карнозин,
3.
интактные клетки + 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом,
4.
интактные клетки + 1 мМ нанолипосом не содержащих нанокарнозин,
5.
введение в культуру клеток 5 мМ H2O2 ,
6.
введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 5
мМ H2O2,
7.
введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до
добавления в культуру клеток 5 мМ H2O2,
8.
введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих
нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 5 мМ H2O2.
Во всех сериях экспериментов время экспозиции культуры клеток с 5
мМ H2O2 составило 0,5 часа.
2.2.2. N-метил-D-аспартат
Для стимуляции специфического окислительного стресса, запускаемого
через механизм, опосредованный рецепторами, использовали N-метил-Dаспартат (NMDA) в концентрации 1 мМ. N-метил-D-аспартат - это агонист
NMDA-рецепторов.
Он
вызывает
экзайтотоксический
эффект,
развитие
гиперактивацию
которого
рецепторов
обусловлено
и
резким
увеличением концентрации внутриклеточного Ca2+ в цитоплазме нейронов,
что влечет за собой накопление активных форм кислорода, инициацию
перекисного окисления липидов и клеточную смерть.
Для изучения механизма действия NMDA на клетки PC-12, мы
использовали блокаторы NMDA-рецепторов: MK-801 и D-AP5.
Протокол эксперимента:
1.
интактные клетки (контроль)
2.
интактные клетки + 1 мМ карнозина
3.
введение в культуру клеток 1 мМ NMDA
4.
введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 1
мМ NMDA
66
5.
введение 10 мкM MK-801 за 1 ч до добавления в культуру клеток 1
мМ NMDA
6.
введение 50 мкМ DAP5 за 1 ч до добавления в культуру клеток 1 мМ
NMDA
Во всех сериях экспериментов время экспозиции культуры клеток с 1 мМ
NMDA составило 0,5 часа.
2.2.3. Гомоцистеиновая кислота
Гомоцистеиновая
кислота,
метаболит
гомоцистеина,
обладает
экзайтотоксическими свойствами, стимулируя NMDA-рецепторы. При этом
происходит избыточное поступление ионов кальция в клетки и образование
большого количества свободных радикалов. Мы добавляли гомоцистеиновую
кислоту в пробы в концентрации 500мкМ. Пробы инкубировались в течение
1 часа. Затем проводили измерения.
Протокол эксперимента:
1.
интактные клетки (контроль)
2.
интактные клетки + 1 мМ карнозина
3.
интактные клетки + 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом
4.
интактные клетки + 1 мМ нанолипосом не содержащих нанокарнозин
5.
введение в культуру клеток 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты.
Измерения проводили через 5, 15, 30 и 60 минут инкубации
6.
введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 500
мкМ гомоцистеиновой кислоты, инкубировавшейся полчаса с клетками
7.
введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до
добавления в культуру клеток 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты (30 мин)
8.
введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих
нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 500 мкМ
гомоцистеиновой кислоты (30 мин)
9.
введение 10 мкM MK-801 за 1 ч до добавления в культуру клеток 500
мкМ гомоцистеиновой кислоты (30 мин)
10. введение 50 мкМ DAP5 за 1 ч до добавления в культуру клеток 500
мкМ гомоцистеиновой кислоты (30 мин)-10.
2.2.4. Полиамины
В работе использовали спермин, спермидин и путресцин. Путресцин
образуется при декарбоксилировании бактериями аминокислоты орнитина. В
67
тканях организма путресцин — исходное соединение для синтеза двух
физиологически
активных
полиаминов —
спермидина
и
спермина.
Полиамины добавляли к клеткам в концентрации по 50, 100 и 500 мкМ
каждый. Инкубация клеток с полиаминами происходила в течение 1 часа при
370С.
Протокол эксперимента:
1.
интактные клетки (контроль)
2.
интактные клетки + 1 мМ карнозина
3.
интактные клетки + 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом
4.
интактные клетки + 1 мМ нанолипосом не содержащих нанокарнозин
5.
введение в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермина
6.
введение в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермидина
7.
введение в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ путресцина
8.
введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 50,
100, 500 мкМ спермина
9.
введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 50,
100, 500 мкМ спермидина
10. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 50,
100, 500 мкМ путресцина
11. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до
добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермина
12. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до
добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермидина
13. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до
добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ путресцина
14. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих
нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ
спермина
15. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих
нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ
спермидина
16. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих
нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ
путресцина
2.2.5. Акролеин
В работе мы использовали акролеин в концентрации 1 мМ, который
готовили под тягой. В культуру клеток вносили 10 мкМ или 100 мкМ
68
водного раствора акролеина. Инкубация клеток в присутствии акролеина
составила 1 час, 3 часа или 24 часа при 370С. Эксперимент проводили в
тёплой среде RPMI без содержания сыворотки.
Протокол эксперимента:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
интактные клетки (контроль) -1;
интактные клетки + 1 мМ карнозина-2;
интактные клетки + 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом-3
интактные клетки + 1 мМ нанолипосом не содержащих нанокарнозин-4
введение в культуру клеток вводили 10 мкМ акролеина («Aldrich») -5;
100 мкМ акролеина-6;
введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 10
мкМ акролеин-7;
введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 100
мкМ акролеина-8;
введение 1 мМ карнозина после инкубации клеток с 10 мкМ акролеин-9;
введение 1 мМ карнозина после инкубации клеток со 100 мкМ
акролеина-10.
введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до добавления
в культуру клеток 10 мкМ акролеина -11;
введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до добавления
в культуру клеток 100 мкМ акролеина -12;
введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих
нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 10 мкМ
акролеина -13;
введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих
нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 100 мкМ
акролеина -14.
Во всех сериях экспериментов время экспозиции культуры клеток с
акролеином составило: 1 ч, 3 ч и 24 ч.
2.3.
Введение карнозина и нанолипосомальных конструкций на
его основе в клеточную культуру PC-12 при моделировании ОС.
2.3.1. Схема экспериментов.
В экспериментах, по индукции ОС различными по химической природе
веществами,
перечисленными
выше,
клетки
снимали
с
подложки,
суспендировали, затем оставляли «контрольную» группу клеток, которая
была необходима для настройки проточного цитометра, свечение клеток
69
которой, так называемый «шум», принималось равной нулю. Остальные
клетки окрашивали DCF в течение 40-60 минут при 370С, помещая пробирку
в место, недоступное для попадания солнечных лучей. После окрашивания
клетки делили на четыре группы, в одну из которых добавляли карнозин, в
другую липосомы, содержащие карнозин, в третью - пустые нанолипосомы, в
четвёртые оставляли в растворе среды RPMI в качестве контроля. После
часовой инкубации с антиоксидантами, клетки делили по пробиркам, в
которых уже содержались вещества - активаторы окислительного стресса,
находящиеся в них в нужной концентрации, инкубация с которыми занимала
от 0,5 часа до 1 часа. После этого, клетки окрашивались PI и величина их
флуоресценции
схематически
измерялась
в
представлены
проточном
на
цитометре.
Эксперимены
следующем
рисунке.
Рис. 2.5. Схематический план эксперимента.
Карнозин, карнозин в составе нанолипосом, а также «пустые» липосомы
добавляли за 1 час до инкубации с веществами, индуцирующими ОС.
2.3.2. Приготовление нанолипосом, содержащих карнозин
Для приготовления пустых и нагруженных карнозином липосом
применялся метод фазовой реверсии (работа выполнена в лаборатории
института Philipps-Universität Marburg Department of Pharmaceutics &
Biopharmacy Левачёвой Ириной Сергеевной).
70
Все
липиды:
1,2-дипальмитол-сн-глицеро-3-фосфохолин,
дистеароил-сн-глицеро-3-фосфохолин
(Lipoid
GmbH,
Germany),
дистеароил-сн-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[малеимид
1,21,2-
(полиэтилен
гликоль)-2000] (соль аммония) и холестерол (Avanti Polar Lipids, Inc., USA)
были растворены в хлороформе. Органический растворитель испаряли в
вакуумных условиях после того как формировалась липидная плёнка.
Раствор сульфата аммония
был использован для гидратации липидной
плёнки при постоянном перемешивании и нагревании до 50°C. Полученная
дисперсия
многослойных
везикул
с
большим
спектром
размеров
пропускалась через поликарбоновую мембрану (Nuclepore, Whatman, United
Kingdom) с порой размером 200 нм и 50°C, при этом использовали Avanti
Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Inc., USA). Чтобы достичь максимальной
монодисперсности, процедуру последовательно проводили 21 раз.
Карнозин загружали в липосомы, используя градиент сульфата аммония.
Процесс происходил в 20-кратно разбавленном HEPES буфере (4-((2гидроксиэтил)-1-пиперазинэтан сульфатная кислота) (AppliChem GmbH,
Germany), содержащем криопротектор (4 % сахароза), при pH 8.4.
Свежеприготовленный раствор карнозин-содержащих нанолипосом был
профильтрован стерильно, с использованием нейлоновой мембраны с порой
размером 0.45 мкм и 0.22 мкм (Pall Corporation, USA).
На первом этапе, нанолипосомные конструкции отсеивались по
загруженности и размеру везикулы.
2.3.2.1.Измерение размеров
Гидродинамический диаметр везикулы и размер был оценен с помощью
динамического
светового
рассеивателя
на
приборе,
измеряющем
наноразмерные структуры Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing
Systems, USA). Липосомную взвесь растворяли в фосфатно-солевом буфере
1:100 (PBS) до концентрации, удобной для измерения и анализа, используя 5mW HeNe лазер (632.8 nm) при угле рассеяния равном 90°.
Вязкость
71
жидкости была приведена к 0, 933 Пуаз, которая соответствовала вязкости
воды при 23°C. Показатель преломления растворителя приводилась к 1.333,
что соответствует показателю преломления воды. Интенсивность среднего
рассеяния приводилась к
300 кГц. Полученные результаты являются
средними величинами, полученными в результате как минимум трёх
повторных измерений со стандартным отклонением.
2.3.2.2.Выбор оптимальной липидной композиции
Шесть различных липидов были приготовлены и изучены на предмет их
максимальной эффективности по критерию способности инкапсулировать
карнозин (оценка проводилась спектрофотометрическим методом) и размер
везикулы
(динамическое
светорассеяние)
для
подбора
оптимальной
липидной композиции, используемой для создания липосомной мембраны.
Результаты не представлены. Также было выбрано определенное молярное
соотношение липидов (23:16:1.6), чтобы загруженность липидов карнозином
составила 84%. Гидродинамический размер везикулы составляет 150 нм.
Методом
замораживания-скалывания
наноструктурных
комплексов
при
оценивался
помощи
двух
размер
микроскопов
-
трансмиссионном электронном микроскопе и зеркальном (отражательном)
электронном микроскопе.
Трансмиссионный электронный микроскоп использует высоковольный
электронный луч для того чтобы сформировать изображение. Электронный
луч
выпускается
из
электронной
пушки,
обычно
использующей
вольфрамовый катод в качестве источника электронов. Электронный луч
обычно усиливается анодом при +100 килоэлектрон-вольт (от 40 до 400 кэВ).
Что
касается
катода,
сфокусированного
на
электростатической
и
электромагнитной линзах, и пропускаемого через образец, то он частично
пропускает электроны, а частично рассеивает их из луча. Когда он проходит
через образец, электронный луч получает информацию о структуре образца,
72
которая усиливается с помощью системы линз объектива микроскопа.
Изображение выводится на экран, покрытый фосфором или каким-либо
сцинтиллятором, например сульфидом цинка. Кроме того, можно записать
данные о структуре образца с помощью фотоплёнки прямо под электронным
лучём. Также изображение можно вывести на экран компьютера.
Рис. 2.6. Нанолипосомы. Проба, полученная на трансмиссионном
электронном микроскопе методом замораживания-скалывания. Размер
каждой липосомы составляет около 150 нм.
В отражательном (зеркальном) электронном микроскопе, также как и в
трансмиссионном, электронный луч падает на поверхность, но вместо
использования трансмиссии, отражаемый луч упругорассеянных электронов
сразу же анализируется детектором и выдаётся в виде численного значения
обрабатывающим устройством.
73
Рис. 2.7. Нанолипосомы. Проба, полученная на отражательном
электронном микроскопе методом замораживния-скалывания.
Метод приготовления препаратов для изучения их в электронном
микроскопе называется метод замораживания-скалывания. Этот метод
используется для исследования липидных мембран. Свежеприготовленная
суспензия моментально замораживается (криофиксация), затем просто
скалывается, либо скалывается с использованием микротома. Замороженная
поверхность затеняется испаряемой платиной или золотом под углом 45° в
вакуумном
устройстве.
Иногда
дополнительно
распыляется
углерод,
наносимый перпендикулярно поверхности скола, обычно это может
использоваться для большей стабильности покрытия реплики (копии).
Образец возвращают в комнатные условия (давление и температура), затем
очень хрупкая плёнка, покрывающая биологический образец, снимается с
помощью химических реактивов, кислот, раствора гипохлорида или
детергента SDS. Далее реплика отмывается от химических агентов и может
быть исследована в трансмиссионном микроскопе.
74
2.3.3. В работе использовался и второй наноструктурный препарат
на основе карнозина (КСЛ).
В качестве нанокострукций использовали липосомы, состоящие из
95,3% фосфолипидов, 2,5% неполярных липидов, и содержащие 1,2% Lкарнозина, стерилизованные автоклавированием при избыточном давлении 1
атм. в течение 45 минут. Средний диаметр липосомальных частиц составлял
150-160 нм.
2.3.4. Определение содержания карнозина в составе нанолипосом
по диазореакции (Практикум по биохимии. Издательство Московского
университета)
Реактивы:
1. Сульфаниловая кислота – раствор содержит 0,9 г сульфаниловой кислоты,
9 мл концентрированной HCl, воды до 100 мл.
2. NaNO2-5%ный раствор, свежеприготовленный.
3. Диазотированная сульфаниловая кислота. В колбу, стоящую во льду,
помещают 6 мл раствора сульфаниловой кислоты, приливают туда 6 мл
свежеприготовленного раствора NaNO2 , перемешивают и оставляют на 5
мин. Прибавляют при помешивании еще 24 мл NaNO2 и через 5 мин
доливают водой до 100 мл. Каждый раз готовят свежий раствор (на льду
хранится в течение 5-6 ч).
4. NaCO3 безводный – 10%ный раствор.
5.Карнозин- стандартный раствор 0,5 мг/мл.
Карнозин содержащие нанолипосомы после упаривания на роторном
испарителе растворяют в 1-2 мл воды. Отбирают различные количества этого
раствора, доводят водой до 2мл, приливают 3 мл диазореактива, хорошо
премешивают и оставляют на 5 мин. Затем добавляют 3 мл 10%-ного
раствора соды, перемешивают и через 10 мин колориметрируют при 490 нм.
Следует убедиться в том, что интенсивность образующейся краски
пропорциональна
определения.
количеству
Количество
исследуемого
карнозина
раствора,
рассчитывают
взятого
с
для
помощью
калибровочного графика, построенного по стандартному раствору карнозина,
75
содержащему от 0,05 до 0,5 мкмоль в пробе. Рассчитывают количество
карнозина в микромолях на 1 г ткани.
2.4.
Приготовление растворов.
Карнозин. Раствор карнозина, в концентрации 0,5 мг/мл готовили из
сухого реактива.
К сухому веществу приливали раствор среды для
культивирования клеток PC-12, RPMI, содержащей все компоненты, кроме
телячьей сыворотки (состав среды см. выше), объёмом 10 мл. После этого в
среде подводили pH до значения, равного 7,4. Растворы хранили в
холодильники не более 1 месяца, проверяя pH каждый раз перед
экспериментом по окраске среды (в ней содержится феноловый красный,
который является индикатором pH)
Пероксид водорода. Концентрированный раствор пероксида водорода
брали в аптеке. В экспериментах использовался водный раствор с конечной
концентрацией 5 мМ. Плотность перекиси проверялась непосредственно
перед проведением эксперимента, т.к. жидкость нестабильна.
NMDA, Гомоцистеиновая кислота. NMDA и гомоцистеиновая кислота в
концентрации 1мМ и 500мкМ соответственно были приготовлены из сухого
реактива, исходя из молекулярной массы каждого - соответственно. Сухое
вещество растворяли в тёплом готовом растворе Хэнкса, затем приводили pH
к стандартному значению 7,4. Раствор гомоцистеиновой кислоты выходит за
границы буферной ёмкости при pK2, то есть при значении константы
диссоциации аминогруппы, что осложняет подведение pH до стандартных
значений, поэтому мы готовили раствор на буфере (р-р Хенкса).
Полиамины. Полиамины (спермин, спермидин, путресцин) готовили на
дистиллированной воде. Исходная концентрация составляла 5 мМ.
Акролеин. Акролеин в концентрации 10 мкМ и 100 мкМ готовили под
тягой на основе дистиллированной воды. Исходная концентрация составляла
1 мМ.
76
MK-801, DAP5 готовили на основе дистиллированной воды. Исходная
концентрация составляла 1 мМ Конечная концентрация составила 10 мкМ и
50 мкМ соответственно.
2.5. Экспериментальные исследования in vitro и in vivo на быстро
стареющих мышах линии SAM
(Senescence Accelerated Mice, клоны
SAMR1 - resistance и SAMP1 - Prone) SPF-категории.
Мыши выращены в Питомнике экспериментальных животных в
Пущино-на-Оке. Все эксперименты проводились с соблюдением регламента
работы с экспериментальными животными, описанными в русскоязычной
версии издания Guide for the Care and Use of Laboratory Animals - Russian
Version, National Academy Press, Washington. DC, 1996.
2.5.1. Окислительный стресс in vitro создавали инкубацией суспензии
выделенных гранулярных клеток мозжечка с 3,5 мМ перекиси водорода в
течение 30 мин при 37ОС в присутствии и в отсутствие карнозинсодержащих
нанолипосом (КСЛ). Конечная концентрация карнозина, внесенного в
составе КСЛ в суспензию нейрональных клеток, составляла 2,65 мМ.
2.5.2. Выделение гранулярных клеток мозжечка. Опыты
in vitro
проводили на суспензии гранулярных клеток мозжечка. Выделение
гранулярных
клеток
мозжечка
проводили
из
10-12
дневных
быстростареющих мышей (Sureda F. et al., 1998). Животных декапитировали,
выделяли мозжечок, промывали его ледяным физиологическим раствором,
удаляли крупные кровеносные сосуды и измельчали скальпелем. Для
разрыхления межклеточного вещества использовали раствор коллагеназы,
приготовленный на основе буфера Тироде (Wako collagenase, 2 mg/ml/1
животное). Измельченные фрагменты ткани мозжечка инкубировали при
32оС в течение 20 мин, не перемешивая. После инкубации декантацией
удаляли
раствор
коллагеназы,
трижды
отмывали
осадок
частично
диссоциированных тканей мозжечка раствором Тироде. Далее к осадку
добавляли раствор Тироде из расчета 1мл на 1 животное и диссоциировали
77
клетки с помощью пастеровской пипетки до получения опалесцирующей
суспензии. Полученную суспензию пропускали через фильтр с размером пор
60 мкм для удаления крупных фрагментов ткани, после чего в 1 мл суспензии
проводили подсчет клеток в камере Горяева, число которых не должно быть
меньше 106/мл.
Затем в выделенной суспензии нейронов индуцировали
окислительный стресс.
2.5.3. Окислительный стресс in vivo индуцировали с помощью острой
гипобарической гипоксии.
Острую гипобарическую гипоксию (ОГГ)
создавали в барокамере проточного типа для предотвращения
развития
эффекта гиперкапнии (Boldyrev A.А. et al., 1997). Опыты выполнены на 8месячных мышах линий SAMR1 (n=25) и SAMP1 (n=25), самцы: самки 50:50%, весом 25-30 г. Мышей из каждой линии делили на 2 группы по 1213 особей в каждой. Животным одной из групп за 1 час до гипоксического
воздействия
вводили
внутрибрюшинно
раствор
карнозинсодержащих
липосом (48 мг/кг массы тела), животным другой группы (контрольной) –
физиологический раствор.
2.5.4. Устойчивость мышей к гипоксии оценивали по стандартным
физиологическим характеристикам: времени до потери позы (ВПП, сек),
времени до остановки дыхания (время жизни - ВЖ, сек), времени от момента
перемещения животного в условия нормального атмосферного давления до
восстановления активной позы (время реституции (ВР, сек). На следующие
сутки после гипоксии животных декапитировали, извлекали мозг и
замораживали
его
в
жидком
азоте
до
проведения
биохимических
исследований.
2.5.5. Определение общей антиоксидантной активности в образцах
ткани мозга (10% экстракты в 0,15 М КС1, 15000 g-супернатант) проводили
по тушению стабильного радикала 2,2’-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ)
(Schlesier K. et al., 2002).
Для получения экстракта замороженную ткань мозга размораживали,
78
гомогенизировали
при
охлаждении
с
помощью
механического
гомогенизатора Поттера в 9 объемах холодного раствора КСl (0,15 М) в 3
приема: сначала фрагмент ткани гомогенизировали со скоростью 40 об/мин
без добавления экстрагирующего раствора до получения гомогенной массы,
затем в два приема добавляли раствор КСl - с первой порцией раствора
(примерно половина общего объема) гомогенизацию вели при скорости 40
об/мин, используя 15 возвратно-поступательных движений пробирки
гомогенизатора вдоль оси вращения пестика, затем добавляли остаток
раствора КСl и продолжали гомогенизацию в таком же режиме, но при
скорости 60 об/мин. Полученный гомогенат подвергали центрифугированию
на рефрижераторной центрифуге Heinz Janetzky K-24 в угловом роторе 12х10
мл со скоростью 12000 об/мин в течение 20 мин. Полученный супернатант
осторожно собирали и хранили на холоду до момента спектрометрического
исследования.
К 1,9 мл водно-спиртового раствора ДФПГ (50% этанола, 100 мкМ
ДФПГ) добавляли 100 мкл исследуемого экстракта мозга и через 20 мин
измеряли
на
спектрофотометре
spectrophotometer
(Amersham
Ultrospec
Biosciences,
3300
USA)
pro
суммарное
UV/Visible
снижение
поглощения при длине волны 519 нм. В качестве стандарта использовали
калибровочную кривую по Тролоксу, так называемый ТЕАС –Trolox
Equivalent of Antioxidant Capacity. Для построения калибровочной кривой к
1,9 мл раствора ДФПГ добавляли раствор тролокса концентрацией 0,5 мг/мл
в объемах 80, 60, 40, 20, 10 или 5 мкл и доводили общий объем пробы для
измерения до 2 мл водой. Измеряли суммарное снижение концентрации
ДФПГ также
за 30 мин. Для расчетов использовали величину удельной
оптической плотности для растворов ДФПГ, равную 9690 М-1,см-1.
2.6. Статистическая обработка результатов
Статистическая
обработка
результатов.
Полученные
результаты
представлены в виде M±m. Данные обрабатывали с использованием
79
программы “Statistica 6.0”. Для оценки достоверности обнаруженных
изменений применяли тесты Стьюдента и Манна-Уитни, достоверность
значений принималась при p < 0,05.
80
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Оценка защитного действия карнозина в составе нанолипосом в
условиях окислительного стресса in vitro и in vivo
3.1. Морфологическая характеристика клеточной культуры PC12,
дифференцированной дексаметазоном и фактором роста нервов
rHuNGF.
В работе использована культура клеток PC12 линии D4. Клетки
содержали в СО2 инкубаторе в присутствии 5% СО2, 98% влажности и 37˚С.
В экспериментах были использованы клетки различных пассажей. Согласно
протоколу, клетки за два дня до эксперимента переносили в голодающую
среду,
не
содержащую
дифференцирующих
сыворотку,
агентов
-
с
одновременным
rHuNGF
(NGF)
или
добавлением
дексаметазон.
Дексаметазон – один из факторов, способных дифференцровать клеки PC-12
по почечному типу, превращая их в обычные хромаффинные клетки. Эта
работа выполнена для сравнения с клетками, дифференцированными по
нейрональному типу (с добавлением NGF), на которых проводилась
дальнейшая работа. После двух суток культивирования клеток с NGF и
дексаметазоном, проводили различные эксперименты, протоколы которых
описанны в разделе «Материалы и Методы».
На рис. 3.1.представлен вид популяции клеток и интактном состоянии. В
культуре интактных клеток преобладают шарообразные клетки, некоторые из
которых имеют отростки, сопоставимые по длине с размером клеток.
Отростки не сужаются на дистальном конце, а имеют такой же диаметр, что
и на проксимальном конце. Одиночные или объединённые в группы клетки
хорошо прикреплены к дну пластикового флакона для культивирования.
81
Рис. 3.1. Клеточная культура PC-12 в интактном состоянии.
Фотографии получены на микроскопе Nikon Eclipse TS-100F.
Рис. 3.2. Культура PC-12, стимулированная дексаметазоном.
Изображение получено на микроскопе Nikon Eclipse TS-100F.
На рис. 3.2 представлен вид клеточной культуры РС-12 после
стимуляции дексаметазоном. Дексаметазон вносили в среду за 2 дня до
эксперимента
в
концентрации
20
нг/мл.
Клетки,
стимулированные
82
дексаметазоном
(рис.
3.2)
более
распластанные
(имеют
форму
многогранников) и крупнее, чем интактные клетки. Отростки этих клеток
отличные по форме от отростков интактных клеток.
Рис. 3.3. Клеточная культура PC-12, стимулированная фактором
роста нервов. Изображение получено на микроскопе Nikon Eclipse TS100F.
На рис. 3.3 представлена клеточная культура PC-12, стимулированная
rHu-NGFβ по нейрональному типу. rHu-NGFβ вносили в среду за 2 дня до
эксперимента в концентрации 0,1 нг/мл.
Клетки, стимулированные NGF (см. Рис. 3.3.) напоминают по форме
нейроны. У них есть «аксоны» и «дендриты», а также тело самой клетки
вытянутое и многогранное. Клетки этой культуры могут сплетаться в сети,
однако могут существовать и отдельно друг от друга. Этот тип клеток
приобретает видимые различия от интактных клеток уже через одни сутки.
Клетки, стимулированные дексаметазоном, дифференцируются в клетки
почечного типа только через двое суток: более тонкие и короткие. Эти клетки
83
склонны к адгезии, что выражается в том, что их очень сложно смыть с
чашки Петри для проведения эксперимента. Кроме того, их адгезивные
свойства
гораздо
более
ярко
выражены
чем
свойства
клеток,
стимулированных NGF и клеток интактной культуры. Мы не анализировали
кривые роста клеток, поскольку это не входило в задачу работы.
Из сравнения рис. 3.1, 3.2 и 3.3 видно, что интактные клетки отличаются
по морфологии от клеток, стимулированных дексаметазоном или фактором
роста нервов. Клетки, стимулированные дексаметазоном, в свою очередь
отличаются от клеток, стимулированных фактором роста нервов.
3.2. Анализ экспрессии NMDA рецепторов в клетках культуры PC12, активированных дексаметазоном или фактором роста нервов NGF.
NMDA рецепторы содержат несколько субъединиц. В настоящей главе
мы изучали наличие NR1-канальной субьединицы и NR2- регуляторной
субьединицы в культуре клеток РС12. При исследовании экспрессии NMDA
рецепторов под влиянием дексаметазона или NGF мы использовали
протоколы активации клеток, описанные в разделе «Материалы и Методы».
На рис. 4.3 представлены достоверные отличия в экспрессии NR1
субъединицы у интактных клеток и у клеток, стимулированных различными
химическими агентами. Данные для NR2 субъединицы также достоверно
отличаются.
Количество NR1 субьединиц вырастает приблизительно от
2% до 10% в случае клеток, стимулированных дексаметазоном и растет до
17% у клеток, стимулированных фактором роста нервов. NR2b субьединица
растёт от 1% до 5% и 14%
- соответственно. Подробные данные о
соотношении экспрессии субьединиц в клетках представлены в таблице 3.1.
Анализ полученных нами в эксперименте данных показывает, что NMDA
рецепторы экспрессируются в клетках феохромоцитомы как в интактном
состоянии, так и в стимулированном дексаметазоном или NGF. Также
84
полученные нами данные показывают, что экспрессия проходит по обеим
субъединицам - канальной и регуляторной, что важно. С точки зрения
функции данных рецепторов можно было предположить, что субъединицы
данных глутаматных рецепторов экспрессируются больше в нейронподобных клетках, т.к. преимущественно эти рецепторы присущи нервным
клеткам. Полученные данные подтверждают наше предположение о том, что
в NGF стмулированных клетках NMDA рецепторов достоверно больше, чем
в клетках, стимулированных дексаметазоном.
Рис. 3.4. Анализ экспрессии субъединиц NMDA рецепторов с помощью
специфических антител. По оси ординат - процент клеток метящихся
антителами «goat-antimouse» относительно всех клеток, присутствующих в
анализируемой прибором суспензии клеток. Знак * соответствует
статистически достоверному различию между контрольными и опытными
образцами. Статистический анализ проводился по критерию Манна Уитни.
Достоверным принималось значение при p < 0,05
Исходя
из
предположить,
данных,
что
представленных
количество
субъединиц
на
рисунке
NR1
и
3.4
можно
NR2b
растёт
пропорционально друг другу, однако данные представленные в таблице 3.1
опровергают эту гипотезу.
85
Таблица 3.1. Характеристика экспрессии субъединиц NMDA
рецепторов
Экспрессируемая
Интактные
PC-12+
субъединица
клетки PC-
дексаметазон
NMDA рецептора
12(I), %
II/I
50 μМ (II), %
PC-12+NGF (III), %
III/I
NR1
1,43± 0,4
7,1 10,02± 1,1 **
11,9 16,60± 1,1 **
NR2b
0,51± 0,09
9,6 4,80± 0,43 *
27,6 13,82± 1,2 *
Знак * соответствует статистически достоверному различию между
контрольными и опытными образцами. Статистический анализ проводился
по критерию Манна Уитни. Достоверным принималось значение при p < 0,05
Данные, представленные в таблице 3.1, показывают, что соотношение
субъединиц при активации клеточной интактной культуры РС-12 разными
дифференцирующими агентами отличается. Так, при активации клеток
дексаметазоном количество NR1 и NR2b возрастает пропорционально
исходному количеству данных субъединиц, присутствующих в интактной
культуре. Это отношение приблизительно равно 8. При активации клеток
NGF, канальная субъединица(NR1) экспрессируется в 12 раз больше, чем в
интактной культуре, а регуляторная (NR2b)- в 28 раз. Это свидетельствует о
том,
что
обязательной
безусловно
для
NR1-субъединица
формирования
NMDA-рецептора
канал-рецепторного
является
комплекса,
она
выполняет каналообразующую функцию. Но реализация функций рецептора
осуществляется с помощью NR2b субъединицы.
Таким образом, в интактных клетках PС-12 мы обнаружили канальную и
регуляторную субьединицы NMDA рецепторов, однако их количества
настолько малы, что возможность их работы минимальна. В клетках,
активированных фактором роста нервов содержится в 11,9 раз большее
86
количество NR1 субьединицы и в 27,6 раз большее количество NR2b
субьединицы. Однако, несмотря на то что количество субьединиц в нейронподобных клетках оказалось большим чем, в интактных клетках, нам
необходимо убедиться в том, что эти рецепторы функционально активны и
работают так же как в нейронах. Для этого мы сравним ответ нейронподобных клеток и интактных клеток на перекись водорода и специфический
агонист NMDA. А также посмотрим, каков будет ответ нейрон-подобных
клеток при блокаде рецепторов при помощи агониста- MK-801 и DAP-5 и
одновременном действии
NMDA. Результаты данных
экспериментов
представлены в следующей главе.
3.3. Индукция окислительного стресса различными химическими
агентами в недифференцированных и дифференцированных клетках
PC-12.
3.3.1. Индукция окислительного стресса при действии NMDA и Н2О2
В данном фрагменте работы мы моделировали окислительный стресс
двумя способами: с помощью специфического лиганда, активирующего
NMDA рецепторы и с помощью экзогенного источника активных форм
кислорода- пероксида водорода.
Далее
мы
неспецифического
анализировали
активатора
способность
развития
специфического
окислительного
и
стресса
стимулировать выброс АФК при помощи подсчёта количества клеток с
большей и меньшей флуоресценцией
флуоресценцию
субпопуляций
клеток,
DCF и сравнивали среднюю
находящихся
в
состоянии
окислительного стресса. Далее определяли, функциональны ли NMDAрецепторы в исследуемой культуре. В случае, если рецепторы не отвечают на
действие лиганда повышением уровня АФК, проверяли при помощи
действия пероксида водорода, способны ли клетки отвечать повышенной
87
продукцией активных форм кислорода на окислительный стресс, созданный
неспецифическим путём. Результаты представлены ниже.
3.3.1.1. Интактные клетки PC-12.
Анализ проводили для всех субпопуляций клеток, однако ниже
представлены только результаты, исключающие отсутствие ответа на
лиганды. Так, популяция интактных клеток РС-12 в координатах прямого
светорассеяния против бокового рассеяния выглядит следующим образом
(Рис. 3.5.):
Рис. 3.5. Вид популяции интактных клеток РС-12 в координатах
«Forward Scatter vs Side Scatter».
На Рис. 3.5 видно, что клетки можно разделить на две субпопуляции в
соответствии с их размерами и гранулярностью. С помощью анализа
субпопуляций было установлено, что в нижней части графика находятся
нежизнеспособные клетки. В координатах DCF vs PI они не окрашены DCF,
но положительно окрашены по пропидий йодиду. В дальнейшем мы
исключали нежизнеспособную часть популяции из анализа и сосредоточили
88
своё внимание на изучение популяции из области, обозначенной как R1(рис.
3.6).
Рис. 3.6. Вид популяции интактных клеток РС12 в координатах
Forward Scatter vs Side Scatter с гейтами, разделяющими анализируемые
клетки (R1) от клеток, вступивших в апопотоз (R2).
3.3.1.2. Интактные клетки PC12 в условиях окислительного
стресса.
При анализе распределения клеток из R1 в координатах «PI vs DCF»
оставшаяся часть клеток также разделяется на субпопуляции. Мертвые
клетки хорошо отделяются от суммарной популяции, концентрируясь в
области высоких флуоресценций PI, а живые клетки, плохо метящиеся
иодидом пропидия, могут условно быть разделены на две подгруппы – с
низкой и высокой флуоресценцией DCF (см. рис. 3.7). Это послужило
основанием
разбивки
графика
на
квадранты,
позволяющие
дифференцировать ответ на окислительный стресс не всей популяции, а
отдельных
групп
клеток.
При
этом
прибор
дает
количественную
характеристику каждой группы клеток в процентах (по углам квадрантов),
проанализировав которую мы получили результаты, представленные ниже
89
(см. рис. 3.7). Около 15% интактных клеток положительно окрашены DCF.
При добавлении к клеткам перекиси водорода количество интенсивно
окрашенных клеток возрастает в 4,5 раза и приблизительно равно 68%.
Очевидно, что пероксид водорода легко проникает через мембрану клеток и
активирует окислительный стресс внутри клетки. При действии NMDA
также происходит активация окислительного стресса, что подтверждает
наличие специфического рецепторного белка, принимающего сигнал.
Количество АФК возрастает до 23%. Доля мёртвых клеток после действия
NMDA (1 мM) и перекиси (5 мМ) составила 23%, 21% что сравнимо с
контролем - 24%.
А
Б
В
Рис. 3.7. Вид субпопуляции интактных клеток РС-12 из региона R1
(см. рис. 3.9), представленной в координатах «PI vs DCF». На рис.
представлены клетки PC-12 из региона R1 в координатах DCF-PI. Ось
абсцисс – флуоресценция DCF, ось ординат – флуоресценция PI. А - в
интактном состоянии, Б - при действии NMDA в концентрации 1 мM, В - при
действии H2O2 в концентрации 5 мМ.
Из рис. 3.7 видно, что клетки из нижнего левого квадранта (А) под
действием NMDA сдвигаются в область правого нижнего квадранта (Б), т.е в
область
с
большей
интенсивностью
флуоресценции
DCF,
что
свидетельствует о том, что в данных клетках под действием NMDA
повысился
уровень
АФК.
Следовательно,
в
клетках
присутствуют
90
функционально активные NMDA рецепторы и отвечают продукцией АФК на
действие специфического агониста.
Под действием 5мМ перекиси (рис. 3.7 В) клетки приобретают
усиленную окраску DCF, поскольку пероксид водорода проникает в клетку,
расщепляется до активных радикалов, которые вызывают свечение DCF.
Таким
образом,
интактная
культура
PC-12
отвечает
как
на
специфический, так и неспецифический окислительный стресс, вызванный
лигандами различной природы.
3.3.1.3. Влияние H2O2 и NMDA на рост АФК в клетках РС12,
дифференцированных по нейрональному типу.
В клетках, стимулированным фактором роста нервов определяли
уровень активных радикалов при действии перекиси водорода и NMDA.
Полученные данные представлены на рис.3.8, 3.9, 3.10 и 4.11, а также в
таблице 3.2.
А
Б
В
Рис. 3.8. Вид субпопуляции клеток РС-12, активированных NGF.
На рис в координатах «PI vs DCF» представлены клетки PC-12 из
региона R1, активированные NGF, контрольные (А), а также клетки
инкубированные с H2O2 5 мМ (Б) и NMDA 1мМ (В). Ось абсцисс –
флуоресценция DCF, ось ординат – флуоресценция PI.
91
На рис. 3.8 видно, что клетки разделяются на 3 различные
субпопуляции, которые, как выяснилось, по-разному отвечают на действие
лигандов.
Это
связано
с
тем,
что
не
все
клетки
подверглись
дифференцировке. Вероятно, те клетки, которые имеют полностью развитые
NMDA рецепторы находятся в правом нижнем квадранте и составляют
маленькую популяцию клеток, равную приблизительно 12% от общего
количества клеток. Мы обозначили её как R1. Оси квадрантов построены
таким образом, чтобы отделить популяцию, положительно окрашенную по
пропидию, от остальных субпопуляций. Изолированная субпопуляция
изменяет своё положение относительно вертикальной оси только при
действии перекиси водорода. Вероятно, как и в случае интактной культуры,
это является результатом того, что перекись проникает в повреждённые при
некрозе участки мембраны. В клетке она превращается в радикал (·ОН) и,
связываясь с DCF, вызывает свечение. Механизм образования активных
форм кислорода при действии NMDA носит более сложный характер,
который, возможно, не может реализоваться клеткой в условиях апоптоза.
Две другие субпопуляции клеток реагируют на лиганды иным образом.
Субпопуляция, представленная на рис. 3.8 А в правом нижнем квадранте,
отвечает на действие обоих лигандов (специфического и неспецифического)
увеличением уровня АФК- то есть развитием окислительного стресса.
Следует заметить, что при действии NMDA и пероксида водорода
данная субпопуляция также «смещается» по оси ординат, то есть по уровню
флуоресценции йодида пропидия. Это может значить, что в мембране клетки
появляются повреждения, в которые проникает флуорохром PI. Повреждения
эти возникают при действии индукторов окислительного стресса. Очевидно,
что концентрация их довольно высока, причем клетки искусственно
поддерживаемой интактной культуры PC-12 более резистентны к данным
концентрациям индукторов стресса, чем клетки, стимулированные NGF.
92
Клетки, находящиеся в левом нижнем квадранте, также реагируют на
добавление лигандов, но для более точных выводов нужно более детальное
изучение каждой субпопуляции, результаты приведены ниже.
На рисунке 3.9.представлены нейрон-подобные клетки, разделённые
гейтами. Субпопуляция, находящаяся вне гейтов не анализировалась, т.к. она
положительна окрашена по PI, то есть содержит некротические клетки.
Рис. 3.9. Вид популяции клеток РС-12, стимулированных NGF.
По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции DCF, по оси ординат PI. С гейтами гейтом R5 обозначена субпопуляция клеток, обладающая
низкой флуоресценцией DCF. Гейтом R3 обозначена субпопуляция клеток с
выокой флуоресценцией DCF.
Субпопуляции, находящиеся в гейтах R3 и R5, анализировались
отдельно друг от друга поскольку клетки по-разному реагировали на
добавление лигандов. Результаты представлены на рис. 3.10 и в таблице 3.2.
93
А
Б
В
Рис. 3.10. Распределение флуоресценции DCF в клетках
стимулированных NGF. На рис. 3.10 представлены клетки PC-12 из региона
R3 в координатах DCF от количества событий. А - в интактном состоянии, Б
- при действии H2O2 5 мМ, В - при действии 1 мМ NMDA.
Данные, представленные на рис. 3.10, показывают, что при добавлении
лигандов окислительного стресса, среднее значение флуоресценции DCF
увеличивается как в случае инкубации с перекисью водорода, так и в случае
инкубации с NMDA. Значения средней флуоресценции клеток из региона R5
представлены в виде таблицы.
Таблица
3.2.
Уровень
активных
форм
кислорода
клеток
анализируемых субпопуляций клеток РС-12 (отн. ед.)
Флуоресценция
Флуоресценция
клеток из
клеток из
региона R5
региона R3
Контроль
8,8±1,3
862,7±34,4
H2O2
18,2±5,2 *
1106,9±134,3 *
NMDA
9,6±5,6
1501,7±111,3 *
MK801
9,2±4,5
1378,8±98,9 *
DAP5
9,1±4,2
1210,2±102,1 *
94
Знак * соответствует статистически достоверному различию между
контрольными и опытными образцами. Статистический анализ проводился
по критерию Манна Уитни. Достоверным принималось значение при p <
0,05. Данные, представленные в таблице 3.2 показывают, что при действии
перекиси водорода в клетках из субпопуляции R5 наблюдается наибольшая
генерация АФК, примерно в 2 раза выше контрольных значений. В то же
время действие специфического лиганда NMDA рецепторов не вызывает
существенного роста АФК в этом регионе. Напротив, данные субпопуляции
из региона R3 показывают, что наибольший рост АФК наблюдается в
условиях активации клеток N-метил-D-аспартатом (в 1,8 раза выше
контрольных значений). Так как анализируемые клетки находились в
одинаковых условиях во время эксперимента, можно полагать, что
концентрация
действующих
Следовательно,
эти
на
клетки
субпопуляции
лигандов,
различаются
по
была
одинаковой.
физиологическим
параметрам. Возможно, в субпопуляции R3 есть сформированные и
функционирующие NMDA-рецепторы, а в популяции R5 данные рецепторы
не до конца встроились в мембрану или по каким-то причинам не способны
функционировать. Возможно, этим клеткам требуется дополнительное время
активации для того, чтобы экспрессировать больше функционирующих
рецепторов.
Следовательно, интактные и дифференцированные по нейрональному
пути клетки
PC-12 по-разному отвечают на действие специфических и
неспецифических индукторов окислительного стресса. Если пероксид
водорода вызывает стандартный ответ клеток, проявляющийся в виде
повышения уровня АФК и клеточной смерти, то NMDA влияет на клетки поразному. Очевидно, нейрон-подобные клетки, синтезировавшие NMDA
рецепторы за время инкубации с фактором роста нервов, отвечают более
выраженно. Подтверждением этого факта являются данные о том, что только
клетки
PC-12
дифференцированные
нейрональному
типу
проявляют
95
достоверный эффект снятия действия NMDA после воздействия агонистов
MK801 и DAP-5, средняя флуоресценция после действия антагонистов
составила приблизительно 1200 и 1300 относительных единиц при 1500
после действия NMDA и 800 отн.ед. в контроле, что свидетельствует о
«полноценности» синтезированных рецепторов и специфичности ответа на
NMDA.
В следующем разделе работы мы исследуем влияние гомоцистеиновой
кислоты на клетки PC-12, действие которой также опосредуется NMDA
рецепторами.
3.3.2. Влияние гомоцистеиновой кислоты на клетки PC-12
3.3.2.1.
Влияние
гомоцистеиновой
кислоты
на
развитие
окислительного стресса в недифференцированных клетках PC-12.
На рис. 3.11.изображено распределение уровня флуоресценции DCF.
Видно, что при инкубации клеток с ГЦК в течение 5 мин график имеет два
пика, больший и меньший.
Рис. 3.11. гистограмма распределения уровня флуоресценции клеток
под действием 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты в течение 5 минут
(закрашенный профиль) и через 60 минут (линия).
96
Меньший пик соответствует мелким клеткам, обломкам, а также он
суммируется с так называемым «шумом». Смысловую нагрузку несёт второй
большой пик. Если сравнить закрашенный высокий пик с незакрашенной
линией,
видно,
что
первый
заканчивается
примерно
на
значениях
флуоресценции равных 1000. Второй, который является показателем
значений флуоресценции клеток, инкубированных 1 час с гомоцистеиновой
кислотой, заканчивается приблизительно на значениях, равных 50 000.
Средние значения данного распределения указаны в таблице ниже, однако из
графика видно, что инкубация клеток в присутствии гомоцистеиновой
кислоты в течение одного часа значительно повышает флуоресценцию DCF
клеток, которая отражает уровень активных форм кислорода.
Обращаем внимание на высокий пик (рис. 3.12), находящийся в области
значений, равных 1000. Видно, что флуоресценция PI в данном случае
значительно выше у клеток, инкубировавшихся час с гомоцистеиновой
кислотой,
чем
у
той
популяции
клеток,
которая
содержалась
с
гомоцистеиновой кислотой в течение 5 минут.
Рис 3.12 уровень клеточной смерти в анализируемой популяции PC12 при действии 500мкМ гомоцистеиновой кислоты при инкубации в
течение 5 минут (закрашенный профиль) и в течение часа (линия)
97
Полученные данные свидетельствуют о том, что в популяции растёт
количество мёртвых клеток, обусловленное действием ГЦК. Данные по
другим временным интервалам представлены в таблице.
Таблица 3.3. Значения смертности и количества активных форм
кислорода в анализируемой популяции недифференцированных клеток
PC-12 при действии на них гомоцистеиновой кислоты в концентрации
500 мкМ.
Мин/средняя
флуоресценция
DCF
PI
0
251,5±12,6
595±29,8
5
266,5±13,3
649,6±32,5
15
280,1±10,0*
635,8±31,8
30
367,2±18,4*
751,5±37,6*
60
390,4±19,5*
621,4±31,1
Знак * соответствует статистически достоверному различию между
контрольными и опытными образцами. Статистический анализ проводился
по критерию Манна Уитни. Достоверным принималось значение при p <
0,05. В таблице приведены данные эксперимента, в котором клетки PC-12
инкубировались с гомоцистеиновой кислотой в концентрации 500мкМ и
различном времени инкубации. Во временном интервале 60 минут были
взяты точки измерения, соответствующие 0 времени инкубации принятые за
контрольные, далее в течение 5 минут, 15, 30 и 60 минут инкубации с ГЦК.
Значения в таблице приведены в относительных единицах флуоресценции
обоих флуорохромов. Из табл. видно, что флуоресценция DCF постепенно
нарастает
пропорционально
времени
инкубации
при
этом
достигая
максимального значения при 60 мин. Флуоресценция PI также нарастает,
достигая своего пика после 30 минут инкубации с ГЦК, а далее идёт на спад.
Такой эффект может быть связан с тем, что в течение 60 мин погибает
довольно
большое
количество
клеток,
а
так
как
флуоресценция,
98
представленная
в
таблице,
является
средним
арифметическим
всех
флуоресценций анализируемых клеток, то и общая флуоресценция клеток
становится немного ниже.
3.3.2.2. Влияние гомоцистеиновой кислоты на рост АФК в клетках
PC-12, дифференцированных по нейрональному типу.
Закрашенный профиль на гистограмме обозначает уровень DCF в
интактных клетках, чёрной линией обозначен уровень DCF клеток,
подвергшихся действию гомоцистеиновой кислоты. Очевидно,
что
гомоцистеиновая кислота увеличивает уровень АФК.
Рис.3.13. Флуоресценция DCF в дифференцированных клетках PC12 при действии гомоцистеиновой кислоты 500мМ и 60мин инкубации
99
Рис.3.14. Действие гомоцистеиновой кислоты и блокаторов NMDA
рецепторов на клетки PC-12 (500мкМ, 60 мин)
Чтобы
оценить
механизм
действия
ГЦК
на
клетки
PC-12,
дифференцированные по нейрональному типу, мы по очереди добавили
блокаторы NMDA рецепторов в пробу с гомоцистеиновой кислотой. DAP-5
является блокатором канальной субъединицы NMDA рецептора, в то время
как MK-801 является блокатором наружной части белка NMDAR. Уровень
флуоресценции
нейрон-подобных
клеток
PC-12
при
действии
гомоцистеиновой кислоты составляет 166,9 отн. ед., в то время как при
действии DAP-5 он снижается до 89,8 отн.ед.. В свою очередь MK-801
арестовывает действие гомоцистеиновой кислоты, значение которой после
действия этого блокатора составило всего 40,58 отн. ед. Таким образом, мы
можем утверждать, что действие гомоцистеиновой кислоты частично
опосредовано NMDA рецепторами.
В качестве сопоставительного примера был поставлен эксперимент, в
котором к пробе вместо ГЦК был добавлен пероксид водорода и блокатор
MK-801. Из рис.3.15. видно, что перекись водорода вызывает рост АФК в
клетках: контрольный уровень флуоресценции соответствует 10,8 отн. ед., в
то время как уровень флуоресценции при действии перекиси водорода
100
повышается до 230,2 отн.ед. Однако внесение в инкубационную среду
одновременно с перекисью водорода антагониста NMDA-рецепторов MK801 не смещает профиль распределения флуоресценции (не влияет на
уровень АФК в клетках), смещенное в сторону увеличения под действием
пероксида водорода. Это, в свою очередь подтверждает известный факт о
том, что механизм действия пероксида водорода никак не затрагивает
глутаматергическую систему клеток.
Рис. 3.15. Действие перекиси водорода на дифференцированные
клетки PC-12 в условиях взаимодействия с антагонистами NMDAрецепторов –500мкМ, 60мин
Таким образом, увеличение АФК и количества мёртвых клеток
наростает пропорционально времени инкубации клеток с ГЦК. Реакция
дифференцированных клеток на ГЦК специфична, действие ГЦК снимается
антагонистами NMDA рецепторов.
3.3.3. Влияние полиаминов на клетки PC-12
101
3.3.3.1.
Влияние
спермина,
спермидина
и
путресцина
на
недифференцированную клеточную культуру PC-12.
На рисунке 3.15 приведены результаты воздействия на клетки
полиаминов. По оси абсцисс отложены значения флуоресценции DCF
недифференцированных клеток PC-12.
Рис. 3.16. Гистограмма (histogramm) распределения флуоресценции
DCF в недифференцированных клетках PC-12 при воздействии Аспермина, В- спермидина, С- путресцина-500 мкМ.
На рис. 3.16 представлены гистограммы распределения флуоресценции
DCF контрольной популяции, инкубировавшейся в среде без добавления
реагентов и клеток, инкубированных с полиаминами. По оси ординат
откладывается количество событий с определённой флуоресценцией, по оси
абсцисс приведены значения самой флуоресценции DCF. Закрашенный
профиль – это профиль флуоресценции контрольной группы клеток. Черная
линия, наложенная поверх закрашенного профиля на рисунке А, обозначает
значения флуоресценции клеток, инкубированных со спермином, В спермидином, С - путресцином.
Профиль распределения флуоресценции полиаминов смещается вправо
по оси абсцисс, то есть к большим значениям флуоресценции, что
демонстрирует увеличение уровня активных форм кислорода под действием
полиаминов от 296 отн.ед. в контроле до 362, 448 и 338 при действии
спермина, спермидина и путресцина соответственно.
102
Рис.3.17. Гистограмма (histogramm) распределения флуоресценции
PI в недифференцированных клетках PC-12 при действии А- спермина,
В-спермидина, С- путресцина. -500мкМ, 60мин
На рис. 3.17 представлены гистограммы распределения флуоресценции
PI контрольной популяции, инкубировавшейся в среде без добавления
реагентов, и клеток, инкубированных с полиаминами. По оси ординат
откладывается количество событий с определённой флуоресценцией, по оси
абсцисс приведены значения самой флуоресценции PI. Закрашенный
профиль соответствует распределению флуоресценции PI контрольной
группы клеток. Черная линия, наложенная поверх закрашенного профиля на
рисунке А обозначает значения флуоресценции клеток, инкубированных со
спермином, В - спермидином, С- путресцином.
Из рис. видно, что профиль чёрной линии смешается вправо по оси, а
значит значения флуоресценции увеличиваются при действии спермина,
спермидина и путресцина Увеличение флуоресценции PI, в свою очередь
указывает, что полиамины увеличивают смертность клеток, которая в
контроле составила 27% мертвых клеток от всей популяции, а при действии
спермина, спермидина и путресцина -32%, 35% и 39% соответственно.
На рис.3.18 представлено влияние полиаминов в условиях их инкубации
с недифференцированными клетками РС12 в дозе 500мкМ в течение 60 мин.
Как видно из рис. 3.17 инкубация клеток со спермином приводит к росту
АФК на 22% относительно контроля, со спермидином – на 51% и с
путресцином- на 31%. При этом рост АФК сопровождается незначительным
103
увеличением гибели клеток: в присутствии спермина – на 6%, спермидина –
на 8% и
путресцина- на 12%. (рис. 3.19).
Таким образом, токсическое
действие полиаминов на недифференцированные клетки РС12 проявляется в
значительном повышении уровня АФК.
Рис.
3.18.
Влияние
полиаминов
на
рост
АФК
в
недифференцированных
клетках РС12.
Знак *
соответствует
статистически достоверному различию между контрольными и опытными
образцами. Статистический анализ проводился по критерию Манна Уитни.
Достоверным
принималось
значение
при
p<
0,05
104
Рис. 3.19. Влияние полиаминов на гибель недифференцированных
клеток РС12. Знак * соответствует статистически достоверному различию
между контрольными и опытными образцами. Статистический анализ
проводился по критерию Манна Уитни. Достоверным принималось значение
при p < 0,05
3.3.3.2. Влияние полиаминов на рост АФК и гибель клеток РС12,
дифференцированных по нейрональному типу.
Данные, представленные на рис. 3.20 свидетельствуют о том, что
полиамины в концентрации 500 мкМ, индуцируют рост АФК и способствуют
гибели клеток РС12.
Рис. 3.20. Точечная гистограмма (dot plot) распределения
флуоресценции PI vs DCF в клетках PC-12, дифференцированных
105
фактором роста нервов в контроле –A и при действии B- спермина , Cспермидина, D-путресцина. –500мкМ, 60мин
По оси абсцисс данного рисунка представлена флуоресценция DCF, по
оси ординат- флуоресценция PI. На рис. 3.20 А представлена контрольная
популяция.
Видно,
что
клетки,
выделенные
гейтом
обладают
флуоресценцией по обеим осям. Однако клетки, представленные на
рис.3.20.B-D обладают более интенсивной флуоресценцией клеток, что
свидетельствует о накоплении внутриклеточных зондов, показывающих
увеличение уровня активных форм кислорода и увеличение клеточной
гибели.
Рис.3.21. Гистограмма (histogramm) распределения флуоресценции
DCF в клетках PC-12, дифференцированных фактором роста нервов при
действии спермина- А, В- спермидина и С- путресцина.500мкМ 60 мин
На рис. 3.21 представлены гистограммы распределения флуоресценции
DCF контрольной популяции, инкубировавшейся в среде без добавления
реагентов и клеток, инкубированных с полиаминами. По оси ординат
откладывается количество событий с определённой флуоресценцией, по оси
абсцисс приведены значения самой флуоресценции DCF. Закрашенный
профиль – это профиль флуоресценции контрольной группы клеток.
Черная линия, наложенная поверх закрашенного профиля на рисунке А
обозначает значения флуоресценции клеток, инкубированных со спермином,
В- со спермидином, С-с путресцином.
106
Если на рис. 3.20 мы могли оценить общую картину увеличения уровня
АФК под действием полиаминов, то на рис.3.21 наглядно показано, как
смещается профиль распределения флуоресценции DCF вправо по оси
абсцисс, свидетельствующий об увеличении уровня
активных форм
кислорода под действием полиаминов. В контроле он составляет 120
относительных единиц флуоресценции, а при добавлении спермина,
спермидина и путресцина-150, 152 и 151 отн.ед. соответственно.
Рис.3.22. Гистограмма (histogramm) распределения флуоресценции
PI в клетках PC-12, дифференцированных фактором роста нервов. Аконтроль и спермин, В-контроль и спермидин, С-контроль и путресцин
(500мкМ, 60 мин)
На рис. 3.22 представлены гистограммы распределения флуоресценции
PI контрольной популяции, инкубировавшейся в среде без добавления
реагентов, и клеток, инкубированных с полиаминами. По оси ординат
откладывается количество событий с определённой флуоресценцией, по оси
абсцисс приведены значения самой флуоресценции PI. Закрашенный
профиль соответствует распределению флуоресценции PI контрольной
группы клеток.
Черная линия, наложенная поверх закрашенного профиля на рисунке А
обозначает значения флуоресценции клеток, инкубированных со спермином,
В- спермидином, С- путресцином.
На рис.3.23 представлено влияние полиаминов в условиях их инкубации
с дифференцированными клетками РС12 в концентрации 500мкМ, 60мин.
107
Как видно из рис. 3.23 инкубация клеток со спермином приводит к росту
АФК на 19% относительно контроля, со спермидином – на 20% и с
путресцином - на 19%. При этом рост АФК сопровождается незначительным
увеличением гибели клеток: в присутствии спермина – на 6%, спермидина –
на 7% и
путресцина- на 7%. (рис. 3.24).
Следовательно, токсическое
действие полиаминов на дифференцированные клетки РС12 проявляется в
повышении уровня АФК.
Рис.
3.23.
Влияние
полиаминов
на
рост
АФК
в
дифференцированных клетках РС12. Знак * соответствует статистически
достоверному различию между контрольными и опытными образцами.
Статистический анализ проводился по критерию Манна Уитни. Достоверным
принималось значение при p < 0,05.
Контрольный уровень флуоресценции DCF принимается за 100%. При
действии полиаминов- спермина, спермидина и путресцина уровень
флуоресценции увеличивается до 119%, 220% и 119% соответственно.
108
Рис. 3.24. Влияние полиаминов на смертность дифференцированных
клетках РС12. Знак * соответствует статистически достоверному различию
между контрольными и опытными образцами. Статистический анализ
проводился по критерию Манна Уитни. Достоверным принималось значение
при p < 0,05.
Контрольное значение смертности клеток составляет 10% от всей
популяции. При действии полиаминов оно увеличивается до 15%, 17% и 18%
соответственно.
Таким образом, мы видим, что при действии спермина, спермидина и
путресцина уровень АФК увеличивается как в недифференцированных, так и
в дифференцированных клетках РС12, что сопровождается незначительным
повышением их смертности. Причем, рост АФК под действием полиаминов
более выражен в недифференцированных клетках РС12.
3.3.4.Токсическое действие акролеина на клетки РС-12 в
зависимости от его дозы и времени инкубации
3.3.4.1. Влияние акролеина на рост АФК.
При инкубации клеток в присутствии 10 мкМ акролеина в течение 1 ч, 3
ч
и
24
ч
отмечался
значительный,
постепенный
рост
АФК,
пропорциональный времени инкубации: в 1,7 раза, 3 раза и 15,2 раза –
соответственно, относительно интактных клеток. Инкубация клеток в
присутствии 100 мкМ акролеина в течение 1 ч, 3 ч и 24 ч также выявила
109
временную зависимость, однако в этих условиях наблюдалось более резкое
увеличение АФК по сравнению с контролем: в 4,2 раза, 13,4 и 15, 3 раза –
соответственно (см. рис. 3.25 и 3.26).
Рис. 3.25. Дозозависимое влияние акролеина на рост АФК в
клетках РС-12. Клетки PC-12 (1-интактные), инкубированные с
акролеином в концентрации 10мкМ (2) и 100 мкМ (3) Время инкубации
с агентом составило 1 час. По оси абсцисс обозначены средние значения
флуоресценции DCF в популяции исследуемых клеток, измеряемые в
канале FL-1 проточного цитометра. По оси ординат - высота пика
распределения флуоресценции измеряемых клеток.
Рис. 3.26. Продукция АФК при действии акролеина в концентрации
100 мкМ в течение 1 час (1), 3 час (2) и 24 час (3).
110
3.3.4.2. Влияние акролеина на гибель клеток РС-12. При воздействии
акролеина в концентрации 10 мкМ на клетки в течение 1 ч, 3 ч и 24 ч
происходило увеличение количества мертвых клеток в 1,6, в 4,2 и в 7 раз –
соответственно
относительно
интактных
клеток.
С
увеличением
концентрации акролеина до 100 мкМ в аналогичных временных условиях
отмечалось более выраженное увеличение числа мертвых клеток - в 6; 6,8 раз
и в 8,7 раз. При этом максимальная гибель клеток (до 90%) отмечалась в
условиях воздействия 100 мкМ акролеина в течение 24 ч (см. рис. 3.27).
Рис. 3.27. Гибель клеток при действии акролеина в концентрации
10 мкМ (слева) и 100мкМ (справа) в течение часа (1), трех часов (2) и 24
часов (3)
Таким образом, токсичность акролеина в отношении клеток РС-12
проявляется
в увеличении
уровня АФК и
числа мертвых клеток
пропорционально повышению концентрации акролеина и времени его
воздействия на клетки. Следует отметить, что выраженная токсичность
акролеина в концентрации 100 мкМ выявляется уже после его часовой
инкубации и превосходит в 2,5 раза действие акролеина в концентрации 10
мкМ в эти сроки (рис. 3.28). Полученные данные указывают на то, что
акролеин является фактором, запускающим развитие окислительного
стресса, как это было показано в литературе (Lou J. et al., 2005).
111
Рис. 3.28. Дозозависимое влияние акролеина на гибель клеток РС12. Клетки PC-12 до инкубации (1), инкубированные с акролеином в
концентрации 10мкМ (2) и 100 мкМ (3). Время инкубации с агентом
составило 1 час. По оси абсцисс обозначены средние значения
флуоресценции PI в популяции исследуемых клеток, измеряемые в
канале FL-3 проточного цитометра. По оси ординат - высота пика
распределения флуоресценции измеряемых клеток.
3.3.4.3. Влияние акролеина на морфологические изменения клеток
РС-12. Анализ морфологического состояния клеток РС-12 указывает на то,
что под действием акролеина в концентрации 100 мкМ (рис. 3.29)
происходило уменьшение размеров клеток и снижение их гранулярности,
особенно значимое в условиях 24 ч инкубации. В целом представленные
данные свидетельствуют о том, что подобные морфологические изменения
являются типичными для гибели клеток по пути некроза.
112
Рис. 3.29. Изменение морфологических признаков клеток при
действии акролеина в концентрации 100 мкМ (справа) в течение 24 ч.
График представлен в виде точечной гистограммы в координатах
прямого и бокового светорассеяния.
3.4. Защитное действие карнозина на клетки PC-12, в условиях
окислительного стресса, индуцированного акролеином.
В наших исследованиях по оценке влияния карнозина на уровень АФК и
гибель клеток РС-12, подвергшихся окислительному стрессу под действием
акролеина, были предприняты два экспериментальных подхода. В одном
случае карнозин вводился в культуру клеток до воздействия акролеина, в
другом – карнозин добавляли после инкубации клеток с акролеином в
течение 1,3 и 24 час.
3.4.1. Защитное влияние карнозина на рост АФК.
Предварительное введение карнозина в инкубационную среду до
акролеина, независимо от его концентрации, способствовало снижению
роста АФК, наиболее значимому после 24 ч инкубации: карнозин примерно в
5 раз снижал рост АФК, индуцированный до 10 мкМ акролеина и примерно в
2 раза снижал рост АФК, индуцированный 100 мкМ акролеина (рис. 3.30).
Эффект от внесения карнозина в инкубационную среду после действия
акролеина зависел от дозы акролеина: так при концентрации акролеина
10мкМ в среде карнозин способствовал значительному (в 2 раза)
предотвращению роста АФК, регистрируемых в течение 24 часов (см. рис.
3.30.А). Также прослеживалась тенденция к снижению АФК в течение трёх
первых часов инкубации с акролеином, однако эффект не столь выражен,
поскольку уровень АФК при действии акролеина 10 мкМ в течение 1 и 3х
час инкубации возрастал незначительно.
В то время как при концентрации акролеина 100 мкМ защитное
действие карнозина проявлялось в условиях 3х часовой инкубации с
акролеином(снижение роста АФК в 1,8 раза). Введение карнозина после
113
инкубации клеток в течение 24 часов с акролеином 100 мкМ не
предотвращало рост АФК и тем самым не оказывало защитного действия на
клетки РС12 (см. рис. 3.30.В).
Рис. 3.30. Влияние различных сочетаний введения карнозина и
акролеина на флуоресценцию активных форм кислорода (A – акролеин
10 мкМ, B- акролеин в концентрации 100мкМ) на флуоресценцию DCF
клеток PC-12. -контроль,
-акролеин,
- последующее действие
карнозина на фоне акролеина, - предварительное действие карнозина
на фоне акролеина.
Таким образом, наиболее выраженный защитный эффект карнозина в
отношении предотвращения роста АФК выявлялся в условиях его
предварительного введения до акролеина. Введение карнозина после
инкубации клеток с акролеином оказалось менее эффективным, однако
прослеживался его позитивный эффект в условиях 24 ч инкубации в
присутствии 10 мкМ акролеина, а также после 3 ч инкубации с акролеином
100 мкМ.
114
Рис. 3.31. Влияние различных сочетаний введения карнозина и
акролеина на смертность клеток PC-12 (A – акролеин 10 мкМ, Bакролеин в концентрации 100мкМ) на флуоресценцию DCF клеток PC12. -контроль,
-акролеин,
- последующее действие карнозина на
фоне акролеина,
- предварительное действие карнозинана фоне
акролеина.
3.4.2. Защитное влияние карнозина на гибель клеток.
Карнозин в условиях его предварительного введения предотвращал
гибель
клеток,
индуцированную
акролеином
независимо
от
его
концентрации и сроков инкубации: в условиях инкубации с 10 мкМ
акролеина карнозин в 1,8-2 раза снижал гибель клеток в условиях 3 час и 24
час. инкубации (см. рис. 3.31.А); в условиях инкубации с 100 мкМ акролеина
карнозин также снижал гибель клеток в 1,7 – 2,6 – 1,5 раза в условиях
инкубации в течение 1-3-24 час – соответственно (см. рис. 3.31.В)
В то время как защитное действие карнозина, вводимого после 10 мкМ
акролеина оказалось наиболее выраженным при 24 часовом воздействии (в
1,3
раза).
Токсическое
действие
100
мкМ
акролеина
достоверно
предотвращалось карнозином только при 1 часовой инкубации, в этих
115
условиях карнозин снижал гибель клеток в 1,7 раза. Во всех остальных
случаях, по-видимому, можно говорить только о тенденции к снижению
количества мертвых клеток при последующем (после 100мкМ акролеина)
воздействии карнозина.
Таким образом, в данной работе впервые выявлено защитное действие
карнозина на акролеин - индуцированную гибель клеток культуры РС-12 и
рост
АФК,
эффективность которого
определялась
токсичной
дозой
акролеина, времени инкубации в его присутствии, а также способа введения
карнозина. Результаты проведенного исследования являются убедительным
доказательством возможности использования клетки РС 12 как тест –
системы
для
оценки
токсичности
альдегида
акролеина,
а
также
протекторного действия антиоксидантов.
3.5. Защитное действие карнозина на клетки PC-12,
дифференцированные по нейрональному типу
В настоящей главе представлены результаты оценки антиоксидантной
способности карнозина в составе нанолипосом на клетки культуры PC-12,
дифференцированные по нейрональному типу в условиях окислительного
стресса.
3.5.1.
Исследование
влияния
карнозина
на
клетки
РС12,
инкубированные с перекисью водорода.
На рис. 3.32 показана величина флуоресценции клеток из региона R3,
отражающая уровень АФК. Инкубация клеток с 5 мМ перекиси водорода
приводит к значительному (в 2 раза) повышению уровня АФК. Карнозин
способствует снижению уровня АФК относительно клеток, инкубированных
с перекисью водорода, однако
остается повышенным относительно
контрольных значений.
116
Рис. 3.32. Действие 1мМ карнозина на клетки РС12,
стимулированные NGF в условиях неспецифического окислительного
стресса, индуцированного 5 мМ Н2О2 из региона R3. * -достоверность
отличий от контроля. * * - достоверность отличий от группы с Н2О2
p<0,05
На рис. 3.33 представлены величины флуоресценций DCF в клетках
культуры
PC-12,
находящихся
в
условиях
окислительного
стресса,
вызванного специфическим индуктором – NMDA (1 мМ).
Рис. 3.33. Действие карнозина на клетки РС12, стимулированные
NGF в условиях специфического окислительного стресса 1 мМ NMDA. *достоверность отличий от контроля. **- достоверность отличий от
группы с NMDA, p<0,05
Инкубация нейрон-подобных клеток с 1 мМ NMDA приводит к
заничельному повышению уровня АФК относительно контроля (в 3 раза);
при этом введение карнозина вместе с NMDA препятствует росту АФК до
уровня контрольных значений.
117
Таким образом, нейрон-подобные клетки из региона R3 отвечают на
действие как неспецифического (перекись водорода), так и специфического
(NMDA) индуктора ОС. При этом эффективность карнозина в отношении
препятствия росту АФК в этом регионе более выражена в условиях
индукции ОС NMDA.
3.5.2. Влияние карнозина на дифференцированные клетки PC-12 в
условиях окислительного стресса, индуцированного гомоцистеиновой
кислотой.
Инкубация клеток с 500 мкМ
ГЦК в течение 1 час приводит к
повышению уровня АФК относительно интактных клеток (см. раздел 3.3.2.)
на 30% относительно уровня АФК в интактных клетках (принятого за 100%).
Рис.3.34. Карнозин снижает уровень АФК при действии ГЦК на клетки
PC12, дифференцированные по нейрональному типу
Инкубация клеток в аналогичных условиях в присутствии 1мМ
карнозина приводит к снижению уровня АФК на 40% относительно уровня
АФК в интактных клетках (принятого за 100%) и на 70% относительно
уровня АФК в клетках, инкубированных только с ГЦК (рис.3.34). Инкубация
с карнозином снижает уровень АФК на 70%.
118
3.5.3.Оценка антиоксидантной активности карнозина в составе
нанолипосом.
Повысить эффективность действия карнозина и защитить его от
действия карнозиназ можно путем загрузки его в нанолипосомальную
конструкцию.
Нанолипосомы,
встраиваясь
в
мембрану
клетки,
высвобождают карнозин непосредственно внутрь клетки.
Рис.3.35.Точечная гистограмма распределения контрольных (А)
клеток PC-12, дифференцированных фактором роста нервов в
координатах прямого и бокового светорассеивания а также клеток,
инкубированных в среде содержащей нанолипосомы с карнозином (В).
(А-medium, В-medium plus nanoliposomes containing carnosine).
По оси абсцисс откладывается боковое светорассеяние (Side scatter),
которое является показателем гранулярности клеток. По оси ординат
представлено прямое светорассеяние (foreword scatter), указывающее на
размер изучаемых частиц.
На рисунке 3.35 представлена популяция нейрон-подобных клеток в
координатах Fcs vs Scc. Внизу, ближе к левому углу (см. рис.3.35 А)
расположены мелкие клетки и обломки клеток. Ближе к правому верхнему
углу видна дополнительная популяция клеток, обладающая высокой
гранулярностью и маленькими размерами (см. рис. 3.35 B). Очевидно, что это
119
нанолипосомы, содержащие карнозин. Нанолипосомы добавлялись к клеткам
в избытке, поэтому не все нанолипосомы встроились в клетки. При этом
концентрация карнозина в липосоме составила – 450 мМ, в жидкости - 50мМ
и конечная концентрация карнозина в пробе составила 1 мМ.
3.6. Защитное действие карнозина в составе нанолипосом на
дифференцированные клетки РС12 в условиях ОС, индуцированного
полиаминами.
3.6.1. Влияние карнозина
и нанокарнозина, включенного в состав
нанолипосом на уровень АФК клеток РС12, при инкубации их с
полиаминами.
Индукция
путресцина)
ОС полиаминами
(500мкМ
спермина,
спермидина и
в течение 60 мин приводит к одинаковому достоверному
повышению уровня АФК (на 20 % относительно флуоресценции интактной
культуры клеток) (см рис 3.36). Предварительное внесение в инкубационную
среду (за 60 мин), содержащую полиамины, карнозина снижает рост АФК на
30% относительно проб, содержащих только полиамины; еще более
эффективно действует карнозин, ключенный в состав нанолипосом – он
снижает уровень АФК приблизительно на 55%. Видна небольшая (на 25%),
но достоверная разница во влиянии на клетки карнозина и нанокарнозина,
которая лучше всего проявляется в случае с путресцином.
В
качестве
контроля
была
использована
популяция
клеток,
инкубировавшаяся в среде с добавлением пустых, не содержащих карнозин,
нанолипосом. Флуоресценция этой группы клеток не отличается от
популяции клеток, инкубировавшихся в среде без добавления как-либо
реактивов. Достоверно не отличается от контроля флуоресценция клеток,
инкубированная в среде, содержащей карнозин в течение 1ч. В отличие от
этих данных, внесение в популяцию клеток карнозин-содержащих липосом
120
приводит к достоверному снижению
в них
уровня АФК - на 40%
относительно контроля и популяции карнозин-содержащих клеток.
Рис. 3.36. Флуоресценция активных форм кислорода при воздействии
карнозина и карнозин содержащих нанолипосом на клетки PC-12,
дифференцированные фактором роста нервов при инкубации с
биогенными аминами (спермин, спермидин, путресцин). По оси ординат
отложены значения флуоресценции DCF в процентах. Med- (medium) среда,
nl-(nanoliposomes) пустые не содержащие карнозин нанолипосомы, carn(carnosine), nlcc-(nanoliposomes containing carnosine) нанолипосомы
содержащие карнозин, sp-(spermine) спермин, sd-(spermidine) спермидин, pc(putrescine) путресцин.
- полиамины, - карнозин, -нанолипосомы, В
качестве контроля использовали пробы с липосомами, не содержащими
карнозин. *-достоверность различий от контроля, **-достоверность
различий между действием полиаминов и действием ПА на фоне карнозина,
***-достоверность различий между карнозином и нанокарнозином.
Статистическая обработка проводилась по тесту Манна- Уитни.
Достоверными принимались значения при p<0,05
3.6.2. Влияние карнозина
и нанокарнозина, включенного в состав
нанолипосом на гибель клеток РС12, индуцированную полиаминами.
Смертность клеток
в условиях токсического действия полиаминов
(спермина, спермидина и путресцина) увеличивается на 50 % относительно
контроля.
Предварительное
(за
60
мин)
внесение
карнозина
в
инкубационную среду, содержащую полиамины приводит к небольшому
121
снижению гибели клеток - на 2-4 % в абсолютных процентах шкалы (с 16%
до 14%- в случае со спермином, с 17% до 13% при инкубации со
спермидином и с18 % до 15% в случае с путресцином); в то же время
добавление карнозина в составе
нанолипосом в значительной степени
защищает клетки от гибели: смертность клеток в пробе падает до уровня,
сопоставимого с уровнем смертности клеток в пробах, содержащих только
нанолипосомы с карнозином.
Рис. 3.37. Уровень смертности дифференцированных фактором
роста нервов NGF клеток PC-12 при окислительном стрессе,
инициированном полиаминами и действии карнозина и нанокарнозина.
Med- (medium) среда, nl-(nanoliposomes) пустые не содержащие карнозин
нанолипосомы, carn-(carnosine), nlcc-(nanoliposomes containing carnosine)
нанолипосомы содержащие карнозин, sp-(spermine) спермин, sd-(spermidine)
спермидин, pc-(putrescine) путресцин.
- полиамины, -карнозин,
нанолипосомы. Значения смертности клеток в разных условиях, выражены в
процентах.(500мкМ, 60мин). Статистическая обработка проводилась по
тесту Манна- Уитни. Достоверными принимались значения при p<0,05
Как видно из рис. 3.37 гибель клеток в контроле составляет 10 % от
общей доли измеренных клеток. «Пустые» липосомы, не содержащие
карнозина не изменяют эти значения. Внесение карнозина в интактную
культуру снижает смертность клеток на 30% при инкубации в течение 1 ч.; в
этих же условиях карнозин, включенный в состав нанолипосом снижает
этот показатель на 50 % относительно контроля.
122
Таким образом, мы показали, что полиамины в концентрации 500 мкМ
активируют
процессы
окислительного
стресса
в
клетках
PC-12,
дифференцированных фактором роста нервов, что приводит к росту
активных форм кислорода и увеличению гибели клеток. «Пустые»
нанолипосомы не влияют как на уровень АФК, так и на гибель клеток. При
этом
эффективность
нанолипосом
действия
карнозина,
включенного
в
состав
на защиту клеток от роста АФК сопоставима с действием
карнозина. Выявляется явное преимущество карнозина, включенного в
состав
нанолипосом в отношении предохранения клеток от гибели -
смертность клеток, обусловленная его действием, оказалась на 60% ниже
относительно самого карнозина.
3.7. Защитное действие нанолипосомальных структур, содержащих
карнозин на нейроны головного мозга мышей линии SAMP1/SAMR1 в
условиях окислительного стресса
3.7.1.Окислительный стресс in vitro cоздавали инкубацией суспензии
выделенных гранулярных клеток мозжечка мышей линии SAMR1
с
пероксидом водорода в присутствии и в отсутствие карнозин содержащих
нанолипосом (КСЛ). Конечная концентрация карнозина, внесенного в
составе КСЛ в суспензию нейрональных клеток, составляла 2,65 мМ.
Таблица 3.5. Уровень АФК в гранулярных клетках мозжечка
мышей линии SAMR1 в условиях инкубации с КСЛ и нанолипосомами
Уровень АФК
Среднее значение
флуоресценции
DCF (отн.ед.)
Контрольные
клетки
15,6 ±0,7
Клетки после
инкубации с
«пустыми»
нанолипосомами
14,0±0,5
Клетки после
инкубации с КСЛ
10,0±0,4 ⃰
(*) - p<0,05 по отношению к контролю (интактные гранулярные
клетки, t-критерий Стъюдента)
123
Используемые в экспериментах in vitro гранулярные клетки мозжечка
характеризовались уровнем флуоресценции DCF (15,6 ±0,7 отн. ед.),
соответствующим стационарному уровню активных форм кислорода (АФК).
Инкубация
клеток
нанолипосомами
не
с
«пустыми»
оказывала
(не
нагруженными
существенного
влияния
карнозином)
на
уровень
флуоресценции (14.0±0,5 отн. ед., рис.3.30Б). В этих же условиях КСЛ
отчетливо снижали уровень АФК (до 10±0,4 отн. ед., рис.3.30В), что
указывает на их антиоксидантную активность (рис. 3.38).
Рис. 3.38. Влияние карнозинсодержащих нанолипосом на
стационарный уровень АФК в изолированных гранулярных клетках
мозжечка мышей SAMR1. А – интактные гранулярные клетки, Б –
клетки после инкубации с нанолипосомами, В – то же с КСЛ–. (*) p<0,05 по отношению к контролю, t-критерий Стъюдента)
Для
оценки
суспензии клеток
антиоксидантной
активности
нанолипосом
мозжечка мышей SAMR1 индуцировали
ОС
в
под
действием перекиси водорода (Рис. 3.39) Уровень АФК при инкубации
нейронов в течение 30 мин с 3,5 мМ Н2О2 увеличивался примерно в 3 раза
(до 297,65%) относительно контроля, принятого за 100% (рис. 3.39А).
124
Внесение
в
инкубационную
среду
за
30
мин
до
индукции
ОС
карнозинсодержащих нанолипосом (до конечной концентрации 2,65 мМ
карнозина) подавляло рост АФК, уровень которых (95,2%) был при этом
сопоставим с контролем (рис. 2Б). При этом также снижалась и смертность
нейронов: в популяции клеток, содержащихся в среде с пероксидом
водорода, эта величина составляла 21,2±3,0%, а в присутствии КСЛ она не
превышала 15,4±2,9%.
Рис. 3.39. Индукция окислительного стресса в выделенных клетках
мозжечка мышей SAMR1 пероксидом водорода (3.5 мМ, 30 мин) в
отсутствие (А) и в присутствии карнозинсодержащих нанолипосом (Б).
Серый фон – интактные клетки, черная линия – после инкубации с Н202:
по оси ординат – количество клеток, по оси абсцисс – относительные
единицы флуоресценции АФК
Таким образом, нанолипосомы, содержащие карнозин, эффективно
снижают накопление АФК в суспензии нейрональных клеток. «Пустые»
нанолипосомы в условиях окислительного стресса не препятствовали
накоплению внутриклеточных радикалов и гибели клеток.
3.7.2. Окислительный стресс in vivo индуцировали с помощью острой
гипобарической гипоксии у мышей линии SAMP1.
На рис. 3.40 и в табл. представлены результаты экспериментов по
оценке влияния КСЛ на устойчивость мышей к гипоксии. Видно, что время
125
до потери позы (ВПП) у контрольных животных линии SAMR1(34,92±9,6
сек.) почти вдвое превышает этот показатель у животных линии SAMP1 с
ускоренным темпом старения (18.83±7.59сек.); время жизни на высоте в
условиях гипоксии до остановки дыхания (ВЖ) у мышей контрольной линии
также больше (70,77±24,01 сек.), чем у мышей SAMP1 (52.0±14.7 сек).
Напротив, время реституции – восстановление активной позы от момента
перемещения животного в условия нормального атмосферного давления (ВР)
у быстро стареющих мышей SAMP1 (92.92±35.77 сек.) выше, чем у
контрольной линии – SAMR1 (68,36±21,65 сек). Введение мышам
линии SAMR1 препарата нанолипосом, нагруженных карнозином, перед
гипоксическим воздействием достоверно повышало ВПП (47,77±18,75 сек) и
ВЖ (93,62±25.81 сек) и уменьшало ВР (49,0± 16,03 сек) – (см. рис. 3.40 А). В
отличие от мышей линии SAMR1 введение КСЛ мышам линии SAMP1
улучшало только один показатель – ВР (67.17±23.29 сек) (см. рис. 3.40Б).
Рис. 3.40. Влияние КСЛ на устойчивость мышей линии SAMR1 (А) и
SAMP1 (Б) к воздействию острой гипобарической гипоксии
(карнозинсодержащие нанолипосомы вводили за 1 ч до гипоксии) (*) p<0,05 по отношению к контролю
Еще одним информативным показателем оценки эффективности
антигипоксического действия КСЛ может быть отношение времени
реституции (ВР) к времени жизни на высоте (ВЖ). В условиях ОГГ без
126
введения КСЛ у мышей
контрольной линии SAMR1 составил 0,96; у
быстростареющих (SAMP1) - 1,79. В то же время на фоне применения КСЛ
значения этого параметра составили 0,52 и 1,23 - соответственно. Исходя из
полученных данных, можно полагать, что этот параметр характеризует
повышение адаптационных возможностей организма под действием КСЛ в
условиях ОГГ.
Таблица 3.4. Устойчивость мышей SAM к гипоксии
Условия
эксперимента
Потеря
позы (сек)
Остановка
дыхания
Реституция
ОГГ без
34,9±9.6
70.8±24,0
68.4±21,6
введения КСН
SAMR1
ОГГ на фоне
47,8±18.7* 93.6±25,8*
49.0±16,0*
КСН
ОГГ без
18,8±7.6
52.0±14,7
92.9±35,8
введения КСН
SAMP1
ОГГ на фоне
19±6,0
55.2±14,4
67.2±23,3*
КСН
(*) р<0.05 по отношению к животным, подвергнутых действию ОГГ
без введения КСН
Для оценки влияния нанолипосом, содержащих L-карнозин, на
общую антиоксидантную активность в ткани мозга измеряли суммарное
восстановление радикала ДФПГ. Введение КСЛ приводило к повышению
суммарной антиоксидантной активности в мозге мышей обеих линий. При
этом у мышей с нормальным темпом старения (SAMR1) отмечалось более
выраженное антиоксидантное действие нанолипосомального карнозина (см.
табл.3.5),
что
соответствует
лучшим
показателям
устойчивости
к
гипоксическому воздействию, характерным для этой линии животных (см.
рис. 3.40).
Табл. 3.5. Влияние карнозинсодержащих нанолипосом (введение за 1
час до ОГГ в дозе 48 мг/кг массы тела) на суммарную антиоксидантную
127
активность экстрактов из ткани
восстановлению ДФПГ-радикала.
Линейные
мыши
мозга,
определяемую
по
Восстановление ДФПГ, мкмоль/г ткани
ОГГ
SAMR1
SAMP1
ОГГ на фоне введения нанолипосом,
нагруженных карнозином
6,3 ± 1,1*
5,3 ± 0,48
5,1 ± 1,0
4,6 ± 0,74
Примечание: (*) р<0,05 по отношению к животным, подвергнутым
действию ОГГ без введения нанолипосом, нагруженных карнозином (Uкритерий Манна-Уитни).
Таким
образом,
характеризующихся
в
опытах in vitro и in vivo
ускоренным
темпом
старения
у
(SAMP1)
контрольной линии (SAMR1), в условиях окислительного стресса
мышей,
и
их
впервые
была выявлена антиоксидантная активность нанолипосом, содержащих
карнозин. В опытах In vitro в суспензии нейрональных клеток, выделенных
из мозжечка мышей линии SAMP1/SAMR1 КСЛ подавляли образование
активных форм кислорода и препятствовали их гибели в условиях индукции
окислительного стресса перексидом водорода. При этом механизмы защиты
нейронов
от
ОС,
обусловленные
действием
КСЛ
сопоставимы
со
свободным L- карнозином. С другой стороны, в опытах in vivo в условиях
воздействия
на
мозг
окислительного
стресса,
вызванного
острой
гипобарической гипоксией, были получены данные, указывающие на
способность КСЛ защищать мозг от гипоксии. Профилактическое введение
этого
препарата
показателей
мышам
устойчивости
приводило
мозга
к
к
улучшению
гипоксическому
физиологических
воздействию
и
повышению его суммарной антиоксидантной активности, более выраженным
у мышей с нормальным темпом старения (SAMR1). Следует отметить, что
эффективность L-карнозина, вводимого мышам в составе нанолипосом в дозе
48 мг/кг, сопоставима с действием L-карнозина, вводимого крысам линии
Wistar в дозе 100 мг/кг до воздействия ОГГ. Таким образом, полученные
результаты как в экспериментах in vitro, так и in vivo указывают на высокую
128
антиоксидантную и нейропротекторную активность КСЛ, превышающую
аналогичные эффекты карнозина. Поскольку карнозин как природное
активно метаболизирующее соединение имеет ограниченное время жизни в
организме,
подвергаясь
расщеплению
специфическим
ферментом
карнозиназой, можно полагать, что нанопрепарат, созданный на его основе
будет иметь большую длительность антиоксидантной активности за счет
увеличения времени жизни в организме, что может обеспечить повышение
эффективности его действия. В целом, нанопрепарат L-карнозина может
рассматриваться
как
перспективная
наноконструкция,
обладающая
антигипоксическими и антиоксидантными свойствами.
129
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Роль окислительного стресса (нерегулируемого образования активных
форм кислорода) и состояния эндогенной антиоксидантной системы
организма в развитии патологических процессов в ЦНС показана как в
экспериментальных, так и клинико-биохимических исследованиях (Федорова
Т.Н., 2004, 2005; Dobrota D. et al., 2005). Развитие окислительного стресса
активирует каскадный механизм саморазрушения нейронов по пути апоптоза
(программируемой клеточной гибели) или некроза, что может приводить к
дальнейшему развитию неврологического дефицита и ухудшению состояния
пациентов с различными заболеваниями ЦНС, такими как сосудистые и
нейродегенеративные заболевания головного мозга.
В
настоящее
время
окислительные
повреждения
мозга
рассматриваются современной неврологией как значимый фактор патогенеза
заболеваний, при этом доказана целесообразность введения в схемы лечения
препаратов антиоксидантного действия (Верещагин Н.В. и соавт, 2004;
Суслина З.А. и соавт, 2000, 2003, 2007; Максимова М.Ю. и Федорова Т.Н.,
2013). Однако антиоксидантная терапия и профилактика заболеваний ЦНС
все
еще
не
находят
широкого
применения
из-за
недостаточной
специфичности и эффективности, а также узкого спектра имеющихся
препаратов. В связи с этим разработка новых антиоксидантных препаратов
сохраняет высокую актуальность.
Одним
их
наиболее
перспективных
антиоксидантов
является
природный дипептид карнозин, протектор клеток и тканей от окислительного
стресса. В настоящее время установлено, что в возбудимых тканях животных
карнозин является природным гидрофильным антиоксидантом прямого
действия (Болдырев А.А., 2012).
На
различных
экспериментальных
моделях
(ишемия/реперфузия
головного мозга крыс, паркинсонизм была продемонстрирована защитная
130
функция карнозина как при его профилактическом, так и постишемическом
введении. Профилактическое введение карнозина повышало активность
митохондриальной
супероксиддисмутазы
и
предотвращало
развитие
окислительного стресса в ткани мозга, что коррелировало с улучшением
неврологической симптоматики, снижением смертности и восстановлением
двигательной активности, а также с улучшением процессов памяти животных
(Федорова Т.Н., 2004; Багыева Г.Х., 2009).
Глобальная
(3-х сосудистая) ишемия головного мозга, отягощенная
систематическим введением 3-НПК, позволила выявить выраженную
неврологическую
симптоматику,
коррелирующую
со
значительными
метаболическими сдвигами и высокой смертностью животных. Курсовое
введение карнозина в постишемическом периоде на фоне 7-14 дневной
реперфузии
защищает
мозг
от
окислительных
повреждений,
что
сопровождается снижением неврологической симптоматики и смертности
животных (Федорова Т.Н. и соавт., 2002) .
Получены
новые
данные
о
патогенезе
нейродегенерации
при
исследовании уникальной экспериментальной модели паркинсонизма у
быстростареющих мышей линии SAMP1 (Senescence Accelerated Mice,
Prone), характеризующихся высоким стационарным уровнем свободных
радикалов в их тканях.
Эта модель отличается ускоренной динамикой
развития возрастных изменений и четко выраженной симптоматикой в ответ
на введение МФТР. Установлено, что у мышей
МФТР
имеют
место
выраженные
SAMP1 после введения
нейрохимические
нарушения,
сопровождающиеся развитием окислительного стресса в мозге. Нарушение
поведенческих реакций в результате воздействия МФТР свидетельствует о
возникновении повреждений в области черной субстанции и в связанной с
ней дофаминергической системе мозга. Окислительный стресс и его
патофизиологические проявления в ткани мозга быстростареющих мышей с
экспериментальным паркинсонизмом предотвращается курсовым введением
131
карнозина, препятствующего угнетению двигательной активности животных
и развитию мышечной ригидности. Нейропротекторный эффект карнозина
позволяет компенсировать дефицит антиоксидантной системы мозга, а также
защищать белки и липиды от окислительной модификации (Багыева Г.Х.,
2009).
Полученные результаты позволили обосновывать целесообразность
включения
карнозина
в
комплексную
терапию
заболеваний
ЦНС,
сопровождающихся развитием ОС. В Научном центре неврологии РАМН
было
проведено
стандартизованное
(двойное
слепое
плацебо
контролируемое) исследование, при котором карнозин применяли для
лечения пациентов с нарушениями мозгового кровообращения. Больные с
перенесенным ишемическим инсультом были случайным образом разделены
на две группы – одна получала стандартное лечение, а другой одновременно
со стандартным лечением давали карнозин. Кроме оценки неврологической
симптоматики, проводили исследование реакции слухового центра коры на
сдвоенные
импульсы
(потенциалы
Р300)
и
анализ
эндогенной
антиоксидантной активности липопротеинов плазмы крови. По окончании 20
дневного курса лечения наблюдалось улучшение в неврологической
симптоматике, в различении сдвоенных импульсов слуховой областью коры
и в восстановлении эндогенной антиоксидантной защиты у пациентов,
принимающих карнозин в качестве дополнительного лечения (Федорова и
соавт, 2008). Действие карнозина было дозозависимым (применяли дозы 0,75
и 2 г в день). Другим примером явилось усиление эффективности лечения
болезни Паркинсона при комбинации стандартной терапии с применением
карнозина (1,5 г ежедневно) (Boldyrev A., et al., 2008). В этом случае после
30 дневного лечения наблюдали снижение стационарного уровня окисленных
белков и липидов в липопротеинах плазмы крови, возрастание устойчивости
к Fe2+индуцированному окислению липопротеинов плазмы крови, снижение
активности
тромбоцитарной
МАО
В
и
возрастание
активности
132
эритроцитарной Cu/Zn СОД. Все эти процессы протекали на фоне
устойчивого снижения неврологической симптоматики.
В то же время присутствие в крови карнозиназы, фермента
разрушающего карнозин требует введение высоких доз этого препарата, что
лимитирует
его
использование
в
клинической
практике.
Повысить
эффективность действия карнозина, защитив его от действия ферментов
распада, можно путем его включения в наноструктурные конструкции.
Результаты исследования, проведенного в лаборатории клинической и
экспериментальной нейрохимии ФГБУ «НЦН» РАМН, биологической
эффективности
наноструктур
методологическом уровне
различной
природы
выявили следующие
на
едином
закономерности.
Так,
исследованные водорастворимые производные фуллеренов характеризуются
наличием
собственной
прооксидантной
активности
в
культуре
переживающих нейрональных клеток, тогда как наблюдающееся при этом
увеличение пула активных форм кислорода не сопровождается при короткой
экспозиции (30 мин) повышением клеточной гибели. В противоположность
этим данным, значительная антиоксидантная активность по отношению к
карнозину была выявлена у карнозина, включенного в состав нанолипосом.
Исходя из полученных данных в качестве перспективной наноконструкции
был выбран карнозин, включенный в нанолипосомы.
В связи с этим, нами была поставлена задача впервые оценить
антиокидантную
способность
нанолипосом
экспериментальных
в
карнозина,
включенного
условиях.
в
состав
Экспериментальные
исследования in vitro были проведены на суспензии нейрональных клеток
мозжечка, выделенных из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным
темпом старения и на клетках PC-12.
Основным объектом экспериментальных исследований
стала клеточная
культура РС-12, дифференцированная по нейрональному типу. Для оценки
133
адекватности используемой модели был проведен анализ морфологического
состояния этих клеток, а также экспрессии NMDA рецепторов в клетках
культуры PC-12, активированных фактором роста нервов NGF. Результаты
проведенных
исследований
показали,
что
полученные
в
результате
дифференцировки под действием фактора роста нервов NGF клетки PC-12 по
морфологии имеют сходство с нейронами, по функциональным свойствам
характеризуются наличием NMDA рецепторов. Эти данные согласуются с
работой, в которой степень NGF- индуцированной дифференциации клеток
PC-12 также оценивалась по изменению морфологических характеристик и
нейрохимических параметров (Das K.P et al., 2012). Эта недорогая и легко
поддерживаемая
культура
дифференцированных
нейронов
характеризуется
в
результате
морфологией
NGF-стимуляции.
Дифференцированная по нейрональному типу культура клеток
РС-12
показывает увеличение уровня фосфорилирования ERK1 / 2 , JNK / SAPK и
Akt , но не p38MAPK. Поскольку фосфорилирование р38МАРК подавляет
рост аксонов, этот факт может быть использован на практике при создании
лекарственных препаратов или альтернативных лекарственных средств для
лечения и профилактики неврологических заболеваний (Brassica L.et al.,
2013).
Индукция окислительного стресса различными химическими агентами
в недифференцированных и дифференцированных клетках PC12 выявила
определенные особенности клеточного ответа в этих клетках. В данной
работе в условиях in vitro было показано, что инкубация клеток РС12 с
NMDA или с ГЦК приводит к росту АФК и этот процесс при длительной
инкубации приводит к некротической смерти клеток.
NMDA-рецепторы
играют
важную
роль
в
функционировании
организма человека. Они участвуют и передаче сигналов при реализации
важнейших его функций, таких как формировании памяти и выработке
поведенческих реакций (Болдырев и др., 2004). Большинство рецепторов
134
располагаются в кортикальных структурах, базальных ганглиях и сенсорноассоциативных системах. В настоящее время интерес учёных привлёк факт
обнаружения NMDA рецепторов на мембранах клеток не нейронального
происхождения, таких, например, как лимфоцитах (Mashkina et al., 2007).
NR1 субьединицы кодируется одним геном, который имеет три области
альтернативного сплайсинга -N1, C1 и C2 и могут быть представлены
восьмью вариантами сплайсинга. (Arseima Y Del Valle-Pinero et al., 2007).
Экзон N1 и C1 могут присутствовать или отсутствовать, не изменяя при этом
функций NR1 белка. N1 находится вне клетки и взаимодействует с
различными фармакологическими модуляторами канала, включающими
цинк, протоны и полиамины (Dingledine et al. 1999). С-концевой участок
белка контролирует экспрессию NR1 на поверхности клетки, поэтому белок с
самым коротким С-концевым участком экспрессируется больше всего на
поверхности клетки (Okabe et al. 1999).
NR2 субьединица включает в себя 5 членов семейства этого белка:
NR2A, 2B, 2C и 2D. Экспрессия различных NR2 субьединиц определяет
деактивацию кинетики белка, чувствительность к антагонистам и афинность
к лигандам рекомбинантного NR1/NR2 рецептора (McBain and Mayer
1994, Mori and Mishina 1995).
В интактных клетках PС-12 мы обнаружили канальную и регуляторную
субьединицы NMDA рецепторов, однако их количества настолько малы, что
возможность их работы минимальна. В клетках, активированных фактором
роста нервов, содержится в 11,9 раз большее количество NR1 субъединицы и
в 27,6 раз большее количество NR2b субъединицы. В работе было показано,
что интактные или дифференцированные по нейрональному пути клетки PC12 по-разному отвечают на действие специфических и неспецифических
индукторов окислительного стресса. Если пероксид водорода вызывает
стандартный ответ клеток, проявляющийся в виде повышения уровня АФК и
клеточной смерти, то NMDA влияет на клетки по-разному. Очевидно,
135
нейрон-подобные клетки, синтезировавшие NMDA рецепторы за время
инкубации
с
фактором
роста
нервов,
отвечают
более
выраженно.
Подтверждением этого факта являются данные о том, что только клетки PC12 дифференцированные нейрональному типу проявляют достоверный
эффект снятия действия NMDA после воздействия агонистов MK-801 и DAP5, что свидетельствует о «полноценности» синтезированных рецепторов и
специфичности ответа на NMDA.
Внесение карнозина в систему in vitro, где образуются активные формы
кислорода, под действием перекиси водорода или NMDA предотвращает
рост АФК и снижает гибель клеток в культуре РС-12.
Объяснением
защитного эффекта карнозина может явиться его способность ограничивать
накопление свободных радикалов в клетках, экспрессирующих NMDA
рецепторы, которые, вызывает рост внутриклеточных АФК. Кроме того,
способность карнозина эффективно защищать дифференцированные по
нейрональномцу типу клетки РС-12 от некроза, индуцированного NMDA
частично за счет активации постсинаптических рецепторов гистамина H1,
может быть основанием для дальнейшего изучения карнозина в качестве
анти-экзайтотоксического агента (Shen Y et al., 2007).
В следующем разделе работы мы исследовали влияние токсического
производного гомоцистеина (ГЦ), гомоцистеиновой кислоты на клетки PC12, действие которой также опосредуется NMDA рецепторами. ГЦ обладает
резко выраженной токсичностью для клеток нервной и иммунной систем:
при повышении концентрации ГЦ в кровотоке нарушается стабильность
гематоэнцефалического барьера, и ГЦ накапливается в тканях мозга. Будучи
структурным аналогом глутамата, он активирует как ионотропные, так и
метаботропные глутаматные рецепторы. Наибольшей опасностью является
активация ГЦ ионотропных глутаматных рецепторов,
активируемых N-
метил-D-аспартатом (Болдырев А.А., 2009). Эти рецепторы, отвечающие за
процессы
долговременной
формирование
памяти,
потенциации,
долгое
время
распознавание
считались
образов
и
специфическими
136
компонентами нервной ткани. В последнее время NMDA рецепторы найдены
в иммунной системе (Boldyrev, A.A., and Johnson, P. , 2007), где они
ответственны за молекулярные процессы, лежащие в основе реакций
клеточного
иммунитета
–
распознавание
чужеродных
белков
и
формирование иммунного ответа через синтез и выделение цитокинов.
Повышенный уровень ГЦ, циркулирующего в крови, приводит к постоянной
активации NMDA рецепторов в клетках нервной и иммунной системы,
вызывает дисфункцию в работе этих важных систем организма. Явление это,
получившее
применительно
к
нейрональной
ткани
название
экзайтотоксичности, индуцирует массированную смерть клеток как по пути
апоптоза, так и по пути некроза – в зависимости от длительности и
интенсивности активации. В наших экспериментальных исследованиях
инкубация клеток РС-12 с ГЦК приводит к накоплению свободных
радикалов, которые, как считают, и являются причиной активации апоптоза,
с одной стороны, и окислительных повреждений клеточных компонентов и
некроза клеток, с другой. Токсическое действие 500 мкМ ГЦК в течение 60
мин на клетки РC-12 предотвращалось ввведением блокаторов NMDA
рецепторов.
Инкубация клеток с ГЦК и карнозином приводит к устранению
токсического действия ГЦК – уровень клеточной смерти оказывается таким
же, как и в интактной суспензии клеток. Можно полагать, что защита клеток
карнозином является прямым следствием его способности снижать уровень
свободных
радикалов.
Эти
данные
сопоставимы
с
результатами
исследования по индукции ОС, вызываемого в нейронах гомоцистеиновой
кислотой (ГЦК), вызывающей как апоптотическую, так и некротическую
смерть нейрональных клеток, поскольку внесение карнозина в среду с ГЦК
защищает от обоих видов клеточной смерти (Болдырев, 2012).
Таким образом, в экспериментах с
клеточными культурами
продемонстрирована прямая антирадикальная активность карнозина: гибель
137
дифференцирующихся клеток РС-12 при их инкубации с NMDA или ГЦК
также предотвращается карнозином.
В настоящее время важная роль в биохимических механизмах
патогенеза
заболеваний
(путресцин,
спермин
ЦНС
и
отводится
спермидин)
полиаминам.
-
Полиамины
полифункциональные
низкомолекулярные азотсодержащие соединения, которые в высоких
концентрациях присутствуют в нервной ткани. Нарушения в обмене
полиаминов с образованием высокотоксичного продукта их рассматривают
как
один
из
механизмов
гибели
нейронов
при
ишемии
мозга,
нейродегенеративных заболеваниях и старении организма.
В экспериментах, проведенных в нашей лаборатории при изучении
содержания полиаминов в мозге быстростареющих
мышей линий
SAMR1/SAMP1 разного возраста было обнаружено, что нарушение баланса
полиаминов наблюдается в мозге 10-дневных мышей и сохраняется до
периода проявления старческих признаков (8 мес). Эти результаты
позволяют предположить, что изменения в спектре
полиаминов в мозге
быстростареющих мышей при гипоксическом воздействии могут быть
связаны с развитием дефицита антиоксидантной системы у этих животных
(Маклецова М.Г.и соавт., 2013)
В клинико-биохимических исследованиях было показано, что
хронических цереброваскулярных заболеваниях
при
(ХЦВЗ) наблюдается
нарушение метаболизма полиаминов – спермина, спермидина и путресцина.
Введение
карнозина
в
комплексную
терапию
ХЦВЗ
способствует
нормализации содержания путресцина и спермина в крови больных, что,
является одним из механизмов защиты мозга карнозином от окислительного
стресса (Маклецова М.Г. и соавт. , 2012).
В то же время механизм защитного действия как карнозина, так
и
карнозина в составе нанолипосом на клетки РС12 в условиях токсического
138
действия
полиаминов и
продукта
их
распада
акролеина оставался
невыясненным.
Инкубация клеток РС12 с карнозином в составе нанолипосом и
полиаминами предотвращает рост АФК на 25% эффективнее карнозина и в
большей степени защищает клетки от гибели: смертность клеток в пробе
падает до уровня, сопоставимого с уровнем смертности клеток в пробах,
содержащих только нанолипосомы с карнозином (без полиаминов). При этом
выявляется
явное
преимущество
карнозина,
включенного
нанолипосом в отношении предохранения клеток от гибели -
в
состав
смертность
клеток, обусловленная его действием, оказалась на 60% ниже относительно
самого карнозина.
Таким образом, токсичность акролеина в отношении клеток РС-12
проявляется
в
увеличении
уровня
АФК
и
числа мертвых
клеток
пропорционально повышению концентрации акролеина и времени его
воздействия на клетки. Следует отметить, что выраженная токсичность
акролеина в концентрации 100 мкМ выявляется уже после его часовой
инкубации и превосходит в 2,5 раза действие акролеина в концентрации 10
мкМ в эти сроки. Полученные данные указывают на то, что акролеин
является фактором, запускающим развитие окислительного стресса, как это
было показано в литературе. В работе МА Siddiqui (Siddiqui М.А. et al., 2008)
также показано, что степень цитотоксического действия продукта ПОЛ (4гидроксиноненаль, 4- ГН) зависело от его дозы и сроков инкубации клеток
РС12.
В исследовании, проведенном Lou et al. (2005) показано цитотоксическое
действие акролеина на клетки РС-12, проявляющееся в увеличении роста
АФК и гибели клеток, преимущественно
по пути некроза, а также
митохондриальной
полагают,
дисфункцией.
Авторы
что
одним
из
механизмов токсического действия акролеина, приводящего к гибели клеток,
является его способностью снижать продукцию АТФ в митохондриях.
139
Высоко реакционный альдегид акролеин является мощным эндогенным
токсином с большим периодом полураспада. На модели акролеининдуцированного
повреждения
клеток
РС-12
показана
способность
гидралазина, нагруженных в хитозановые наночастицы (размером от 300
нм до 350 нм в диаметре и с регулируемым поверхностным зарядом)
препятствовать развитию ОС (Cho Y et al., 2010).
В данной работе впервые выявлено защитное действие карнозина на
акролеин - индуцированную гибель клеток культуры РС-12 и рост АФК,
эффективность которого определялась токсичной дозой акролеина, времени
инкубации в его присутствии, а также способа
Результаты
проведенного
исследования
введения карнозина.
являются
убедительным
доказательством возможности использования клетки РС-12 как тест –
системы
для
оценки
токсичности
альдегида
акролеина,
а
также
протекторного действия антиоксидантов.
Результаты
выполненного
исследования
подчёркивают
исключительную важность антиоксидантной системы в функционировании
нервной ткани и позволяют расширить представление о механизмах
защитного действия этого дипептида.
В данной работе впервые была выявлена антиоксидантная
активность карнозина в составе нанолипосом у мышей, характеризующихся
ускоренным темпом старения (SAMP1) и их контрольной линии (SAMR1), в
условиях окислительного стресса в опытах in vitro и in vivo.
В опытах in vitro в суспензии нейрональных клеток, выделенных из
мозжечка мышей линии SAMR1, а также
нанолипосомы, содержащие карнозин
в культуре клеток PC-12
подавляли образование активных
форм кислорода и препятствовали их гибели в условиях индукции
окислительного стресса пероксидом водорода или полиаминами. При
этом механизмы защиты нейронов или клеток РС-12 от ОС, обусловленные
140
действием карнозина в составе нанолипосом были сопоставимы с Lкарнозином, однако его действие превышал эффективность карнозина.
С другой стороны, в опытах in vivo в условиях воздействия на мозг
окислительного стресса, вызванного острой гипобарической гипоксией, были
получены данные, указывающие на способность карнозина в составе
нанолипосом защищать мозг от гипоксии. Профилактическое введение этого
препарата мышам приводило к улучшению физиологических показателей
устойчивости мозга к гипоксическому воздействию и повышению его
суммарной антиоксидантной активности, более выраженным у мышей с
нормальным темпом старения (SAMR1).
Линия быстростареющих мышей SAMP (Senescence Accelerated Mouse Prone)
является одним из наиболее значимых обьектов в экспериментальных
исследованиях. Эти животных характеризуются ускоренным накоплением
возрастных изменений с развитием стойкого окислительного стресса в
тканях,
обусловленного
дефицитом
антиоксидантной
системы
и
сопровождающегося накоплением хромосомных аберраций и дефектов в
клеточных белках и липидах. В основе системных нарушений, приводящих к
окислительному стрессу, лежит повышенная экспрессия митохондриальной
моноаминооксидазы В, происходящая на фоне подавления активности MnСОД, что вызывает дисбаланс между образованием и нейтрализацией
активных форм кислорода и накопление множественных метаболических и
функциональных дефектов.
Следует отметить, что эффективность L-карнозина, вводимого мышам
в составе нанолипосом в дозе 48 мг/кг, сопоставима с действием Lкарнозина, вводимого крысам линии Wistar в дозе 100 мг/кг до воздействия
ОГГ (Стволинский С.Л., 2006). Полученные в экспериментах in vivo данные
указывают на то, что применение карнозин-содержащих нанолипосом
обеспечивает разнонаправленный защитный эффект в условиях воздействия
141
на организм
окислительного стресса, вызванного острой гипоксической
гипоксией.
Таким образом, полученные результаты как в экспериментах in vitro,
так и in vivo указывают на высокую антиоксидантную и нейропротекторную
активностькарнозина в составе нанолипосом, значительно превышающую
аналогичные эффекты карнозина. Поскольку карнозин как природное
активно метаболизирующее соединение имеет ограниченное время жизни в
организме,
подвергаясь
расщеплению
специфическим
ферментом
карнозиназой, можно полагать, что нанопрепарат, созданный на его основе
будет иметь большую длительность антиоксидантной активности за счет
увеличения времени жизни в организме, что может обеспечить повышение
эффективности его действия. В целом, нанопрепарат L-карнозина может
рассматриваться
как
перспективная
наноконструкция,
обладающая
антигипоксическими и антиоксидантными свойствами. А результаты работы
могут стать основанием для разработки высокоспецифичных препаратов и,
следовательно, для создания обоснованных методов лечения и профилактики
заболеваний ЦНС.
142
ВЫВОДЫ
1. Полученные в результате дифференцировки под действием фактора
роста нервов NGF клетки PC-12 по морфологии имеют сходство с
нейронами, по функциональным свойствам характеризуются наличием
NMDA рецепторов .
2. Дана
сопоставительная
специфических
полиамины,
оценка
токсического
(NMDA-специфический
гомоцистеиновая
агонист
кислота)
так
действия
как
NMDA-рецепторов,
и
неспецифических
(перекись водорода, акролеин), проявляющаяся ростом АФК и гибели
клеток РС12.
3. Показано протекторное действие карнозина и его липосомального
наноструктурного аналога на рост АФК и гибель клеток PC-12 в
условиях токсического влияния полиаминов (спермина, спермидина и
путресцина) и продукта их распада- акролеина.
4. Выявлено
защитное
действие
липосомального
наноструктурного
аналога карнозина на нейроны, выделенные из мозжечка 10-12 дневных
мышей с ускоренным темпом старения в условиях ОС, индуцированного
перекисью водорода.
5. На модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с
ускоренным темпом старения (SAMP1) показано протекторное действие
наноструктурного аналога карнозина
на физиологические (время
потери позы, время «жизни на высоте», время до остановки дыхания,
время реституции, способность к обучению) и нейрохимические (общая
антиоксидантная активность) параметры.
143
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Айдарханов Б.Б., Локшина Э.А., Ленская Е.Г. Молекулярные аспекты
механизма антиокислительной активности витамина Е: особенности действия
токоферолов // Вопр. мед. химии. - 1989. - № 3. - С. 2 - 9.
2.
Багыева Г.Х. Клинико-генетический и биохимический анализ болезни
Паркинсона: механизмы предрасположенности, экспериментальные модели.
Подходы к терапии // Автореф. дисс д. м. н. -2009. - С.48.
3.
Бадалян Л.О. и соавт. // Детская неврология. -1984.
4.
Бархатова В.П., Суслина З.А. Основные направления нейропротекции при
ишемии мозга. //Неврологический журнал. - 2002. - №4. - С. 42 - 50.
5.
Бобырева Л.Н. Перспективы применения препаратов биоанти- оксидантов
для
лечения
и
профилактики
ишемической
болезни
мозга
атеросклеротического генеза. //В кн: Сосудистые заболевания головного
мозга. – 1984. - С. 14 - 15.
6.
Болдырев А. А. Молекулярные механизмы токсичности гомоцистеина //
Биохимия. -2009. - Т. 74. - № 6. - С. 725 - 736.
7.
Болдырев А.А. 2012. Карнозин: новые концепции для функций давно
известной молекулы // Биохимия. - Т. 77, - №4, - С.403-418.
8.
Болдырев А.А. Дискриминация между апоптозом и некрозом нейронов под
влиянием окислительного стресса. // Биохимия. - 2000. - T. 65. - C. 981 - 990.
9.
Болдырев А.А. Карнозин и защита тканей от окислительного стресса // Изд.
Московского Университета “Диалог”. - 1999.- С.364.
10. Болдырев
А.А.
Окислительный
стресс
и
мозг.
//
Соросовский
образовательный журнал. - 2001. - T. 7. - № 4. - С. 21 - 28.
11. Болдырев А.А., Куклей М.Л. Свободные радикалы в нормальном и
ишемическом мозге. // Нейрохимия. - 1996. - Т.13. -№.4. - С.271 – 278.
12. Болдырев А.А., Булыгина, Е.Р., Волынская, Е.А. // Биохимия. -1995, - Т.60. №10. - С.1688-1695.
144
13. Болдырев A.A., Брюшкова Е.А., Владыченская, Е.А. NMDA-рецепторы в
клетках иммунной системы // Биохимия. -2012. -77. –C. 128–134.
14. Булыгина
Е.Р.,
Ляпина
Л.Ю., Болдырев А.А.
Активация глутаматных
рецепторов ингибирует Na/K-ATPазу гранулярных клеток мозжечка. //
Биохимия. -2002. -Т.67. - С.1209 - 1214.
15. Верещагин
Н.В.,
Танашян
М.М.,
Федорова
Т.Н.,
Смирнова
И.Н.
Антиоксиданты в ангионеврологии. // Атмосфера. Нервные болезни. -2004. № 3. -С. 8-12.
16. Весельских И.Ш., Сонник А.В. Применение корректоров процессов
перекисного окисления липидов и гемостаза в комплексном лечении больных
с цереброваскулярными расстройствами. // Журн. неврол. и психиатр. - 1997.
- Т. 97, - № 2, С. 51- 54.
17. Владимиров Ю.А., Арчаков А.М. Перекисное окисление липидов в
биологических мембранах. // Автореферат докт. дисс. -2000. - С.256.
18. Гамалей И.А., Клюбин И.В. 1996. Перекись водорода как сигнальная
молекула // Цитология. - Т. 38. - С. 1233-1247.
19. Захарова М.Н. Боковой амиотрофический склероз и оксидантный стресс. //
Автореф. докт. дисс. - 2001.
20. Зацепина С.Н., Мытников А.М., Зверева Б.И. Изменение состава высших
жирных кислот фосфолипидов плазмы крови и мембран эритроцитов у детей
с тяжелой травматической болезнью мозга. // Ж. невропат.и псих.- 1983.-№
10. - С. 1461 - 1463.
21. Зенков Н. К., Ланкин В. З., Меньщикова Е. Б. Окислительный стресс. //
МАИК.- 2001. – С.343.
22. Капелько В.И. Нарушение энергообразования в клеткахсердечной мышцы: п
ричины и следствия. // Соросовский образовательный журнал. – 2000. - №5.
С.14-20.
23. Караченцев А.Н, Мельниченко И.А. Перекисное окисление липидов в аорте
крысы при действии половых гормонов. // Экперим. и клин. фарм.- 1997. Т.60, № 6. - С. 13 - 16.
145
24. Крыжановский Г.Н., Никушкин Е.В., Воронко В.И. и др. Содержание
продуктов перекисного окисления липидов и свободных жирных кислот в
плазме крови и спинномозговой жидкости у больных эпилепсией. // Ж.
невропат. и псих. -1984.- № 6.- С. 806 - 809.
25. Ланкин В.З., Тихазе А.К, Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы
при заболеваниях сердечно-сосудистой системы. // Кардиология. - 2000. - T.
40, №. 7.-C. 58 - 71.
26. Максимова
М.Ю.Перекисное
окисление
липидов
и
гемостатическая
активация при ишемическом инсульте. // Автореф. дисс к. м. н. - 1996. - С. 29.
27. Максимова М.Ю., Федорова Т.Н. Применение милдроната при транзиторных
ишемических атаках. // Ж-л неврол. и псих. -2013. -Т. 113. -№6. C. 41-44.
28. Махро А.В., Машкина А.П., Соленая О.А., Трунова О.А., Козина Л.С.,
Арутюнян А.В., Булыгина Е.Р. Пренатальная гипергомоцистеинемия как
модель окислительного стресса мозга. // Бюл. эксперим. биологии и
медицины. - 2008. - № 146. - С.37- 39.
29. Никушкин
Е.В.
Перекисное
окисление
липидов
при
эпилепсии.
Антиоксиданты в противосудорожной терапии. // Автореф. дис. д. м. н. –
1991.-С.42.
30. Одгаева
А.В.,
Туровецкий
В.Б.,
Каменский
А.А.
Повреждение
плазматических мембран перитонеальных макрофагов мышей при действии
Н2О2. // Вестник МГУ серия 16. биология. – 2007. -№4. -C. 20-21.
31. Переседова А.В Свободнорадикальные реакции и аутоантитела к фактору
роста нервов при рассеянном склерозе. // Автореф. дис. - 1999. - С. 148.
32. Пономарев Т.М. // Книга «Нанотехнология: физико-химия нанокластеров,
наноструктур и наноматериалов». – 2009
33. Разина Л.Г. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1957. -№ 43. -С. 87 -91.
34. Савищева О.С., Полещук В.В., Иванова-Смоленская И.А., Федорова Т.Н.,
Окисляемость апо-В-липопротеинов плазмы крови при паркинсонизме. //
Нейрохимия. -2000. - Т. 17. - № 3. – С. 237 – 239.
146
35. Сейфулла Р.Д. Нанотехнологии в нейрофармакологии. // Onebook. -2012. –
С.352.
36. Сейфулла
Р.Д.,
Фармакодинамика
нанонейрофармакологических
и
препаратов. //
фармакокинетика
Фармакодинамика
и
фармакокинетика. -2012 г. -1(4). – С.33- 38.
37. Скулачев В. П. В своем межмембранном пространстве митохондрия таит
«белок
самоубийства»,
который
выйдя
в
цитозоль,
вызывает
апоптоз //Биохимия.-1996.-Т. 61, вып. 11.- С.2060-2063.
38. Сорокина Е.В. Влияние нейротоксина
МРТР на биохимические и
физиологические параметры мышей линии SAM. // Автореф. дисс к. б. н. 2003. –С.24.
39. Сорокина Е.В., Бастрикова Н.А., Стволинский С.Л., Федорова Т.Н. Эффекты
карнозина и селегилина при паркинсонизме, вызванном введением МРТР
мышам линии SAM (Senescence Accelerated Mice). // Нейрохимия 2003. Т.20.
С. 133-138.
40. Стволинский, С.Л. , Федорова, Т.Н. // Вестник РУДН. Сер. Экология и
безопасность жизнедеятельности. -2006.- № 1 (13). -С.56-63.
41. Суслина
З.А.,
Максимова
М.Ю.
Оксидантный
стресс
и
основные
направления нейропротекции при нарушениях мозгового кровообращения. //
Неврологический журнал. 2007. № 4, С. 4 – 8.
42. Суслина З.А., Федорова Т.Н., Максимова М.Ю., Рясина Т.В., Стволинский
С.Л.,
Храпова
Е.В.,
Болдырев
А.А.
Антиоксидантная
терапия
при
ишемическом инсульте. Ж. неврол. и психиатр. -2000-Т. 100. - № 10.-С. 34 –
38.
43. Суслина З.А., Федорова Т.Н., Максимова М.Ю., Ким Е.К. Антиоксидантное
действие милдроната и L-карнитина при лечении больных с сосудистыми
заболеваниями головного мозга. Ж. экспер. и клин. фармакол., -2003 -№ 3-С.
32-35.
44. Фёдорова
Т.Н.
сравнительной
Применение
оценки
хемилюминесцентного
антиоксидантной
активности
анализа
для
некоторых
147
фармакологических препаратов. // Эксп. и клин. фармакология. -2003. -№5. –
С. 56-58.
45. Федорова Т.Н. Окислительный стресс и защита головного мозга от
ишемического повреждения. // Автореф. дисс д. б. н. -2004. –С.41.
46. Федорова Т.Н., Стволинский С.Л., Багыева Г.Х., Иванова-Смоленская И.А.,
Иллариошкин С.Н. Нейродегенеративные изменения, вызванные введением
нейротоксина МРТР быстростареющим мышам. // Успехи физиологических
наук, 2005, Т. 36., № 2, С. 84 – 91.
47. Федорова
Т.Н.,
Стволинский
С.Л.,
доброта
Д.,
болдырев
А.А.
Терапевтическое действие карнозина при экспериментальной ишемии мозга.
// Вопросы биол., мед., и фарм. химии. -2002. - №1. – с. 41 – 44
48. Федорова Т.Н., Беляев М.С., Трунова О.А.,Гнездицкий В.В., Максимова
М.Ю., Болдырев А.А. Нейропептид карнозин увеличивает устойчивость
липопротеинов и эритроцитов крови и эффективность иммунокомпетентной
системы у пациентов с хронической дисциркуляторной энцефалопатией
//Биол. Мембраны.- 2008.-№25. –С. 479–483.
49. Ansell J.B. Phospholipids. // Form and function of phospholipids. - 1973. - P. 347 422.
50. Arseima Y Del Valle-Pinero, Shelby K. Suckow, Qiqi Zhou, Federico M. Perez, G.
Nicholas Verne and Robert M. Caudle. Expression of the N-methyl-D-aspartate
Receptor NR1 Splice Variants and NR2 Subunit Subtypes in the Rat Colon //
Neuroscience. Author manuscript. -2007. -№147(1). –P.164–173.
51. Aruoma O. and Halliwell B. Molecular biology of free radicals in human diseases
// OICA Int. -1999.
52. Asztely F. & Gustafsson B. Ionotropic glutamate receptors.Their possible role in
the expression of hippocampal synaptic plasticity. // Molecular Neurobiology
1996. –№12. -P.1—11.
53. Babior BM. NADPH oxidase: an update. // Blood .-1993. –P.1464-1476.
148
54. Bedard K, Krause KH, The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases:
physiology and pathophysiology// Physiological reviews. -2007 . vol. 87(1). –
P.245-313
55. Bellia F, Vecchio G, Cuzzocrea S, Calabrese V, Rizzarelli E. Neuroprotective
features of carnosine in oxidative driven diseases // Mol Aspects Med. -2011 .№32(4-6). -P.258-66.
56. Benzi, G. and Moretti, A. Are reactive oxygen species involved in Alzheimer’s
disease? // Neurobiol. Aging. -1995. –№16. -P661–674
57. Bobko A, Ivanov A, Khramtsov V. Discriminative EPR detection of NO and HNO
by encapsulated nitronyl nitroxides // Free Radic Res. -2013. -№47(2). –P.74-81.
58. Boldyrev A., Song R., Djatlov V., Lawrence D., and Carpenter D. Neuronal cell
death and reactive oxigen species //Cell Mol. Neurobiol. - 2000. – V. 20. – P. 433
– 450.
59. Boldyrev A.А., Stvolinsky S.L., Tyulina O.V. et al. // Cell.Mol. Neurobiol. -1997.
-Vol. 17, -N 2. -P. 259 - 271.
60. Boldyrev AA, Aldini G, Derave W . Physiology and pathophysiology of carnosine.
// Physiol Rev. -2013. -№93(4). –P.1803-45.
61. Boldyrev AA.Carnosine: new concept for the function of an old molecule //
Biochemistry. -2012. -№77(4). P.-313-26
62. Boldyrev A. Carnosine and protection of cells and tissues against oxidative stress //
NovaPubl. -2006. –P.298.
63. Boldyrev, A., Fedorova, T., Stepanova, et al. Carnosine increases efficiency of
DOPA therapy of Parkinson's disease: a pilot study// Rejuv. Res. 2008, v. 11, № 8,
p.988–994.
64. Boldyrev A., Fedorova T., Stepanova M., Dobrotvorskaya I., Kozlova E.,
Boldanova N., Bagyeva G., Ivanova-Smolenskaya I., and Illarioshkin S. Carnisone
149
increases efficiency of DOPA therapy of Parkinson's disease: a pilot study //
Rejuv. Res. -2008. -№11(8). P.988–994.
65. Boldyrev A.A., Dupin A.M., Bunin A.Ya., Babizhaev M.A. and Severin S.E. The
antioxidative properties of carnosine, a natural histidine-containing dipeptide.
//Biochem. Int. – 1987. –15. – P. 1105 - 1113.
66. Boldyrev A.A., Kukley M.L., Stvolinsky S.L. and Gannushkina I.V., Carnosine
and free radical defense mechanisms in brain. // In Natural Antioxidants:
Molecular Mechanisms and Health Effects.-1996. -P. 600-613.
67. Boldyrev, A.A., Song, R., Lawrence, D. and Carpenter, D.O. Carnosine protects
against excitotoxic cell death independently of effects on reactive oxygen species
//Neuroscience. - 1999. – 94. – P. 571 - 577.
68. Bonfoco E., Kraing D., Ankacrona M., Nicotera P. and Lipton S.A. Apoptosis and
necrosis: two distinct events induced respectively by mild and intense insults with
N-methyl-D-aspartate or nitric oxide/superoxide in cortical cell cultures
//Proc.Natl.Acad.Sci.USA. – 1995. – V. 92. – P. 7162 – 7166.
69. Boveris A. Mitochondrial production of superoxide radical and hydrogen peroxide
//Adv.Exp.Biol.Med. – 1977. – V. 78. – P. 67 - 82
70. Bradley
MA,
Markesbery
WR,
Lovell
MA.
Increased levels of 4-
hydroxynonenal and acrolein in the brain in preclinical Alzheimer disease.vFree
Radic Biol Med. -2010. –V.15.-№48(12). P.1570-6.
71. Bradley.M.A.,Markesbery
W.R.,
Lovell
M.A.
Increased
levels
of
4-
hydroxynonenal and acrolein in the brain in preclinical Alzheimer disease // Free
radical biology & medicine. -2010. -P. 1570-1576
72. Brailovskaia VG, Khaspekov LG, Zinchenko VP, Luk'ianova LD Oxidationreduction states of rat nerve tissue in situ. // Biull Eksp Biol Med. -1989. №107(4).). –P 431-3.
73. Bräuner-Osborne H, Egebjerg J, Nielsen EO, Madsen U, Krogsgaard-Larsen
P.Brorson J.R. et al., Ligands for glutamate receptors: design and therapeutic
prospects. // J Med Chem. -2000. –v.13.- №43(14). Р.2609-45
150
74. Brose N. Membrane fusion takes excitatory turn: syntaxin, vesicle docking protein,
or glutamate receptor? // Cell. -1993.-№17;75(6). Р.1043-4.
75. Bulygina E., Gallant Boldyrev A., Bulygina E., Gallant S., Kramarenko G.,
Stvolinsky S., Yuneva M. Free radical generation in the brain of senescence
accelerated mice. // Pathophysiology. -1998. -№5. -Р.87.
76. Butterfield DA, Reed T, Perluigi M, De Marco C, Coccia R, Cini C, Sultana
R.2006.Elevated protein-bound levels of the lipid peroxidation product, 4-hydroxy2-nonenal, in brain from persons with mild cognitive impairment. // NeurosciLett. 2006.-№397(3). Р.170-3.
77. Behl C., Hovey L., et al., Bcl-2 prevents killing of neuronal cells glutamate but not
by amyloid beta protein, // Biochem. Biophys. Res. Com. -1993. P.949-956.
78. Cadet J.L. and Brannock C. Free radicals and the pathobiology of brain dopamine
systems. // Neurochem Int. -1998. -32(2). -Р.117-31
79. Calabrese JR, Ketter TA, Youakim JM, Tiller JM, Yang R, Frye MA. Adjunctive
armodafinil for major depressive episodes associated with bipolar I disorder: a
randomized, multicenter, double-blind, placebo-controlled, proof-of-concept study.
// J Clin Psychiatry. -2010. -№71(10). -Р. 1363-70.
80. Carney J.M., Hall N.C., Cheng M., Wu J., Butterfield D.A. Protein and lipid
oxidation followingischemia/reperfusion injury, the role of polyamines: an electron
paramagnetic resonance analysis.//Adv.Neurol. – 1996. - 71. – P. 259 – 268.
81. Carpenter D. Oxidative stress at molecular, cellular and organ levels
// Res.
Signpost. -2002., -Р. 77–88.
82. Chan P.H. Role of oxidants in ischemic brain damage //Stroke. – 1996. – V. 27. –
P. 1124 – 1129.
83. Chan P.H.,Kawase M., and Murakami K. Overexpression of SOD1 in transgenic
rats protects vulnerable neurons against ischemic damage after global cerebral
ischemia and reperfusion //J. Neurosci. – 1998. – V. 18. – P. 8292 – 8299.
84. Chan S.L., Mattson M.P. Caspase and calpain substrates: roles in synaptic
plasticity and cell death //J.Neurosci.Res. - 1999. – 58. - P.167 –190.
151
85. Chen J.J., and Yu B.P. Alterations in mitochondrial mrmbrane fluidity by lipid
peroxidation products //Free Radical Biol. Med. – 1994. – V. 17. – P 411 - 418.
86. Chen J, Ni H, Sun J, Weng G. G protein beta(1)gamma (2) subunits purification
and their interaction with adenylyl cyclase. // Sci China C Life Sci. -2003. №46(2). –Р.212-23
87. Chen Y. Cai R.Study and analytical application of inhibitory effect of captopril on
multienzyme redox system. // Talanta. -2003. -№61(6). -Р.855-61.
88. Clark W.M., and Zivin J.A. Antileukocyte therapy: preclinical trials and
combination therapy //Neurology. – 1997. – V. 49. – Suppl, 4. – P. S32 – S36.
89. Cohen G. Enzymatic/nonenzymatic sources of oxy-radicals and regulation of
antioxidant defenses //Ann.New York Acad.Sci. - 1994. – 738. – P. 8 – 14.
90. Contestabile A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of
neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. // Cerebellum. -2002. -№1(1). –
Р.41-55.
91. Coyle JT, Puttfarcken P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative
disorders. // Science. -1993. -Vol 262(5134).-Р. 689-95.
92. Curr Opin Immunol. The function of type I interferons in antimicrobial
immunity. // Review.Clin Infect Dis.- 2001.-№32(2). -Р.302-6
93. Dalle-Donne, R. Rossi, R. Colombo, D. Giustarini and A. Milzani Biomarkers of
oxidative damage in human disease. // Clinical Chemistry. -2006, vol. 52;4.- Р.
601-623.
94. Damon D.H.,D`Amore PA et al, Nerve growth factor and fibroblast growth factor
regulate neurite outgrowth and gene expression in PC12 cells via both protein
kinase C- and cAMP-independent mechanisms. // J,Cell.Biol. -1990. -№110. –
Р.1333-1339
95. Dingledine R, Borges K, Bowie D, Traynelis SF. The glutamate receptor ion
channels // Pharmacol Rev. 1999.-№51(1). -Р.7-61.
152
96.
Dobrota D., Fedorova T., Stvolinsky S.L., Babusikova E., Licavcanova K.,
Drgova A., Strapkova A., Boldyrev A.A. Carnosine protects the brain of rats and
Mongolian gerbils against ischemic injury: After-Stroke-Effect. // Neurochem.
Res. -2005, -V. 30 (10).-P. 1283 – 1288.
97. Dreher D, Vargas JR, Hochstrasser DF, Junod AF. Effects of oxidative stress and
Ca2+ agonists on molecular chaperones in human umbilical vein endothelial cells.
// Electrophoresis. -1995.-№16(7). -Р.1205-14.
98. Edwards MA., Loxley RA, Williams AJ, Connor M, Phillips. Lack of functional
expression of NMDA receptors in PC-12 cells. // Neurotoxicology. -2007
99. Elliot MA, Edwards HM Jr.Studies to determine whether an interaction exists
among boron, calcium, and cholecalciferol on the skeletal development of broiler
chickens. // Poult Sci.-1992. -№71(4).-Р.677-90.
100. Esterbauer H, Schaur RJ, Zollner H. Chemistry and biochemistry of 4hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. // Free RadicBiol Med. 1991.-Vol.11(1). -Р. 81-128
101. Fedorova TN, Yuneva MO, Boldyrev AA. Protective effect of carnosine on Cu,Znsuperoxide dismutase during impaired oxidative metabolism in the brain in vivo //
Bull Exp Biol Med. -2003. -135(2). -Р.130-2.
102. Fedorova, TN, et al. // Biochemistry. -2009. -№3. Р.62–5
103. Finkel T. Oxigen radicals and signaling//Curr. Opin. Cell. Biol. – 1998. - 10. - P.
248 – 253.
104. Fonteh AN, Harrington RJ, Huhmer AF, Biringer RG, Riggins JN, Quantification
of free amino acids and dipeptides using isotope dilution liquid chromatography
and electrospray ionization tandem mass spectrometry. // Amino Acids. -2007 .№32(2). Р.203-12.
105. Gaboury CL, Simonson DC, Seely EW, Hollenberg NK, Williams GH. Relation of
pressor responsiveness to angiotensin II and insulin resistance in hypertension. // J
Clin Invest. -1994. -№94(6). Р.2295-300.
106. Gamaley IA, Kirpichnikova KM, Klyubin IV. Activation of murine macrophages
by hydrogen peroxide. // Cell Signal. -1994.- №6(8). -Р.949-57.
153
107. Ge QF, Wei EQ, Zhang WP, Hu X, Huang XJ, Zhang L, Song Y, Ma ZQ, Chen Z,
Luo JH. Activation of 5-lipoxygenase after oxygen-glucose deprivation is partly
mediated via NMDA receptor in rat cortical neurons. // J Neurochem. -2006 .№97(4). -Р.992-1004.
108. Geering K.Lipase and unspecific esterase activity in the fat body of Aedes aegypti
L. // Acta Trop. -1975. -№32(3). –Р.273-6.
109. Greene L.A., TischierA.S. Nerve growth factor-induced process formation by
cultured rat pheochromocytoma cells. // Nature.-1976. -Vol 258(5533). –Р. 341342
110. Greene L.A., TischierA.S. Establishment of a noradrenergic clonal line of rat
adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor.//
ProcNatlAcadSci U S A.-1976. -Vol73(7). –P.2424-2428.
111. Greenlund L.J.S., Deckworth T.L., and Johnson E.M. Jr. Superoxide dismutase
delays neuronal apoptosis: a role for reactive oxygen species in programmed
neuronal death //Neuron – 1995. –V. 14. – P. 303 – 315.
112. Janet C., R. Wayne Barbee,Joseph T. Bielitzki, Leigh Ann Clayton, John C.
Donovan, Coenraad F. M. Hendriksen,
Dennis F. Kohn, Neil S. Lipman, Paul A. Locke, John Melcher, Fred W. Quimby,
Patricia V. Turner, University of Guelph, Canada
Geoffrey A. Wood, Hanno Wьrbel. Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals- Russian Version // National Academy Press, Washington. DC.1996.
113. Halliwell B., Vitamin C: antioxidant or pro-oxidant in vivo. //Free Radic.Res.1996. - 25. – Р. 439 - 454.
114. Halloran MC, Kalil K.Dynamic behaviors of growth cones extending in the corpus
callosum of living cortical brain slices observed with video microscopy. // J
Neurosci. -1994.-№14(4).-Р.2161-77.
115. Harwat, M., Bőhm, V., and Bitsch Assessment of antioxidant activity by using
different in vitro methods.//Free Rad. Res. -2002. -v.36.-№ 2. Р.177-187.
154
116. Hayashi T., Sakurai M., Itoyama Y., Abe K. Oxidative damage and breakage of
DNA in rat brain after transient MCA occlusion//Brain Res. - 1999. - 832. – P. 159
– 163.
117. Henry GH. Mirror, mirror on the wall, can the brain tell right from left at all? //
Clin Exp Optom. -2001. -№84(4). -Р.195-199.
118. Hipkiss AR. Carnosine and its possible roles in nutrition and health. // Adv Food
Nutr Res. -2009. -№57. –Р.87-154
119. Hipkiss AR. On the enigma of carnosine's anti-ageing actions. // Exp Gerontol. 2009.-№44(4).-Р.237-42
120. Hipkiss AR.Carnosine, diabetes and Alzheimer's disease. // Expert Rev Neurother.
-2009.-№9(5). -Р.583-5
121. Hosokawa M. A higher oxidative status accelerates senescence and aggravates agedependent disorders in SAMP strains of mice. // Mech. Ageing dev. -2002. –№
123. – Р. 1553 – 1561.
122. Hosokawa M. A higher oxidative status accelerates senescence and aggravates agedependent disorders in SAMP strains of mice. // Mech Ageing Dev. -2002 .№123(12). -Р.1553-61.
123. Igarashi K, Kashiwagi K.Characterization of genes for polyamine modulon. //
Methods Mol Biol. -2011. -№720. –Р.51-65.
124. Igarashi K., Kashiwagi K. Modulation of cellular function by polyamines. // J.
Biochem. Cell Biol. -2010. -№42. –Р.39-51.
125. Igarashi K., Kashiwagi K. Use of polyamine metabolites as markers for stroke and
renal failure. // Methods Mol Biol. -2011. -№720. –Р.395-408.
126. Ivanova S., Botchkina G.I., Al-Abed Y.
et al. Cerebral ischemia enhances
polyamine oxidation: identification of enzymatically formed 3-aminopropanal as
an endogenous mediator of neuronal and glial cell death. // J. Exp. Med.-1998.№20. –Р.327-340.
127. Jacobson M.D. Reactive oxygen species and programmed cell death //Trends
Biochem.Sci. – 1996. – V. 21. – 83 – 86.
155
128. Jacobson N.D., Burne J.F., and Raff M.C. Programmed cell death and Bcl-2
protection in the absence of a nucleus //EMBO J. – 1994. – V. 13. – P. 1899 –
1910.
129. Johnson, P., Wei, Y., Huentelman, M.J., et al.. // Free Rad. Res. 1998, v.28, №4,
p.393-402.
130. Kahler W., Kuklinski B., Ruhlmann C., Plotz C. Diabetes mellitus--a free radicalassociated disease. Results of adjuvant antioxidant supplementation //Z Gesamte
Inn Med.-1993. -№48(5). –Р.223-32.
131. Gries F.A.; Wessel K. eds. The role of anti-oxidants in diabetes mellitus // Oxygen
radicals and anti-oxidants in diabetes. – 1993.-Р. 33 - 53;
132. Karnaukhova NA, Sergievich LA, Karnaukhov VN. Analysis of the temporal
organization of the synthesis of RNA and protein in blood lymphocytes during the
immune response of the body. // Biofizika. -2008-№53(4). –Р.632-7.
133. Kashiwagi K, Igarashi K.Identification and assays of polyamine transport systems
in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. // Methods Mol Biol. -2011. №720. –Р.295-308.
134. Katoh H, Yasui H, Yamaguchi Y, Aoki J, Fujita H, Mori K, Negishi M.Small
GTPase RhoG is a key regulator for neurite outgrowth in PC12 cells. // Mol Cell
Biol.-2000.-№20(19). –Р.7378-87.
135. Kitado H, Higuchi K, Takeda T. Molecular genetic characterization of the
senescence-accelerated mouse (SAM) strains. // J Gerontol. -1994 -№49(6).-Р.24754.
136. Klyubin IV, Kirpichnikova
KM, Gamaley
IA.
Hydrogen
peroxide-induced
chemotaxis of mouse peritoneal neutrophils. // Eur J Cell Biol. -1996. -№70(4). –
Р.347-51.
137. Kohno K., Higuchi T., Ohta S., Kumon Y., and Sakaki S. Neuroprotective nitric
oxide synthase inhibitor reduces intracellular calcium accumulation following
transient global ischemia in the gerbil //Neurosci Lett. – 1997. – V. 224. – P. 17 –
20.
156
138. Krippeit-Drews P, Düfer M, Drews G. Parallel oscillations of intracellular calcium
activity and mitochondrial membrane potential in mouse pancreatic B-cells. //
Biochem Biophys Res Commun. -2000.- №267. -Р.179-83.
139. Krogsgaard-Larsen P, Hansen JJ. Naturally-occurring excitatory amino acids as
neurotoxins and leads in drug design. // Toxicol Lett. -1992.-Р.409-16.
140. Krohn AJ, Preis E, Prehn JH.Staurosporine-induced apoptosis of cultured rat
hippocampal neurons involves caspase-1-like proteases as upstream initiators and
increased production of superoxide as a main downstream effector. // J Neurosci. 1998.-№18(20). –Р.8186-97.
141. Kuida,K, Zhen T., Na.S. et al. Decreased apoptosis in the brain and premature
lethality in CPP32-deficient mice. // Nature. -1996.-№384. -Р.368-372.
142. Kummer JL, Rao PK, Heidenreich KA.Apoptosis induced by withdrawal of trophic
factors is mediated by p38 mitogen-activated protein kinase. // J Biol Chem. 1997.-№272(33). -Р.20490-4.
143. Kuo DW, Chan HK, Wilson CJ, Griffin PR, Williams H, Knight WB. Escherichia
coli leader peptidase: production of an active form lacking a requirement for
detergent and development of peptide substrates. // Arch Biochem Biophys. 1993 .-№303(2).-Р.274-80.
144. Kuo SC, Lauffenburger DA.Relationship between receptor/ligand binding affinity
and adhesion strength. // Biophys J. -1993.-№65(5). –Р.2191-200.
145. Lafon-Cazail M., Pietri S., Culcasi M. and Bockaert J. NMDA-dependent
superoxide production and neurotoxicity //Nature. – 1993. – V. 364. – P. 5353 –
5357.
146. Lamoureux P, Altun-Gultekin ZF, Lin C, Wagner JA, Heidemann SR. Rac is
required for growth cone function but not neurite assembly. // J Cell Sci. -1997.№110. –Р.635-41.
147. Leclerc CL, Chi CL, Awobuluyi M, Sucher NJ.Expression of N-methyl-Daspartate receptor subunit mRNAs in the rat pheochromocytoma cell line PC12. //
Neurosci Lett. -1995. -№201(2). –Р.103-6.
157
148. Lenney, J. F. Hoppe Seyler. Separation and characterization of two carnosinesplitting cytosolic dipeptidases from hog kidney (carnosinase and non-specific
dipeptidase). // Biol. Chem. -1990, v.371, №5, p.433-440.
149. Linnik M.D., Zobrist R.H., Hatfield M.D. Evidence supporting a role for
programmed cell death in focal cerebral ischemia in rats//Stroke. - 1993. – 24. - p.
2002 – 2008.
150. Li-Weber M, Giaisi M, Treiber MK, Krammer PH.The anti-inflammatory
sesquiterpene lactone parthenolide suppresses IL-4 gene expression in peripheral
blood T. // Eur J Immunol. -2002.-№32(12). –Р.3587-97.
151. Lo, Y.Y. and Cruz T.F. Involvement of reactive oxygen species in cytokine and
growth faktor induction of c-fos expression in chondrocytes// J. Biol. Chem. 1995. - 270. – P. 11727 - 11730.
152. Lou J., Robinson P., Shi R. Acrolein-induced cell death in PC12 cells: role of
mitochondria-mediated oxidative stress. // Neurochemistry international. -2005.Vol. 47. -Р.449-457.
153. Luk'ianova LD, Chernobaeva GN, Romanova VE.An external oxidation pathway
in nerve tissue. // Biull Eksp Biol Med. -1989.-№107(4). Р.431-3
154. Luk'ianova LD, Vlasova IG.The energy mechanism of phasic changes in the
spontaneous electrical activity of the neurons during hypoxia. // Biull Eksp Biol
Med. -1989.-108(9). -Р.266-9.
155. Luo J, Shi R. Acrolein induces oxidative stress in brain mitochondria. //
Neurochem Int.-2005. Vol46(3). –Р.243-52.
156. Luo J., Shi R. Acrolein induces axolemmal disruption, oxidative stress, and
mitochondrial impairment in spinal cord tissue. // Neurochem Int. -2004. Vol44(7). –Р. 475-86.
157. Luo X., Reichetzer B., Trines J. L-carnitine attenuates doxorubicin-induced lipid
peroxidation in rats // Free Radic. Biol. Med.–1999. - V. 26, № 9- 10. – P. 1158 –
1165.
158. Lyrer P. et al., Levels of low molecular weight scavengers in the rat brain during
focal ischemia // Brain Res. – 1991. - 567. - P.317 - 320.
158
159. Majno G., and Joris I. Apoptos, oncosis and necrosis. An overview of cell death //
Am.J.Pathol. – 1995. – V.146. – P. 3 – 15.
160. Margolis FL, Grillo
M, Grannot-Reisfeld
characterization
immunocytochemical
and
N, Farbman
localization
AI.Purification,
of
mouse
kidney
carnosinase. // Biochim Biophys Acta.-1983.-№744(3). –Р.237-48.
161. Margolis RL, Robinson RG.Right and left cortical lesions asymmetrically alter
cerebrovascular permeability in the rat. // Brain Res.-1985.-№359(1-2).-Р.81-7.
162. Mattson M.P. and Mark R.J. Excitotoxicity and excitoprotection in vitro.
//Adv.Neurol. - 1996. -71. – P. 1 – 37.
163. Mattson M.P. Chan S.L., LaFerla F.M., Leissring M, Shepel P.N.,Geiger J.D.
Endoplasmatic reticulum signaling in neuronal plasticity and neurodegenerative
disorders. //Trends Neurosci. - 2000.-Р. 23
164. McBain CJ, Mayer ML.N-methyl-D-aspartic acid receptor structure and function.
// Physiol Rev. -1994.-№74(3). -Р.723-60.
165. Mignotte B. and Vayssiere J.L. Mitochondria and apoptosis //Eur.J.Biochem. –
1998. - 252. – P. 1- 15.
166. Mori H, Mishina M.Structure and function of the NMDA receptor channel. //
Neuropharmacology. -1995.-№34(10). -Р.1219-37.
167. Motoyama N, Wang F, Roth KA, Sawa H, Nakayama K, Nakayama K, Negishi
I, Senju S, Zhang Q, Fujii S, et al.Massive cell death of immature hematopoietic
cells and neurons in Bcl-x-deficient mice. // Science. -1995.-№267(5203).-Р.150610.
168. Nedergaard M. and Hansen A.J. Characterization of cortical depolarization evoked
in focal cerebral ischemia // J. Cereb. Blood Flow Metab. – 1993. – V. 13. – P. 568
– 574.
169. Nicotera P and Lipton S.A. Excitotoxins in neuronal apoptosis and necrosis.
//J.Сereb.Blood Flow Metab. – 1999. – 19. – P. 583 – 591.
170. Nicotera P. Apoptosois and neurodegeneration: role of caspases. In Krieglstein J.
and Klumpp S. Pharmacology of cerebral ischemia. // Med. Pharm Sci. Publ.,
Stuttgart, 2000. - Р. 3 - 9.
159
171. Nicotera P., Bonfoco E., and Brune Mechanisms for nitric oxide-induced cell
death: involvement of apaptosis //Adv. Immunol. – 1995. – V.5 – P. 411 – 420.
172. O’Brien J.S., Sampson E.L. Fatty acid and fatty aldegyde composition of the major
brain lipids in normal human gray matter, whyte matter and myelin. //J.Lipid Res. 1965. - 6. - P. 545-551.
173. Ohta A, Akiguchi I, Seriu N, Ohnishi K, Yagi H, Higuchi K, Hosokawa M.
Deterioration in learning and memory of inferential tasks for evaluation of
transitivity and symmetry in aged SAMP8 mice. // Hippocampus. -2002-№12(6). –
Р.803-10.
174. Okabe H, Beppu T, Ishiko T, Horino K, Masuda T, Hayashi H, Komori H, Tanaka
H, Takamori H, Masahiko H, Baba H.Multimodal treatment for adrenal metastases
from hepatocellular carcinoma (HCC). // Gan To Kagaku Ryoho. -2007 .-№34(12).
-Р.1973-5.
175. Olanov C.W. A radical hypothesis of neurodegeneration //Trends Neurosci. - 1993.
– 16. - P. 439 - 444.
176. Oppenheim R., Cell death during development of the nervous system.1991. // Ann.
Rev. Neurol. 14,453-501
177. Oyama H, Iwakoshi T, Niwa M, Kida Y, Tanaka T, Kitamura R, Maezawa S,
Kobayashi T.Coagulation and fibrinolysis study after local thrombolysis of a
cerebral artery with urokinase. // Neurol Med Chir .-1996. -№36(5). -Р.300-4.
178. Packer L., Trischler H.J.and Wessel K. Neuroprotection by the metabolic
antioxidant -lipolic acid. // Free Radical Biol. Med.- 1997. - Vol. 22, N. 1-2 P. - 359 - 378.
179. Patel D.J. and Shen C. Sugar pucker geometries at the intercalation site of
propidium diiodide into miniature RNA and GNA duplexes in solution. // Proc
Natl Acad Sci USA. -1978. -№75 (6). –Р.2553 - 7.
180. Patel T, Gores GJ, Kaufmann SH.The role of proteases during apoptosis. // FASEB
J. -1996.-№10(5).-Р.587-97.
181. Pettmann B, Henderson CE.Neuronal cell death. // Neuron. -1998.-№20(4).-Р.63347.
160
182. Prehn J.H.M., Karkoutly C., Nuglisch J., Peruche B., Krieglstein J. Dihydrolipoate
reduces neuronal injury after cerebral ischemia //J. Cereb. Blood Flow Metab. 1992. - V. 12. - P. 78 – 87.
183. Raff M., Barres.J.,Burne J,F, Coles. H.Ishizaki Y. and Jacobson MD // Science.1993. -№262. -Р.695-700
184. Rao VK, Carlson EA, Yan SS.Mitochondrial permeability transition pore is a
potential drug target for neurodegeneration. // Biochim Biophys Acta. -2013. №18.
185. Rathmell J.C. and Thompson C.B. The central effectors of cell death in the
immune system//Annu. Rev. Immunol. – 1999. - 17. – P. 781 – 828.
186. Reddy MK, Labhasetwar V. Nanoparticle-mediated delivery of superoxide
dismutase to the brain: an effective strategy to reduce ischemia-reperfusion injury.
// FASEB J.- 2009-№23(5).-Р.1384-95
187. Reich EE, Markesbery WR, Roberts LJ 2nd, Swift LL, Morrow JD, Montine TJ.
Brain regional quantification of F-ring and D-/E-ring isoprostanes and
neuroprostanes in Alzheimer's disease. // Am J Pathol. -2001. -Vol158(1). –Р. 293297.
188. Rice M.E Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. //Trends in
Neurosciencs. - 2000. - V.23, N 5. – P. 209 – 216.
189. Rice M.E. High levels of ascorbic acid, not glutathione, in the CNS of anoxia –
tolerant reptiles contrasted with levels in anoxia-intolerant species //J.Neurochem. 1995. – 64. – P. 1790 – 1799.
190. Roveri A, Coassin M, Maiorino M, Zamburlini A, van Amsterdam FT, Ratti E,
Ursini F.Effect of hydrogen peroxide on calcium homeostasis in smooth muscle
cells. // Arch Biochem Biophys. №1992.-№297(2). -Р.265-70.
191. Saiki R., Nishimura K., Ishii I. et al. Intense correlation between brain infarction
and protein-conjugated acrolein. // Stroke. -2009-№40.-Р.3356-3361.
192. Saito Y, Tsuzuki K, Yamada N, Okado H, Miwa A, Goto F, Ozawa S.Transfer of
NMDAR2 cDNAs increases endogenous NMDAR1 protein and induces
161
expression of functional NMDA receptors in PC12 cells. // Brain Res Mol Brain
Res. -2003.-№110(2). –Р.159-68.
193. Saitoh Y, Hosokawa M, Shimada A, Watanabe Y, Yasuda N, Takeda T, Murakami
Y.Age-related hearing impairment in senescence-accelerated mouse (SAM). //
Hear Res. -1994.-№75(1-2).-Р.27-37.
194. Schiller M, Blank N, Heyder P, Herrmann M, Gaipl US, Kalden JR, Lorenz
HM.Induction of apoptosis by spermine-metabolites in primary human blood cells
and various tumor cell lines. // Apoptosis. -2005. -№10(5). -Р.1151-62.
195. Schipper G., Verhofstad A.A.J. Distribution Patterns of Ornithine Decarboxylase
in Cells and Tissues: Facts, Problems, and Postulates // J. Histochem. Cytochem.2002.-№ 50.-Р.1143-1160.
196. Schlesier K, Harwat M, Böhm V, Bitsch R.Assessment of antioxidant activity by
using different in vitro methods. // Free Radic Res. -2002.-№36(2).-Р.177-87.
197. Shen Y, Wang Y, Shi Y, Liu J, Liu Y.Clinicopathologic study of endometrial
dedifferentiated endometrioid adenocarcinoma: a case report. // Int J Clin Exp
Pathol. -2012.-№5(1).-Р.77-82.
198. Shen Y., Hu WW., Fan YY at al., Carnosine protects against NMDA-induced
neurotoxicity in differetniated rat PC-12 cells through carnosine- histidinehistamine pathway and H(1)/H(3)receptors. // Biochem Pharmacology - 2007,№73 (5).-Р. 907-17
199. Sies H. Oxidative stress: oxidants and antioxidants // Academic Press.- 1997 .№82(2).-Р.291-5
200. Singh NK, Behera DR, Agrawal A, Singh MN, Kumar V, Godhra M, Gupta A,
Yadav DP, Singh U, Pandey LK, Matah M.Hospital based prospective longitudinal
clinical and immunologic study of 179 patients of primary anti-phospholipid
syndrome.Int J Rheum Dis. 2013 Oct;16(5):547-55. doi: 10.1111/1756185X.12150.
201. Song H, Xu X, Wang H, Wang H, Tao Y. Exogenous gamma-aminobutyric acid
alleviates oxidative damage caused by aluminium and proton stresses on barley
seedlings. // J Sci Food Agric. -2010.-№90(9).-Р.1410-6
162
202. Stvolinskii SL, Fedorova TN, Yuneva MO, Boldyrev AA.Protective effect of
carnosine on Cu,Zn-superoxide dismutase during impaired oxidative metabolism in
the brain in vivo. // Bull Exp Biol Med. -2003.-№135(2). -Р.130-2.
203. Stvolinsky S, Antipin M, Meguro K, Sato T, Abe H, Boldyrev A.Effect of
carnosine and its Trolox-modified derivatives on life span of Drosophila
melanogaster. // Rejuvenation Res. -2010.-№13(4). –Р.453-7.
204. Stvolinsky S, Kukley M, Dobrota D, Mezesova V, Boldyrev A.Carnosine protects
rats under global ischemia. // Brain Res Bull. -2000.-№53(4).-Р.445-8.
205. Stvolinsky SL, Dobrota D.Anti-ischemic activity of carnosine. // Biochemistry.2000.-№65(7).-Р.849-55.
206. Su JH, Anderson AJ, Cummings BJ, Cotman CW.Immunohistochemical evidence
for apoptosis in Alzheimer's disease. // Neuroreport. -1994.-№20 –Р. 2529-33.
207. Sucher NJ, Akbarian S, Chi CL, Leclerc CL, Awobuluyi M, Deitcher DL, Wu MK,
Yuan JP, Jones EG, Lipton SA.Developmental and regional expression pattern of a
novel NMDA receptor-like subunit (NMDAR-L) in the rodent brain. // J
Neurosci. -1995.-№15(10) –Р.6509-20
208. Sundaresan M, Yu ZX, Ferrans VJ, Irani K, Finkel T.Requirement for generation
of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. // Science. -1995.№270(5234). –Р.296-9.
209. Sureda FX, Escubedo E, Gabriel C, Camarasa J, Camins A.Effect of glutamate
receptor ligands on mitochondrial membrane potential in rat dissociated cerebellar
cells. // Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. -1996.-№354(4).-Р.420-3.
210. Suzuki J., Fuyimoto S., Mizoi K., Oba M. The protective effect of combined
administration of antioxidants and perfluorochemicals on cerebral ischemia.
//Stroke. - 1984. - 4. - P. 672 - 678.
211. Suzuki J., Imaizumi S., Кayama T., Yoshimotop T. Chemiluminescence in hypoxic
brain - the second report: cerebral protecnive effect of mannitol, vitamin E and
glucocorticoid. //Stroke - 1985. - V. 16, №. 4. - P. 695 - 700.
163
212. Tang XQ, Song JP, Chen L, Song DL, Mao Y, Zhou LF.Surgical treatment for the
giant aneurysms of middle cerebral artery. // Zhonghua Wai Ke Za Zhi. -2009.№47(14). –Р.1075-8.
213. Thomas M.J. The role of free radicals and antioxidants: how we know they are
working? //Crit.Rev.Food Sci.Nutr. - 1995. - V. 35. - P. 21 - 39.;
214. Trompier D, Vejux A, Zarrouk A, Gondcaille C, Geillon F, Nury T, Savary S,
Lizard G.Brain peroxisomes. // Biochimie. -2013
215. Troy C.M., and Shelanski M.L. Downregulation of copper/zinc superoxide
dismutase (SOD1) causes neuronal cell death. //Proc.Natl.Acad.Sci USA. – 1994. –
V. 91. – P. 6384 – 6387.
216. Vladychenskaya,
E.A.,
Tyulina,
O.,
Urano,
S.,
and
Effect of homocysteine and homocysteic acid on blood cells.//
Boldyrev,
Cell
A.
Biochem.
Funct.-2011. –№29, -Р.527–533.
217. Varnum-Finney B, Reichardt LF.Vinculin-deficient PC12 cell lines extend
unstable lamellipodia and filopodia and have a reduced rate of neurite outgrowth. //
J Cell Biol. -1994. –№127(4). -Р.1071-84.
218. Vaudry D, Stork PJ, Lazarovici P, Eiden LE. Signaling pathways for PC12 cell
differentiation: making the right connections. // Science. -2002.-Vol.296(5573). –
Р.1648-1649.
219. Wang F, Li ZH.A study on miRNA alternation after H2O2-induced PC12 cell
apoptosis using microarray technique. // Fa Yi Xue Za Zhi. -2007 .-№23(5).Р.328-31.
220. Wesering RH, Ewing AG. The PC12 cell as model for neurosecretion. // Acta
Physiol. -2008. -Vol. 192(2). –Р. 273-285.
221. Whiteley W., Tseng M., Sandercock P. Blood biomarkers in the diagnosis of
ischemic stroke a systematic review. // Stroke. -2008.-Vol.39.-Р.2902-2909
222. Williams TI, Lynn BC, Markesbery WR, Lovell MA. Increased levels of 4hydroxynonenal and acrolein, neurotoxic markers of lipid peroxidation, in the
brain in Mild Cognitive Impairment and early Alzheimer's disease. // Neurobiol
Aging. -2006. -Vol.27(8).-Р.1094-1099.
164
223. Winn SR, Tresco PA, Zielinski B, Greene LA, Jaeger CB, Aebischer P.Behavioral
recovery following intrastriatal implantation of microencapsulated PC12 cells. //
Exp Neurol. -1991. №113(3).-Р.322-9.
224. Wolvertang E.J., Jonson K.L., Krauer K., Ralph S.J., and Linnane A.W.
Mitochondrial respiratory chain inhibitors induce apoptosis. //FEBS Lett. – 1994. –
V. 339. – P. 40 – 44.
225. Yao R, Cooper GMRequirement for phosphatidylinositol-3 kinase in the
prevention of apoptosis by nerve growth factor. // Science. -1995.-№267(5206).Р.2003-6.
226. Zaidan E., and Sims N.R. The calcium content of mitochondria from brain
subregions following shot-term forebrain ischemia and recirculation. //
J.Neurochem.- 1994. – V. 63. – P. 1812 – 1819.
227. Zhong Y, Bellamkonda RV.Biomaterials for the central nervous system. // J R Soc
Interface. -2008.-№5(26). –Р.957-75.
228. Zolnik, B.S.and Sadrieh, N. Regulatory perspective on the importance of ADME
assessment of nanoscale material containing drugs. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2009. -V.61. -№6. –Р.422–427.
165