Оригинальное исследование - Белорусская медицинская

УДК 616.36 – 031.81]- 008.9:546.72
РОЛЬ C282Y и H63D МУТАЦИЙ HFE ГЕНА В ФОРМИРОВАНИИ
ВТОРИЧНОЙ ПЕРЕГРУЗКИ ЖЕЛЕЗОМ
(Оригинальное исследование)
Л.С. Богуш1, Л.Н. Сивицкая2, Н.Г. Даниленко2
1
ГУО «Белорусская медицинская академии последипломного образования»,
2
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»
Перегрузки железом (ПЖ) является патологическим состоянием,
характеризующимся количественным увеличением элементного железа в
организме, сопровождающимся повреждением органов и тканей вследствие
токсического действия избытка микроэлемента [11,14,17,21,23,24,26]. На
сегодняшний день известно, что ПЖ является причиной или сопровождает
течение более 20 различных заболеваний. Согласно рабочей классификации
болезней перегрузки железом (по Andrews N.S. et al., 2000), для врожденных,
генетически детерминированных заболеваний принято использовать термин
«гемохроматоз», а в отношении приобретенных синдромов - термин
«вторичная перегрузка железом» [1].
Сегодня большой интерес у клиницистов вызывает проблема формирования
ВПЖ при хронических заболеваниях печени, особенно индуцированных
алкоголем или вирусами гепатитов В и С. В этих случаях механизм ПЖ повышенное всасывание известен более 20 лет, однако причины усиленной
абсорбции до сих пор дискутируются [9,14,16,18,20,22,26,27,31]. На данный
момент времени исследователи активно обсуждают значение двух основных
факторов ВПЖ: этиологический (патологическое влияние на обмен железа
алкоголя и вирусов гепатитов) и генетический (мутации белков-регуляторов
обмена железа) [7,8,14,19,22].
С момента открытия HFE гена (G. Feder, 1996г.), особое значение в
формировании ПЖ уделяется носительству его двух основных мутаций - C282Y
и H63D. Эти дефекты определяют деградацию HFE протеина – белка
регулирующего абсорбцию железа, что приводит к чрезмерному поступлению
микроэлемента в клетки [6,11,15,17,18,21,27,31]. Было установлено, что самая
тяжелая ПЖ встречается у гомозигот по C282Y «мажорной» мутации, которая и
обуславливает развитие гемохроматоза. Остальные варианты мутаций (C282Y и
H63D гетерозиготы или H63D гомозиготы) принято считать «минорными»,
носительство которых фенотипически может не проявляться или проявляется
ПЖ легкой степени. Как оказалось на практике, наличие дефектов HFE гена не
является однозначным фактором для развития ПЖ. Данные, полученные в
результате
широкомасштабных
популяционных
исследований,
свидетельствуют, что избыточное содержание железа в организме
регистрируется только у трети гомозигот по C282Y [7,10,12,13,16,23]. Кроме
этого замечено, что степень депонированного железа не всегда четко
коррелирует с типом мутации HFE гена, то есть наряду с бессимптомным
носительством мажорных мутаций, встречается тяжелая ПЖ при минорных.
[1,6,7,13,23,25]. Принимая во внимание активное участие печени в метаболизме
железа (в том числе и синтез HFE белка) и частую встречаемость мутаций HFE
гена (10-13% северо-европейской популяции) исследователи допускают
вероятность того, что дефекты, фенотипически не проявляющие себя у
здоровых людей, могут способствовать нарушению обмена железа у больных c
хроническими заболеваниями печени [1,2,8,9,10,11,17,19,31].
В настоящей статье рассматриваются данные молекулярно-генетической
диагностики у больных алкогольной болезнью печени (АБП) и хронической
HCV-инфекцией, имевшие высокие значения сывороточных маркеров ПЖ.
Материалы и методы 30 больным с заболеваниями печени алкогольной
этиологии и HCV-инфекцией проведено генотипирование HFE гена по C282Y и
H63D мутациям. Критерии включения: наличие признаков хронического
диффузного заболевания печени (гепатит или цирроз), гиперферритинемия
(более 250 мкг/мл у мужчин, более у 200 мкг/мл женщин) и/или коэффициент
насыщения
трансферрина
железом
(НТЖ)
превышающий
45%.
Серологическими признаками ПЖ, согласно рекомендациям Американской
Ассоциацией по изучению заболеваний печени (AASLD), принимали сочетание
НТЖ>45% с гиперферритинемией [6,12,16,28,29,30,32]. Больные с
заболеваниями печени обследованы в соответствии с «Протоколами
обследования и лечения пациентов с патологией органов пищеварения в
амбулаторно-поликлинических и стационарных условиях» (2006). Диагноз
алкогольной болезни печени (АБП) устанавливали на основании комплексной
диагностики, включающей сбор алкогольного анамнеза, оценку риска
потребления алкоголя по тест-вопросникам ВОЗ и CAGE, выявления
лабораторных и морфологических признаков алкогольной болезни. В группу
больных хронической HCV-инфекцией включались пациенты с наличием
положительных anti-HCV и HCV РНК, не получавших этиотропного лечения.
Стадия заболевания печени определялась на основании лабораторных,
инструментальных и морфологических данных.
Определение лабораторных показателей состояния депо железа проводили на
базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Белорусской
медицинской академии последипломного образования. Изучали уровень
сывороточного железа (СЖ), общую железосвязывающую способность
сыворотки крови (ОЖСС) с последующим вычислением коэффициента
насыщения трансферрина железом (НТЖ), содержание сывороточного
ферритина (СФ) [4,32]. Исследования проводили на автоматическом
биохимическом анализаторе «Dialab» (Австрия) реактивами НТПК «Анализ Х»
(Республика Беларусь). Определение количества сывороточного ферритина
(СФ) проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа набором
«ИФА-Ферритин» УП «ХОПиБОХ» (Республика Беларусь). Кроме
серологических в исследовании использовались морфологические методы
диагностики состояния обмена железа. Наличие железа в биоптатах печени
определялось с помощью специальной реакции с ферроцианидом по методу
Перлса.
Диагностику мутаций C282Y и H63D гена HFE проводили в лаборатории
нехромосомной наследственности Института генетики и цитологии НАН
Беларуси методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) [4]. Для получения
генетического материала забирали образцы капиллярной крови на целлюлозный
носитель и затем выделяли
тотальную ДНК из лейкоцитов крови. ПЦР
диагностику выполняли на амплификаторе MyCyclerTM Termal cycler (BIORAD) с
последующей рестрикцией продуктов ПЦР и анализом рестрикционных
фрагментов методом гель-электрофореза. Результаты электрофоретического
разделения фрагментов фиксировали на цифровую камеру Nikon 2100.
Статистический анализ результатов проводился при помощи пакета
программ статистического анализа STATISTICA 6.0 (С. Гланц 1998; О.Ю.
Реброва, 2003). Проверка соответствия распределения количественных данных
закону нормального распределения выполнялась с помощью критерия ШапироУилка (W-критерий). Для описания вариационных рядов в случае нормального
распределения признака использовались выборочная средняя (X), стандартное
отклонение (σ), минимальное (Min) и максимальное (Max) значения признака. В
случае неправильного распределения признака для описательной статистики
использовалось определение минимального (Min) и максимального (Max)
значений, медианы (Ме), 25-го и 75-го квартилей (Р25 и Р75). Для
сравнительного анализа симметричных вариационных рядов использовался
критерий Стьюдента (t). При неправильном распределении признака
использован непараметрический метод для сравнительного (критерий МаннаУитни, и корреляционного анализа по Спирмену. Сравнение качественных
характеристик проводилось с использованием критерия 2. Для относительных
частот определялся 95% ДИ. Вероятность справедливости нулевой гипотезы
признавалась при значениях Р>0,05.
Результаты и обсуждение.
Из 30 обследованных больных мутации HFE гена по С282Y и H63D были
обнаружены у 11 (36,7%, ДИ 95% 19,9-56,1) человек. Среди выявленных
вариантов генотипов наблюдались: 1 (3,3%, 95% ДИ 1,0-17,2) гетерозигота по
C282Y мутации, 8 (26,7%, 95% ДИ 14,7-49,4) гетерозигот по H63D мутации и 2
(6,7%, 95% ДИ 8,0-22,1) гомозиготы по H63D мутации. У 19 (63,3%, ДИ 95%
43,9-80,1) пациентов мутаций по 282 и 63 аллелям HFE гена обнаружено не
было. Количество и распределение рестриктных фрагментов, полученных в
процессе элекрофоретического разделения, представлены на рис. 1 и 2.
Рис. 1 Электрофореграммы ПДРФ-фрагментов гена HFE для идентификации
C282Y и H63D мутаций
Проведено сопоставление основных демографических характеристик
пациентов, этиологии и стадии заболевания печени с показаниями
серологических маркеров обмена железа уровней (НТЖ и СФ),
морфологическими признаками ПЖ – гемосидероз печени (ГСП) и
результатами генотипирования. В группу исследования входило 19 мужчин и 11
женщин, а средний возраст пациентов составил 44,56±12,88 лет. Половина
больных (15 человек) в анализируемой группе имели АБП, а другая половина хроническую HCV-инфекцию. Стадия поражения печени у 17 человек
соответствовала хроническому гепатиту, а у 13 – ЦП. Кроме этого, у двух
пациенток с хронической HCV-инфекцией на фоне фиброза 4степени были
обнаружены клетки гепатоцеллюлярного рака (ГЦР). Медиана СФ в группе
составила 497,4 мкг/л (Min-243,15, Max-2320,80 мкг/л) при среднем значении
НТЖ (54,88±19,58%). Серологические признаки ПЖ имели 18 (60%) больных.
Морфологическое исследование на железо – реакция с ферроцианидом по
методу Перлса проведено у 9 пациентов с хронической HCV-инфекцией. В
таблице 1 представлена описательная характеристика больных исследуемой
группы.
Таблица 1 – Описательная характеристика больных с результатами
генотипирования по C282Y и H63D мутациям HFE гена
№
Пол,
Этиообразца
логия
возраст
(лет)
Стадия заболеСФ
Результаты
вания печени
НТЖ
мкм/л ГСП генотипирования
%
C282Y H63D
4
76
77
90
95
110
128
139
152
155
163
166
169
Ж., 44
Ж., 56
M., 47
М., 67
Ж., 59
М., 42
М., 43
М., 50
М., 28
М., 56
М., 24
М., 35
М., 35
АБП
АБП
АБП
АБП
АБП
АБП
АБП
АБП
HCV
АБП
HCV
HCV
HCV
ЦП
ЦП
ХГ
ЦП
ХГ
ЦП
ЦП
ЦП
ХГ
ЦП
ХГ
ХГ
ХГ
44
75
71
50
58
69
52
67
45
35
34
32
43
176
179
М., 30
М., 32
HCV
HCV
ХГ
ХГ
33
41
734,47 618,71 1340,62 351,50 262,00 1918,33 415,65 650,00 288,49 2320,80 378,00 Нет
462,76 Нет
275,16 Есть
N/N
N/N
C282Y/N N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/H63D
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/ H63D
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
H63D/H63D
586,00 Нет N/N
N/N
551,09 Нет N/N
H63D/
H63D
180
181
183
184
189
197
208
212
214
215
221
225
227
229
232
М., 50
М., 40
Ж., 49
М., 41
M., 44
М., 41
М., 29
Ж., 56
Ж., 22
Ж., 63
Ж., 53
Ж., 61
Ж., 67
Ж., 25
Ж., 48
АБП
АБП
АБП
HCV
АБП
HCV
АБП
АБП
HCV
HCV
HCV
HCV
HCV
HCV
HCV
ХГ
ХГ
ХГ
ХГ
ХГ
ХГ
ХГ
ХГ
ХГ
ЦП, ГЦР
ЦП
ЦП
ЦП, ГЦР
ЦП
гепатит
67
49
58
81
68
48
88
28
35
104
58
84
41
30
32
677,70 307,88 619,70 243,15 Нет
532,11 339,47 Нет
1091,00 600,00 286,55 Нет
284,87 Есть
723,00 784,00 255,00 290,00 250,00 Нет
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/N
N/ H63D
N/ H63D
N/ H63D
N/N
N/N
N/ H63D
N/ H63D
N/N
N/N
N/ H63D
N/N
В ходе сопоставления данных оказалось, что 7 из 11 пациентов с мутациями
HFE гена имели серологические признаки ПЖ, а у 4 была зафиксирована лишь
изолированная гиперферритинемия. Необходимо отметить, что Ме возраста у
больных с мутациями и лабораторными признаками ПЖ составила 53,0 года, а у
лиц с изолированной гиперферритинемией - 33,5 лет. Такая разница в возрасте
является существенной для процесса накопления железа, что и может объяснять
отсутствие признаков ПЖ. У двух пациентов с хронической HCV-инфекцией мужчина 35 лет с ХГ (гомозигота по H63D мутации) и женщина 63 лет с ЦП
(гетерозигота по H63D мутации) обнаружен ГСП, причем у женщины признаки
ПЖ сопровождали клеточную трансформацию в ГЦР. Принимая во внимание
длительность процесса накопления железа, мы считаем, что отсутствие
морфологических признаков ПЖ у остальных носителей HFE мутаций не
позволяет полностью исключить возможность формирования ПЖ в будущем
[23,27,31].
Проведено сопоставление частоты встречаемости изучаемых мутаций HFE
гена у больных с патологией печени и серологическими признаками ПЖ с
данными исследования 771 здоровых добровольцев, проведенного Институтом
генетики и цитологии НАН Беларуси (табл. 2). Согласно опубликованным
данным встречаемость генотипа C282Y N/NN в популяции белорусов составила
5,3% (95% ДИ 4,8-5,8), NN/H63D N - 24,6% (95% ДИ 21,5-27,7), NN/H63D H63D
- 2,7% (95% ДИ 1,6-3,8). У 60,9% (95% ДИ 57,3-64,5) здоровых добровольцев
мутации С282Y и H63D не обнаружены (генотип NN/NN) [2,3].
Таблица 2 – Сравнительная характеристика частот встречаемости С282Y и H63D
мутаций HFE гена у больных и здоровых представителей белорусской
популяции
Варианты
генотипов
Обследованны
е больные,
Здоровые,
χ2
Р
% (95% ДИ)
% (95% ДИ)
(n=771)
NN/NN
(n=30)
63,3 (43,9-80,1)
C282Y N/NN
3,3 (1,0-17,2)
5,3 (4,8-5,8) 0,533
NN/H63D N
26,7 (14,7-49,4)
NN/H63D
H63D
6,7 (8,0-22,1)
24,6 (21,50,181
27,7)
2,7 (1,6-3,8) 1,032
60,9 (57,364,5)
0,
1
3
2
0,71
4
0,46
2
0,665
0,31
2
Таким образом, встречаемость вариантов генотипов C282Y N/NN,
NN/H63D H63D, NN/H63D H63D у больных с патологией печени не отличалось
о таковой у здоровых представителей белорусской популяции (χ2 =0,533,
Р=0,462, χ2 =0,181, Р=0,665, χ2 = 1,032, Р=0,312 соответственно). В процентном
соотношении количество пациентов без C282Y и H63D мутаций в группе с
патологией печени не имела достоверных различий с группой здоровых
добровольцев (χ2=0,132, Р=0,714). Отсутствие различий в количестве и
вариантах дефектов HFE гена в группах не позволяет судить о индеферентном
значении минорных мутаций HFE гена при хронической патологии печени,
поскольку исследований состояния обмена железа у здоровых добровольцев не
проводилось.
Проведен сравнительный анализ серологических показателей метаболизма
железа у больных с наличием и отсутствием мутаций HFE гена (табл. 4). Стоит
заметить, что больные с наличием мутаций HFE гена и без них по возрасту (t=0,079, P=0,963) и полу (χ2=0,226, Р=0,634) достоверно не различались, что
является существенным для оценки параметров обмена железа.
Таблица 4 – Сравнительная характеристика уровней сывороточного
ферритина у больных хроническими диффузными заболеваниями печени с
наличием (отсутствием) мутаций HFE гена
Характеристики
Больные
без HFE мутаций с HFE мутациями
(n=19)
(n=11)
t/z/χ2
Р
Возраст, лет (Х±σ)
Пол, м/ж
CЖ, ммоль/л (Me)
ОЖСС, ммоль/л (Ме)
НТЖ,% (Ме)
СФ, мкг/л (Ме)
44,42±13,03
11/8
25,54±7,17
52,58±16,72
51,64±17,60
462,76
44,81±13,29
7/4
34,87±16,71
60,96±22,50
59,40±23,13
532,11
-0,079
0,226
-2,138
-0,839
-0,796
0,064
0,936
0,634
0,041
0,401
0,425
0,948
Как оказалось, медианы значений СЖ у больных с патологией печени и
мутациями HFE гена были значимо выше, чем у больных без мутаций (t=-2,138,
Р=0,041). Обращало на себя внимание, что значения показателей ОЖСС, НТЖ и
СФ в случаях с мутациями превышали аналогичные в случаях без мутаций,
однако статистически достоверной разницы между ними обнаружено не было
(z= 0,839, Р=0,401, z =-0,796, Р=0,425, z =0,064, Р=0,948 соответственно).
Принимая во внимание минорный характер обнаруженных мутаций можно
сделать вывод только о том, что на данном возрастном этапе (44,42±13,03 и
44,81±13,29 лет) значимых различий в значениях серологических маркеров депо
железа (НТЖ и СФ) нет.
Согласно критериям диагностики гемохроматоза Американской ассоциации
гастроэнтерологов, значения НТЖ, превышающие 45%, весьма точно
определяют 97,9% гомозигот по C282Y мутации без ложноположительных
результатов среди здоровых представителей популяции [29]. Поскольку
выявленные генетические дефекты не являлись столь тяжелыми, в ходе нашего
исследования возник вопрос: какой диагностической значимостью обладают
значения НТЖ>45% для минорных мутаций у больных с патологией печени?
Для сравнительного анализа частоты мутаций и уровней лабораторных
маркеров ПЖ пациенты были систематизированы на основании значимого
уровня показателя НТЖ (табл. 5).
Таблица 5 – Сопоставление серологических и молекулярно-генетических
результатов обследования
Число случаев
Всего
Всего с мутациями HFE гена
Всего без мутаций HFE гена
НТЖ>45% при мутациях HFE гена
НТЖ<45% при мутаций HFE гена
НТЖ>45% без мутаций HFE гена
НТЖ<45% без мутаций HFE гена
Абс.
30
11
19
7
4
14
5
%
100
36,7
63,3
63,6
21,1
73,7
26,3
Как было установлено ранее, в данной выборке было 11 пациентов с
мутациями HFE гена, из них - 7 (63,3%) с НТЖ>45% и 4 (21,1%) с НТЖ<45%.
Превышение порогового значения НТЖ было зафиксировано у 14 (73,3%)
человек без дефекта HFE гена, а значения показателя ниже 45% - у 5 (26,3%).
Принимая во внимание результаты сопоставления, были определены
специфичность, чувствительность и прогностическая ценность значения
НТЖ>45% для выявления минорных мутаций HFE гена (табл. 6).
Таблица 6 - Значение порогового показателя НТЖ для диагностики
носительства минорных мутаций HFE гена
Показатель Специфич- Чувствитель- Позитивная
ность %,
ность %,
прогностическая
ценность %,
(95% ДИ)
(95% ДИ)
(95% ДИ)
Негативная
НТЖ>45% 23,8
44,4
(8,2-47,2)
63,3
(59,0-100,0)
33,3
(14,6-57,0)
прогностическая
ценность %,
(95% ДИ)
(13,7-78,8)
Было установлено, что специфичность показателя НТЖ более 45% весьма
низкая и составляет всего 23,8% (95% ДИ 8,2-47,2), т.е. при наличии малых
мутаций HFE гена значениях НТЖ могут соответствовать нормальным. Наряду
с этим получена удовлетворительная чувствительность этого теста - 63,3% (95%
ДИ 59,0-100,0), однако и она не позволяет быть полностью уверенным в
присутствии минорных мутаций при НТЖ>45%. Расчетная вероятность наличия
мутаций при НТЖ>45% (позитивная прогностическая ценность) составила
33,30% (95% ДИ 14,6-57,0), а вероятность отсутствия дефектов HFE гена при
НТЖ<45% (негативная прогностическая ценность) - 44,4% (95% ДИ 13,7-78,8).
Таким образом, было установлено, что у лиц с патологией печени уровень
НТЖ>45% не сохраняет свое значение для диагностики носительства минорных
мутаций HFE гена. Объяснение полученного результата, возможно, кроется в
самом заболевании печени (значения НТЖ и СФ связаны с воспалительнонекротической активностью процесса) и в минорном характере выявленных
мутаций.
Наличие совокупности факторов у больных с патологией печени (нарушение
синтетической функции печени, в том числе синтез HFE протеина, носительство
минорных мутаций HFE гена) позволяет расценивать риск формирования ВПЖ
как высокий. Необходимо отметить, что ПЖ формируется медленно, а ВПЖ
еще зависит от длительности основного заболевания (АБП, хронической HCVинфекции), поэтому у больных с патологией печени нельзя быть абсолютно
уверенным в отсутствии процесса избыточного накопления железа даже
НТЖ<45%. Особенно это положение касается молодых людей до 40 лет с
коротким анамнезом заболевания. Поэтому поиск мутаций HFE гена, особенно
при наличии необъяснимого роста сывороточных маркеров депо железа НТЖ и
СФ, будет являться весьма полезным в плане определения риска формирования
ВПЖ при заболеваниях печени.
Литература
1. Болезни перегрузки железом (гемохроматозы): руоводство для врачей /
под ред. А.Г. Румянцева, Ю.Н. Токарева. – М: ИД Медпрактика-М, 2004.
– 328 с.
2. Сивицкая, Л.Н. Наследственный гемохроматоз: частота мутаций C282Y и
H63D гена HFE в белорусской популяции / Л.Н. Сивицкая, Е.И.
Кушнеревич // Вести НАН Б – 2007. – № 5. – С.14-19.
3. Частоты мутаций гена HFE у жителей разных регионов Беларуси / Л.
Н.Сивицкая [и др.] // От классических методов генетики и селекции к
ДНК-технологиям: материалы Междунар. науч. конф., посвящ 95-летию
со дня рождения академика Н.В. Турбина, Гомель, 2-5 окт. 2007 г. / Под.
ред. А.В. Кильчевского [и др.] – Мн.: Право и экономика, 2007. – С. 141.
4. Щербина, С.П. Диагностическое значение комплексного исследования
показателей метаболизма железа в клинической практике / С.П.Щербина,
Е.А. Романова, А.А. Левина // Гематол. и трансфузиол. – 2005. №. 5. –
С.23-28.
5. Щербина, С.П. Молекулярно-генетическая диагностика наследственного
гемохроматоза / С.П.Щербина, Е.А. Романова, С.С Зборовский // Гематол.
и трансфузиол. – 2005. №. 1. – С.23-27.
6. Adams, P.C. Hemochromatosis and iron-overload screening in a racially
diverse population / P.C. Adams, D.M. Reboussin // N. Engl. J. Med. – 2005. –
Vol. 352. – P. 1769-1778.
7. Brissot, P. Current approaches to the management of hemochromatosis. / P.
Brissot // Hematology – 2006. – Vol. 50, № 13. – P. 36–41.
8. Common heterozygous hemochromatosis gene mutations are risk factors for
inflammation and fibrosis in chronic hepatitis C / A. Geier [et al.] // Liver Int.
2004. – Vol. 24, №4. – P. 285-294.
9. Correlation between iron status and genetic hemochromatosis (codon C282Y)
in a large German population / C.E. Wrede [et al.] // Isr. Med. Assoc. J. –
2004. – Vol. 6, № 1. – P. 30-33.
10. C282Y and H63D mutations in the HFE gene have no effect on iron overload
disorders in Japan / Y. Shiono [et al.] // Intern. Med. – 2001. – Vol. 40, № 9. –
P. 852-856.
11. Fletcher, L.M. Hemochromatosis and alcoholic liver disease / L.M. Fletcher,
L.M. Powell // Alcohol – 2003. –Vol. 30 , № 46. – P. 131-136.
12. Franchini, M. Hereditary iron overload: update on pathophysiology, diagnosis,
and treatment. Hemochromatosis - a new look at an old disease / M. Franchini
// N. Engl. J. Med. – 2004. – Vol. 350, № 43. – P. 2383–2397.
13. Gender-specific phenotypic expression and screening strategies in C282Ylinked ha