Современные биотехнологии определения
advertisement
Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации ФГУ Эндокринологический научный центр Росмедтехнологий СОВРЕМЕННЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕСТОСТЕРОНА ДЛЯ ОЦЕНКИ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ МУЖЧИН Под редакцией И.И. Дедова Москва 2010 Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации Российская ассоциация эндокринологов ФГУ Эндокринологический научный центр Росмедтехнологий «УТВЕРЖДАЮ» Главный эндокринолог Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Президент Российской ассоциации эндокринологов Академик РАН и РАМН __________________________ И.И. Дедов СОВРЕМЕННЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕСТОСТЕРОНА ДЛЯ ОЦЕНКИ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ МУЖЧИН Москва 2010 1 Рабочая группа: Дедов И.И. акад. РАН и РАМН, директор ФГУ ЭНЦ, главный эндокринолог Министерства здравоохранения и социального развития РФ Гончаров Н.П. д.м.н., проф., руководитель лаборатории биохимической эндокринологии и гормонального анализа ФГУ ЭНЦ Кация Г.В. д.м.н., главный научный сотрудник лаборатории биохимической эндокринологии и гормонального анализа ФГУ ЭНЦ Малышева Н.М. к.б.н., научный сотрудник лаборатории биохимической эндокринологии и гормонального анализа ФГУ ЭНЦ 2 Оглавление ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................................................... 4 ОСНОВНЫЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ТЕСТОСТЕРОНА ................................................................................... 4 ПОКАЗАНИЯ К ОПРЕДЕЛЕНИЮ ТЕСТОСТЕРОНА ............................................................................................................ 5 ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА УРОВЕНЬ ТЕСТОСТЕРОНА ................................................................................................ 5 ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЙ ЭТАП, СВЯЗАННЫЙ С ПОЛУЧЕНИЕМ ПРОБ КРОВИ И ЕЁ ОБРАБОТКИ .......................... 7 ОБЩИЙ ТЕСТОСТЕРОН............................................................................................................................................................ 8 СВОБОДНЫЙ ТЕСТОСТЕРОН ............................................................................................................................................... 19 ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНОГО ТЕСТОСТЕРОНА В СЛЮНЕ .......................................................................................... 20 ЛИТЕРАТУРА ............................................................................................................................................................................ 32 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ........................................................................................................................................................ 32 3 Введение Тестостерон (Т) занимает ключевое положение в системе гипоталамус-гипофиз-половые железы. Он принадлежит к группе С19 стероидов, его предшественниками являются прегненолон и прогестерон, дегидроэпиандростерон и андростендион. У мужчин он синтезируется преимущественно в семенниках клетками Лейдига, у женщин – корой надпочечников, а также клетками яичников. Кроме того, Т образуется в значительных количествах в периферических тканях из надпочечниковых андрогенов. Тестостерон превращается в различных тканях, прежде всего в предстательной железе в биологически активные 5α-дигидротестостерон и эстрадиол. 9799% тестостерона циркулирует в крови в связанном с белками состоянии. Основными связывающими и транспортными белками являются альбумин и глобулин, связывающий половые гормоны (ГСПГ). Лишь свободная фракция тестостерона (около 2-3% у мужчин и 1-2% у женщин) обладает биологической активностью. Для тестостерона характерен суточный ритм, более выраженный у мужчин. Изменяющийся в течение суток уровень тестостерона у мужчин обусловлен эпизодическим характером секреции люлиберина и ЛГ. У женщин циркадный ритм тестостерона объясняется значительным вкладом коры надпочечников в общий пул тестостерона, поэтому максимальный выброс тестостерона в кровь наблюдается в ранние утренние часы. До 50% тестостерона у женщин образуется вне яичников и надпочечников, преимущественно в жировой ткани, прежде всего из андростендиона. Основные физиологические функции тестостерона Главная биологическая функция гормона – поддержание репродуктивной функции у мужчин. Тестостерон посредством своего метаболита 5α-дигидротестостерона контролирует функцию простаты, потенцию, развитие, формирование и обеспечение мужского фенотипа и играет важную роль в поддержании сперматогенеза. У обоих полов Т формирует либидо, влияет на рост волос и тембр голоса. Кроме специфических задач, тестостерон обеспечивает рост тела, метаболизм костной ткани, её ремоделирование и поддержание анаболических процессов, особенно, в мышечной ткани. Он принимает активное участие в обеспечении процесса эритропоэза и регуляции ряда других функций. Вместе со своим активным метаболитом эстрадиолом и 5α-дигидротестостероном он выполняет в организме более 15 функций и имеет свои рецепторы в 40 различных органах и тканях. 4 Показания к определению тестостерона Пубертатный период Тестикулярные нарушения у мальчиков Овариальные нарушения у девочек Нарушения деятельности надпочечников у девочек и мальчиков Замедленное или ускоренное половое созревание Врожденная дисфункция коры надпочечников Мужчины Тестикулярная недостаточность и мониторинг при лечении тестикулярной недостаточности Бесплодие Сексуальная дисфункция Гипогонадизм различного генеза, включая наиболее распространенный возрастной гипогогонадизм Гинекомастия (одновременно с определением эстрадиола) Женщины Гирсутизм Тестикулярная феминизация Опухоли яичника и надпочечника, продуцирующие тестостерон Синдром поликистозных яичников Нарушения менструального цикла Аменорея Бесплодие Синдром андрогенной недостаточности Сексуальная дисфункция, прежде всего со снижением или исчезновением либидо и оргазма Факторы, влияющие на уровень тестостерона • Сезонные колебания уровня Т Сезонные колебания концентрации общего Т (обТ) достигают 19%, а свободного – 31%. Наиболее низкие концентрации регистрируются летом, пиковые осенью. Они также зависят от региона проживания. Приведенную разницу в уровнях, естественно, необходимо учитывать при выполнении продолжительных исследований. • Суточные колебания Как известно, 50-60% обТ с высокой аффинностью связано с ГСПГ, а 40-50% связано с альбумином (легко диссоциирующая связь). Только 1-2% Т циркулирует в свободной форме (свТ) и вместе со связанным с альбумином Т, они обозначаются как биодоступный Т (биоТ). Суточные 5 колебания биоТ достигают 57%, свТ – 68%, тогда как колебания обТ составляют 45%. Данный процесс обусловлен увеличением синтеза Т в ночное время с одновременным снижением связывающих белков, как следствие особенностей гемодинамики организма в горизонтальном положении. С возрастом выраженный суточный ритм сглаживается, что также необходимо учитывать при выработке протокола клинических исследований. • Диета Содержание Т во многом определяется временем приема пищи и её составом. В большинстве проводимых или опубликованных работах этот фактор не учитывается. Поэтому взятие крови натощак или после «легкого» завтрака может существенно влиять на результаты определения Т. Зарегистрировано падение уровня Т в крови у здоровых мужчин после перорального приема глюкозы. При проведении глюкозо-толерантного теста наблюдается падение концентрации обТ на 15% через 30 мин, которое сохраняется на протяжении последующих 3 часов. Причем зарегистрированное падение было связано не со снижением сигнала со стороны ЛГ, а обусловлено выбросом в кровь глюкогоно-подобного пептида -1 , который уменьшает импульсную продукцию Т. Наиболее важный эффект диеты - изменение содержания ГСПГ, уровень которого снижается при большом потреблении белка, жирной пищи, и, наоборот, его концентрация повышается при вегетарианской пище и потреблении диеты, богатой клетчаткой. Высокое содержание свободных жирных кислот нарушает процесс связывания половых стероидов с ГСПГ, что сказывается на уровне свТ. • Алкоголь В небольшой дозе алкоголь повышает уровень Т в крови на 20% у мужчин и женщин. Хроническое злоупотребление алкоголем приводит к необратимым деструктивным изменениям клеток Лейдига и клеток Сертоли семенников, к развитию ожирения, повышению уровня эстрогенов, в результате формируется необратимый дефицит андрогенов в комбинации с эректильной дисфункцией. • Физическая активность Чрезмерные физические нагрузки, например, у молодых спортсменов, приводят к падению уровня как обТ, так и свТ. • Психосоматическое состояние организма Стресс, как физический, так и психоэмоциональный, приводит к подавлению продукции Т, через центральные механизмы – гипоталамус-аденогипофиз-гонадотропины. Кроме этого повышенный выброс кортизола ингибирует стероидогенез в клетках Лейдига. • Сексуальная активность Уровень как обТ, так и свТ повышается в процессе интимных отношений у обоих партнеров, мастурбация также сопровождается увеличением концентрации циркулирующего Т. 6 • Курение У курильщиков уровень обТ и свТ возрастает на 5-15% . Преаналитический этап, связанный с получением проб крови и её обработки Сравнительно недавно экспериментально была четко обоснована схема получения сыворотки для последующего определения Т: отделение сыворотки от форменных элементов должно проходить в течении 6 часов при комнатной температуре или пробы крови могут храниться при +40 С до 48 часов, а затем пробы центрифугируются. Пробы сыворотки можно хранить при -200 С в течение 3х месяцев, а при -700 С больше 6 месяцев. Более продолжительное хранение проб сыворотки не гарантирует правильное определение концентрации Т, так как за это время может измениться сама технология определения гормона. Недопустимо также повторное замораживание и размораживание проб сыворотки, которая приводит к деструкции ГСПГ, что приводит к неправильному определению свободного и биологически доступного Т. Использование сыворотки или плазмы в случае экстракционного РИА метода определения Т не имеет значения. Однако, в случае неизотопных прямых методов, включая автоматические анализаторы, необходимо использовать сыворотку, так как при измерении Т в плазме определяется заниженная концентрация гормона. Использование ЭДТА или цитрата для получения плазмы недопустимо для всех прямых методов. Забор крови в стеклянные или пластиковые пробирки для получения сыворотки не влияет на результаты определения Т. Однако, при использовании гелевого разделяющего компонента, что имеет место в вакутейнерах для взятия крови, происходит завышение результатов для обТ до 28%, занижение уровня ФСГ на 43%. При одних и тех же вакутейнерах разные анализаторы могут генерировать различные результаты при определении того или иного гормона. Более подробно влияние различных экзогенных и эндогенных факторов на уровень общего тестостерона изложены в работе д-ра Carruthers [3]. Повышенный уровень тестостерона может быть обнаружен при приеме лекарственных препаратов (барбитуратов, кломифена, эстрогенов, гонадотропинов у мужчин, пероральных контрацептивов у женщин). Снижение общего тестостерона может быть обусловлено стрессорными ситуациями, алкоголизмом, приемом андрогенов, дексаметазона, дигоксина, спиранолактоном. 7 Общий тестостерон Наиболее адекватно определение общего тестостерона (т.е. свободного и связанного с белками тестостерона) радиоиммунологическим методом с использованием высокоспецифических антисывороток и предварительной экстракцией его из сыворотки этиловым эфиром. Переход на автоматизированные системы иммуноанализа обеспечил высокую производительность, что в комбинации с оперативностью получения результатов, сделало их экспресс-методами в диагностике эндокринных нарушений. Однако по мере эксплуатации этих методов и накопления полученных результатов возникли в их интерпретации проблемы, прежде всего для всей группы близко родственных по химической структуре стероидных гормонов. В последние 5 лет опубликована серия оригинальных работ, в которых доказана неадекватность определения в крови общей циркуляции таких гормонов, как тестостерон, эстрадиол и другие стероиды, прямыми не экстракционными методами, включая ИФА и практически все используемые автоматические анализаторы с их химической составляющей. Как правило, такие методы принципиально завышают концентрацию гормона, что входит в противоречие с клиническими проявлениями заболевания. Итогом многочисленных обсуждений этой проблемы международным сообществом было официальное заявление международной ассоциации эндокринологов в 2007 г (W.Rosner и соавт., JCEM, 92, 405-413, 2007) о недопустимости использования прямых методов иммуноанализа, включая все анализаторы, для определения физиологически низких концентраций тестостерона у женщин и детей. В настоящее время крупные лаборатории США и Европы используют для определения тестостерона и других стероидов высокочувствительную и высокоточную технологию тандем-масспектрометрии. Для этой цели рекомендуется массспектрометры фирмы API- 3000/ 5000 или фирмы Waters/Micromass Quattro. Сравнительный анализ методов определения общего тестостерона в сыворотке крови Как уже отмечалось, определение тестостерона в сыворотке крови играет важную роль в клинической оценке многих эндокринных заболеваний у мужчин: гипогонадизм различной этиологии, преждевременное половое развитие или отставание физического развития у мальчиков, мониторинг адекватности гормональной заместительной терапии андрогенами. Чрезвычайно важно проводить мониторинг содержания тестостерона в крови у пациентов с раком простаты, получаюших лечение пролонгированными аналогами люлиберина (ГнРГ). Одновременное определение тестостерона, ЛГ и ФСГ способствует получению информации о природе гормональной дисфункции семенников. В частности, определение тестостерона необходимо для 8 подтверждения возрастного его дефицита (синдром PADAM) как объективного маркера для назначения терапии препаратами тестостерона У женщин уровень тестостерона необходим для оценки функции гонад при гирсутизме, алопеции, акне, при подозрении на андрогенсекретирующие опухоли яичников и надпочечников, мониторинг за лечением гирсутизма для выбора оптимальной дозы препарата, подавляющего избыточную продукцию андрогенов. Он является важным маркером при динамическом наблюдении за пациентами с врожденной дисфункцией коры надпочечников, получающими терапию глюкокортикоидами. Во всех этих случаях требуется высокочувствительный, специфический и воспроизводимый метод определения общего тестостерона в биологических средах. Для лучшего понимания технологии современного иммуноанализа, в частности методов определения тестостерона в биологических средах, необходимо вспомнить, как шло развитие методов его определения. До 1960 года основным методом был биологический, затем появились количественные физико-химические методы с использованием газовой хроматографии и метода двойной изотопной метки, однако, они требовали для определения значительное количество плазмы (до 20 мл) и обязательного этапа экстракции тестостерона из плазмы большими объемами органических растворителей, что ограничивало возможность их применения в диагностических гормональных лабораториях. Кроме того, они были мало производительны. В конце 60-х годов прошлого века появились методы определения тестостерона с использованием секс-стероид связывающего глобулина, а затем и радиоиммунологические (РИА) методы на основе специфической антисыворотки Высокая чувствительность РИА-метода позволяла определять тестостерон в 50-100 мкл плазмы, но с обязательной экстракцией. Дальнейшее развитие РИА-методов, создание иммунометрического варианта (ИРМА), использование в качестве метки 125 I вместо трития способствовали повышению чувствительности РИА-метода, который был основным в определении тестостерона на протяжении почти 30 лет. Параллельно шла разработка альтернативной неизотопной технологии, в частности иммуноферментных методов (ИФА), с использованием в качестве метки пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и др. и создание соответствующих инструментов (ридеров) для регистрации сигнала. ИФА-технология как прямой не экстракционный метод получила широкую популярность. Однако она не обеспечила необходимую чувствительность при определении очень низких концентраций гормона у детей и женщин. Около 25 лет назад были созданы сверхчувствительные методы иммуноанализа 3-го поколения с использованием в качестве метки европия и специального флуориметра (регистрация отсроченной во времени флуоресценции). Данная технология была сконструирована группой финских ученых (система «Delfia») и быстро завоевала большую популярность. 9 Приблизительно в это же время английскими учеными был разработан метод усиленной люминесценции с применением пероксидазы хрена и люминола, изолюминола или акридина и регистрацией усиленного люминесцентного сигнала на люминометре (система «Amerlite»). Оба метода обеспечивают очень высокую чувствительность, что позволяет определять низкие концентрации тестостерона (110-13М), равно как и других гормонов. Одновременно шло создание полностью автоматизированных анализаторов, которые к настоящему времени стали доминировать в эндокринологических и клинических биохимических лабораториях во всех странах, в том числе и в России. В отличие от РИА-методов, автоматизированные системы являются абсолютно закрытыми, и сотрудники лабораторий не могут корректировать их работу. Более того, многие операции данной технологии являются секретом фирмы-производителя. Основные преимущества автоматизированных систем - высокая производительность и оперативность в выдаче результатов и экономическая выгода. К наборам прилагается инструкция с ожидаемым диапазоном колебаний концентрации тестостерона, предлагаемым фирмой-производителем набора. Как правило, фирмы не учитывают физиологические нормальные значения, полученные референсным методом (газовая хроматография и масс-спектрометрия), и не проводят сравнения с этим методом, а дают тот диапазон, который получен при определении тестостерона у здоровых людей их методом. Обычно компании при выпуске своей технологии ограничиваются тестированием, используя пул сывороток с высоким, средним и низким содержанием гормона. При таком подходе нижняя граница содержания тестостерона у здоровых мужчин может быть снижена у некоторых компаний до 4,5 нмоль/л, вместо 11-12 нмоль/л, принятой повсеместно во всех странах в качестве нижней границы физиологической нормы. Такая практика часто дезориентирует сотрудников лабораторий и врачей в интерпретации полученных результатов и неизбежно ведет к диагностическим ошибкам. В ИФА-методах, как и в автоматизированных системах иммуноанализа 3-го поколения, проводится прямое безэкстракционное определение общего тестостерона, что создает трудно преодолимую проблему, несмотря на использование моноклональных антител: как получить величину точного, истинного содержания тестостерона в сыворотке. При проведении прямого метода иммуноанализа очень сложно избежать влияния матрикса - вмешательство в реакцию лиганд-антисыворотка связывающих транспортных белков, различных стероидов и их метаболитов, обладающих близкой структурой молекулы, липидов и т.д. На результаты определения общего тестостерона влияет и состояние больного. Например, его содержание может быть существенно снижено благодаря уменьшению концентрации глобулина, связывающего половые гормоны в крови и, как следствие этого, ускорение его обмена (ожирение, гипотиреоз, нефропатический синдром, прием андрогенов, глюкокортикоидов, прогестинов) и, наоборот, 10 повышение уровня тестостерона может быть обусловлено повышением концентрации ГСПГ (возраст, гипертиреоз, дефицит андрогенов, прием эстрогенов и противоэлептических средств, цирроз печени). Определение циркулирующего тестостерона необходимо в качестве объективного критерия для диагностики различных форм нарушения андрогенного статуса. Зависимость содержания тестостерона в сыворотке от изменения концентрации ГСПГ требует, для оценки адрогенной функции клеток Лейдига, определения как свободного, так и биологически доступного тестостерона. Определение свободного тестостерона - наиболее трудная задача. Наибольшую популярность получил математический метод расчета, предложенный Vermulen [7]. Доля свободного тестостерона в крови не превышает 2% от общего тестостерона, связанного с альбумином (60%) и секс-стероид связывающим глобулином (38%). Широкое распространение автоматизированных систем и их повседневное использование в лабораториях гормонального анализа для определения тестостерона привело к возникновению ряда проблем, основная из которых - систематическое завышение результатов, что зачастую приводит к диагностическим ошибкам. В лаборатории биохимической эндокринологии и гормонального анализа ЭНЦ на протяжении 15 лет использовали РИА-метод определения общего тестостерона с предварительной его экстракцией и применением высокоспецифических моноклональных антител. За основу метода была взята технология ВОЗ, разработанная в рамках Программы ВОЗ по репродукции человека. Этот метод был калиброван с референсным методом - газовая хроматография/массспектрометрия, нормальный уровень общего тестостерона при его определении данным методом составлял 12-35 нмоль/л у здоровых мужчин репродуктивного возраста. Система внутреннего и внешнего контроля качества ВОЗ, в которой участвовала лаборатория гормонального анализа ЭНЦ совместно со 165 лабораториями разных стран, позволяла проводить систематический мониторинг получаемых результатов определения тестостерона, которые отличались от согласованной средней на 5-7% и только в отдельных случаях при низкой концентрации тестостерона позитивное отклонение достигало 19%. Поэтому названный РИА-метод был выбран нами в качестве референсного. Образцы крови были собраны от 100 мужчин, которые обращались в клинику и поликлинику для подтверждения или исключения диагноза различных форм гипогонадизма, возрастного андрогенного дефицита, сексуальной дисфункции и других нарушений гормональной функции семенников. Возраст пациентов 16 - 65 лет. Кровь брали из кубитальной вены натощак утром (9.00-10.00). После центрифугирования полученные сыворотки были разлиты на аликвоты по 0,5 мл в 6 пробирок и хранилась при -200С до анализа. Ни один из образцов не был подвергнут разморозке и повторному замораживанию. 11 Концентрацию общего тестостерона определяли следующими широко используемыми в настоящее время методами: 1. Vitros ECi (Ortho-Clinical Diagnostics), автоматический мультианализатор 2. Architect (Abbott Laboratories), автоматический мультианализатор 3. Access (Beckman-Elmer), автоматический мультианализатор 4. Delfia (Perkin-Elmer), мультианализатор 5. DRG, иммуноферментный набор (ELISA) 6. Радиоиммунологический набор (3Н-Т), после экстракции, стандартизованный ВОЗ (РИА). Основные характеристики используемых наборов представлены в табл.1. Суммарные показатели концентрации тестостерона у 100 мужчин представлены в табл.2. Концентрация тестостерона в крови, определенная любыми неизотопными методами, была значима выше, чем при определении РИА. Самый высокий уровень зафиксирован при определении системой Delfia (медиана 19,2 нмоль/л), самый низкий (медиана 13,0 нмоль/л) - при определении РИА. Наиболее близки были показатели Vitros ECi и РИА (медиана 13,1 и 13,0 нмоль/л, соответственно). Разницы между показателем РИА и показателем неизотопного метода (табл.3) колебалась от минимальных значений - 0,4 нмоль/л для Vitros ECi (что составляло в среднем 0,03%) до максимальных - 7,3 нмоль/л для Delfia (что составляло в среднем 65%). Если высчитывать этот параметр по двум подгруппам - ниже нормы (10 нмоль/л) и близко к норме (выше 10 нмоль/л), то оказалось (рис.1), что при определении тестостерона всеми неизотопными методами, кроме Vitros ECi, в первой подгруппе разница значений более значительна, тогда как во второй подгруппе эта разница снижается, но остается существенной. Исключением является Vitros ECI и Access: при определении этим методом концентрация тестостерона в нормальном диапазоне близка к таковой при определении РИА. 100 80 % 60 40 20 0 Vitros Access <10нмоль/л DRG Architect Delfia >10 нмоль/л Рис.1 . Различия (в процентах) между показателями концентрации тестостерона (медиана), полученными РИА и неизотопными методами у мужчин с содержанием тестостерона (по РИА) <10 нмоль/л и >10 нмоль/л. 12 Концентрация тестостерона, определенная методом РИА, коррелирует с показателями, полученными неизотопными методами. Наиболее выраженная корреляция наблюдается между РИА и Vitros ECi, наименьшая - между РИА/Delfia и РИА/Architect. В подгруппе с содержанием тестостерона менее 10 нмоль/л наблюдалась слабая корреляция между показателями, определенными РИА и неизотопными методами В подгруппе с нормальным и высоким содержанием тестостерона корреляция между РИА и неизотопными методами возрастает Таким образом, все неизотопные методы, за исключением Vitros ECi, приводят к достоверному завышению определяемого уровня тестостерона по сравнению со стандартизированным РИА-методом. Наиболее выраженная систематическая ошибка наблюдается при определении низких концентраций тестостерона, то есть у тех пациентов, у которых при клиническом обследовании заподозрено наличие дефицита андрогенов. Если при анализе результатов в качестве пограничного критерия норма/андрогенный дефицит использовать величину 11 нмоль/л, то из 100 обследованных образцов сывороток по данным РИА концентрация тестостерона 11 нмоль/л и ниже определялась у 38 мужчин, т.е. в 38% случаев предполагалось наличие андрогенного дефицита различной степени тяжести (от 2,1 до 9,8 нмоль/л). Если уровень тестостерона определяли неизотопными методами, то частота выявления андрогенного дефицита при использовании метода Vitros ECi составляла 25%, Architect – 13%, DRG – 10%, Delfia – 7%, Access – 5% (рис. 2). 5 Access 7 Delfia 10 DRG 13 Architect 25 Vitros 37 RIA 0 10 20 30 40 %% Рис. 2. Частота (в %%) биохимического диагноза андрогенного дефицита при использовании различных методов определения общего Т в одних и тех же образцах сывороток мужчин. При использовании значений нормы, рекомендуемых в инструкциях разработчиков неизотопных методов, частота выявления андрогенного дефицита среди всех обследованных мужчин снижается в еще большей степени. Радиоиммунные методы, основанные на применении меченого тритием тестостерона, включают обязательную экстракцию стероида, которая исключает связывающие глобулины, 13 подобные по структуре белки, огромную группу различных стероидов и некоторые липиды. С помощью этих методов получены результаты, сравнимые с таковыми, полученными с помощью газожидкостной хроматографии/масс-спектрометрии. Последние методы, как правило, используются в референсных лабораториях как основные методы. РИА-методы обеспечивали устойчивый диапазон определяемых концентраций тестостерона у здоровых мужчин (11-35 нмоль/л). Неизотопные методы третьего поколения на основе усиленной хемилюминесценции и флуоресценции, отсроченной по времени, адаптированы для использования в автоматических анализаторах различных диагностических компаний, которые в настоящее время очень широко используются в рутинной клинической практике. Однако до сих пор нельзя было ответить на вопрос относительно степени сопоставимости результатов определения тестостерона, полученных при их использовании. Приемлемая сопоставимость результатов была получена при определении тестостерона в крови мужчин, но не женщин и детей. Такая зависимость от пола и возраста пациента определяется низкой концентрацией тестостерона в плазме женщин и детей. Аналогичную зависимость обнаружили и мы при сравнении тестируемых методов. Чем выше концентрация тестостерона в крови, тем больше степень совпадения абсолютных показателей, полученных разными методами. Приведенные нами результаты однозначно демонстрируют, что практически все исследуемые неизотопные методы имеют низкое совпадение с РИА-методом, выбранным в качестве референсного. Наибольшие различия наблюдаются при сравнении с наборами Delfia, использующими поликлональные антитела. В этом случае регистрируется позитивное отклонение свыше 60%, а при низких концентрация тестостерона - до 100%. Регрессионный анализ показал, что корреляция значений, полученных наборами Delfia и РИА слабая с тенденцией к дальнейшему ее понижению при на низких концентрациях тестостерона. Наборы Architect и DRG также имели положительное отклонение, то есть завышение результатов на 40% и 20% соответственно, а при низких концентрациях - на 70% и 50%. Наиболее близкие результаты получены с помощью наборов Vitros ECi и РИА. Различия между этими методами составляло менее 0,1% в общей группе пациентов с индивидуальным разбросом от -49% до 169%. Результаты определения тестостерона имели хорошую корреляцию, хотя и более слабую в группе с низкой концентрацией тестостерона. При сравнении с показателями РИА, андрогенный дефицит регистрируется у 59% пациентов, однако, если руководствоваться пределами нормальных значений, рекомендованных инструкцией Vitros ECi , количество пациентов с адрогенным дефицитом снижается до 16%. Такая тенденция обнаружена и при использовании наборов Access: если руководствоваться пределами нормальных значений, рекомендованных инструкцией Access (нижняя граница нормы 14 - 5,3 нмоль/л), то процент выявленных пациентов с андрогенным дефицитом снижается с 46% до 5%. Это значит, что названные методы существенно снижают выявление истинного андрогенного дефицита, который требует проведения фармакокоррекции. Существует несколько возможных причин объяснения несовпадения между результатами, полученными прямыми методами (неизотопными) и методом с экстракцией (РИА). На первом месте - так называемый эффект матрикса. Целый ряд соединений, присутствующий в сыворотке крови, могут вмешиваться в реакцию антисыворотка определяемый лиганд. К ним относятся весь спектр липидов и различных белков, включая специфический глобулин связывающий половые гормоны, а также значительные количества полярных и менее полярных стероидов, присутствующих в сыворотке. В условиях классического РИА-метода многие из этих соединений элиминируются на преаналитическом этапе. Процедура экстракции в РИА-методе сводит эффект матрикса к минимуму. Важным источником несовпадений является также приготовление калибровочной кривой и степень чистоты используемого кристаллического стандарта тестостерона для ее калибровки. Другая важная причина разницы полученных результатов связана со специфичностью используемых антисывороток, имеющих разную степень аффинности к тестостерону и другим сопутствующим стероидам. Ряд компаний используют поликлональные антитела, тогда как другие - моноклональные. Большое значение имеет также и возможность метода определять минимальную концентрацию гормона и его функциональная чувствительность (точность определения), что особенно важно при измерении низких (менее 1,7 нмоль/л) и очень низких (порядка 0,17 нмоль/л) концентраций тестостерона в крови. Оба эти фактора могут существенно влиять на показатели определяемой концентрации тестостерона, как правило, завышая ее значение . Всегда при низкой или очень низкой концентрации тестостерона регистрируется эффект наибольшего завышения результатов и, как следствие этого систематическая ошибка в работе метода. Это характерно для всех исследуемых нами систем, за исключением Vitros ECI, где результаты были сопоставимы с РИА-методом для концентраций выше 10 нмоль/л. Практически идентичные результаты были получены группой зарубежных авторов, которые провели сравнительную оценку 8 различных методов. По их данным, одна группа методов, включая Immulite 2000, ASC-180, Autodelfia, Archtect 2000, RIA-Immunotech, Coat-Acount-DPC, давала результаты, которые значительно (в среднем на 70%) превышала результаты, полученные референсным методом (газовая хроматография/масс-спектрометрия), при этом наибольшее расхождение наблюдалось при использовании Immulite 2000 и Autodelfia. Вторая группа методов, куда входили Vitros ECI и Elecsis 2010, обеспечивала определение концентрации тестостерона в мужской сыворотке в пределах физиологических референсных интервалов. 15 Аналогичные результаты получены при сравнении РИА-метода определения тестостерона и автоматизированных систем Elecsys Roche, Bayer Centaur, Vitros ECi, и DPC Immulite 2000 с референсным методом жидкостной хроматографии/масс-спектрометрией. Все методы иммуноанализа не обеспечивали необходимую точность в определении тестостерона в сыворотке и давали завышенные результаты (за исключением Vitros ECi), особенно при низких его величинах. По мнению авторов, которое мы разделяем, ни один из всех вышеназванных автоматизированных систем не может обеспечить точное, надежное и воспроизводимое определение тестостерона при его низких величинах (менее 1,7 нмоль/л), что характерно в основном для детей и женщин. Практически эти системы не могут быть использованы для объективной биохимической оценки их андрогенного статуса. 16 Таблица 1. Основные аналитические характеристики пяти неизотопных и одного изотопного методов определения тестостерона. Характеристика Принцип метода Природа антител Твердая фаза Меченый тестостерон Способ регистрации сигнала Объем образца (мкл) Полное время инкубации (мин) Длительность стабильности калибровки (дни) Диапазон определения (нмоль/л) Чувствительность метода Коэффициент вариации -% (Withinassay) высокие/низкие концентрации Коэффициент вариации -% (Between-assay) высокие/низкие концентрации Ожидаемые значения у здоровых мужчин (нмоль/л) Vitros ECi (OrtoClinical Diagnostics) Конкурентный Моноклональныеантитела, биотинированные Лунки, покрытые стрептовидином Пероксидаза хрена Непрямая хемилюминесценция 25 32 28 Architect (Abbott Laboratories) Access (Beckman Coulter) Delfia (Perkin-Elmer) DRG International Inc. RIA WHO matched reagent program Конкурентный Моноклональные антитела Конкурентный Моноклональные антитела Конкурентный Поликлональные антителаIgG Конкурентный Моноклональные антитела Конкурентный Моноклональные антитела Парамагнитные частицы Парамагнитные частицы Моноклональные антитела - Эфир акридина Щелочная фосфатаза Люминесценция IgG, противокроличь и Еu3+ Н3 Флуоресценция Пероксидаза хрена Абсорбция -излучение 20 20 14 25 125 - 25 75 - 50 50 - 0,3-73,6 0,03 2,5/3,1 0-52,0 0,28 1,9/4,5 0,3-48,0 0,3 3,9/2,1 0-65,0 0,3 6,0/5,5 0-55,5 0,24 5,8/3,8 0-33,0 0,3 8,8/6,5 4,9/7,0 3,7/8,0 7,1/4,9 12,9/6,8 3,7/3,0 11,2/9,6 4,6-28,2 9,7-38,1 5,3-23,4 9,4-33,5 8,3-41,6 11,0-33,0 Прямая хемилюминесце н-ция 150 29 28 17 Таблица 2. Значения тестостерона, полученные радиоиммунологическим и неизотопными методами. Метод Access Delfia Architect DRG Vitros ECi РИА Число определе-ний 100 100 100 100 100 100 Геометр. среднее 13,9 19,3 16,8 15,6 12,7 12,1 Медиана Разброс 14,2 19,2 17,8 16,3 13,1 13,0 3,1-50,1 3,6-94,6 3,8-114,4 3,5-40,8 1,8-44,2 2,1-34,6 Стд.отк лонен. 6,8 13,0 12,7 6,5 7,7 6,0 Критерий Уилкоксона РИА/Access РИА/Delfia РИА/Architect РИА/DRG РИА/Vitros ECi РИА 0,000000 0,000000 0,000000 0,000000 0,019009 Таблица 3. Различия в концентрации тестостерона между показателями, полученными РИА и неизотопными методами (n=100). Метод Access-РИА Delfia-РИА Architect-РИА DRG-РИА Медиана нмоль/л 1,2 7,3 4,9 2,7 Разброс нмоль/л -7,0/41,3 -10,4/85,8 -7,3/105,6 -9,8/19,0 Ст.откло нен. 4,9 11,8 11,3 4,1 Медиана % 12 65 39 21 Разброс % -26/469 -61/951 -45/1200 -33/284 Vitros ECi-РИА 0,4 -5,2/16,8 4,2 0,03 -49/163 18 Свободный тестостерон Как указывалось выше, тестостерон циркулирует в крови в комплексе с ГСПГ и неспецифическим белком альбумином, который имеет низкую аффинность, но большую емкость за счет его высокой концентрации в крови. И только 1-2% тестостерона циркулирует в крови в свободном виде. Константа ассоциации тестостерона, связанная с ГСПГ, высокая (109 л/моль), тогда как с альбумином она намного ниже (3,6∙104 л/моль). Приведенные параметры детерминируют и скорость диссоциации тестостерона: с ГСПГ – около 20 секунд, а с альбумином - около 1 сек, что определяет его биодоступность к тканям-мишеням при прохождении через стенку капилляра. Свободный тестостерон и связанный с альбумином тестостерон обозначают как биологически активную форму гормона. Вопрос о биологической роли комплекса тестостерона с ГСПГ остается открытым, большинство исследователей рассматривают его как буферную систему, препятствующую быстрой деградации тестостерона в печени, а некоторые авторы допускают его биологическое негеномное действие через мембранные рецепторы клетки Соотношение между свободным и связанным с белками тестостероном в физиологических условиях поддерживается на постоянном уровне. Однако при целом ряде патофизиологических ситуаций их соотношение нарушается и, прежде всего, за счет изменения концентрации основного специфического транспортного белка ГСПГ. Стандартное обследование больного с подозрением на дефицит андрогенов начинается с определения общего тестостерона, поэтому неизбежны ошибки в интерпретации полученных результатов, так как остается открытым вопрос о содержании свободного и биологически доступного тестостерона, которые определяют андрогенный статус пациента. Биологическая значимость ГСПГ до настоящего времени до конца не раскрыта. Например, он продуцируется в печени только приматов (низших и человекообразных обезьян и человека). Его уровень не подчиняется суточному ритму, тогда как для уровня тестостерона характерен такой ритм. Поскольку концентрация циркулирующего ГСПГ влияет на содержание общего и свободного тестостерона и их соотношение, то необходимо помнить о наиболее значимых факторах, изменяющих содержание ГСПГ. Эндогенные и экзогенные эстрогены повышают его концентрацию, а андрогены, наоборот, снижают. Гормоны щитовидной железы увеличивают его продукцию, а при их недостатке концентрация циркулирующего ГСПГ снижается. Его содержание в крови детей выше, чем у взрослых. У мужчин старше 50 лет концентрация ГСПГ нарастает и, тем самым, снижается доля свободного биологически активного тестостерона, усугубляя тем самым формирование возрастного гипогонадизма. 19 Согласно теории о свободных формах циркулирующих в крови гормонов уровень свТ отражает андрогенный статус более адекватно, чем содержание в крови обТ . Именно поэтому создание и внедрение адекватных аналитических методов определения свТ, обеспечило бы наиболее оптимальную диагностику андрогенного статуса пациента. Комплекс свТ/обТ – термодинамическая система, в которой свободная фракция гормона зависит от концентрации как обТ так и содержания связывающих белков, а также уровня ассоциации и диссоциации комплекса, что в свою очередь определяется температурой и рН . Традиционно отделение свТ от тестостерона связанного с белками проводится методом равновесно диализа или методом ультрафильтрации (УФ), который появился позднее. При этом необходим ультрачувствительный и высоко специфичный метод определения низкой концентрации св Т в фильтрате. Коммерческие диагностические компании разработали прямой безэкстракционный метод определения свТ в сыворотке, который используется в ряде эндокринологических лабораторий, несмотря на обоснованную и аргументированную критику о недопустимости его использования для оценки андрогенного статуса в силу недоработки протзводителями. Долгое время метод равновесного диализа определения свТ и других стероидов рассматривался как “золотой стандарт”. Однако с 2003 г. Европейский Комитет по Стандартизации диагностических систем и их компонентов принял решение о замене термина “золотой стандарт” другим определением “референсная измерительная процедура” (RMP). Для стероидных гормонов должен быть использован в качестве референсного метода – метод тандем масс- спектрометрии (TD-MS) .Принцип данного метода гарантирует точность, специфичность и снижение эффекта матрикса при количественном измерении Т или любого другого стероида. А для разделения комплекса обТ/свТ предложено использовать технологию ультрафильтрации или равновесного диализа с последующим количественным измерением концентрации свободного Т референсным методом масс-спектрометрии. При такой комбинации методов в сыворотке мужчин содержание свТ составляло 1,8% от общего Т, а при использования диализа 2,2%. Эти технологии используются в референсных лабораториях. Определение свободного тестостерона в слюне Неудовлетворительные и зачастую неприемлемые результаты автоматизированными системами послужили для нас основанием определения об.Т поиска альтернативных технологий и, прежде всего, прямого и доступного метода определения свободной формы Т, как наиболее адекватного маркера андрогенного статуса, как у мужчин, так и у женщин. Однако прямое определение свободной формы тестостерона в крови сопряжено с определенными технологическими трудностями. Поэтому мы обратились к альтернативной 20 биологической жидкости – слюне, куда поступает только свободные формы стероидов, включая тестостерон. Слюна, как биологическая жидкость, привлекла внимание исследователей почти 50 лет назад, так как слюнные железы обладают особенным свойством: в слюнной проток проникают соединения только с низкой молекулярной массой (< 400 дальтон), к которым относится и тестостерон, не связанный с альбумином и специфическим глобулином. Концентрация жирорастворимых свободных стероидов, таких как тестостерон, не зависит от скорости выделения слюны и соответствует уровню несвязанной формы стероида в сыворотке крови. Если измерить адекватными методами концентрацию свободного тестостерона, который доступен тканям-мишеням и оказывает свое биологическое действие в этой форме, то его уровень в слюне становится идеальным маркером для определения андрогенного статуса, как у мужчин, так и особенно у женщин и детей, у которых уровень Т во много раз ниже. Сбор слюны прост, не инвазивен и имеет большие преимущества перед традиционными методами определения стероидов в венозной крови, взятие которой требует квалифицированного персонала, и сам по себе является добавочным стрессорным фактором, способным искажать показатели гормональных параметров. Необходимо отметить, что в процессе развития методов гормонального анализа неоднократно предпринимались попытки использования слюны в качестве биологической среды для диагностики гормональных нарушений. Однако, РИА-методы, а в последующем и традиционные иммуноферментные методы не обеспечивали достаточной чувствительности, необходимой для определения низких концентраций свободных стероидов в слюне. Поэтому для анализа были необходимы большие объемы слюны (до 3 мл), после сбора слюны следовала процедура экстракции диэтиловым эфиром, который является огнеопасным и взрывоопасным растворителем. В результате такую технологию было сложно адаптировать для рутинного использования в гормональных лабораториях для клинической диагностики. Как известно, группой д-ра Vermeulen предложена формула для расчета концентрации свободного тестостерона на основе определения общего тестостерона и ГСПГ в крови [7]. В этом случае корректное определение концентрации свободного тестостерона в крови основано на четком знании истинной концентрации общего тестостерона. Реально это не простая проблема, так как современные автоматизированные технологии для измерения общего тестостерона дают совершенно разные результаты. Кроме того, требуется также оптимальный метод для определения ГСПГ, что значительно удорожает стоимость вычисления концентрации свободного тестостерона. Лишь появление современной технологии иммуноанализа, основанной на усиленной хемилюминесценции, сочетающей ультрачувствительность и высокую специфичность, сделало возможным определение свободных форм стероидных гормонов в очень малых объемах слюны 21 прямым методом (без экстракции). Высокая аналитическая (6,2 пмоль/л) и функциональная (17,3 пмоль/л) чувствительность позволяет количественно определять очень низкие (2-3 пг/пробе) концентрации тестостерона в слюне, что особенно важно для диагностики андрогенного статуса у женщин и детей. В процессе адаптации метода были обследованы здоровые добровольцы-мужчины (n=70) в возрасте 21- 55 лет. Пациенты-мужчины (n = 190), которые обращались в клинику для подтверждения или исключения диагноза различных форм гипогонадизма, возрастного андрогенного дефицита, сексуальной дисфункции и других нарушений гормональной функции яичек в возрасте 19- 83 лет Мальчики (n=93) в возрасте 2-18 лет без эндокринной патологии, с нормальным уровнем полового развития в соответствии со шкалой Таннера. Процедура сбора слюны Чтобы исследовать колебания концентрации тестостерона, три порции слюны были собраны в течение одного часа трижды в день. Порции слюны были собраны по следующей схеме: Образец 1 - в 8.30 Образец 4 - в 15.30 Образец 7 - в 22.00 Образец 2 - в 9.00 Образец 5 - в 16.00 Образец 8 - в 22.30 Образец 3 - в 9.30 Образец 6 - в16.30 Образец 9 - в 23.00 Наш опыт показал, что правильный сбор слюны – ключевой момент в достижении точных и воспроизводимых результатов измерения свободного тестостерона. Для этого мы разработали детальную процедуру сбора слюны. Образцы слюны необходимо собирать в специальные контейнеры (SaliCaps® , IBL) с трубочкой, изготовленные из материала, который не сорбирует стероиды. Слюна должна быть собрана не менее, чем через 30 минут после еды, питья, чистки зубов или употребления жвачки. Требовалось примерно 2 минуты, чтобы собрать необходимое количество слюны (0,6-0,8 мл). Образцы с небольшим окрашиванием из-за контаминации кровью необходимо исключить. Все образцы были помечены специальным маркером (имя пациента, дата, время). Собранная слюна могла храниться до 5 дней при 20оС, 10 дней при 2-8оС и 6 месяцев и более при -20оС. Свободный тестостерон измерялся в 50 мкл слюны в дубликатах. Ниже приведены некоторые приемы для быстрого и простого сбора слюны: При сборе слюны не рекомендуется делать перерыв и удалять трубочку изо рта и/или из пробирки Сбор слюны становиться легче, если вы слегка сжимаете зубами верхний конец трубочки Рекомендуется собирать слюну перед зеркалом, чтобы контролировать процесс наполнения пробирки Параллельно проводили определение содержания обТ и ГСПГ в сыворотке крови. 22 Определение свободного тестостерона проводилось люминисцентным LIA-методом (фирма IBL-Гамбург, Германия), основанном на принципе конкурентного связывания. Регистрацию люминисцентного сигнала проводили на мультианализаторе Victor (фирма Wallac, Финляндия). Определение общего тестостерона в образцах крови определяли методом усиленной хемилюминисценции с помощью автоматического анализатора Vitros ECi (Ortho-Clinical Diagnostics, J&J, Великобритания), как наиболее адекватного метода . Определение содержания глобулина, связывающего половые гормоны (ГСПГ), проводили методом отсроченной по времени флуоресценции с помощью автоматизированной системы Autodelfia (фирма Wallac, Финляндия). Вычисление концентрации свободного тестостерона в крови определяли с помощью математической формулы, использующей показатели содержания в крови общего тестостерона и ГСПГ и описанной в работе A.Vermeulen (калькулятор расчетного свободного Т в Интернете http://www.issam.ch/freetesto.htm) Средние показатели общего тестостерона, уровня ГСПГ, расчетного свободного тестостерон (св.Т) в крови и средний возраст обследованных мужчин представлены в табл.4. Таблица 4. Характеристика исследуемых групп (медиана и 10/90 процентили) Группы Возраст, лет Здоровые Мужчины Мужчины с андрогенным дефицитом р 38 (25-52) 35 (21-54) 0,2242 Общий тестостерон, нмоль/л 18,8 (12,4-26,1) 6,7 (1,2-10,8) ГСПГ, нмоль/л 36,1 (21-54) 33,0 (14,7-104,1) Вычисленный свободный тестостерон, пмоль/л 374 (225-544) 135 (9,3-215) <0,0001 0,3958 <0,0001 Обнаружено, что сопоставимые по возрасту здоровые мужчины и мужчины с андрогенным дефицитом имели сравнимый уровень ГСПГ (медиана, соответственно, 36,1 и 33,0 нмоль/л). Однако уровень общего тестостерона был значительно выше в группе здоровых мужчин (18,8 и 6,7 нмоль/л). Концентрация вычисленного свТ в крови у здоровых мужчин также была в три раза выше, чем у пациентов с андрогенным дефицитом (374 и 135 пмоль/л). 23 Таблица 5. Суточная динамика свободного тестостерона в слюне (пмоль/л) у здоровых мужчин и мужчин с андрогенным дефицитом (медиана и 10-90 процентили) Группы 8-30 371 (260 -562) 205 (76 -250) <0,0001 здоровые Андрогенный дефицит p 9-00 364 (277 -531) 209 (36 -267) <0,0001 9-30 374 (263 -541) 218 (52 -302) <0,0001 Время сбора слюны (часы) 15-30 15-00 16-00 329 322 288 (208 (225 (225 -440) -502) -440) 240 201 169 (35 (21 (51 -416) -319) -347) 0,0926 0,0147 0,0037 22-00 212 (146 -423) 131 (45 -364) 0,0083 22-30 295 (222 -430) 157 (66 -305) 0,0019 23-00 343 (164 -475) 145 (42 -316) 0,0056 Средняя концентрация тестостерона в слюне у здоровых мужчин (по 3 утренних образца от каждого, 8-30 – 9-30) составляла 380 пмоль/л (270-544). Средняя концентрация днем и вечером, соответственно, 80 ±15% и 71±21% от утренней концентрации (рис.3, табл.5). 700 600 пмоль/л 500 400 300 * * * * день вечер 200 100 0 утро Рис.3. Суточная динамика свободного тестостерона в слюне у здоровых мужчин (* медиана, достоверность разницы – между утром и вечером p=0,0012, между днем и вечером p=0,0006). В отличие от здоровых мужчин, суточная динамика свободного тестостерона в слюне у больных с андрогенным дефицитом выражена менее заметно. Концентрации свободного тестостерона утром и днем практически не отличались, статистически достоверное различие было обнаружено только вечером - 68±29% от утреннего уровня (рис.4 табл.5). 24 500 пмоль/л 400 300 * 200 * * 100 0 утро день вечер Рис.4. Суточная динамика свободного тестостерона в слюне пациентов с андрогенным дефицитом, * - медиана, достоверность разницы между утром и вечером p=0,583, между днем и вечером p=0,0006). Концентрация свТ в слюне и расчетная концентрация свТ в крови у здоровых мужчин практически не отличались друг от друга: 380 пмоль/л (270-544 пмоль/л) и 374 пмоль/л (225-544 пмоль/л, р=0,111) (рис.5), тогда как у пациентов с андрогенным дефицитом концентрация св.Т часто отличалась от вычисленной концентрации свТ в крови. Медиана свободного тестостерона в трех утренних образцах слюны была выше (215 пмоль/л, разброс 55-249 пмоль/л), чем вычисленная концентрация свободного тестостерона в крови – 135 пмоль/л (разброс 9,3-215 пмоль/л) (рис.6). 600 550 500 пмоль/Л 450 P=0.605 400 350 300 250 200 Св .Т в слюне Св. Т в крови Рис.5. Сравнение показателей расчетного св Т в крови и св Т в слюне в утренние часы у здоровых мужчин. 25 300 250 200 пмоль/Л 150 100 50 0 -50 1 2 Рис.6 Сравнение показателей расчетного св Т в крови ( 1 )и св Т в слюне (2)в утренние часы у пациентов с андрогенным дефицитом. Воспроизводимость концентрации свободного тестостерона в слюне во времени тестировалась в образцах слюны здоровых мужчин, которые были собраны еженедельно на протяжении 5 недель. В начале исследования (1-я неделя) концентрация свободного тестостерона у обследуемых была в пределах 180-745 пмоль/л. Последующие определения тестостерона (2-я – 5-я недели) показали высокую повторяемость результатов (коэффициент вариации (9% - разброс от 5 до 23%) (рис.7). Следующий важный аспект - мониторинг заместительной терапии андрогенами по уровню свободного тестостерона в слюне. Мы проводилои мониторинг определения свТ в слюне у транссексуала (женщина → мужчина) после лечения сустаноном. До лечения уровень общего и вычисленного свободного тестостерона в крови был очень низок (соответственно 3,9 нмоль/л и 42,3 пмоль/л). Через 1 неделю после инъекции сустанона уровень обТ в крови вырос на 29%, концентрация вычисленного свТ в крови – на 140%, тогда как содержание свТ в слюне возросло утром на 275% и вечером на 527% (рис.8). 26 800 CV =9 +/ - 7% 700 600 пмоль/Л 500 400 300 200 100 0 1 2 3 4 5 недели Рис.7. Воспроизводимость концентрации св.Т в слюне в группе здоровых мужчин в течение 5 недель ( сбор образцов слюны один раз каждую неделю). 1200 1000 пмоль/л 800 600 400 200 0 8:30 9:00 9:30 15:30 до лечения 16:00 16:30 22:00 22:30 23:00 на фоне лечения Рис.8. Динамика св. Т в слюне у транссексуала (женщина → мужчина). Мониторинг заместительной терапией андрогенами более адекватен при определении свТ в слюне с помощью LIA-технологии. С этим методом достаточно просто изучать фармакокинетику в каждом отдельном случае, с тем, чтобы подбирать оптимальную дозу препарата и пути его введения. 27 Мальчики от 2 до 18 лет В целом по группе (n=93) содержание общего Т варьировало от 0,05 до 25,8 нмоль/л, расчетного Т от 0,001 до 557 пмоль/л (рис. 9). 30 25 TT нмоль/л 20 15 10 нижний интервал референсных значений взрослых мужчин 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Возраст Рис.9. Динамика общего тестостерона у мальчиков на различных этапах пубертатного развития. 600 свТ расч. пмоль/л 500 400 300 нижний интервал рефересных значений взрослых мужчин 200 100 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Возраст Рис.10. Динамика расчетного свободного тестостерона в крови у мальчиков на различных этапах пубертатного развития. 28 Особый интерес представляет стадия препубертата – дети до 10 лет. Общий тестостерон в данной подгруппе варьировал в пределах 0,05 – 0,44 нмоль/л, т.е. на пределе аналитической чувствительности используемой нами автоматизированной системы Витрос, чувствительность которой 0,03 нмоль/л. Такая же динамика характерна и для расчетного Т, который варьировал практически около нуля, что является естественным результатом специфики стадии препубертата – низкий уровень Т в комбинации с высоким уровнем ГСПГ. (рис.10). В то же время содержание св.Т. в слюне в данной подгруппе варьирует в диапазоне определяемых концентраций от 3 до 127 пмоль/л (рис.11). С возрастом концентрация об.Т, расч. Т и св. Т в слюне нарастает и к 16-18 годам сглаживается и достигает уровня средних значений взрослых мужчин. 600 св.Т слюна пмоль/л 500 400 нижний интерв ал референсных значений в зрослых мужчин 300 200 100 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Возраст Рис.11. Динамика свободного тестостерона в слюне у мальчиков на различных этапах пубертатного развития. Во всех возрастных группах показатели св. Т в слюне с различной степенью значимости коррелируют с общим Т к крови. Коэффициент корреляции между общим, расчетным и св. Т в крови достигает статистической значимости только после 10 лет (табл. 6). 29 Таблица 6. Корреляционные связи между показателями тестостерона в группах обследованных мальчиков. Возраст, лет 2 – 10 (n = 14) 10 – 13 (n = 25) 13 – 16 (n = 33) 16 – 18 (n = 21) св. Т слюны об. Т крови св. Т слюны об. Т крови св. Т слюны об. Т крови св. Т слюны об. Т крови св. Т слюны расч. св. Т крови r p r p 0,559 0,667 0,400 0,452 - 0,037 <0,0001 0,020 0,030 - 0,237 0,085 0,983 0,718 0,688 0,473 0,552 0,680 0,413 0,787 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,005 0,009 <0,0001 Полученные данные показали, что использование количественных параметров общего и расчетного Т имеют ограниченную информативность для оценки андрогенного статуса у детей в период препубертата (до 10 лет). В то же время определение содержания св. Т в слюне является дополнительным к клинической симптоматике важным биохимическим маркером для диагностики возможных нарушений андрогенного статуса. В таблице 7 представлены выработанные нами интервалы значений уровня свободного Т в слюне в исследованных возрастных подгруппах. Необходимо отметить, что полученные значения могут использоваться только в качестве справочных. Рекомендуется отработка собственных результатов для установления референсных значений в каждой лаборатории для конкретной популяции. Таблица 7. Показатели свободного тестостерона в слюне у мальчиков (результаты представлены в виде медианы и 5/95-процентилей). Возраст, лет 2 - 10 св. Т слюны, пмоль/л 31,6 3,2 – 127 82,3 1,5 – 284 216 71,2 - 402 331 42,0 - 439 10 - 13 13 - 16 16 - 18 Таким образом введение в практику очень чувствительной и специфичной LIA-технологии, определение концентрация тестостерона объективный и адекватный в слюне может быть широко использована как гормональный критерий в диагностике различных форм гипогонадизма у мужчин, Использование количественных параметров общего и расчетного Т 30 имеет существенные ограничения для оценки андрогенного статуса у детей в период препубертата (до 10 лет). В то же время определение содержания св. Т в слюне является дополнительным к клинической симптоматике важным биохимическим маркером для диагностики возможных нарушений андрогенного гомеостаза.. Определение св. Т в слюне ЛИА - методом может также служить методом выбора для научных исследований, мониторинга и лечении гонадальных дисфункций, включая изучение фармакокинетики производных тестостерона при заместительной терапии. Для иллюстрации важности выбора адекватной технологии определения тестостерона приводим результаты сравнительного анализа LIA и ELISA технологий для определения свободной формы тестостерона в слюне в широком диапазоне концентраций. В работе были использованы 160 образцов слюны, в которых содержание св. Т, при определении LIA методом, варьировало в пределах 10 - 990 пмоль/л (3 – 285 пг/мл). Мы проводили измерение уровней свободного тестостерона в одних и тех же образцах слюны LIA (ультра чувствительный хемилюминесцентный анализ) и ELISA (ферментный иммуноанализ с регистрацией сигнала методом фотометрии) наборами, рекомендованными фирмой IBL для определения св. Т в слюне. Достаточно высокая корреляция между определяемыми показателями регистрируется во всем исследуемом диапазоне концентраций. Коэффициент корреляции составлял 0.94 в диапазоне высоких концентраций (св. Т в слюне > 110 пмоль/л по результатам LIA метода) и 0.86 в диапазоне низких концентраций (менее 110 пмоль/л). Анализ абсолютных значений св. Т в слюне показал, что в диапазоне высоких концентраций различия между методами практически отсутствовали. В то же время в диапазоне низких концентраций использование метода ELISA завышает показатели Т в 1,5 – 2 раза, т.е. для данной категории его нельзя использовать. Таким образом, с введением в практику очень чувствительной и специфичной LIAтехнологии, определения концентрация тестостерона в слюне может быть широко использована как объективный и адекватный гормональный критерий в диагностике различных форм андрогенного дефицита у мужчин, а его определение LIA-методом может служить методом выбора для целого ряда научных исследований, мониторинга в процессе терапии гонадальных дисфункций, включая изучение фармакокинетики производных тестостерона при заместительной терапии. 31 Литература 1. Гончаров Н.П., Кация Г.В., Колесникова Г.С. и др.// Пробл. эндокринол.-2005.-№6.-С. 3137. 2. Гончаров Н.П., Кация Г.В., Добрачева А.Д. и др.// Пробл. эндокринол.- 2007.- № 3. – C. 3035. 3. Carruthers M, Trinick TR, Wheeler MJ. // Aging Male – 2007. – V.10, N3. – P. 165-72. 4. Goncharov N.,Katsya G., Dobracheva A. et al. // Aging Male.-2006.-V.9.-P.111-122. 5. Rosner W, Auchus R, Azziz R. et al.// J Clin Endocrinol Metab. – 2007.- V.92.- P.405-413. 6. Taieb J., Mathian F., Patricot M.C. et al. // Clin.Chem. - 2003. - V.49. - P.1381-1395. 7. Vermuelen A., Verdonck L., Kaufman J.M.A // J.Clin.Endocrin.Metab. - 1999. – V.84. - P.36663672. 8. Wang C., Catlin D.H., Laurence M.D. et al. // J.Clin.Endocr.Metab. - 2004. - V.89. - P.534-543. Список сокращений биоТ - биодоступный тестостерон ГнРГ - гонадотропный рилизинг-гормон ГСПС - секс-стероидсвязывающий глобулин ИФА - иммуноферментный анализ ЛГ - лютеинизирующий гормон обТ - общий тестостерон РИА - радиоиммунологический анализ свТ - свободный тестостерон Т - тестостерон УФ - метод ультрафильтрации ФСГ - фолликулостимулирующий гормон ELISA - ферментный иммуноанализ LIA - люминесцентный иммуноанализ 32