PaskoNV - страница

На правах рукописи
ПАСЬКО НАДЕЖДА ВАЛЕРИЕВНА
ПЕРОКСИДНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ, АНТИОКСИДАНТНАЯ
СИСТЕМА И ОКСИД АЗОТА ПРИ ПОСЛЕРОДОВЫХ НАРУШЕНИЯХ
СОКРАТИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ МАТКИ У КОРОВ
03.00.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Воронеж-2009
Работа выполнена в отделе клинической биохимии ГНУ Всероссийский
научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии
и терапии РАСХН.
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Рецкий Михаил Исаакович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Беляев Василий Иванович
кандидат биологических наук
Венцова Инна Юрьевна
Ведущая организация:
ФГОУ ВПО Курская государственная
сельскохозяйственная академия
им. И.И. Иванова
Защита состоится __ ________ 2009 года в __ часов на заседании диссертационного совета_ДМ 006.004.02 в ГНУ Всероссийский НИВИ патологии, фармакологии и терапии РАСХН (394087, г.Воронеж, ул.Ломоносова
114-б)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИВИПФиТ.
Автореферат разослан «__»__________ 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
канд.биол.наук
2
Г.Н. Близнецова
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Противоречивые сведения о характере течения
инволюционных процессов, этиологии, патогенезе и клиническом проявлении функциональных расстройств в половых органах после родов сдерживают разработку эффективных методов ранней диагностики, лечения и профилактики патологии послеродового периода.
Среди всех акушерских заболеваний, регистрируемых у животных в послеродовый период, одним из наиболее распространенных является субинволюция матки. В основе данного заболевания матки лежат нарушение тонуса
и ослабление её сократительной функции (Нежданов А.Г., Мисайлов В.Д.,
1996). На фоне субинволюции могут развиваться гнойно-катаральный и гнойный септический эндометриты, различные функциональные расстройства
яичников и матки, приводящие к длительному бесплодию животных (Нежданов А.Г., 1982; Шахов А.Г. с соавт., 2006).
Согласно современным представлениям универсальными регуляторами
функций любых физиологических систем организма являются процессы свободнорадикального окисления и система оксида азота (L-аргинин-NO) и существует тесная взаимосвязь между процессами свободнорадикального
окисления (СРО), инициаторами которого являются активные формы кислорода (АФК), антиоксидантной системой и системой оксида азота (Зенков
Н.К. с соавт., 2001).
Свободнорадикальная природа NO (Halliwell B. et al, 1997) позволяет
ему, как активировать цепные свободнорадикальные реакции, так и ингибировать их (Laskin J.D. et al., 2001). При этом защитные эффекты NO связаны
с его способностью увеличивать активность антиоксидантных ферментов и
экспрессию кодирующих их генов (Gromadzinska J., Zachara B., 1992) и замедлять свободнорадикальное окисление липидов (Wu S. et al, 2000). Оксид
азота может быть вовлечен и в механизмы повреждения наряду с процессами
свободнорадикальной модификации белков и нуклеиновых кислот активными формами кислорода (Laskin J.D. et al., 2001). В зависимости от природы
действующего фактора эти повреждающие эффекты возможно могут быть
обусловлены либо гипо-, либо гиперпродукцией АФК, а избыточный или недостаточный синтез NO в организме является одним из факторов патогенеза
различных заболеваний (Зенков Н.К. с соавт., 2001).
Дисбаланс прооксидантных и антиоксидантных процессов в организме
приводит к формированию оксидативного стресса (Осипов А.Н. с соавт.,
1990; Naziroglu M. et al., 2000), который является основным метаболическим
синдромом, способствующим развитию многочисленных морфофункциональных нарушений в организме (Меньщикова Е.Б. с соавт., 1994).
Имеются данные о том, что оксид азота участвует в расслаблении гладких мышц матки, тормозит сокращения матки при беременности и играет
роль релаксанта цервикального канала в родах (Garfield R.E. et al., 2001).
Все это позволяют предполагать важную роль процессов свободнорадикального окисления, состояния антиоксидантной системы, а также систе3
мы L-аргинин-NO в патогенезе послеродовых нарушений сократительной
функции матки у коров. Выяснение этой стороны патогенетических механизмов может быть перспективно и в плане поиска и разработки фармакологических средств снижающих проявление нарушений сократительной функции матки в послеродовый период.
К сожалению работ, посвященных изучению роли процессов пероксидного окисления липидов, системы антиоксидантной защиты и интенсивности
образования оксида азота в период беременности и после родов у коров, а
также их связи с развитием послеродовой патологии и, в частности, с нарушением сократительной функции матки крайне мало. Это и определило общую направленность работы, выбор методологических подходов и экспериментальных моделей.
Цели и задачи. Основной целью исследования является изучение роли
свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантной системы, а
также оксида азота в развитии послеродовых нарушений сократительной
функции матки у коров.
В соответствии с указанной целью на разрешение ставятся следующие
задачи:
1. Изучить показатели, характеризующие интенсивность свободнорадикального окисления липидов в разные периоды до и после отела у здоровых
коров и коров с субинволюцией матки.
2. Изучить показатели, характеризующие состояние ферментативного
звена антиоксидантной системы в разные периоды до и после отела у здоровых коров и коров с субинволюцией матки.
3. Изучить динамику уровня стабильных метаболитов оксида азота в
предродовый и послеродовый период у здоровых коров и коров с субинволюцией матки.
4. Выявить характер взаимосвязи динамики половых гормонов и оксида
азота у коров с нормальным и патологическим течение послеродового периода.
5.Определить биохимические критерии риска развития у коров нарушений сократительной функции матки в послеродовый период.
Научная новизна. Впервые комплексно изучены процессы пероксидного окисления липидов, состояние антиоксидантной системы и генерации оксида азота в течение беременности и в послеродовый период у здоровых коров и
животных с послеродовым нарушением сократительной функции матки.
Установлено, что по мере приближения родов различия в уровне функционального состояния ферментативного звена системы антиоксидантной защиты
и интенсивности течения процессов пероксидного окисления липидов между
животными с нормальным и патологическим течением послеродового периода
усиливаются. Впервые изучено влияние уровня генерации в организме оксида
азота во время беременности и после родов на сократительную активность
миометрия у клинически здоровых коров и коров с субинволюцией матки.
Выявлена взаимосвязь сократительной функции матки и интенсивности образования оксида азота в организме у коров. Установленные взаимосвязи между
оксидантно-антиоксидантным гомеостазом, оксидом азота, половыми гормо4
нами и сократительной функцией матки позволяют расширить современные
представления о молекулярно-биохимических механизмах развития её субинволюции у коров. Получен патент РФ №2296507 «Способ прогнозирования
патологии послеродового периода у коров».
Практическая значимость. Даны биохимические критерии повышенного риска развития субинволюции матки у коров. Полученные данные можно
использовать для оценки устойчивости к заболеваниям, прогнозирования возникновения патологических состояний и разработки научно обоснованных методов управления и комплексной профилактики субинволюции матки у коров.
Материалы диссертации вошли в Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике субинволюции матки у коров рассмотренные, одобренные и рекомендованные к изданию секцией «Патология, фармакология и терапия» (протокол № 1 от 24.03.2005).
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Международных научно-практических конференциях «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях (Воронеж,
2002); «Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных» (Воронеж, 2004); «Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных» (Воронеж, 2005); «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Курск, 2008) и на 1 съезде фармакологов России (Воронеж, 2007).
Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 15 научных статьях, опубликованных в различных изданиях, в том числе 4 в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК
РФ и 1 патенте.
На защиту выносятся следующие положения:
1. У коров с субинволюцией матки до и после отела повышена интенсивность процессов свободнорадикального окисления липидов и имеются
нарушения в ферментативном звене системы антиоксидантной защиты организма по сравнению с коровами с нормальным течением послеродового периода.
2. Изменению синтеза оксида азота принадлежит важная роль в регуляции сократительной активности миометрия. У коров с субинволюцией
матки в послеродовой период интенсивность образования оксида выше, чем у
коров с нормальным течением послеродового периода.
3. Оксиду азота принадлежит важная роль регуляции сократительной
функции матки у коров. У коров с нормальным течением послеродового периода инволюция матки происходит на фоне снижения образования оксида
азота, а отсутствие такой закономерности является одной из причин развития
послеродовой субинволюцией матки.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 144 страницах
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, объектов и
методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения,
выводов и практических предложений. Список использованной литературы
5
содержит 255 источников, из них 138 отечественных и 117 иностранных. Иллюстративный материал включает 17 рисунков и 7 таблиц.
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования выполнены в 2001-2008 г.г. в отделе клинической биохимии в соответствии с планом научно-исследовательских работ Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии по заданиям 04.01.03.
«Изучение этиологии и патогенеза субклинического мастита у супоросных
свиноматок и сухостойных коров, субинволюции матки у коров и разработка
методов их диагностики, терапии и профилактики» (№ гос. регистрации
01.200.117018) и 08.04.02. «Разработать новые экспресс-тесты и терапевтические препараты для эффективной системы мероприятий по диагностике,
профилактике и терапии болезней органов размножения и молочной железы
у коров и свиней, обеспечивающей снижение бесплодия маточного поголовья, получение жизнеспособного приплода и производство продукции высокого санитарного качества (№ гос. регистрации 15070.3666026906.06.8.002.3).
Опыты проведены в зимне-стойловый период (октябрь-апрель) на 120
коровах в возрасте 2-8 лет, средней упитанности, массой тела 500-700 кг в
ОАО “Воронежпищепродукт” Новоусманского района Воронежской области.
Кормление коров проводилось по общепринятым в хозяйстве рационам. В
соответствии с анамнестическими данными коровы были распределены на
следующие группы: клинически здоровые, с острой и хронической субинволюцией матки. Учитывали общее клиническое состояние, характер течения
родов, послеродовых инволюционных процессов в половых органах и сроки
их завершения. Субинволюция матки подтверждалась клиническими и лабораторными исследованиями. Исследования крови у подопытных животных
проводили в разные периоды до и после отела в зависимости от задач опыта.
Работа была выполнена совместно с д-ром. вет. наук В.И. Михалевым,
канд. биол. наук Г.Н. Близнецовой, в связи с чем, автор выражает им свою
благодарность.
Для изучении in vitro влияния состояния системы L-аргинин-NO на сократительную активность миометрия опыты проведены на беременных белых
крысах с массой тела 200-250 г на 20-й день беременности (n=5) и сразу после родов (n=5). Рога матки иссекали и тщательно очищали от окружающей
соединительной ткани. У беременных крыс после удаления плодов миометрий рассекали на продольные полоски размером приблизительно 511 мм и
помещали в специальную ванночку объемом 10 мл, заполненную раствором,
содержащим (в мМ/л): хлорид натрия 125, хлорид калия 2,4, хлорид кальция
1,8, хлорид магния 0,5, бикарбонат натрия 23,9 и глюкозу 11,0. Температура
раствора 37°C, pH = 7,4. Регистрирацию сокращения в изометрическом режиме проводили через 30 минут после прикрепления к кусочкам миометрия
груза в 1 г с использованием специального тензометрического датчика Grass
FT 03 на полиграфе Grass 79E фирмы Grass, Quincy, Mass. (США). Регистрирующее устройство было откалибровано так, чтобы напряженность мышцы
соответствующая силе в 1 г соответствовало вертикальному смещению пера
6
самописца на 1 см. Анализировали 10-минутные периоды до и после добавления следующих вещест: L-аргинин, метиловый эфир нитро-L-аргинина (LNAME) и карбохолин фирмы Sigma (США), которые растворяли в 0,9 %
NaCl и добавляли в ванночки с инкубационной средой в объеме 50 мкл.
Для оценки интенсивности процессов пероксидного окисления липидов, состояния ферментативного звена системы антиоксидантной защиты и
интенсивности синтеза оксида азота у коров определяли: содержание в крови
коньюгированных диенов и кетодиенов (ед.оп.пл/мл), малонового диальдегида (мкМ/л), в сыворотке крови - содержание флуоресцирующих оснований
Шиффа (усл. ед./мл), в крови - активность каталазы, глутатионпероксидазы с
использованием в качестве субстрата перекиси водорода и глутатионредуктазы (Бузлама В.С. с соавт., 1997), супероксиддисмутазы (Сирота Т.В., 1999);
показатели биохемилюминесценции плазмы крови (Владимиров Ю.А.,
Шерстнев М.П., 1989); содержание стабильных метаболитов оксида азота в
сыворотке крови (Близнецова Г.Н. с соавт., 2002). Определение оптической
плотности растворов проводили на спектроколориметре «Spekol 210» (Германия) или спектрофотометре СФ-16 (Россия), параметры биохемилюминесценции - на биохемилюминометре БХЛ-06.
Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием прикладной программы «Statistica 5.0». Достоверность отличий оценивали методом парных сравнений, используя t-критерий Стьюдента
(Лакин Г.Ф., 1990).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Динамика показателей свободнорадикального окисления липидов и
состояния антиоксидантной системы в крови клинически здоровых коров в последний месяц беременности и ранний послеродовый период
Установлено, что в предродовый и в послеродовый периоды у коров
происходят заметные изменения содержания в крови первичных, промежуточных (вторичных) и конечных продуктов ПОЛ.
За 25-30 дней до отела концентрация диеновых конъюгатов (ДК) в крови
глубокостельных коров составила 0,49±0,011 ед.оп.пл/мл крови.
В дальнейшем за 15-20 и 2-3 дня до отела концентрация ДК повышается
по сравнению с исходным уровнем на 8,0 и 18,0% соответственно. Наивысшей
концентрации в крови ДК достигают в ранний послеродовый период. На 2-3
день после отела их уровень превосходит исходный (за 25-30 дней до отела) на
38,0%. На 5-10 и 15-20 сутки послеродового периода происходит снижение
уровня ДК и их концентрация в крови животных ниже, чем на 2-3день после
родов на 10 и 19% соответственно.
Изменение содержания в крови коров кетодиенов (КД) полностью соответствует динамике диеновых конъюгатов.
За 25-30 дней до отела уровень малонового диальдегида (вторичного
продукта ПОЛ) у коров составлял 0,92±0,019 мкМ/л крови. За 15-20 дней до
родов его уровень достоверно возрастает на 15%, по сравнению с исходным
7
уровнем. За 2-3 дня до отела концентрация МДА в крови еще более возрастает. В ранний послеродовый период (2-3 дни после отела) в крови животных
достоверно наиболее существенно (на 48%) увеличивается уровень МДА, по
сравнению с его уровнем в крови за 1 месяц до отела. Начиная с 5-10 дня после отела, уровень МДА начинает постепенно снижается и к 15-20 суткам послеродового периода составляет 113,3% от исходного за месяц до родов.
Динамика содержания в крови флуоресцирующих оснований Шиффа
также свидетельствует о тенденции к повышению их концентрации по мере
приближения и сразу после родов с последующим снижением до исходного
уровня за 1 месяц до отела.
Таким образом, у клинически здоровых коров завершающий период беременности и ранний послеродовый период протекают на фоне интенсификации процессов свободнорадикального окисления липидов, которая наиболее
выражена за 2-3 дня до и 2-3 дня после отела. К 20-му дню после родов уровень всех типов продуктов ПОЛ заметно снижается и статистически достоверно не отличается от их уровня за 25-30 дней до отела.
Изменение интенсивности протекания процессов ПОЛ у коров в предродовый и послеродовый периоды тесно связано с функционированием системы антиоксидантной защиты, состояние ферментативного звена которой изменяется в зависимости от физиологического состояния животных.
По мере приближения родов (за 15-20 дней до отела) активность каталазы в крови возрастает, а за 2-3 дня до родов становится выше исходного уровня на 21,0 и 24,5% соответственно (рис.1).
В раннем послеродовом периоде (2-3 дни после отела) происходит достаточно резкое снижение активности каталазы по сравнению с её активностью за несколько дней до родов, а к 15-20 дню послеродового периода происходит некоторое повышение активности каталазы по сравнению со 2-3 днем
послеродового периода. Также при приближении родов наблюдается тенденция к повышению активности ГПО относительно исходного уровня на 7,8% и
14% соответственно (рис.2).
Рис. 2. Динамика активности глутатионпероксидазы (мМ G-SH/л×мин) в крови
клинически здоровых коров в предродовый и
послеродовый период.
Рис. 1. Динамика активности каталазы
(мМ Н2О2/л×мин) в крови клинически здоровых коров в предродовый и послеродовый период.
8
На 2-3-и сутки послеродового периода происходит резкое увеличение
активности ГПО на 25,2% по сравнению со 2-3 днем до родов. К 15-20 суткам
послеродового периода активность ГПО несколько снижается по сравнению с
ранним послеродовым периодом, но все еще остается на достаточно высоком
уровне.
За 15-20 дней до отела отмечена
тенденция к повышению активности глутатионредуктазы в крови, а за
2-3 дня её активность еще более возрастает (рис.3). В ранний послеродовый период активность глутатионредуктазы в крови снижается до
174,0±13,2 но уже к 15-20 суткам послеродового периода активность
фермента практически восстанавливается до уровня, определенного за
Рис. 3. Динамика активности глутатионредуктазы (мкМ окисленного глутатиона/ месяц до отела.
л×мин) в крови клинически здоровых коров в
различные периоды до и после отела.
3.2. Свободнорадикальное окисление липидов и состояние
антиоксидантной системы у коров с субинволюцией матки
За 1-1,5 месяца до отела у коров с последующим развитием после отела
субинволюции матки, по сравнению с коровами с нормальным течением послеродового периода, установлена пониженная мощность ферментативного
звена системы антиоксидантной защиты (табл.1).
Таблица 1
Активность ферментов системы антиоксидантной защиты в крови
у здоровых и заболевших коров в разные периоды до и после отела
Периоды исследования
Группа
Через
Через
За 1-1,5 месяца
За 10-14 дней
животных
1-2 суток
15 суток
до отела
до отела
после отела
после отела
Супероксиддисмутаза, усл. ед. акт./мг Hb
Здоровые
6,70,71
7,20,88
5,60,74
6,80,65
Заболевшие
5,30,39
5,60,62
2,00,36*
2,90,42*
Глутатионпероксидаза, мМ восстановленного глутатиона/л×мин
Здоровые
20,42,22
21,22,34
29,32,32
24,22,11
Заболевшие
13,61,98
14,12,17
18,12,18*
16,21,59*
Глутатионредуктаза, мкМ окисленного глутатиона/л×мин
Здоровые
217,717,4
256,418,6
200,421,6
275,231,4
Заболевшие
130,614,9*
158,015,9*
120,617,8*
178,620,4*
Примечания: * - P < 0,05-0,001
Об этом свидетельствует более низкая активность в крови у заболевших
после отела коров глутатионредуктазы (на 40%), фермента поддерживающего
9
общий пул восстановленного глутатиона в организме. Помимо этого у коров
снижена активность СОД на 20,8 % , ГПО на 33,3 % и каталазы на 6,5%, что в
целом свидетельствует о более низком уровне функционального состояния
ферментативного звена антиоксидантной системы у коров, предрасположенных к субинволюции матки.
Различия в активности ферментативного звена системы антиоксидантной защиты сохраняются и после родов. В этот период активность СОД у них
ниже более чем в 2 раза, каталазы – на 27,6 %, глутатионпероксидазы – на
38,2% и глутатионредуктазы – на 39,8 % (табл.1). Это не позволяет адекватно
контролировать и удерживать в физиологических пределах чрезмерную активацию процессов ПОЛ и накопление в организме его токсических продуктов. Поэтому уровень конъюгированных диенов повышен на 25,9 %, малонового диальдегида – на 40,0 %, а содержание в сыворотке крови флуоресцирующих оснований Шиффа – на 38,5 % (табл.2).
Таблица 2
Содержание продуктов ПОЛ в крови у здоровых и заболевших коров
в разные периоды до и после отела
Периоды исследования
В начале
Через
За 10-14 дней
сухостойного
1-2 суток
до отела
периода
после отела
Конъюгированные диены
Здоровые
0,1080,018
0,1240,016
0,1440,025
Заболевшие
0,1360,021
0,1560,034
0,2660,035*
Малоновый диальдегид
Здоровые
0,450,051
0,560,051
0,980,055
Заболевшие
0,630,056*
0,880,064*
2,290,109*
Основания Шиффа
Здоровые
0,130,010
0,160,012
0,270,029
Заболевшие
0,180,014*
0,240,019*
0,790,062*
Примечания: *- P < 0,05-0,001 по сравнению со здоровыми
Группа
животных
Через
15 суток
после отела
0,1380,014
0,2650,029*
0,550,048
1,320,102*
0,180,011
0,720,059*
Таким образом, у коров с субинволюцией матки имеется существенный
дисбаланс в системе ПОЛ-АОЗ. В этом может заключаться одна из причин
метаболических нарушений в организме коров в ранний послеродовый период, на фоне чего возрастает риск развития субинволюции матки.
3.3. Хемилюминесцентный анализ плазмы крови коров в пред- и
послеродовый период
По характеру параметров хемилюминесценции (ХЛ) плазмы крови между оксидантно-антиоксидантными процессами у коров за 30 суток до отела
существует определенный баланс.
По мере приближения к родам показатели интенсивности ХЛ увеличиваются и достигают своего максимума непосредственно перед родами, что
свидетельствует о повышении интенсивности процессов свободнорадикального окисления и развитии дисбаланса в системе СРО-АОЗ (табл.3).
10
Однако к 10-му дню после родов дисбаланс между образованием и утилизацией свободных радикалов смещается в сторону нарастания мощности системы антирадикальной защиты. В дальнейшем (на 30-е сутки после отела)
изменения интенсивности процессов пероксидации за счет активизации системы АОЗ приводят к нормализации течения СРО и переходу этих процессов на более низкий стационарный уровень, обеспечивающий нормальное
течение метаболических процессов в организме.
Таблица 3
Интенсивность хемилюминесценции плазмы крови клинически здоровых и
с субинволюцией матки коров
Показатели
ХЛ
До отела, сутки
30
7-10
Период исследования
После отела, сутки
1-3
1-3
7-10
30
9,2±0,4
11,5±0,8
18,9±0,9
21,1±1,1
15,7±0,7
10,8±0,5
9,8±0,5
12,5±0,8
19,5±0,9
23,5±1,6
18,3±1,2
11,7±0,8
20,2±1,3
25,7±1,8
32,2±2,1
34,6±2,0
26,8±2,2
21,3±1,2
S, mVсек
23,2±1,5
26,7±1,4
33,1±2,0
36,6±2,1
29,8±1,7
24,2±1,5
2,0±0,10
2,1±0,10
2,5±0,15
2,9±0,21
2,4±0,17
2,1±0,12
tg1,mVсек
2,0±0,12
2,8±0,17* 3,1±0,10*
3,4±0,19
3,2±0,17*
3,1±0,24*
-2,2±0,12
-1,9±0,20
-1,4±0,08 -1,2±0,08
-1,8±0,12
-2,1±0,12
tg2,mVсек
-2,1±0,15
-1,7±0,09
-1,3±0,07 -0,8±0,07* -1,2±0,11*
-1,8±0,12
0,46±0,04 0,45±0,03 0,59±0,06 0,61±0,06
0,59±0,06
0,48±0,03
К1 (Imax/S)
0,42±0,01 0,47±0,04 0,59±0,06 0,64±0,06
0,61±0,03
0,48±0,01
0,11±0,013 0,07±0,003 0,04±0,003 0,03±0,001 0,07±0,004 0,10±0,004
К2 (tg2/S)
0,09±0,012 0,06±0,006 0,04±0,001 0,02±0,001 0,04±0,002* 0,07±0,003*
Примечание: числитель – здоровые, знаменатель- субинволюция матки.
* - P< 0,05 по сравнению со здоровыми
Imax, mV
Иная картина наблюдалась у коров, после отела, у которых развилась
субинволюция матки. За 30 суток до отела у них установлена пониженная
мощность системы антиоксидантной защиты и более интенсивное течение
свободнорадикальных процессов, о чем свидетельствуют показатели светосуммы (S) и величины максимальной вспышки (Imax) хемилюминесценции. Эта тенденция сохраняется на протяжении всего предродового периода.
В первые сутки после отела отмечается наиболее высокая интенсивность свободнорадикальных процессов, что характеризует в определенной
мере функциональную недостаточность неферментативного звена АОС крови. Об этом же свидетельствует низкая антиокислительная активность плазмы крови в тот же период, оцениваемая по тангенсу угла наклона кинетической кривой (tg 2), который на 33,4% больше по сравнению с таковым у
оставшихся здоровыми коров.
Следствием сниженного функционального состояния систем, контролирующих на разных стадиях интенсивность течения процессов свободнорадикального окисления, являются и более высокие показатели S и Imax у заболевших коров, по сравнению со здоровыми: через 1-3 суток - на 5,0% и
11
10,2%, через 7-10 суток - на 10,1% и 14,2%, через 30 суток - на 7,9% и 7,7%
соответственно.
О сбалансированности оксидантно-антиоксидантных процессов можно
судить по значению коэффициента К1, рассчитанного как отношение Imax/S и
отражающего степень интенсивности процессов пероксидации (рис.4).
Согласно полученным данным
у коров с нормальным течением
послеродового периода за 1-3 суток
до отела значение данного коэффициента возрастало на 28,3%, а на
1-3 сутки после отела – 32,6%, одновременно со снижением АОА(-tg
2) крови в эти же сроки. У коров с
субинволюцией матки характер
изменения коэффициента К1 был
такой же, но дисбаланс в системе
СРО-АОЗ был более выражен. У
Рис.4. Динамика сбалансированности оксиних за 1-3 суток до отела коэффидантно-антиоксидантных процессов у здоровых коров и коров с субинволюцией матки в циента К1 возрастал на 40,5%, а
через 1-3 суток после отела коэфпредродовый и послеродовый периоды.
фициент К1 был выше, чем за 30 дней до родов на 52,4 %. Для оценки сбалансированности оксидантно-антиоксидантного статуса и своевременного обнаружения явления "оксидативного стресса" у крупного рогатого скота предложено также использовать отношение показателя АОА крови к интенсивности пероксидации в качестве коэффициента сбалансированности К 2 (-tg2/S),
но в отличие от коэффициента К1, он отражает вклад внеклеточных антиоксидантов в становление антирадикального гомеостаза организма (Степанова
И.П., 2004).
Значение коэффициента сбалансированности К2 у коров за 1-3 суток до
отела и на 1-3 сутки после отела по сравнению с его значением за 30 суток до
родов снижается в 2,75 и в 3,78 раза соответственно. Это снижение указывает
на состояние "окислительного стресса" в этот период у коров.
У животных с послеродовой субинволюцией матки снижение коэффициента сбалансированности К2 было более существенно (в 4,5 раза). При
этом и за месяц до и после родов у таких животных система СРО-АОЗ менее
сбалансирована, о чем свидетельствовал более низкий (на 22,2 и 30,0% соответственно) коэффициент сбалансированности К2 у них, по сравнению с коровами с нормальным течением послеродового периода.
Таким образом, хемилюминесцентный анализ СРО в плазме крови у коров в поздний предродовый и ранний послеродовый периоды свидетельствует
об интенсификации окислительных реакций, протекающих по свободнорадикальному механизму. Снижение интенсивности реакций подобного класса,
начиная с 7-10-х суток у оставшихся здоровыми коров после родов, обусловле-
12
но включением адаптационно-компенсаторных механизмов, направленных на
подавление избыточного процесса окислительной деструкции биополимеров.
У коров с послеродовой субинволюцией матки дисбаланс в системе
СРО-АОЗ на фоне имеющейся у них недостаточной мощности антиоксидантной системы создает предпосылки неадекватного восстановления оксидантно-антиоксидантного статуса коров в критические периоды (непосредственно до и после родов), возникновению у них явления "окислительного
стресса" и на его фоне развитию острой субинволюции матки. Это является
основанием рассматривать необходимость применения антиоксидантов животным в последний месяц беременности и ранний послеродовый период в
условиях риска развития послеродовой субинволюции матки как важный
фактор профилактики этой патологии.
3.4. Динамика содержания стабильных метаболитов оксида азота
у клинически здоровых и коров с субинволюцией матки
Установлено, что за 1,5-1 месяц до родов уровень стабильных метаболитов оксида азота у коров не заболевших субинволюцией матки, составил
39,0±4,77 мкМ/л (табл. 4).
Таблица 4
Содержание стабильных метаболитов оксида азота (NOх ) в сыворотке крови
у здоровых коров и коров с острым и хроническим течением субинволюции
матки, мкМ/л
Периоды
исследования
Здоровые
Субинволюция
острая
хроническая
До родов
За 45-30 суток
За 14-7 суток
За 3-1 суток
39,0 ± 4,77
42,0 ± 1,92
77,4 ± 7,56*
66,6 ± 5,43*
152,7 ± 7,08*
145,5± 4,77*
После родов
Через 1 сутки
94,8 ± 7,2*
140,7 ± 3,9*
Через 2 суток
53,4 ± 12,6
132,3± 3,78*
Через 3-5 суток
51,9 ± 2,85
117,8±4,26*
Через 30 суток
47,1 ± 4,14
66,0 ± 8,04*
*- Р ≤ 0,05-0,001 по сравнению с периодом за 45-30 суток до родов
40,5 ± 1,53
75,3 ± 1,32*
147,2±4,98*
105,9 ± 4,53*
90,6 ± 8,55*
88,2 ± 4,95*
77,1 ± 2,37*
К концу последнего триместра беременности и приближения родов
суммарный уровень метаболитов оксида азота в сыворотке крови коров постепенно возрастает и за 1-3 сутки до родов превышает уровень NO за 1,5-1
месяцев почти в 4 раза. Через 1 сутки после отела уровень метаболитов оксида азота у здоровых коров составляет 94,8±7,2 мкМ/л, а уже на 2-е сутки после отела суммарное содержание NOх снижается до 53,4±12,6 мкМ/л. Далее
происходит еще большее снижение их уровня до величин, установленных за
2-4 недели до родов, что, вероятно, является одним из факторов способствующих сокращению матки после родов и развитию инволюционных процессов. Возможно, что именно эти механизмы лежат в основе послеродовый инволюции матки.
13
Интенсивность продукции оксида азота у коров с нарушением сократительной функции матки в период клинического проявления этой патологии
существенно отличается как от оставшихся здоровыми животных, так и в зависимости от характера её проявления (см. табл. 4). Уровень NOx в крови коров с острым течением субинволюции матки на следующий день после родов
превышает таковой у коров с нормальным течением инволюционных процессов на 48,4%, через 2 суток - в 2,5 раза, через 3 суток - в 2,3 раза и через 1
месяц на 40% соответственно.
До родов у животных с разным характером течения субинволюции
матки уровень NOх существенно не различается. Через сутки после родов у
животных с острой субинволюцией уровень стабильных метаболитов оксида
азота превышает уровень у коров с хронической субинволюцией на 24,0%.
Далее у коров всех групп характер динамики уровня NOx в сыворотке крови
является аналогичным.
На 30-е сутки после отела содержание NOх у коров с острой формой
субинволюции (к этому времени состояние матки у них нормализуется) становится таким же, как и у здоровых животных, а у коров с хронической
субинволюцией матки уровень NOх в крови почти в 1,5 раза превышает их
уровень у здоровых коров и на 16,8% - уровень у коров, у которых регистрировалась острая субинволюция матки, что может быть одной из предрасполагающих причин развития хронического нарушения сократительной функции
матки у коров после отела.
3.5. Взаимосвязь сократительной функции матки и уровня
стабильных метаболитов оксида азота в крови у коров
При детальном изучении
динамики содержания в сыворотке крови стабильных метаболитов оксида азота и сократительной функции матки у коров
во время и в течение суток после родов в норме установлена
достаточно четкая взаимосвязь
между интегральным показателем сократительной функции
матки (контракционным индекРис.5. Взаимосвязь сократительной функции сом – КИ) и интенсивностью
матки) с уровнем стабильных метаболитов генерации оксида азота (рис. 5).
оксида азота в сыворотке крови здоровых коУ коров с нормальным течеров и коров с субинволюцией матки
нием послеродового периода закономерное снижение КИ происходит на фоне снижения уровня стабильных
метаболитов оксида азота, который отражает его синтез в организме коров
(r=+0,92, Р<0,001), а у коров с послеродовой субинволюцией матки такая закономерность отсутствует (r= +0,12, Р>0,1).
14
3.6. Сократительная функция миометрия при модуляции синтеза оксида
азота
Цель этой серии опытов состояла в изучении in vitro влияния состояния
системы L-аргинин-NO на сократительную активность миометрия в середине
беременности и в период родов.
Установлено, что спонтанная сократительная активность гладкой мускулатуры матки при добавлении в инкубационную среду (в концентрациях
10-6-10-4 М) L-аргинина уменьшалась, а при добавлении L-NAME увеличивалась (рис. 6). При этом для миометрия, взятого на 20-й день беременности
(рис.6.1) статистически достоверное снижение L-аргинином и повышение LNAME амплитуды и частоты спонтанных сокращений происходило при концентрации 10-5 М (P<0,05), а для миометрия, взятого в период родоразрешения чтобы достигнуть подобных статистически достоверных (P<0,05) изменений требовались более высокие концентрации (10-4 M) L-аргинина и LNAME (рис. 6.2).
1
2
Рис. 6. Влияние L-аргинина (A) и L-NAME (Б) на спонтанную сократительную активность миометрия крысы на 20-й день беременности (1) и в период
родов (2)
Таким образом, из результатов проведенного исследования следует, что
система генерации оксида азота L-аргинина-NO присутствует в матке и реактивность миометрия является более высокой в середине беременности и
уменьшается в период родоразрешении. Это заключение базируются на том,
что тормозящее действие L-аргинина (субстрата NO-синтаз), значительно
изменяется в зависимости от концентрации (от 10-5 М до 10-4 М) на миометрий в период родоразрешения, по сравнению с миометрием, изолированном в
середине беременности.
Карбохолин в концентрации 10-6 М вызывал контракцию миометрия
изолированного как на 20-й день беременности, так и в период родоразрешения. Амплитуда сокращений миометрия, изолированного на 20-й день беременности, вызванных карбохолином статистически достоверно уменьшалась
в ответ на добавление L-аргинина и увеличивалась в ответ на добавление в
среду L-NAME уже в концентрации 10-5 М и еще значительнее – в концен15
трации 10-4 М (рис. 7.1), а миометрия, изолированного в период родоразрешения только в концентрации 10-4 М (рис. 7.2.). При этом как L-аргинин, так
и L-NAME существенно не изменяли частоту сокращений (P> 0,05).
1
2
Рис. 7. Влияние L-аргинина (A) и L-NAME (Б) на сократительную активность
миометрия, изолированного в середине беременности (1) и в период родов
(2), на фоне действия карбохолина. Карбохолин добавляли в среду за 10 минут перед добавлением L-аргинина и L-NAME.
Таким образом, система L-аргинин-NO участвует и в спонтанной и в
стимулируемой сократительной активности миометрия. При этом активация
этой системы расслабляет гладкую мускулатуру миометрия, а ингибирование
– повышает сократитетельную активность миометрия. Причем реакция на Lаргинин и L-NAME увеличена в середине беременности и уменьшена в период родов. Это указывает на то, что система L-аргинин-NO играет роль в
поддержании низкой сократительной активности матки в течение беременности, а также в инициировании и обеспечении родов. Увеличение активности NO-синтазы и образования NO в системе L-аргинин-NO при беременности, вероятно, связано с действием половых гормонов, в частности, эстрогенов (Buhimschi I. et al. 1995).
3.7. Половые гормоны и оксид азота у коров в период беременности и
после отёла
Установлено, что концентрация прогестерона в крови коров, заболевших
субинволюцией матки, за 30 дней до отёла выше в 1,47 раза в сравнении с животными, у которых послеродовый период протекал без осложнений, а содержание эстрадиола-17 у них, наоборот, ниже в 1,84 раза. Соотношение прогестерон/эстрадиол у коров, заболевших после родов субинволюцией матки, выше чем у здоровых в 2,58 раза. При этом не установлено существенных различий между животными этих двух групп в интенсивности синтеза оксида азота,
которая находилась на относительно низком уровне.
За 1-3 суток до отела содержание прогестерона у коров, заболевших
субинволюцией матки, снижается на 12,4%, а у животных, оставшихся клинически здоровыми – на 35,5%. Концентрация эстрадиола-17 в это же время
16
у животных, у которых после родов зарегистрирована субинволюция матки,
была в 2,65 раза ниже, чем у коров, у которых послеродовый период протекал без осложнений и соответственно прогестерон-эстрадиоловое отношение
– выше в 3,27 раза.
Через 1-3 суток после отёла в крови коров, заболевших субинволюцией
матки, содержание прогестерона выше в 2,29 раза, чем у животных с физиологическим течением послеродового периода, концентрация эстрадиола-17 ниже в 1,97 раза, а прогестерон-эстрадиоловое отношение у этих животных
выше в 4,65 раза. В этот период установлены и существенные различия в образовании оксида азота в организме коров.
У животных с субинволюцией матки уровень его стабильных метаболитов был в 2,48 раза
выше, чем у оставшихся здоровыми коров (рис. 8). При этом
различия в интенсивности синтеза оксида азота до отела у здоровых и заболевших коров отсутствуют. И только через 1-3
суток после родов на фоне суРис.8. Сравнительная динамика прогестеронэстрадиолового отношения и уровня оксида щественно более высокого (в
азота у здоровых и заболевших субинволюцией 4,65 раза) соотношения прогематки коров
стерон/эстрадиол-17 у коров,
заболевших субинволюцией матки, интенсивность синтеза оксида азота существенно превышает его образование у здоровых животных.
Таким образом, у коров с субинволюцией матки за месяц до и 1-3 дня
до отёла имеется высокое содержание в крови прогестерона и низкоеэстрадиола-17. Прогестерон-эстрадиоловое отношение у них выше, чем у
оставшихся здоровыми животных соответственно в 2,58 и 3,27 раза, но существенные различия в интенсивности синтеза оксида азота в организме в
эти сроки отсутствуют. И только через 1-3 суток после родов на фоне более
высокого соотношения прогестерон/эстрадиол-17 (в 4,65 раза) у коров, заболевших субинволюцией матки, интенсивность синтеза оксида азота существенно превышает его образование в организме у здоровых животных.
ВЫВОДЫ
1. У клинически здоровых коров заключительный этап беременности и
ранний послеродовый период протекают на фоне интенсификации процессов
свободнорадикального окисления липидов. Это наиболее выражено за 2-3 дня
до и 2-3 дня после тела. В эти сроки концентрация малонового диальдегида в
крови коров соответственно выше по сравнению с исходными показателями за
25-30 дней до отела на 26% и 48%, диеновых конъюгатов - на 18% и 38%, оснований Шиффа на – 11% и 28%. К 20-му дню после отела уровень началь17
ных, промежуточных и конечных продуктов ПОЛ заметно снижается и статистически достоверно не отличается от их уровня за 25-30 дней до отела.
2. У коров с субинволюцией матки, развившейся после отела, уже за
1-1,5 месяца до отела уровень конъюгированных диенов повышен на 25,9 %,
малонового диальдегида – на 40,0 %, а содержание в сыворотке крови флуоресцирующих оснований Шиффа – на 38,5 %, по сравнению с животными
оставшимися здоровыми. На 2-3 день после отела у заболевших после родов
коров, уровень конъюгированных диенов возрастает на 70,5 %, малонового
диальдегида – в 2,6 раза, а оснований Шиффа – в 3,3 раза по сравнению с исходными данными.
3. У клинически здоровых коров интенсификация процессов пероксидного окисления липидов в указанные сроки сопровождается повышением
функциональной активности ферментативного звена системы антиоксидантной защиты, направленного на ограничение чрезмерной интенсификации
ПОЛ и поддержание их на более низком стационарном уровне, обеспечивающим оптимальное течение метаболических процессов в организме.
4. В сухостойный период у коров с последующим развитием субинволюции матки, по сравнению с коровами с нормальным течением послеродового периода, мощность ферментативного звена системы антиоксидантной
защиты снижена. Активность глутатионредуктазы в крови у заболевших после отела коров ниже на 40%, СОД - на 20,8 % , ГПО - на 33,3 % и каталазы на 6,5%. На 2-й день после отела активность СОД у таких коров ниже, чем у
оставшихся здоровыми более чем в 2 раза, каталазы – на 27,6 %, глутатионпероксидазы – на 38,2% и глутатионредуктазы – на 39,8 %.
5. У коров с субинволюцией матки в ранний послеродовой периоды
более существенно выражен дисбаланс в системе ПОЛ-АОЗ. Если у коров с
нормальным течением послеродового периода коэффициент сбалансированности в системе ПОЛ-АОЗ (К2), как отношение АОА плазмы крови (-tg2) к
светосумме хемилюминисценции (S), отражающий вклад внеклеточных антиоксидантов в становление антирадикального гомеостаза организма, на 1-3
сутки после отела снижается в 3,78 раза по сравнению с периодом за 30 дней
до отела, то у коров с послеродовой субинволюцией матки - в 4,5 раза. У таких животных и за месяц до родов коэффициент сбалансированности К2 также на 22,2% ниже по сравнению с коровами с нормальным течением послеродового периода.
6. Изменению синтеза оксида азота принадлежит важная роль в регуляции сократительной активности миометрия. Система генерации оксида
азота L-аргинин-NO участвует в обеспечении низкой сократительной активности матки в течение беременности, а также в инициировании и обеспечении родового акта. Активация этой системы расслабляет гладкую мускулатуру миометрия, а ингибирование – повышает сократительную активность
миометрия.
7. В крови коров с нормальным течением послеродового периода по
мере приближения к родам суммарный уровень стабильных метаболитов оксида азота (NOx) существенно возрастает и за 1-3 суток до родов превышает
18
уровень NOx за 1,5-1 месяцев до родов почти в 4 раза. В первые сутки после
родов их уровень снижается в 1,6 раза и к 3-5 суткам после родов статистически достоверно не отличается от величин, установленных за 1-1,5 месяца до
отела. Это способствует сокращению матки и развитию инволюционных
процессов после родов.
8. До отела интенсивность образования оксида азота у коров с субинволюцией матки в послеродовый период существенно не различается от животных с нормальным течением послеродового периода, однако у таких животных в течение первых 5 суток после родов уровень стабильных метаболитов оксида азота в крови примерно в 1,5 раза выше, чем у коров с нормальным течением послеродового периода.
9. Сумма стабильных метаболитов оксида азота в крови коров с острой
формой течения субинволюции матки на следующий день после родов превышает таковой у коров с нормальным течением инволюционных процессов
в 1,48 раза, через 2 суток - в 2,5 раза, через 3 суток - в 2,3 раза и через 1 месяц
– в 1,4 раза.
10. У коров с нормальным течением послеродового периода снижение
контрактационного индекса, как интегрального показателя сократительной
функции матки происходит на фоне снижения образования оксида азота
(r=+0,92, P<0,001), а у коров с послеродовой субинволюцией матки такая закономерность отсутствует (r=+0,12, P>0,1).
11. У коров с патологическим течением послеродового периода через 13 дня после отела, повышенный в 2,3 раза уровень прогестерона и сниженное
в 4,65 соотношение прогестерон/эстрадиол-17, по сравнению со здоровыми
животными, коррелирует с более высоким в 2,5 раза содержанием в крови
коров суммы стабильных метаболитов оксида азота.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. В качестве биохимических критериев повышенного риска развития у
коров послеродовой субинволюции матки предлагается использовать следующие показатели: содержание в крови коров за месяц до отела малонового
диальдегида выше 0,80 мкМ/л, оснований Шиффа - более 0,20 отн. ед./мл
сыворотки, активность в крови глутатионпероксидазы - ниже 14,0 мМ восстановленного глутатиона/л× мин, глутатионредуктазы - ниже 145,0 мкМ
окисленного глутатиона/л×мин, содержание стабильных метаболитов в сыворотке крови коров выше 140,0 мкМ/л через 2-е суток после отела.
2. При диагностике, терапии и профилактике субинволюции матки у
коров руководствоваться Методическими рекомендациями по диагностике,
терапии и профилактике субинволюции матки.- Воронеж, 2005.
19
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
*1. Близнецова Г.Н. Спектрофотометрический метод определения метаболитов оксида азота / Г.Н. Близнецова, Н.В. Ермакова, З.Д. Мухаммед, М.И.
Рецкий// Вестник ВГУ. Проблемы химии и биологии.- 2002.- №1.- С.56-60.
2. Самохин В.Т. Применение витаминно-минерального премикса для
профилактики субинволюции матки у коров / В.Т. Самохин, В.И. Шушлебин,
В.Н. Коцарев, В.И. Михалев, А.А. Сотников, Н.В. Ермакова, М.Н.Кочура//
Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Материалы международной научно-практической конференции.- 2002.- С.534-535.
*3. Рецкий М.И. Динамика стабильных метаболитов оксида азота у коров с субинволюцией матки / М.И. Рецкий, Н.В. Ермакова, Г.Н. Близнецова
и др. // Ветеринарная патология.-2003.-№ 2.-С.89-90.
*4. Рецкий М.И. Возрастная динамика образования оксида азота в организме крупного рогатого скота / М.И. Рецкий, А.Г. Шахов, Г.Н. Близнецова, С.С. Артемьева, Н.Н. Каверин, Н.В. Ермакова, Н.А. Косматых// Доклады
Российской академии сельскохозяйственных наук.- 2004.- №4.- С.58-60.
5. Пасько Н.В. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов у коров с субинволюцией матки / Н.В. Пасько // Свободные радикалы,
антиоксиданты и здоровье животных. Материалы международной научнопрактической конференции.- Воронеж: Воронежский государственный университет.- 2004.- С. 127-130.
6. Мисайлов В.Д. Субинволюция матки у коров / В.Д. Мисайлов, В.И.
Михалев, Ю.Н. Бригадиров, Н.В. Пасько, Ю.В. Сергеев, М.Н. Кочура, В.И.
Шушлебин // Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных.
Материалы международной научно-практической конференции.- Воронеж:
Воронежский государственный университет.- 2004.- С. 391-396.
7. Михалев В.И. Профилактика послеродовой субинволюции матки у
коров / В. И. Михалев, В.Д. Мисайлов, Н.В. Притыкин, В.И. Шушлебин, Н.В.
Пасько// Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных. Материалы международной научно-практической конференции.- Воронеж: Воронежский государственный университет.- 2004.- С. 396-399.
8. Михалев В.И. Методы лечения острой субинволюции матки у коров /
В. И. Михалев, В.Д. Мисайлов, С.М. Сулейманов, Н.В.Пасько // Свободные
радикалы, антиоксиданты и здоровье животных. Материалы международной
научно-практической конференции.- Воронеж: Воронежский государственный университет.- 2004.- С. 399-403.
9. Заливанский Э.Б. Роль оксида азота в патогенезе гестоза / Э.Б. Заливанский, М.И. Рецкий, Г.Н. Близнецова, С.С. Артемьева, Н.В. Пасько// Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у
животных. Материалы международной научно-практической конференции.
Воронеж, 5-7 октября 2005 г.- Воронеж: Европолиграфия.- 2005.- С.292-299.
10. Рецкий М.И. Роль оксида азота в патогенезе субинволюции матки у
коров / М.И. Рецкий, В.И. Михалев, Г.Н. Близнецова, Н.В. Пасько// Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у жи20
вотных. Материалы международной научно-практической конференции. Воронеж, 5-7 октября 2005г.- Воронеж: Европолиграфия.- 2005.- С.382-385.
11. Рецкий М.И. Роль метаболических нарушений в развитии послеродовой субинволюции матки у коров / М.И. Рецкий, В.Д. Мисайлов, А.И. Золотарев, Г.Н. Близнецова, Н.В. Пасько, В.И. Михалев // Научные основы
профилактики и лечения болезней животных: Сборник научных трудов ведущих ученых России, СНГ и др. стран.- Уральское издательство, Екатеринбург.- 2005.- С.547-551.
12. Мисайлов В.Д. Методические рекомендации по диагностики, терапии и профилактике субинволюции матки у коров /В.Д. Мисайлов, А.Г.
Нежданов, А.Г. Михалев, Н.В. Пасько и др.- Воронеж, 2005.- 20 с.
*13. Шахов А.Г. Значение оксида азота и половых стероидов в развитии субинволюции матки коров / А.Г. Шахов. В.И. Михалев, М.И. Рецкий,
В.Д. Мисайлов, Г.Н. Близнецова, Н.В. Пасько// Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук.- 2006.- №6.- С.49-51.
14. Близнецова Г.Н. Роль оксида азота в регуляции сократительной активности миометрия в период беременности и родов / Г.Н. Близнецова, Н.В.
Пасько, М.И. Рецкий // Материалы 1-го съезда фармакологов России.Воронеж, 2007.-С.126-131.
15. Пасько Н.В. Хемилюминесцентный анализ плазмы крови коров при
субинволюции матки / Н.В. Пасько // Актуальные проблемы ветеринарной
медицины. Материалы международной начно-практической конференции.Курск, 2008.-С.283-287.
16. Патент 2296507 Российской Федерации, С1 Способ прогнозирования патологии послеродового периода у коров/А.И. Золотарев, М.И. Рецкий,
В.Д. Мисайлов, В.И. Михалев, Н.В. Притыкин, Г.Г. Чусова, Н.В. Пасько, Н.А.
Ильина.- № 2005133941; Заявлено 02.11.2005; Опубл. 10.04.2007., Бюлл. №10.
*- издания из Перечня ведущих рецензируемых научных журналов и
изданий ВАК РФ.
21