lekciya_10_novye_diagnosticheskie_i_lechebnye_tehnologii

Лекция № 9
НОВЫЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ И ЛЕЧЕБНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ,
ОСНОВАННЫЕ НА ДОСТИЖЕНИЯХ КВАНТОВОЙ БИОФИЗИКИ
(БИОЭЛЕКТРОНИКИ)
Прижизненная флуориметрия компонентов дыхательной цепи. Для оценки
клеточного дыхания существует несколько методов. Среди них преобладают
биохимические. Остановимся на биофизической методике прижизненной
флуориметрии НАДН и окисленных флавопротеидов (ФП), которая была предложена
Бриттеном Чансом в начале 60-х гг. XX в., и вскоре ее наладила в Ленинградском
государственном университете М.П. Бургова. В начале 1970-х гг. ее стали применять
ее в Военно-медицинской академии, благодаря помощи И.Я. Барского.
Методика основана на способности НАДН и ФП люминесцировать при
воздействии на них света. Важно, что для их флуоресценции не нужны люминофоры.
Поэтому такое свечение было названо собственной флуоресценцией. Максимальная
флуоресценция НАДН приходится на λ = 460 нм (синий свет) и, согласно правилу
Стокса, для ее возбуждения ткань нужно облучать светом с более короткой длиной
волны. Для этого используется ближний ультрафиолет (  = 365 нм). Максимальная
флуоресценция ФП обнаружена на  = 520−530 нм (желто-зеленая область спектра),
причем это свечение возникает также под влиянием ультрафиолета (  = 365 нм), хотя
более эффективно оно возбуждается синим светом.
Из сказанного следует, что освещенная ультрафиолетом (  = 365 нм) живая
ткань дает свечение в видимой области. В нем преобладает синий свет с примесью
желто-зеленого. Для выделения полос флуоресценции НАДН и ФП из смешанного
света применяется техника спектрального анализа. Основу монохроматора
составляют либо интерференционные светофильтры (в насадке ФМЭЛ-1), либо
дифракционная решетка (в насадке СФН-10).
На рис. 37 представлена схема двухволнового спектрофлуориметра-микроскопа.
Свет от ртутной лампы, из которого светофильтром выделена полоса в области  =
365 нм, поступает через опак-иллюминатор на микроскопируемый объект и
возбуждает в нем люминесценцию НАДН и ФП. Их свечение улавливается
объективом и направляется в монохроматор (в данном случае СФН-10), который
разлагает смешанный свет в спектр. Излучение на каждой из длин волн,
присутствующих в спектре, направляется в фотоэлектронный умножитель,
преобразуется им в электрический сигнал, усиливается и обрабатывается
компьютером, на экране которого наблюдается весь спектр флуоресценции
исследуемой клетки. В нем измеряется интенсивность флуоресценции на  = 460
нм и на  = 520 нм. Первая отображает содержание в клетке НАДН, а вторая − ФП. В
этой донорно-акцепторной паре донор π-электронов флуоресцирует в
восстановленной форме (НАДН), а акцептор − в окисленной (ФП). Естественно, что в
покое преобладают восстановленные формы (верхняя кривая), а при усилении
окислительных процессов — окисленные (нижняя кривая).
Изменения метаболической активности хорошо отображает так называемый
параметр  , равный отношению интенсивности свечения ФП к НАДН, т. е.
соотношению содержания окисленных и восстановленных компонентов дыхательной
цепи в каждый момент времени. Этот параметр, величина которого прямо
1
пропорциональна скорости переноса электронов с НАДН на ФП, был предложен В.Н.
Карнауховым и широко используется в подобных исследованиях.
Для точного определения параметра  , необходимо одномоментно (с точностью
порядка 1 мс) измерять интенсивности свечения и НАДН, и ФП. Одноволновая
установка мало пригодна для этого. Поэтому был разработан двухволновой
спектрофлуориметр (рис. 37). Он одномоментно выделяет из смешанного излучения
клетки флуоресценцию только на двух длинах волн (460 и 520 нм) и разводит два луча
к разным фотоэлектронным умножителям. На экране компьютера регистрируются
три кривые, отображающие динамику свечения НАДН, ФП, а также изменения
 (третья кривая, изображеная на рисунке). Заметим, что  =I520/I460, где I520 −
интенсивность свечения ФП на  = 520 нм, I460 − интенсивность свечения НАДН на  =
460 нм.
В одно- и двухволновом флуориметрах использован опак-иллюминатор,
изобретенный Е.М. Брумбергом как своеобразная альтернатива оптическим системам
с темнопольными объективами, что позволяет измерять очень слабую
флуоресценцию живых тканей.
Рис. 37. Схема двухволнового микроспектрофлуориметра и осциллограмма
параметра 
Флуориметрический анализ клеточного дыхания проведен в нейронах, волокнах
поперечнополосатых и гладких мышц, кардиомиоцитах, эпителии кожи, слизистых
оболочек органов желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей, в лейкоцитах,
маргинальных клетках сосудистой полоски внутреннего уха, каротидных, вкусовых,
обонятельных, медуллярных рецепторах. Оказалось, что самым интенсивным
клеточным дыханием у млекопитающих обладают маргинальные клетки сосудистой
полоски внутреннего уха.
Благодаря тому, что биоэнергетические процессы, по словам И.П. Павлова,
составляют «дно жизни», их количественные флуориметрические показатели весьма
информативны для интегральней оценки функционального состояния организма. Не
случайно Н.Н. Савицкий выводил должные величины минутных объемов дыхания и
кровообращения из параметров биоэнергетики. Уровень метаболизма служит, на
языке кибернетики, уставкой всем вегетативным процессам.
2
Параметр  , стал высоко чувствительным индикатором реакций организма на
различные воздействия внешней среды: неионизирующие излучения (во всем
диапазоне электромагнитного спектра) и токсические факторы (включая
ксенобиотики). Наибольшей чувствительностью обладает методика исследования
реакций клеточного дыхания на стандартный раздражитель, предъявляемый на фоне
действия изучаемого фактора внешней среды.
Прижизненная флуориметрия компонентов дыхательной цепи митохондрий
сделала клеточное дыхание объектом исследований физиологов и клиницистов.
Физиолог и специалист функциональной диагностики приобрели возможность
изучать все этапы дыхания, а не два из трех.
Важной особенностью работ по флуориметрии живых тканей является
возможность проводить ее in situ − в условиях нормальной иннервации и хорошего
кровоснабжения при минимальном травмировании изучаемых тканей. Эндоскопыфлуориметры послужили базой новых медицинских технологий, обеспечивающих
раннюю диагностику рака желудка и кишечника.
В злокачественной опухоли, как установил О. Варбург, анаэробный гликолиз
конкурирует с клеточным дыханием. Клеточное дыхание в раковой клетке угнетено,
причем ослабляется флуоресценция и НАДН, и ФП, но ФП − в большей степени.
При эндоскопическом исследовании флуоресценции это видно даже на глаз.
В содружестве с И.Я. Барским в конце 70-х гг. XX в. были созданы гастроскопфлуориметр и колоноскоп-флуориметр, которые позволяют измерять интенсивность
свечения НАДН и ФП при обычных эндоскопических процедурах в амбулатории и
стационаре. Метод оказался весьма чувствительным и обеспечил раннюю диагностику
злокачественных заболеваний желудочно-кишечного тракта.
Кроме эндоскопов, разработаны интраоперационные люминесцентные щупы,
позволяющие измерить интенсивность флуоресценции НАДН и ФП в тех органах и
тканях, которые доступны врачу при хирургических операциях например,
лимфатические узлы для выявления метастазов рака) и без них (например, кожа).
Щупы принесли большую пользу врачам при первичной хирургической обработке
огнестрельных ран и минно-взрывных травм, когда для экономной резекции тканей
необходима оценка их жизнеспособности.
Биофизические исследования и новые медицинские технологии, в которых
применяется флуориметрическое изучение транспорта электронов в молекуляных
ансамблях живых клеток, хорошо обеспечены метрологически. Прижизненная
флуориметрия дает, кроме статических показателей, динамические характеристики
биологических систем, так как позволяет проводить функциональные пробы и
исследовать зависимости типа «доза − эффект».
Достижения квантовой биофизики уже сейчас служат базой не только
диагностических, но и лечебных технологий. Их реализация опирается на тот факт,
что акцепторы электронов служат эффективными регуляторами клеточной
активности, поскольку малейшие изменения содержания акцепторов электронов в
клетке приводят к значительным сдвигам ее метаболизма. В частности, по
утверждению А. Сент-Дьёрдьи, «для остановки онкороста нужно непрерывно
поддерживать в клетке определенный уровень акцепторов электронов». Но, с одной
стороны, жизнь не совместима с сильными акцепторами электронов, а с другой
стороны, перенос электронов со слабых доноров на слабые акцепторы возможен
только на свету, так как связан с поглощением фотона, а этой способностью не
обладают неокрашенные вещества. Поскольку большинство веществ в организме не
3
обладает цветом и почти все биохимические реакции темновые, живые ткани
вынуждены продуцировать не слабые и не сильные, а умеренные акцепторы
электронов, при чем делать это непрерывно, регулируя темп их наработки по мере
надобности. Главным акцептором электронов является карбонил, причем его
активность может повышаться при увеличении фонда π-электронов. В дыхательной
цепи митохондрий конечный акцептор π-электронов − молекулярный кислород,
поступающий в клетки из атмосферы благодаря внешнему дыханию и
кровообращению.
Однако для лечения многих заболеваний приходится использовать и другие
экзогенные акцепторы электронов. К ним, очевидно, относится препарат глутоксим,
разработанный Л.А. Кожемякиным. Это лекарство, проникая в клетку, сохраняется в
окисленном состоянии несколько десятков минут и принимает на себя избыток
электронов. Глутоксим хорошо зарекомендовал себя в комплексной терапии многих
болезней, включая и рак.
Мощным акцептором электронов являются фуллерены − шарообразные
молекулы, состоящие из большого количества атомов углерода. Их терапевтический эффект
только начинает изучаться.
Все большее распространение находит фотодинамческая терапия рака. Она
основана на том, что в раковой клетке повышена концентрация порфиринов, не
сдерживающих железо, а при внутривенном введении этих веществ или их
предшественников раковые клетки насыщаются ими. Порфирины избирательно
поглощают излучение на  = 620 нм. Такое излучение дает лазер на парах золота. При
подведении к опухоли низкоэнергетичных световых импульсов на этой длине волны
(  = 620 нм) раковые клетки погибают, а нормальные − преимущественно
сохраняются. Избирательное воздействие лазера обеспечивает лечебный эффект.
ЛАЗЕРНОЕ ИЗЛУЧЕНИЕ
Термин «лазер» происходит от английского LASER – Light Amplification by
Stimulated Emission of Radiation (усиление света при вынужденном излучении).
В основе работы лазера лежат: вынужденное (индуцированное) излучение;
инверсионная населенность энергетических уровней; наличие метастабильных
энергетических уровней.
Индуцированное излучение − это излучение электромагнитных волн, которое
возникает, если атом переходит из возбужденного состояния в основное под
действием внешнего излучения (фотона). Такое взаимодействие фотона с
возбужденным атомом может быть, если энергия hv фотона равна разности
уровней энергий атома в возбужденном и основном состояниях (рис. 38).
Е2
Е1
Рис. 38. Вынужденное
излучение:
квант
электромагнитного излучения
hv = Е2 – Е1 инициирует переход атома с уровня Е2 на уровень Е1 с
испусканием еще одного такого же кванта.
4
В этом случае после взаимодействия фотона с атомом от атома будут
распространяться уже два фотона: вынуждающий и вынужденный, т. е.
наблюдается усиление света. Образовавшееся при этом вынужденное излучение
имеет ту же частоту и фазу, что и стимулирующее этот процесс, и
распространяется в том же направлении, т. е. индуцированное излучение
когерентно вынуждающему излучению.
При взаимодействии фотонов с веществом наряду с вынужденным
излучением идет процесс поглощения фотонов, при котором атомы вещества
переходят из основного состояния в возбужденное. В обычном состоянии
невозбужденных атомов в веществе значительно больше, чем возбужденных,
поэтому при взаимодействии фотонов с веществом преобладает процесс
поглощения и нет усиления света.
Интенсивность света I, прошедшего через слой вещества, зависит от толщины
слоя l по закону Бугера:
(35)
где I0 − интенсивность
падающего света; kн − натуральный
показатель поглощения.
При взаимодействии света с веществом в обычном состоянии: I < I0 и kн > 0. Для
того чтобы процесс вынужденного излучения преобладал над поглощением,
необходимо изменить распределение атомов облучаемого вещества по
энергетическим уровням. Усиление света имеет место в том случае, если
концентрация атомов вещества на верхних энергетических уровнях,
соответствующих возбужденному состоянию, больше, чем на нижних. Такое
состояние называется инверсной населенностью.
Интенсивность света, прошедшего через среду с инверсной населенностью
атомов, увеличивается (I > I0), что соответствует, по закону Бугера,
отрицательному значению натурального показателя поглощения kн < 0.
В состоянии термодинамического равновесия распределение атомов по
энергетическим уровням определяется законом Больцмана:
(37)
где Ni − число атомов,
находящихся при температуре Т
в состоянии с энергией Еi; k − постоянная Больцмана; с − коэффициент
пропорциональности.
Состояние вещества с инверсной населенностью − это состояние с
отрицательной термодинамической температурой.
Понятие отрицательной термодинамической температуры характеризует
термодинамическую неравновесность такого состояния вещества, при котором
большая часть атомов находится в возбужденном состоянии.
В.А. Фабрикант впервые рассмотрел возможности получения сред с
отрицательной температурой и, изучая распространение света в таких средах,
сформулировал принцип молекулярного усиления. Из этого принципа следует, что
интенсивность света возрастает по мере его распространения в среде с
отрицательной температурой.
5
Принцип молекулярного усиления был положен Н.Г. Басовым и А.М.
Прохоровым и американским физиком Ч. Таунсом в основу устройства первых
квантовых генераторов электромагнитных волн.
Генераторы, дающие излучение в оптическом диапазоне длин волн,
называются лазерами.
Устройство и принцип действия газового гелий-неонового лазера.
Основным его элементом является разрядная трубка, заполненная смесью газов −
гелия и неона. Парциальное давление гелия 1 мм рт. ст., неона − 0,1 мм рт. ст.
Атомы неона являются излучающими (рабочими), атомы гелия −
вспомогательными, необходимыми для создания инверсной населенности атомов
неона.
На рис. 39. изображены энергетические уровни атомов неона и гелия. При
электрическом разряде в трубке возбуждаются атомы гелия и переходят в
состояние 2. Первый возбужденный уровень 2 гелия совпадает с энергетическим
уровнем 3 атомов неона. Поэтому, соударяясь с атомами неона, атомы гелия
передают им свою энергию и переводят их в возбужденное состояние 3. Таким
образом, в трубке создается активная среда, состоящая из атомов неона с
инверсной населенностью.
Спонтанный переход отдельных атомов неона с энергетического уровня 3 на
уровень 2 вызывает появление фотонов.
Рис. 39. Энергетические уровни атомов неона и гелия.
При дальнейшем взаимодействии этих фотонов с возбужденными атомами
неона возникает индуцированное когерентное излучение последних и в трубке
возникает увеличивающийся поток фотонов с энергией hv.
Для увеличения мощности излучения трубку помещают в зеркальный
резонатор. Отражаясь от зеркал, поток фотонов многократно проходит вдоль оси
трубки, при этом в процесс индуцированного излучения включается все большее
число атомов неона и интенсивность генерируемого излучения возрастает.
Лазер работает в режиме генерации, если потери энергии световой волны при
каждом отражении от зеркал резонатора меньше, чем прирост энергии в результате
индуцированного излучения при прохождении ее вдоль трубки через активную
среду.
Резонатор состоит из плоского 5 (рис. 40) и вогнутого 6 зеркал с
многослойными диэлектрическими покрытиями. Коэффициент отражения этих
зеркал очень высок − 98-99%. Коэффициент пропускания света одним зеркалом
составляет около 0,1%, а другим − около 2%. Применение зеркального резонатора
позволяет получить мощный и узкий пучок света.
6
Рис. 40. Схема лазерного резонатора.
Энергетические уровни 2 и 3 атома неона обладают сложной структурой,
поэтому лазер может излучать до 30 различных длин волн в инфракрасном и
видимом диапазонах. Зеркала резонатора делают многослойными для того, чтобы
создать вследствие интерференции необходимый коэффициент отражения для
одной длины волны. Таким образом, лазер излучает строго определенную длину
волны. Резонансная трубка 1 с торцов закрыта плоскопараллельными стеклянными
пластинками 4, установленными под углом Брюстера к оси трубки. Такое
положение пластинок обеспечивает прохождение через них поляризованного
излучения неона без потерь на отражение и приводит к плоской поляризации
излучения лазера.
Для создания в трубке электрического разряда в нее введены два электрода:
анод 2 и катод 3. Индуцированное излучение газового лазера является
высококогерентным, исключительно монохроматическим, плоскополяризованным,
остронаправленным. На этих свойствах основано применение лазеров.
В настоящее время лазеры широко используются в различных областях
медицины. Впервые с лечебной целью лазер был применен в офтальмологии.
Эксперименты на животных показали, что воздействие лучей лазера небольшой
энергии (сотые и десятые доли джоуля) вызывает слипчивое воспаление между
внутренними оболочками глаза с последующим образованием мощного
соединительного рубца. Офтальмологи используют лазер прежде всего для лечения
отслоения сетчатки. Луч лазера позволяет «приварить» отслоенную сетчатку к
лежащей под ней сосудистой оболочке. Лучи лазера с успехом применяют и для
лечения некоторых начальных форм внутриглазных опухолей без удаления
глазного яблока.
Исключительный интерес представляет возможность использования лазера в
хирургии. Луч лазера позволяет абсолютно стерильным «световым скальпелем»
рассекать ткани и проводить операции почти без кровотечений. Объясняется это
тем, что при рассечении лучом лазера мелкие и средние сосуды спаиваются и лишь
крупные сосуды необходимо перевязывать. Использование лазера позволило
производить хирургические операции на паренхиматозных органах.
Разрушительное действие лазерного луча используется для лечения
пигментных пятен, бородавок и опухолей. Применение гибких световодов
позволило использовать лазерное излучение для получения голограмм некоторых
внутренних органов, а также для внутренней коагуляции.
Кроме того, при облучении тканей лазерным светом происходит
избирательная активация молекул биологических тканей: возбужденные молекулы
активно участвуют в процессах клеточного метаболизма и поэтому лазерное
излучение часто используется для заживления трофических язв, лечения
заболеваний кожи и т. п.
7