О. Теселкин, И. В. Бабенкова, Г. И. Клебанов, А. В. Асейчев,... АНТИОКСИДАНТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА

УДК 615.322.015.42.076.9
Ю. О. Теселкин, И. В. Бабенкова, Г. И. Клебанов, А. В. Асейчев, Н. А. Тюкавкина,
Ю. А. Колесник, И. А. Руленко, В. К. Колхир
АНТИОКСИДАНТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА
ПРИ ОБЩЕМ  - ОБЛУЧЕНИИ1
Кафедра биофизики (зав. — акад. РАМН проф. Ю. А.
Владимиров) Российского государственного медицинского
университета, ММА им. И. М. Сеченова, ВНИИ лекарственных
и ароматических растений
Исследовано влияние природного антиоксиданта дигидрокверцетина (ДГК) на процесс
свободнорадикально-го окисления липидов в плазме крови и печени мышей при общем внешнем
однократном -облучении в дозе 3,5 Гр. Обнаружено, что содержание продуктов липидной
пероксидации, реагирующих с 2-тиобарбитуро-вой кислотой, у облученных животных, получавших
ДГК перорально в течение /55 сут после радиационного воздействия (опыт), было достоверно
ниже по сравнению с аналогичным показателем у облученных животных, не получавших
антиоксиданта (контроль). Интенсивность Fe2+-индуцированной хемилюминесцен-ции гомогенатов
печени мышей опытной группы к концу эксперимента была на 25—30% меньше интенсивности
свечения гомогенатов печени как контрольных, так и интактных мышей (р < 0,001).
Предполагается, что это обусловлено преимущественным накоплением ДГК и продуктов его
метаболизма в печени.
Yu. О. Teselkin, I. V. Babenkova, G. I. Klebanov, A. V. Aseichev, N. A. Tyukavkina, Yu. A. Kolesnik, I. A.
Rulenko, V. K. Kolkhir. — THE ANTIOXIDATIVE EFFECT OF DIHYDROQUERCETIN DURING TOTAL yRADIATION
The effects of the natural antioxidant dihydroquercetin (DHQ) on free radical lipid peroxidalion
were investigated in the plasma and liver of the mice exposed to single total external radiation at 3.5 Gy.
The levels of lipid peroxidation products reacting with 2-thiobarbititric acid in the irradiated animals
receiving oral DHQ for /55 days after radiation exposure (an experiment group) were found to be
significantly lower than those in the irradiated animals untreated with the antioxidant (a control group).
The intensity of Fe2+-induced chemiltiminescence of the liver homage-nates of the experimental animals was
25-30% less than that of control and intact animals (P < 0.001). This can be possibly explained by the
predominant hepatic accumulation of DHQ and its metabolic products.
Одной из актуальных задач медико-биологических исследований является создание новых
лекарственных препаратов с выраженными антиоксидантными свойствами для лечения
заболеваний, сопровождающихся усилением реакций свободно-радикального окисления
(СРО) и развитием синдрома липидной пероксидации. В настоящее время в качестве
эффективных антиоксидантов хорошо себя зарекомендовали соединения флавоноидной
природы растительного происхождения [14]. К ним относится дигидрокверцетин (ДГК) [6],
богатым сырьем для промышленного получения которого служит древесина лиственницы.
Показано, что ДГК проявлял антиоксидантные свойства в различных модельных системах
окисления, в частности, тормозил фотоокисление люминола [9], окисление этилбензола,
инициированное азобисизобутиронитрилом [4], а также СРО липосом из яичных
фосфолипидов, индуцированное с помощью системы Fе2+-аскорбат [10] или
фотосенсибилизированное производными гематопорфирина при облучении гелий-неоновым
лазером [13]. При этом антиоксидантный эффект ДГК был сравним либо превышал
антиоксидантный эффект таких известных природных антиоксидантов, как -токоферол,
ликопин, -каротин, карнозин.
Малотоксичность, высокая стабильность при хранении и выраженная антиоксидантная
активность позволили использовать ДГК в качестве антиоксидантной пищевой добавки для
продления сроков хранения сахаристых кондитерских изделий на жировой основе [8] и сухого
1
Данная работа поддержана грантом РФФИ № 98-04-48657 (А. В. Асейчев, РГМУ).
молока [5]. Кроме того, на основе шоколада и сухого молока созданы пищевые продукты с
добавкой ДГК, выполняющие лечебно-профилактическую функцию по предупреждению и
коррекции состояний, связанных с недостаточным уровнем антиоксидантов в организме
[11]. Однако, несмотря на многочисленные исследования, в которых доказано антиоксидантное действие ДГК на реакции СРО, протекающие in vitro, влияние ДГК на интенсивность
свободно-радикальных процессов, протекающих in vivo, изучено недостаточно. Хорошей
экспериментальной моделью патологического состояния, сопровождающегося развитием
синдрома липидной пероксидации, является общее -облучение [7].
Цель настоящей работы — изучение влияния ДГК на СРО липидов, развивающееся при
воздействии ионизирующей радиации.
Материалы и методы
Опыты выполнены на 155 мышах-самках линии BALB, содержавшихся на стандартном
рационе вивария. Возраст животных в начале эксперимента 2—3 мес, масса 17,4 ± 0,8 г.
Животные были разделены на 3 группы: 1-я — интактные (п = 45), 2-я — контрольные
(облученные, п = 50), 3-я — подопытные (облученные и получавшие ДГК, п = 60).
Однократное внешнее общее -облучение мышей проводили на установке ГУТ-60 (60Со). Поглощенную дозу 3,5 Гр формировали при постоянной мощности дозы 0,6 Гр/мин. ДГК
подопытным животным вводили ежедневно перорально через зонд в виде воднокристаллической суспензии из расчета 100 мг/кг в течение первых 40 сут после облучения и 5
мг/кг в последующие сутки до конца эксперимента. Перед облучением и на 15, 40, 70 и 155е сутки после облучения по 6—30 животных из каждой группы декапитировали под легким
эфирным наркозом, предварительно извлекая кровь из сердца с помощью шприца с
гепарином (20 ЕД на 1 мл крови). Кровь центрифугировали при 900 § в течение 15 мин для
получения плазмы. Выделенную печень мышей промывали физиологическим раствором,
подсушивали с помощью фильтровальной бумаги и использовали для приготовления 5%
гомогената в фосфатном буфере (40 мМ КН2РО4, 100 мМ КС1, рН 7,45). Все операции
проводили при 4°С.
Рис. 1. Содержание ТБК-РП в
плазме крови (а) и печени (б) мышей:
светлые кружки — интактных, темные —
облученных, треугольники — облученных,
получавших ДГК. Здесь и на рис. 3 цифры у
кривых в скобках — количество животных в
группах к последним суткам эксперимента.
липидов.
По оси абсцисс — срок
наблюдения, сут; по оси ординат —
содержание ТБК-РП, нмоль на 1 мг
Об уровне процесса СРО липидов в плазме крови и печени судили по содержанию в
них продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП), которые измеряли
флюориметрически [2] с добавлением в инкубационную среду 0,1 мл
10-2 М этанольного раствора ионола. Накопление ТБК-РП в плазме крови и печени
выражали в на-номолях на 1 мг липидов. Содержание общих липидов определяли с
помощью набора Био-Lache-mа-Тест (Чехия). Принцип метода основан на том, что липиды
после их гидролиза концентрированной серной кислотой взаимодействуют с фосфованилиновым реактивом с образованием окрашенного продукта, который фотометрируют при
530 нм. Для измерения хемилюминесценции (ХЛ) печени в кювету хемилюминометра ХЛМ3 ("Бикап", Москва) вносили 3,5 мл фосфатного буфера, 1 мл гомогената печени и
регистрировали спонтанное свечение в течение 2 мин. Затем в кювету вводили 0,5 мл 25 мМ
раствора FеSО4 и измеряли кинетику Fе2+-индуцированной ХЛ в течение 15 мин. Интенсивность ХЛ определяли как разность между максимальным и спонтанным уровнем
свечения и выражали в относительных единицах на 1 мг липидов.
Результаты обработаны методом вариационной статистики с использованием критерия
Стюдента.
Результаты и их обсуждение
Общее радиационное воздействие на мышей в дозе 3,5 Гр вызывало активацию в их
организме процесса СРО липидов. Это проявлялось в повышении содержания ТБК-РП
липидной пероксидации в плазме крови и печени облученных животных по мере
увеличения сроков наблюдения (рис. 1,а,б ).
Рис. 2, Кинетика Fe2+-индуцированной ХЛ
гомогената печени (о); зависимость интенсивности
ХЛ (светлые кружки) и накопления ТБК-РП
(темные) в реакционной среде от объема добавляемого гомогената печени (о).
По оси абсцисс: а — время, мин, б —
объем гомогената, мл; по оси ординат: п —
интенсивность ХЛ, отн. сд., 6 — слева —
интенсивность ХЛ, отн. ед., справа — накопление ТБК-РП, мкМ.
Так, в частности, к 155-м суткам уровень ТБК-РП в плазме крови и печени животных 2-й
группы был соответственно в 2,1 и 1,5 раза выше, чем у животных 1-й группы.
Известно, что общее -облучение сопровождается не только активацией
свободнорадикальных реакций, но и усилением расходования эндогенных антиоксидантов, а
также снижением активности антиоксидантных ферментов [7]. В связи с этим следовало
ожидать, что введение животным экзогенного антиоксиданта ДГК приведет к торможению
СРО липидов в организме облученных мышей. Действительно, у мышей 3-й группы, получавших ДГК, содержание ТБК-РП в плазме крови в течение 70 сут с момента облучения
достоверно не отличалось от такового у интактных мышей и лишь затем наблюдалось его
увеличение (см. рис. 1, а). Однако и в этом случае уровень ТБК-РП в плазме крови был более
низким, чем у животных 2-й группы (р < 0,001). В отличие от плазмы крови содержание
ТБК-РП липидной пероксидации в печени мышей 3-й группы не отличалось от нормы в
течение всего эксперимента. Последнее, по-видимому, обусловлено тем, что печень является
органом, играющим важную роль в метаболизме флавоноидов, поступающих в организм с
пищей или в виде лекарственных форм. Не случайно некоторые флавоноиды используются в
качестве гепатопро-текториых средств при лечении ряда заболеваний и токсических
повреждений печени [3, 12]. Гепато-протекторный эффект был обнаружен и у ДГК на
моделях гепатита, индуцированного с помощью подкожного введения тетрациклина или
тетрахлорида углерода [б]. Предполагается, что этот эффект, а также
противовоспалительные, гастро- и ангиозащнтные свойства ДГК связаны с наличием у него
антиоксидантных свойств.
Аккумуляция ДГК в ткани печени может повлиять на ее ХЛ, инициированную ионами Fе2+.
При добавлении сульфата железа к гомогенату печени развивалось свечение, интенсивность
которого достигала максимальных значений через 15 мин после введения инициатора (рис.
2, а). С увеличением количества гомогената печени, вносимого в реакционную среду,
интенсивность ХЛ увеличивалась практически прямо пропорционально (рис. 2, б).
Поскольку накопление ТБК-РП липидной пероксидации в реакционной среде за время,
равное 15 мин, от количества добавленного гомогената менялось аналогичным образом (рис. 2,
б), то правомерно с помощью регистрации ХЛ оценивать способность липидов печени
подвергаться Fе2-инду-цированному СРО. Эта способность зависит от соотношения в
исследуемом объекте количества субстрата окисления, гидропероксидов и антиоксидантов
[1]. В связи с тем что количество субстрата окисления в гомогенатах печени разных животных
неодинаково, в настоящей работе интенсивность ХЛ гомогената нормировали на
содержание липидов в образце. Обнаружено (рис. 3), что интенсивность нормированной ХЛ
гомогенатов печени животных 2-й группы на 40-е и 70-е сутки наблюдения достоверно
превышала значения этого показателя у животных 1-й и 3-й групп (р < 0,05), что может
быть связано, в частности, с высоким уровнем липидных гидропероксидов в печени облученных мышей (см. рис. 1, б). В свою очередь интенсивность нормированной ХЛ гомогенатов
печени животных 3-й группы к концу эксперимента (155 сут) была соответственно в 1,3 и
1,5 раза ниже по сравнению с таковой у животных 1-й и 2-й групп (р < 0,001). Не исключено,
что меньшая окисляемость ткани печени животных 3-й группы
Рис. 3. Интенсивность ХЛ гомогенатов
печени мышей: светлые кружки — интактных,
темные — облученных, треугольники —
облученных, получавших ДГК.
По оси абсцисс — срок наблюдении,
сут; по оси ординат — интенсивность ХЛ, отн.
ед. на 1 мг липидов.
в присутствии ионов Fe2+ обусловлена накоплением в ней ДГК и продуктов его метаболизма,
замедляющих процесс окисления.
Выводы
1. Показано, что ДГК тормозит развитие СРО липидов в плазме крови и печени мышей,
подвергнутых общему  - облучению.
2. Полученные результаты открывают перспективы использования ДГК не только в
качестве пищевой добавки, но и как лекарственного средства для защиты организма
человека от реакций СРО, которые активируются при различных патологических состояниях
и неблагоприятных воздействиях факторов внешней среды.
ЛИТЕРАТУРА
1. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. — М.. 1972.
2. Гаврилов В. Б., Гаврилова А. Р., Мпжуль Д.М. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления
липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой // Вопр. мед. химии. — 1987. — № ;. — С.
118—122.
3. Дементьева Г. С., Фарбер Н. А., Брагинский Д. М. и др. Кверцетин в терапии вирусного гепатит В; // Сов. мед. —
1990. - № 3. - С. 102-104.
4. Захарова Н. А., Богданов Г. Н., Запрометов М. Н. и др. Антирадикальная эффективность некоторых природных
фенольных соединений //Журн. общ. химии — 1970. — Т. 42, № 6. - С. 1414-1420.
5. Клебанов Г. И., Теселкин Ю. О., Бабенков И. В. и др. Ин-гибирование дигидрокверцетином
свободнорадикального окисления липидов сухого молока // Биотехнол. и управление, - 1995. — № 1. - С. 36—
39.
6. Колхир В. К., Тюкавкина Н. А., Быков В. А. и др. Диквертин
— новое антиоксидантное и капилляропротекторное средство // Хим.-фарм. журн. — 1995. — № 9. — С.
61—64.
7. Палагина М. В., Хасина М. А., Гельцер Б. И., Девятое А. П. Антиокислительное действие препарата солодки
уральской при остром поражении сурфактанта легких тотальным у-облучением // Вопр. мед. химии. — 1995. —
№ 1. — С. 32— 34.
8. Руленко И. А., Колесник Ю. А., Тюкавкина Н. А. и др. Кондитерские изделия с добавками биологически активных
веществ. 2. Антиоксидантное действие дигидрокверцетина в составе сахаристых кондитерских изделий на
жировой основе // Биотехнол. и управление. — 1993. — № 3—4. — С. 27-30.
9. Теселкин Ю. О., Бабенкова И. В., Жамбалова Б. А. и др. Исследование механизма антиоксидантного действия
дигидрокверцетина // Международный симпозиум "Экология человека: проблемы и состояние лечебнопрофилактического питания", 3-й: Тезисы докладов. — 1994. — Ч. 2. — С. 305-306.
10. Теселкин Ю. О., Жамбалова Б. А., Бабенкова И. В. и др. Ан-тиоксидантные свойства дигидрокверцетина //
Биофизика.
- 1996. - Т. 41, № 3. - С. 620-623.
11. Тюкавкина Н. А., Руленко И. А., Колесник Ю. А. Природные флавоноиды как пищевые антиоксиданты и
биологически активные добавки // Вопр. питания. — 1996. — № 2. — С. 33-38.
12. Фролов В. М., Германов В. Т.. Пересадин Н. А. Эффективность применения иммунокорректоров и
антиоксидантов у беременных с хронической патологией гепатобилиарной системы // Акуш. и гин. — 1993.
— № 3. -- С. 51—53.
13. Klebanov С. /., Tese/kin Yu. О., Babenkova I. V. et al. Effect of lipophilic antioxidants on peroxidation of liposome
membranes photosensitized by hematoporphyrin derivatives upon Hc-Ne laser irradiation// Membr. Cell Biol. - 1996. Vol. 10, N 2. — P. 139-143.
14. Rice-Evans C. A., Miller N. J., Puganga G. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids
// Free Radic. Biol. Med. - 1996. - Vol. 20, N 7. - P. 933-956.