Скачать... - Курский государственный университет

Информация о проектах Федеральной целевой программы «Исследования и
разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического
комплекса России на 2014—2020 годы»
Тема проекта: «Разработка экспрессионной системы на основе генов антистрессовой
устойчивости дрожжей Yarrowia lipolytica»
Номер Соглашения о предоставлении субсидии: 14.574.21.0031
Приоритетное направление: Науки о жизни
Критическая технология: Геномные, протеомные и постгеномные технологии
Период выполнения: 17.06.2014 - 31.12.2015
Плановое финансирование проекта: 12.90 млн. руб.
Бюджетные средства 9.40 млн. руб.,
Внебюджетные средства 3.50 млн. руб.
Получатель: федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования "Курский государственный университет"
Индустриальный партнер: Общество с ограниченной ответственностью «ЭдиВак»
Ключевые слова: Yarrowia lipolytica, антистрессовый ответ, протеомика, интегративная
генетическая система, транскрипционные репортеры
Цель проекта, назначение его результатов:
Разработка экспрессионной системы с использованием генов антистрессовой
устойчивости дрожжей Yarrowia lipolytica, обеспечивающей возможность получения
эффективной кормовой добавки на основе дрожжей, ферментируемых на низкосортном
сырье (рыбной и мясокостной муки с превышением ПДК по микотоксинам).
Основные результаты, полученные на I этапе выполнения проекта:
1. Выполнен аналитический обзор научных и информационных источников,
затрагивающих научно-техническую задачу, исследуемую в рамках ПНИ
(уникальные особенности метаболизма Y. lipolytica, механизмы ее адаптации к
стрессам, биодеградация ксенобиотиков Y. lipolytica).
2. Проведены патентные исследования в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96.
3. Выполнено обоснование и выбраны методы и направления исследований по
разработке экспрессионной системы с использованием генов антистрессовой
устойчивости дрожжей Yarrowia lipolytica, способы решения задач.
4. Разработана методическая база исследования антистрессовой адаптации Y. lipolytica
в условиях промышленной ферментации на низкосортном сырье (рыбной и
мясокостной муки с превышением ПДК по микотоксинам).
5. Отработаны методика и исследования спектра белков Y. lipolytica в условиях
антистрессовой адаптации при промышленной ферментации на низкосортном сырье
методом двумерного электрофореза по О’Фареллу.
6. Идентифицированы ключевые белки, участвующие в антистрессовой адаптации Y.
lipolytica, методом спектроскопии MALDI-TOF.
Основные результаты, полученные на II этапе выполнения проекта:
1. Получены интегративные плазмидные конструкции, предназначенные для
экспрессии репортёрного гена LacZ из E. coli под контролем промоторов генов
антистрессовой адаптации Y. lipolytica: VDAC, CPY, NAA и KGDH в рекомбинантных
штаммах дрожжей Y. lipolytica.
2. Изучена генетическая стабильность и эффективность экспрессии репортёрного гена
LacZ при культивировании рекомбинантных штаммов на низкосортном
промышленном сырье: рыбной и мясокостной муке с превышением ПДК по
афлотоксинам.
1
3.
4.
5.
Показана способность рекомбинантных штаммов, несущих интегративные
плазмидные конструкции, предназначенные для экспрессии репортёрного гена LacZ
из E. coli под контролем промоторов генов антистрессовой адаптации Y. lipolytica:
VDAC, CPY, NAA и KGDH, осуществлять биоконверсию низкосортного
промышленного сырья - рыбной и мясокостной муки с превышением ПДК по
афлотоксинам - в биодобавку «Ярролипин».
Изучен биохимический состав биодобавки «Ярролипин» по содержанию жира,
общего белка, аминокислот и афлотоксинов.
Доказана пригодность биодобавки для проведения испытаний по экспериментальной
оценке ее кормовой ценности.
Основные результаты, полученные на III этапе выполнения проекта:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Сконструированы банки случайных пептидов в N-концевом положении
репортёрного белка, экспрессируемого в интегративной системе с помощью
промоторов генов антистрессовой адаптации с использованием сигнала
репортёрного гена в условиях культивирования Y. lipolytica.
Произведен скрининг банка случайных пептидов на увеличение репортёрного
сигнала за счёт стабилизации репортёрного белка в клетках Y. lipolytica N-концевым
пептидом.
Исследована генетическая стабильность интегративной системы в условиях
культивирования Y. lipolytica на различных видах низкосортного сырья.
Проведен исследовательские испытания кормовой эффективности и безопасности
(острая и субхроническая токсичность) экспериментальных образцов кормовой
добавки согласно разработанной программе и методикам испытаний.
Выполнено технико-экономическое обоснование (ТЭО) использования разработки с
учетом технологических возможностей индустриального партнера.
Разработаны рекомендации и предложения по использованию результатов поисковой
ПНИ в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и
разработках.
Разработан проект ТЗ на ОТР по теме: «Разработка опытно-промышленной
технологии получения кормовой добавки на основе рекомбинантных штаммов
Yarrowia lipolytica».
При выполнении ПНИ в практику биотехнологии впервые введены генетические
конструкции, включающие промоторы генов адаптации Y. lipolytica к росту на средах с
превышением ПДК по микотоксинам: VDAC, CPY, NAA и KGDH. Создан
модифицированный вариант гена LacZ, продукт которого обладает повышенной
протеолитической устойчивостью в клетках Y. lipolytica. Но основе модифицированного
гена создана высокоэффективная транскрипционная репортёрная система, позволившая
наиболее точно исследовать эффективность промоторов генов адаптации Y. lipolytica к
росту на средах с превышением ПДК по микотоксинам: VDAC, CPY, NAA и KGDH, в
условиях in vivo. Показана способность штаммов Y. lipolytica эффективно конвертировать
избыток компонентов гидрофобной природы, содержащихся в мясокостной и рыбной
муке, в сбалансированный по аминокислотному составу кормовой белок, одновременно
обеспечивая полную очистку сырья от содержащихся в нем афлотоксинов (на примере
зеараленона и афлотоксина B1).
Показано полное сохранение способности рекомбинантных штаммов Y. lipolytica,
несущих репортёрные конструкции на базе промоторов VDAC, CPY, NAA и KGDH,
эффективно
осуществлять
биоконверсию
и
детоксификацию
малоценного
промышленного сырья при высокой генетической стабильности конструкций и высоком
уровне репортёрного сигнала. Этот результат доказывает пригодность новой системы для
2
введения в состав биодобавки биоактивных белков и пептидов за счет использования
рекомбинантных штаммов Y. lipolytica.
Таким образом, все работы, проведенные на втором отчетном этапе, соответствуют
требованиям ПГ и ТЗ по Соглашению, получены все основные результаты,
предусмотренные Соглашением и приложениями к нему, а также представлены все
необходимые документы, позволяющие говорить об успешном завершении данного этапа
работы.
На основании проделанной работы были опубликованы следующие статьи:
1.
Секова В.Ю., Исакова Е.П., Дерябина Ю.И. Применение экстремофильных
дрожжей Yarrowia lipolytica в различных областях биотехнологии. //
Прикладная биохимия и микробиология. 2015. Том 51. № 3. С. 290-308.
2.
Секова В.Ю., Гесслер Н.Н., Исакова Е.П., Антипов А.Н., Дергачева Д.И.,
Ю.И. Дерябина, Е.В. Трубникова. Окислительно-восстановительный статус
экстремофильных дрожжей Yarrowia lipolytica при адаптации к рН-стрессу.
// Прикладная биохимия и микробиология. 2015, том 51, № 6, с. 570-577.
3.
Исакова Е.П., Куланбаева Ф.Ф., Трубникова Е.В., Зылькова М.В., Белякова
А.В., Дерябина Ю.И., Николаев А.В.. Исследование механизмов индукции
гена митохондриального потенциал-зависимого порина VDAC Y. lipolytica в
стрессовых условиях. // Доклады Академии наук. 2016. Том 465. № 1. (в
печати).
Результаты работ по ПНИ были доложены на международных научных
конференциях:
1.
Дергачева
Д.И.,
Секова
В.Ю.
Перекрестная
адаптация
полиэкстремаофильных дрожжей Yarrowia lipolytica к неблагоприятным
факторам среды. Материалы 12 Международной научной конференции
студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2015", секция
"Биология", Москва, 13-17 апреля 2015 г., с. 66-67;
2.
Секова В.Ю., Дергачева Д.И., Исакова Е.П., Дерябина Ю.И. Изучение
адаптации дрожжей Yarrowia lipolytica к тепловому и рН-стрессу. Сборник
статей Международной конференции "Рецепторы и внутриклеточная
сигнализация", Пущино, 25-28 мая 2015 г., с. 560-564.
3.
Секова В.Ю., Терешина В.М., Дергачева Д.И., Исакова Е.П., Дерябина Ю.И.
Жирнокислотный состав липидов клеток дрожжей Yarrowia lipolytica в
условиях экстремальных значений рН. Международный Микологический
форум (Национальная академия микологии), Москва, 14-15 апреля. Выпуск
1. С. 87.
Охраноспособные результаты интеллектуальной деятельности (РИД), полученные
в рамках прикладного научного исследования и экспериментальной разработки:
- заявка на патент на изобретение № 2015116622 от 30.04.2015. Эпова Е.Ю.,
Баловнева М.В., Дерябина Ю.И., Исакова Е.П., Секова В.Ю., Трубникова Е.В., Кудыкина
Ю.К., Зылькова М.В., Гусева М.А, Белоус А.С., Диссанаяке Дж. Модифицированный
вариант гена LacZ из E. coli, кодирующий стабилизированный вариант белка, для
использования в качестве транскрипционного репортера в Yarrowia lipolytica». Заявитель
ФГБОУ ВПО "КГУ".
3