РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ
advertisement
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ ИМ. С.Н. ВИНОГРАДСКОГО (ИНМИ РАН) УДК 581.1 № госрегистрации 114122540069 Инв. № УТВЕРЖДАЮ Директор ИНМИ РАН _____________ В.Ф. Гальченко «___» _______________ 2015 г. Соглашение о предоставлении субсидии от «28» ноября 2014 г. № 14.607.21.0093 Шифр «2014-14-579-0175-069» ОТЧЁТ О ПРИКЛАДНЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РАЗРАБОТКАХ в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы» по теме: «РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА BACILLUS ANTHRACIS В СОСТАВЕ ГИБРИДНЫХ ЧАСТИЦ БАКТЕРИОФАГОВ» (промежуточный, этап №2) Наименование этапа: «Создание рекомбинантных штаммов-продуцентов модифицированного протективного антигена B. anthracis в форме частиц бактериофагов» Руководитель ПНИЭР, заведующий лабораторией, доктор биологических наук __________________ А.В. Летаров «___» ___________ 2015 г. Москва-2015 СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ Руководитель темы: доктор биологических наук, заведующий лабораторией ____________________ подпись, дата Летаров А.В. (раздел 1, 7, 8, 9, «Заключение») кандидат биологических наук, старший научный сотрудник _____________________ подпись, дата Куликов Е.Е. (раздел 2-4) кандидат биологических наук, заведующий лабораторией _____________________ подпись, дата Петраков Е.С. (раздел 5, 6) кандидат биологических наук, старший научный сотрудник _____________________ подпись, дата Иванов П.А. («Введение», раздел 6) без ученой степени, младший научный сотрудник _____________________ подпись, дата Летарова М.А. («Введение», раздел 5) без ученой степени, младший научный сотрудник _____________________ подпись, дата Голомидова А.К. (раздел 1, 10) кандидат биологических наук, старший научный сотрудник _____________________ подпись, дата Лебедева А.А. (раздел 2, 6) без ученой степени, младший научный сотрудник _____________________ подпись, дата Прохоров Н.С. (раздел 3) без ученой степени, младший научный сотрудник _____________________ подпись, дата Татарский Е. В. (раздел 1) Исполнители темы: Нормоконтролер ____________________ подпись, дата 2 Летаров А.В. РЕФЕРАТ Отчет 77 страниц, рисунков - 34, таблиц – 6, библиография – 39 источника. Ключевые слова: БАКТЕРИОФАГ, ВИРУСОПОДОБНАЯ ЧАСТИЦА, СИБИРСКАЯ ЯЗВА, BACILLUS ANTHRACIS,ПРОТЕКТИВНЫЙ АНТИГЕН, ВАКЦИНА, ДИАГНОСТИКА, ТОКСИН-НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ, БЛАСТ- ТРАНСФОРМАЦИЯ. Объект исследования: прототипы иммунобиологических препаратов с повышенной иммуногенностью на основе протективного антигена B. anthracis Цель работы: 1. На примере протективного антигена Bacillus anthracis разработать подход по модификации антигенов, которые могут быть использованы для повышения эффективности иммунобиологических препаратов вакцинного назначения. 2. Создать прототип иммунобиологического препарата на основе протективного антигена B. anthracis с генно-инженерными модификациями (слияние со структурными белками бактериофагов), которые позволяют формировать вирусоподобные частицы и за счет этого направленно регулировать силу и специфичность иммунного ответа. 3. Изучить иммуногенность полученного антигена и оценить возможность его применения для конструирования вакцин. Методы проведения работы: 1. Методы микробиологии. 2. Выделение ДНК из клеток бактерий. 3 3. Выделение геномной ДНК из клеток растений. 4. Трансформация растительных и бактериальных клеток. 5. Анализ рекомбинантных клонов ДНК. 6. Полимеразная цепная реакция. 7. Электрофорез в агарозном и полиакриламидном геле. 8. Вестерн-блот анализ. 9. Метод ДНК-ДНК гибридизации. 10. Гибридизация на фильтрах по Саузерну. 11. Хроматография. 12. Секвенирование. Результаты работы: Исследования по ПНИЭР «Разработка методов получения иммунобиологических препаратов на основе протективного антигена Bacillus anthracis в составе гибридных частиц бактериофагов» на 2 этапе работ выполнены в полном объёме в соответствии с Планом-графиком и требованиями Технического задания Соглашения № 14.607.21.0093 от «28» ноября 2014 г. Работа по отчетному периоду была направлена на реализацию ранее принятых решений по созданию новой технологии промышленнного получения вирусоподобных частиц, несущих на поврехности антиген Bacillus anthtracis. Уделялось внимание требованиям к технологии в части экономической эффективности, простоты и высокой технологической устойчивостью. Основной научно-технической задачей являлось обспечение свойства суперантигенности – повышенной иммуногенности полимеризованного антигена по сравнению с его растворимой формой, сопоставимой с иммуногенностью природных вирусных частиц. В течение отчетного периода работы были получены следующие наиболее важные результаты, удовлетворяющие требованиям Технического задания: 4 1) В соответствии с требованиями пунктов 3.6 и 6.1.6 ТЗ выполнен скрининг коллекции (16 изолятов) с целью отбора патентно-чистых бактериофагов, пригодных для дисплея антигена на поверхностных белках вириона и/или содержащих гены полимеризующихся белков, пригодных в качестве скаффолда для дисплея антигенов. 2) Получены две экспрессионные конструкции pTTPx (белок трубки хвоста Т5-подобного бактериофага и DT5C) pTrP (белок, терминирующий хвост, Т5-подобного бактериофага DT5C) на базе вектора pET28a (Novagen), обеспечивающие продукцию в клетках E.coli белков бактериофагов, потенциально пригодных для дисплея антигенов на вирусоподобных частицах (в соответствии с требованиями п. 3.7, 4.13, 4.2.2, 6.1.8 ТЗ). 3) Получена экспрессионная конструкция, обеспечивающая продукцию полимеризующегося белка бактериофага порядка Caudovirales, слитого с целевым антигеном PAG20 (в соответствии с требованиями п. 3.7, 4.2.2, 6.15 ТЗ). 4) Путем скрининга 20 единиц хранения ВКПМ проведен подбор (селекция) штамма E.coli для обеспечения максимального уровня продукции вирусоподобных частиц (в соответствии с требованиями п. 4.2.3 ТЗ). Наилучшие показатели по сравлнению с другими штаммами дал штамм TG1. 5) Отработаны условия культивирования рекомбинантных продуцентов на основе E. coli, обеспечивающие максимальный уровень продукции слитого протективного антигена B. anthracis в нативной форме – свыше 5% (в соответствии с требованиями п. 4.1.2 ТЗ) 6) Соисполнителем ПНИЭР ФГБНУ ВНИИФБиП выполнено депонирование рекомбинантного штамма E. сoli, обеспечивающего максимальный уровень продукции слитого протективного антигена B. anthracis в нативной форме, во Всероссийской коллекции микрорганизмов (в соответствии с требованиями п. 3.10 и 6.1.11 ТЗ). 5 7) За счет внебюджетных средств разработана методика количественной оценки уровня накопления слитого протективного антигена B. anthracis в рекомбинантных продуцентах на основе E. coli (в соответствии с требованиями п. 2.8, 3.16 и 6.1.12 ТЗ). 8) За счет внебюджетных средств разработана методика количественной оценки уровня накопления вирусоподобных частиц (в соответствии с требованиями п. 3.17 и 6.1.13 ТЗ). 9) За счет внебюджетных средств проведены работы, направленные на освещение и популяризацию промежуточных результатов ПНИЭР. 10) Проведены материально-техническое обеспечение выполнения работ этапа за счет внебюджетных средств получателя субсидии и индустриального партнера ПНИЭР. Область применения: В настоящее время существует необходимость в создании вакцины против сибирской язвы для крупного рогатого скота и северного оленя, производство которой будет экономически эффективным и безопасным, при этом выработка иммунного ответа будет обеспечивать пожизненный иммунитет привитых животных. Помимо этого, для снижения себестоимости производства, предотвращения риска заражения людей и животных производственными безопасные штаммами микроорганизмы, желательно трансформация использовать которых полностью генетическими конструкциями, несущими гены ключевых антигенов B. anthracis, позволит получить высокоэффективную субъединичную рекомбинантную вакцину против сибирской язвы сельскохозяйственным животным. Основным типом потребителя разработки представляются крупные и средние биофабрики, обладающие опытом производства и испытания вакцин против особо опасных инфекций и дистрибьютерской сетью. Примерами таких предприятий могут служить ФКП «Щелковский биокомбинат» и ФКП «Орловская биофабрика». 6 СОДЕРЖАНИЕ Введение 11 1 Скрининг коллекции с целью отбора патентно-чистых бактериофагов, пригодных для дисплея антигена на поверхностных белках вириона и/или содержащих гены полимеризующихся белков, пригодных в качестве скаффолда для дисплея антигенов 2 Получение экспрессионных конструкций, обеспечивающих продукцию в клетках E.coli не менее 2 белков бактериофагов, потенциально пригодных для дисплея антигенов на вирусоподобных частицах 3 Получение экспрессионной конструкции, обеспечивающей продукцию полимеризующегося белка бактериофага порядка Caudovirales, слитого с целевым антигеном 4 Проведение подбора и/или селекции штаммов E.coli для обеспечения максимального уровня продукции вирусоподобных частиц 5 Отработка условий культивирования рекомбинантных продуцентов на основе E. coli, обеспечивающих максимальный уровень продукции слитого протективного антигена B. anthracis в нативной форме 6 Депонирование рекомбинантного штамма E. сoli, обеспечивающего максимальный уровень продукции слитого протективного антигена B. anthracis в нативной форме 7 Разработка методики количественной оценки уровня накопления слитого протективного антигена B. anthracis в рекомбинантных продуцентах на основе E. coli 8 Разработка методики количественной оценки уровня накопления вирусоподобных частиц 9 Проведение работ, направленных на освещение и популяризацию промежуточных результатов ПНИЭР 10 Материально-техническое обеспечение выполнения работ этапа Заключение 12 Список использованных источников 74 7 31 37 39 45 60 62 64 67 69 70 НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ В настоящем отчете о ПНИЭР использованы ссылки на следующие стандарты: • выполнение ПНИЭР в рамках Госконтракта проводилось согласно ГОСТ 15.101-98; • оформление отчета – согласно ГОСТ 7-32.2001. 8 ОПРЕДЕЛЕНИЯ В настоящем отчете о ПНИЭР применяют следующие термины с соответствующими определениями: Протективный антиген Bacillus anthracis (РА) – транспортная субъединица трехсбъединичного экзотоксина возбудителя сибирской язвы массой 83 кДа, обеспечивающая проникновение в цитоплазму эукариотической клетки летального токсина (LT) и отёчного фактора (EF) через механизм эндоцитоза. Бактериофа́ги (фаги) (от др.-греч. φᾰγω — «пожираю») — вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис. Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала одноцепочечной или двуцепочечной нуклеиновой кислоты (ДНК или, реже, РНК). Размер частиц приблизительно от 20 до 200 нм. Штамм – чистая культура микроорганизмов одного вида, у которого одинаковые морфологические и физиологические особенности. Вирусоподобные частицы (ВПЧ, VLP) – регулярно организованные агрегаты из нескольких сотен или тысяч белков (как правило, вирусного или фагового происхождения), содержащие или не содержащие нуклеиновую кислоту, имеющие диаметр от 5 до 200 нм. 9 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ В настоящем отчете о ПНИЭР применяют следующие Обозначения и сокращения: Б.О.Е. - бляшкообразующая единица ФТ - фаговая терапия РНТФ - реакция нарастания титра фага ЭП - эффективность посева ВПЧ - вирусоподобная частица ФВК - фосфовольфрамовая кислота НК - нуклеиновая кислота ИТП - инвертированные терминальные повторы ПЦР - полимеразная цепная реакция ДХФ - длинные хвостовые фибриллы ЛП - латентный период (фаговой инфекции) ЭкП - эклипс-период (фаговой инфекции) 10 ВВЕДЕНИЕ Основанием федеральной для проведения ПНИЭР, выполняемой целевой программы «Исследования и в рамках разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы», является Соглашение № 14.607.21.0093 от «28» ноября 2014 г. На предыдущем этапе выполнения проекта нами была сформирована коллекция бактериофагов природного происхождения, выделенных из естественных источников или патентно незащищённых коммерческих препаратов терапевтических бактериофагов. В сумме коллекция представлена 44 уникальными расами бактериофагов, активных против широкого спектра штаммов кишечных бактерий (Enterobacteriaceae). Все находящиеся в коллекции вирусы являются природными объектами, не подвергавшимися селекции или генно-инженерной модификации и, соответственно, не являющиеся объектами охраны интеллектуальной собственности. В сформированную коллекцию включены частично охарактеризованные изоляты, полученные лабораторией ИНМИ РАН, которые по предварительной оценке могут быть перспективны для целей Проекта, а также проведено выделение новых изолятов колифагов, также оцениваемых как перспективных для работы по Проекту. Уникальность каждого из полученных бактериофагов была показана прямыми методами физико-химической биологии и геномики на предыдущем этапе проекта, и эти данные были использованы для разработки протокола скрининга полученной коллекции. 11 1 СКРИНИНГ КОЛЛЕКЦИИ С ЦЕЛЬЮ ОТБОРА ПАТЕНТНОЧИСТЫХ БАКТЕРИОФАГОВ, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ДИСПЛЕЯ АНТИГЕНА НА ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКАХ ВИРИОНА И/ИЛИ СОДЕРЖАЩИХ ПРИГОДНЫХ ГЕНЫ В ПОЛИМЕРИЗУЮЩИХСЯ КАЧЕСТВЕ СКАФФОЛДА ДЛЯ БЕЛКОВ, ДИСПЛЕЯ АНТИГЕНОВ Для скрининга полученной нами ранее коллекции необходимо было продумать рациональный дизайн, который бы позволил сильно сократить затраты времени и средств, необходимых для проведения отбора из коллекции бактериофагов, несущих в составе частицы экспонированные наружу белки, пригодные для использования в целях Проекта. К таким белкам относятся, прежде всего, белки адсорбционного аппарата бактериофага, отвечающие при фаговой инфекции за присоединение частицы бактериофага к специфическим детерминантам адсорбции бактериальных клеток – компонентам липополисахарида, полисахаридным антигенам, высоко представленным белкам-поринам внешней мембраны грамотрицательных бактерий, и тому подобных биологическим структурам. Сводные данные по составу сформированной нами коллекции, подвергаемой скринингу, приведены в таблице 1. Таблица 1 - Состав коллекции изолятов бактериофагов порядка Caudovirales для скрининга № Названи Семейство Род (или группа) и е (-viridae) основания классификации 1 St10y 2 10GB Podoviridae Podoviridae Примечания N4 – подобные, полная Подобен фагу G7C, нуклеотидная содержащему tail-spike последовательность генома подобные белки N4 – подобные, полная Подобен фагу G7C, 12 3 4 Lc30/70 Siphoviridae phiKT Podoviridae нуклеотидная содержащему tail-spike последовательность генома подобные белки Сходство с колифагом К1F , секвенирование Возможно новый род, полный геном Очень близок к G7C, но 5 Alt63 N4-подобный, spike подобных белков Podoviridae 6 DT571/2 7 8 DT5G 9G Имеет Siphoviridae T5-like, полный геном декорирующий белок, содержащий два Iglike домена. Siphoviridae Siphovirida e 9 отличается одним из tail 17 T5-like, ПЦР Новый род, полный геном Felix01-подобный, секвенирование случайных Myoviridae 10 p1/4 ND, электронная Myoviridae 11 p21 микроскопия ND, электронная Myoviridae 12 клонов микроскопия Выделен из неохарактеризованного коммерческого препарата Выделен из неохарактеризованного коммерческого препарата Прототип группы имеет Gost2 декорирующий белок и Podoviridae phiEco32, частично несет сложно определена организованный комплекс последовательность генома фибрилл, потенциально пригодный для экспонирования антигенов 13 14 GT2 GRV5 Podoviridae Myoviridae Сходен с phiKT, ПЦР ДНК устойчива к гидролизу рестриктазами Rv5-подобный, ПЦР, 13 частично определена последовательность генома 15 SKP1 – SKP14 ПЦР, таргетное Myoviridae Серия из 14 изолятов секвенирование, электронная бактериофагов, полученных микроскопия 16 из фекалий свиней INMI 1 – Серия из 16 новых, INMI полученных в ходе 16* ND текущего этапа, изолятов ND колифагов, выделенных из фекалий лошадей. Простейшим и весьма информативным способом скрининга, позволяющим оценить напрямую наличие у частицы бактериофага развитого адсорбционного аппарата, является метод негативного контрастирования вирионов фага, адсорбированных на заряженную полимерную поверхность, солями тяжёлых металлов с последующей прямой визуализацией результата методом просвечивающей электронной микроскопии. Использование этого метода не только позволяет убедиться в том, что исследуемый фаг содержит в составе вириона объёмистые белки адсорбционного аппарата, но и в том, что эти белки, находясь в составе интактной вирусной частицы, оказываются экспонированы наружу. Это условие оказывается ключевым для успешной реализации целей и задач Проекта, так как иммуногенные свойства белковых антигенов напрямую зависят от пространственной доступности потенциальных эпитопов антител для их презентации. Для электронно-микроскопического исследования нами были использованы свежие лизаты исследуемых бактериофагов, приготовленные в стандартных условиях в соответствии с Протоколом скрининга коллекции бактериофагов. Кроме первичного скрининга коллекции на содержание бактериофагов с объёмными и экспонированными наружу белками адсорбционного 14 аппарата, нами были параллельно получены и дополнительные данные о структуре вирионов полученных фагов. Крайне важным показателем, также полученным в процессе электронно-микроскопического исследования, оказывалась также оценка морфологической гомогенности фаговых препаратов. Кроме этого параметра, определяющего выделенные фаги как уникальные и однородные объекты, мы могли оценить и устойчивость фаговых частиц к механическим воздействиям, неизбежным при получении препаратов фагов. Критерием, позволяющим определить пригодность бактериофага для целей Проекта, служила хорошая морфологическая сохранность фага (наличие на микрофотографиях минимального количества дефектных и повреждённых частиц бактериофагов), и, кроме того, способность бактериофагов давать при лизисе клеток минимальное количество крупных клеточных обломков (дебриса), затрудняющих последующую очистку фага при получении препаратов, а также обладающих собственными иммуногенными и адьювантными свойствами. В качестве вторичного критерия пригодности бактериофага для целей Проекта мы использовали потенциальное наличие на головке вириона декорирующих белков, также наблюдаемых при электронной микроскопии с негативным контрастированием. Такие белки обычно присутствуют в составе вирусных частиц во множестве копий, и также экспонированы наружу. После начального отбора фагов, удовлетворяющих условиям скрининга по морфологии вириона, мы проводили углублённый скрининг отобранных образцов с применением методов геномики (рестрикционный анализ геномной ДНК, получение случайных клонов геномной ДНК в плазмидных конструкциях, выборочное секвенирование полученных конструкций, секвенирование полных геномов фагов) и биоинформатики (сравнительный анализ кодирующих белки участков геномов фагов). Схема скрининга бактериофагов для целей Проекта может быть представлена в виде блок-схемы (рис. 1). Бактериофаги, при исследовании 15 которых получали положительные ответы на все отмеченные справа от этапов скрининга вопросы (отмеченные зелёным цветом этапы имеют одинаковый ранг, и достаточно положительного ответа хотя бы на один из вопросов), оценивали как перспективные для углублённого исследования. Рисунок 1 - Блок-схема скрининга коллекции бактериофагов Особенное внимание уделялось нами проверке оригинальности и патентной чистоты выделенных находящихся в составе коллекции вновь выделенных из природы бактериофагов. Для оценки этого показателя мы использовали методы биоинформатики (поиск по международным базам данных NCBI Nucleotide, Genbank, DDBJ). Результаты исследования 16 показали, что ни один из выделенных и охарактеризованных нами бактериофагов не подпадает под защиту авторским правом, и, следовательно, его геном или компоненты генома могут быть свободно использованы в рамках ПНИ для создания патентно чистых препаратов, интеллектуальная собственность на которые может быть защищена в России и за рубежом. Основные усилия по скринингу пришлись на ранее неохарактеризованные обширные серии бактериофагов, указанные в таблице 1 под порядковыми номерами 15 и 16 (серии SKP и INMI). Эти группы выделенных нами ранее различающихся близкородственных и имеющих сходное экологическое происхождение бактериофагов относятся к ранее охарактеризованным родам хвостатых бактериофагов (T4, N4), для которых уже известны детали устройства адсорбционных аппаратов, и наличие/отсутствие декорирующих белков головки. Именно эти серии фагов позволили нам в итоге отобрать максимально соответствующие задачам Проекта расы бактериофагов, удовлетворяющие всем предложенным нами выше критериям скрининга. По результатам углублённого скрининга нами были отобраны 20 рас фагов, принадлежащих к различным семействам, которые были использованы для дальнейшего выполнения проекта. 24 расы фагов были исключены из дальнейшего использования из-за явного несоответствия критериям отбора. Ниже, на рисунках 2-24 приведены электронные микрофотографии некоторых бактериофагов из сформированной нами коллекции, отобранных на соответствие формальным критериям скрининга. 17 Рисунок 2 - Бактериофаг SKP002. Семейство Myoviridae, T4-подобный. Соответствует критериям скрининга Рисунок 3 - Бактериофаг SKP004. Семейство Myoviridae, T4-подобный. Соответствует критериям скрининга 18 Рисунок 4 - Бактериофаг SKP005. Семейство Myoviridae, T4-подобный. Соответствует критериям скрининга Рисунок 5 - Бактериофаг SKP006. Семейство Myoviridae. Felix01-подобный. Соответствует критериям скрининга 19 Рисунок 6 - Бактериофаг SKP007. Семейство Myoviridae. Felix01-подобный. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата Рисунок 7 - Бактериофаг SKP008. Семейство Myoviridae. Felix01-подобный. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата 20 Рисунок 8 - Бактериофаг SKP009. Семейство Myoviridae. Felix01-подобный. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата Рисунок 9 - Бактериофаг SKP011. Семейство Myoviridae. Felix01-подобный. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата 21 Рисунок 10 - Бактериофаг SKP012. Семейство Myoviridae. Felix01-подобный. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата. Рисунок 11 - Бактериофаг SKP014. Семейство Myoviridae. Felix01-подобный. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата 22 Рисунок 12 - Бактериофаг INMI001. Семейство Myoviridae. Felix01подобный. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата Рисунок 13 - Бактериофаг INMI003. Семейство Myoviridae. Felix01подобный. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата 23 Рисунок 14 - Бактериофаг INMI005. Семейство Myoviridae. Felix01подобный. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата Рисунок 15 - Бактериофаг INMI006. Семейство Podoviridae. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата 24 Рисунок 16 - Бактериофаг INMI007. Семейство Podoviridae. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата. Рисунок 17 - Бактериофаг INMI008. Семейство Podoviridae. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата 25 Рисунок 18 - Бактериофаг INMI009. Семейство Myoviridae. Felix01подобный. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата Рисунок 19 - Бактериофаг INMI012. Семейство Myoviridae. Felix01подобный. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата 26 Рисунок 20 - Бактериофаг INMI014. Семейство Myoviridae. Felix01подобный. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата Рисунок 21 - Бактериофаг INMI015. Семейство Podoviridae. Соответствует критериям скрининга. Обращает на себя особое внимание размером белков адсорбционного аппарата 27 Рисунок 22 - Бактериофаг INMI016. Семейство Podoviridae. Не соответствует критериям скрининга. Препарат содержит большое количество клеточного дебриса и повреждённых фаговых частиц Рисунок 23 - Бактериофаг INMI010. Семейство Podoviridae. Не соответствует критериям скрининга. Препарат содержит большое количество клеточного дебриса и повреждённых фаговых частиц, кроме того, в препарате встречаются компоненты фагов других морфологических типов 28 Рисунок 24 - Бактериофаг INMI011. Семейство Myoviridae. Не соответствует критериям скрининга. Препарат содержит большое количество клеточного дебриса и повреждённых фаговых частиц, кроме того, в препарате встречаются компоненты фагов других морфологических типов Секвенирование случайных клонов геномной ДНК бактериофагов группы SKP, принадлежащих к семейству Myoviridae, показало высокую гомологию получаемых последовательностей с геномом одного из широко распространённых фагов энтеробактерий – фагом Felix01. Нами было решено остановить свой выбор на данной серии бактериофагов, так как благодаря известной организации их генома (рис. 25) мы смогли сразу же проанализировать последовательности генов, кодирующих у отобранных нами фагов белки адсорбционного аппарата, и определить их пригодность для создания химерных конструкций в рамках Проекта. Одновременно нами была определена патентная чистота используемых последовательностей – ни один из выделенных нами фагов не был использован ранее для получения защищённой интеллектуальной собственности. 29 Рисунок 25 - Организация локуса поздних генов и генов белков адсорбционного аппарата у фага Felix 01 – прототипа отобранной нами группы фагов SKP 30 2 ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИОННЫХ КОНСТРУКЦИЙ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ПРОДУКЦИЮ В КЛЕТКАХ E.COLI (НЕ МЕНЕЕ 2 ПРИГОДНЫХ БЕЛКОВ ДЛЯ БАКТЕРИОФАГОВ), ДИСПЛЕЯ ПОТЕНЦИАЛЬНО АНТИГЕНОВ НА ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦАХ Для дальнейшего использования в целях создания вирусоподобных частиц на предыдущем этапе было предложено использовать белок pb6, являющийся главным белком хвоста (TTP) Т5-подобных бактериофагов, в том числе фагов DT57C и DT571/2, выделенных в нашей лаборатории и являющихся таким образом патентно-чистыми объектами. Преимущество pb6 перед другими кандидатными белками состоит в том, что в полимерном состоянии с составе трубки хвоста фага он образует тримерные, а не гексамерные кольца. При этом pb6 имеет большую молекулярную массу (ок. иммуноглобулин-подобный 50 КДа) и несет на своем С-конце домен, по-видимому, экспонированный во внешнюю среду. Эти свойства позволяют предполагать, что данный белок представляет собой перспективную платформу для дисплея на полимерных структурах крупных антигенных доменов. Для создания экспрессионных конструкций с белками бактериофагов, потенциально пригодными для дисплея антигенов на вирусоподобных частицах нами был сконструирован специальный вектор pNPtX1. Основой для создания этого вектора послужила плазмида pESL (Sycheva et al. 2012), которая в свою очередь является производным плазмиды pET28a (Novagen, USA). Для целей проекта из вектора был удален фрагмент, гомологичный гену slyD, удалены сайты рестрикции BglII, PciI, BspHI, заменён маркёр устойчивости KmR на AmpR, из промотора гена β-лактамазы направленным мутагенезом был удалён сайт BspHI. В полученную конструкцию по сайтам NheI и MunI был вставлен ликер 1 (GCTAGCGGCAGCGGTGGCAGATCTGGTGTCATGAGCCCCGGGGGTACC 31 GGCCAATTG), по сайтам BamHI и – EcoRI линкер 2 (GGATCCGGCAACATGTCGGGCACTAGTGGTGAATTC), по сайтам SpeI и – XhoI линкер 5 (ACTAGTAAGCTTGAATTCTAAGATATCGTCGACGGTGGCAGTGGCGGT AGCGGTGGTAGTCTCGAG). Полученный вектор назван pNPtX1. Эта конструкция позволяет производить клонирование и экспрессию целевого гена, амплифицированного с помощью пары праймеров с сайтами NcoI и EcoRI, или рестриктаз с совместимыми липкими концами (BspHI, PciI и MunI, соответственно), в виде С-концевых и N-концевых трансляционных гибридов с His-tag и/или с дополнительными доменами. Ген белка TTP фага DT57C был амплифицирован в реакции ПЦР с праймерами 57CTTP.F1 – BspHI (TATATTCATGaCTTTACAACTATTACG) и 57CTTP.R2 – EcoRI (TGAATTCTTCACCAGCACTAACTG) и Были получены три варианта конструкции с геном белка pb6 (ТТP): - pTTP рассчитанная для продукции нативной формы ТТР (Рис.1), полученная клонированием ПЦР-фрагмента по сайтам NcoI/BspHI (эти ферменты образуют совместимые липкие концы) и EcoRI 32 Рисунок 26 - Карта плазмиды pTTP -pXTTP, предназначенная для N-концевого слияния, полученная клонированием фрагмента по сайтам PciI/BspHI и Eco RI Рисунок 27 - Карта плазмиды pXTTP 33 - pTTPX, предназначенная для получения С-концевых фьюзов, полученная клонированием ПЦР-фрагмента по сайтам NcoI/BspHI и EcoRI/MunI (рис. 28) Рисунок 28 - Карта плазмиды pTTPX В связи с тем, что во время выполнения работ этапа вышла публикация (Noirclerc-Savoye et al. 2015), в которой было показано, что белок pb6 фага Т5, сходный с TTP фага DT57C не полимеризуется в растворе автономно, нами было принято техническое решение создать дополнительную конструкцию, коэкспрессирующую TTP с шапероном сборки хвоста. Это решение основано на данных другой недавно появившейся статьи (Xu et al. 2014), в которой показано, что полимеризация белка трубки хвоста фага лямбда может быть индуцирована за счет повышенной экспрессии шаперона GT. Этот белок продуцируется при инфекции фагом лямбда за счет программированного сдвига рамки считывания в гене G/T и является более длинной формой шаперона. В случае Т5 и родственных фагов вместо перекрывающихся рамок считывания с сигналом запрограммированного сдвига рамки трансляции 34 предполагаемые шапероны сборки хвоста (p138 и p139) кодируются отдельными генами (Zhivonovich et al. 2013). Для исследования возможности инициации полимеризации ТТP нами получена конструкция, содержащая регион pb6-p140-p139. С этой целью соответствующий фрагмент генома был амплифицированы в реакции ПЦР с праймерами 139 R_SalI (5’- at at at gtc gac CAA AAT CAG CAA CAG CAT CTA G) и pb6D (5’- TAT CAG CCT CCA CGTAG) и клонирован в вектор pGEMT (Promega, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Клоны с ориентацией вставки, позволяющей транскрипцию целевых генов с промотора Т7 – полимеразы были отобраны с помощью рестрикционного анализа. В результате получен экспрессионный вектор pG140-39. В качестве второго кандидатного белка нами был выбран продукт гена 142 того же фага, известный как белок, терминирующий хвост (TrP). Выбор белка ТrP был основан на данных Noirclerc-Savoye et al. (2015), свидетельствующих, что полимеризация этого белка может быть индуцирована помещением His-tag на С-конец его полипептидной цепи. При этом образуются трубчатые структуры, по диаметру сходные с хвостом фага Т5, образованные, по-видимому, 6-заходовой спиралью cубъединиц TrP. Ген белка ТrP был амплифицирован в реакции ПЦР с праймерами 57CTrP.F2 - NcoI (TATATСCATGGATCACAGAACAAGTATAGCG) и 57CTrP.R2- EcoRI (TGAATTCTCTGCGAAGTGACCTACGTG) Было создано два варианта конструкций, экспрессирующих TrP: -pTrP для экспрессии нативной последовательности белка ТrP, полученная клонированием ПЦР-фрагмента по сайтам NcoI – EcoRI (рис. 29) 35 Рисунок 29 - Карта плазмиды pTrp -pTrPX, предназначенная для создания С-концевых фьюзов с белком TrP, полученная клонированием ПЦР-фрагмента по сайтам NcoI-EcoRI/MunI (рис. 30) Рисунок 30 - Карта плазмиды pTrPX 36 3 ПОЛУЧЕНИЕ ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕЙ ЭКСПРЕССИОННОЙ ПРОДУКЦИЮ КОНСТРУКЦИИ, ПОЛИМЕРИЗУЮЩЕГОСЯ БЕЛКА БАКТЕРИОФАГА ПОРЯДКА CAUDOVIRALES, СЛИТОГО С ЦЕЛЕВЫМ АНТИГЕНОМ Поскольку вопрос об инициации полимеризации белка ТТP, ранее выбранного в качестве наиболее перспективного полимеризующегося скаффолда нуждается в дополнительном изучении (соответствующие работы проводятся нами в настоящее время) для создания экспрессионной конструкции был выбран белок TrP, автономная полимеризация которого достижима при суперэкспрессии без дополнительного инициирующего воздействия. Поскольку белок TrP по данным литературы способен полимеризоваться при наличии C-концевого тэга (Noirclerc-Savoye et al. 2015) было принято решение сконструировать на данном этапе экспрессионный вектор на основе плазмиды pTrPX. Для решения этой задачи ген с помощью амплификации в реакции ПЦР с праймерами PA.F1 - BamHI (TTGGATCCCAGGCAGAAGTTAAACAGGA) и PA20.R1 - XhoI (TTTTCTCGAGTCCTATCTCATAGCCTTTTTTA). Полученный фрагмент РА20 был клонирован в плазмиду pTrPX с по сайтам BamHI и ХhoI, в результате чего получена плазмида pTrPPA (рис. 31), кодирующая последовательность белка pTrP слитую через полиглициновый линкер и сайт узнавания TEV протеазы с последовательностью антигена РА20. 37 Рисунок 31 - Карта плазмиды pTrPPA. 38 4 ПРОВЕДЕНИЕ ПОДБОРА И/ИЛИ СЕЛЕКЦИИ ШТАММОВ E.COLI ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ МАКСИМАЛЬНОГО УРОВНЯ ПРОДУКЦИИ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ Поскольку сборка фагоподобных (вирусоподобных частиц, ВПЧ) не всегда имеет высокую эффективность, приближающуюся к 100%, и часть структурного белка ВПЧ может оставаться в растворимой форме или аморфных агрегатах, была проведена процедура отбора штаммов E.coli, обеспечивающих максимальный уровень продукции ВПЧ. Для выполнения плановых работ использовалась конструкция pTrPPA, кодирующая слитой белок в составе: белко TrP - продукт гена 142 T5подобного фага DT57C (белок, терминирующий хвост) + N-концевой домен протективного антигена B. anthracis 0055 (белок PAG20). В качестве материала для скрининга использовались единицы хранения Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) в количестве 20 штаммов E. coli. При отборе штаммов стремились включать в скрининг как природные изоляты, не родственные типовому штамму K12, так и мутантные варианты K12 с охарактеризованным генотипом (таблица 2). Таблица 2 - Штаммы E. coli, использованные для отбора вариантов, обеспечивающих максимальный выход ВПЧ при введении конструкции pTrPPA, кодирующей слитой белок антиген TrP (DT57C) – PAG20 № № Род Вид ВКПМ Авторское Альтернативные название, закладки происхождение 1. 7854 Escherichia coli 2. 7855 Escherichia coli Природный - изолят Природный 39 - изолят 3. 7856 Escherichia coli 4. 8191 Escherichia coli 5. 8192 Escherichia coli 6. 8193 Escherichia coli 7. 8194 Escherichia coli 8. 8195 Escherichia coli 9. 8208 Escherichia coli Природный изолят Природный 9632 Escherichia Природный Природный Природный coli 12. 10101 Escherichia coli - изолят Природный - изолят Природный - изолят (мутант К12: thi, (lac- ATCC 9637; proAB), CCM 2024; F'[traD36 DSM 1116: lacIq NCIB 8666; lacZ M15]) Escherichia - изолят proAB+ 9633 - изолят coli 11. - изолят TG1 10. - NRRL B-766 JM109 (мутант К12: recA, мутант К12: thi, (lac-proAB), F'[traD36 DSM 2607; proAB+ lacIq NCIB 8743 lacZ M15])) Природный ATCC 10799; изолят DSM 4261; CCM 2260; NCIB 8134 40 13. 10229 Escherichia coli 14. 1316 Escherichia coli Природный ATCC изолят DSM 1900 NM 182 мутант 11105; - К12: thi, lacIq) мутант RY13 - К12: thi, (lac15. 1776 Escherichia proAB), coli F'[traD36 proAB+ lacIq lacZ M15]) 16. 1817 Escherichia coli R245, GA9 - 17. 1849 Escherichia coli J53(R124) - Escherichia coli C600(pJA4620) - 18. 1850 19. 1911 Escherichia coli 20. 1917 Escherichia coli (мутант К12) CK (мутант - p71/6 - К12) J62 (мутант К12) Для введения конструкции pTrPPA в клетки штаммов E. coli, использовали 0,1 мкг очищенной ДНК плазмидной ДНК. Препарат плазмидной ДНК добавляли к аликвоте объемом 50 мкл компетентных клеток E. coli, приготовленных по методике, предложенной в работе (Cohen et al, 1972). Обработанную суспензию клеток высевали на агаризованную среду LB, содержащую ампициллин (100 мкг/мл) и IPTG (2 мМ). Рекомбинантные клоны с введенной конструкцией pTrPPA, отбирали с помощью однократного пассирования на селективной среде, содержащую ампициллин (100 мкг/мл), после чего переносили на полноценную питательную среду LB объемом 3 мл, содержащую ампициллин (100 мкг/мл), 41 культивировали на микробиологической качалке при ротации со скоростью 220 об/мин при 37С в течение 16 часов. Полученную биомассу штамма-трансформантов, несущих конструкциею pTrPPA, выращенную на жидкой полноценной среде LB (1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl), осаждали низкоскоростным центрифугированием (7-10 тыс. g в течение 10 мин при комнатной температуре), помещали в полипропиленовую пробирку с завинчивающейся крышкой типа Falcon объемом 15 мл, суспендировали в 5 мл охлажденного забуференного физиологического раствора (NaCl 100 мМ, фосфат натрия 10 мМ, рН 7,2) и добавляли 300 мг стеклянных шариков диаметром 0,5 мм. Биомассу гомогенизировали, встряхивая смесь на лабораторном ручном вортексе 5 раз по 1 минуте. В промежутках между встряхиванием пробирки охлаждали на ледяной бане в течение 5-10 минут. Лизат осветляли центрифугированием в течение 30 минут при 12000 g. В качестве метода скрининга, позволяющим оценить напрямую наличие частицы бактериофага в клетках рекомбинантных штаммов E. coli с введенной конструкцией pTrPPA, был выбран метод просвечивающей электронной микроскопии с негативным контрастированием вирионов фага, адсорбированных на заряженную полимерную поверхность, солями тяжёлых металлов с последующей прямой визуализацией результата методом. Использование этого метода не только позволило убедиться в том, что исследуемые ВПЧ содержат в составе вириона антиген, но и в том, что эти белки, находясь в составе интактной вирусной частицы, оказываются экспонированы наружу. Это условие оказывается ключевым для успешной реализации целей и задач Проекта, так как иммуногенные свойства белковых антигенов напрямую зависят от пространственной доступности потенциальных эпитопов антител для их презентации. Кроме первичного скрининга коллекции штаммов E. coli на способность обеспечивыать максимальный уровень накопления ВПЧ с 42 экспонированным наружу целевым антигеном PAG20, нами были параллельно получены и дополнительные данные о структуре ВПЧ. Важным показателем, микроскопического полученным исследования, является в процессе оценка электронно- морфологической гомогенности препаратов ВПЧ. Кроме этого параметра, определяющего выделенные фаги как уникальные и однородные объекты, мы могли оценить и устойчивость ВПЧ к механическим воздействиям, неизбежным при получении препаратов. Критерием, позволяющим определить пригодность ВПЧ для целей Проекта, служила хорошая морфологическая сохранность фага: наличие на микрофотографиях минимального количества аморфных агрегатов, а также дефектных и повреждённых частиц, и, кроме того, способность бактериофагов давать при лизисе клеток минимальное количество крупных клеточных обломков (дебриса), затрудняющих последующую очистку фага при получении препаратов, а также обладающих собственными иммуногенными и адьювантными свойствами. Количественную нормировку наргрузки клеточного материала при изготовлении препаратов для электронной микроскопии проводили по общему белку: для изготовления одного препарата использовали 0,1 мкг общего белка лизата. Результат выражали в количестве ВПЧ в 10 независимых полях зрения. Результаты скрининга представлены в таблице 3. Таблица 3 - Результаты скрининга штаммы E. coli на способность обеспечивать максимальный выход ВПЧ при введении конструкции pTrPPA № № ВКПМ Число ВПЧ в 10 полях % от максимального зрения, шт 1. 7854 2 0,87% 2. 7855 121 52,38% 3. 7856 0 0,00% 43 4. 8191 0 0,00% 5. 8192 0 0,00% 6. 8193 0 0,00% 7. 8194 0 0,00% 8. 8195 9 3,90% 9. 8208 5 2,16% 10. 9632 231 100,00% 11. 9633 12. 10101 15 17 13. 10229 21 9,09% 14. 1316 0 0,00% 15. 1776 0 0,00% 16. 1817 0 0,00% 17. 1849 6 2,60% 18. 1850 0 0,00% 19. 1911 0 0,00% 20. 1917 11 4,76% 6,49% 7,36% Проведенные исследования позволили установить, что наиболее эффективным штаммов для проведения ВПЧ является штамм TG1 (#10 в коллекции, подвергнутой исследованию). Этот штамм часто используется в лабораторной практике для выполнения работ по генноинженерному конструированию. Он оказался в два раза эффективнее второго по выходу ВПЧ штамма ВКПМ В-7855 и в 28-72 раза эффектнее других иследованных штаммов. С учётом этого дальнейшие работы по получению ВПЧ вели преимущественно с применнеием штамма E. coli TG1. 44 ОТРАБОТКА 5 РЕКОМБИНАНТНЫХ УСЛОВИЙ ПРОДУЦЕНТОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ОСНОВЕ E. COLI, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ МАКСИМАЛЬНЫЙ УРОВЕНЬ ПРОДУКЦИИ СЛИТОГО ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА B. ANTHRACIS В НАТИВНОЙ ФОРМЕ При отработке условий культивирования рекомбинантных продуцентов на основе E. coli, обеспечивающих максимальный уровень продукции слитого протективного антигена B. anthracis в нативной форме использовалась разработанная в рамках очтетного этапа лабораторная методика разработана в рамках 2-го этапа по соглашению № 14.607.21.0093 о предоставлении субсидии от «28» ноября 2014 г. в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы», по теме: «Разработка методов получения иммунобиологических препаратов на основе протективного антигена Bacillus anthracis в составе гибридных частиц бактериофагов». Лабораторная методика обеспечивает полуколичественное определение слитого протективного антигена Bacillus anthracis на основании установления предельного разведения (титра) белка в составе лизата рекомбинантного продуцента, дающего положительную иммунологическую реакцию. Для повышения устойчивости измеряемого сигнала измерения выполняют в варианте иммуноблоттинга, где целевой белок отделяется от примесей с помощью денатурирующего электрофореза. Определение включает следующие стадии: 1) Получение биомассы; 2) Съём и дезинтеграция биомассы; 3) Определение общего белка в образцах; 4) Приготовление образцов и проведение электрофореза; 45 денатурирующего 5) Перенос белков на мембрану и проведение иммунохимического окрашивания; 6) Оценка результата и составление отчета. Для получения слитого протективного антигена B. anthracis (ген клонирован из вакцинного штамма B. anthracis 55, полученного из НИИ микробиологии МО РФ, г Киров)) в нативной форме с N-концевым 6-Hisтагом использовалась конструкуция pQE-PAG2 (рис. 32). Xho I (2) T5promoter pQE-III/IV Aat II (5600) T5 Promoter primer Bam HI (146) Amp Sac I (162) Bgl I (4798) PAG whole pQE-PAG2 Nar I (1418) 5669 bp ColEori Kpn I (2376) Nde I (3608) Xma I (2377) Sma I (2379) Xba I (3372) Sal I (2382) rrnT1 term pQE30 reverse primer To term Nhe I (2516) Pvu II (2668) ctcgagaaatcataaaaaatttatttgctttgtgagcggataacaattataatagattc aattgtgagcggataacaatttcacacagaattcattaaagaggagaaattaactatgagagga 46 tcgcatcaccatcaccatcacggatccgcatgcgagctccaggcagaagttaaacaggagaacc ggttattaaatgaatcagaatcaagttcccaggggttactaggatactattttagtgatttgaa ttttcaagcacccatggtggttacctcttctactacaggggatttatctattcctagttctgag ttagaaaatattccatcggaaaaccaatattttcaatctgctatttggtcaggatttatcaaag ttaagaagagtgatgaatatacatttgctacttccgctgataatcatgtaacaatgtgggtaga tgaccaagaagtgattaataaagcttctaattctaacaaaatcagattagaaaaaggaagatta tatcaaataaaaattcaatatcaacgagaaaatcctactgaaaaaggattggatttcaagttgt actggaccgattctcaaaataaaaaagaagtgatttctagtgataacttacaattgccagaatt aaaacaaaaatcttcgaactcaagaaaaaagcgaagtacaagtgctggacctacggttccagac cgtgacaatgatggaatccctgattcattagaggtagaaggatatacggttgatgtcaaaaata aaagaacttttctttcaccatggatttctaatattcatgaaaagaaaggattaaccaaatataa atcatctcctgaaaaatggagcacggcttctgatccgtacagtgatttcgaaaaggttacagga cggattgataagaatgtatcaccagaggcaagacacccccttgtggcagcttatccgattgtac atgtagatatggagaatattattctctcaaaaaatgaggatcaatccacacagaatactgatag tcaaacgagaacaataagtaaaaatacttctacaagtaggacacatactagtgaagtacatgga aatgcagaagtgcatgcgtcgttctttgatattggtgggagtgtatctgcaggatttagtaatt cgaattcaagtacggtcgcaattgatcattcactatctctagcaggggaaagaacttgggctga aacaatgggtttaaataccgctgatacagcaagattaaatgccaatattagatatgtaaatact gggacggctccaatctacaacgtgttaccaacgacttcgttagtgttaggaaaaaatcaaacac tcgcgacaattaaagctaaggaaaaccaattaagtcaaatacttgcacctaataattattatcc ttctaaaaacttggcgccaatcgcattaaatgcacaagacgatttcagttctactccaattaca atgaattacaatcaatttcttgagttagaaaaaacgaaacaattaagattagatacggatcaag tatatgggaatatagcaacatacaattttgaaaatggaagagtgagggtggatacaggctcgaa ctggagtgaagtgttaccgcaaattcaagaaacaactgcacgtatcatttttaatggaaaagat ttaaatctggtagaaaggcggatagcggcggttaatcctagtgatccattagaaacgactaaac cggatatgacattaaaagaagcccttaaaatagcatttggatttaacgaaccgaatggaaactt acaatatcaagggaaagacataaccgaatttgattttaatttcgatcaacaaacatctcaaaat atcaagaatcagttagcggaattaaacgcaactaacatatatactgtattagataaaatcaaat taaatgcaaaaatgaatattttaataagagataaacgttttcattatgatagaaataacatagc agttggggcggatgagtcagtagttaaggaggctcatagagaagtaattaattcgtcaacagag ggattattgttaaatattgataaggatataagaaaaatattatcaggttatattgtagaaattg aagatactgaagggcttaaagaagttataaatgacagatatgatatgttgaatatttctagttt acggcaagatggaaaaacatttatagattttaaaaaatataatgataaattaccgttatatata agtaatcccaattataaggtaaatgtatatgctgttactaaagaaaacactattattaatccta gtgagaatggggatactagtaccaacgggatcaagaaaattttaatcttttctaaaaaaggcta 47 tgagataggtaccccgggtcgacctgcagccaagcttaattagctgagcttggactcctgttga tagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccgccgggc gttttttattggtgagaatccaagctagcttggcgagattttcaggagctaaggaagctaaaat ggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacatttt gaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcct ttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccg cctgatgaatgctcatccggaatttcgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggat agtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtg aataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtga aaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgg gtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttca ccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatca tgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgag tggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagttattggtgcccttaaacgcctggggtaatga ctctctagcttgaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgtttta tctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccctctagagctgcctcgcg cgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtc tgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcg gggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcat cagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggag aaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcgg ctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggata acgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgtt gctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcag aggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgc gctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgt ggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctg ggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttg agtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcag agcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactaga aggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagct cttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattac gcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtgg aacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatcc ttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacag 48 ttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagtt gcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctg caatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccgg aagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgc cgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaag gcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgtt gtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctctta ctgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgaga atagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacat agcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatct taccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttt tactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaata agggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatc agggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggt tccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacatta acctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcac Рисунок 32 - Рестриктная карта и полная нуклеотидная последовательность конструкции pQE-PAG2, предназначенной для получения слитого протективного антигена B. anthracis в нативной форме в клетках E. coli В качестве способа определения выхода белка-антигена использовался электрофорез растворимой фракции клеточного лизата в денатруирующих условиях по Лэмли с иммунологическим окрашиванием продукта антителами лошади, иммунизированной жидкой сибиреязвенной вакциной производства ФКП «Орловская биофбарика». Расчетная масса продукта 45 кДа. Для размножения штамма использовалась полноценная среда LB с некоторыми модификациями с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. В качестве индуктора использовали IPTG в концентрации 0,5 и 2 мМ, 1% лактозу, а также проводили культивирование в отсутствие индуктора. Штамм получали путем введения ДНК конструкции pQE-PAG2 в клетки TG-1 (supE, hsd5, thi, 49 (lac-proAB) F'[traD36 proAB+ lacIq lacZ M15])) (депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-5837). Получение посевного материала для проведения ферментаций штамма TG1(pQE-PAG2) продуцента слитого протективного антигена B. anthracis в нативной форме проводили на полноценной среде LB состава (г/л): протеозный пептон (Difco) – 10-20, дрожжевой экстракт (Difco) – 5-10, NaCl – 2-20. Для поддержания генетической стабильности плазмиды после автоклавирования в среду вносят ампициллин до концентрации 100 мкг/мл. Ферментацию TG1(pQE-PAG2) проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 50 мл среды, в течение 24 часов при интенсивной аэрации при температуре 30С или 37С. Выросшую биомассу собирают центрифугированием при 10000 g в течение 20 мин, осадок гомогенизируют с помощью ультразвука и отделяют растворимую фракцию с помощью центрифугирования при 30-50 тыс. G в течение 30 мин. Получение посевного материала для проведения ферментации штамма E. coli TG-1 (supE hsd 5 thi (lac-proAB) F'[traD36 proAB+ lacIq lacZ M15])) (депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-5837), несущей конструкцию pQEPAG2 проводили на плотной питательной среде LB состава (г/л): протеозный пептон (Difco) – 10, дрожжевой экстракт (Difco) – 5, NaCl – 10, агар - 20. Отдельную колонию микробиологической петлей засевали в жидкую питательную среду LB объемом 3 мл, содержащую ампициллин (100 мкг/мл), культивируют при ротации со скоростью 220 об/мин на микробиологической качалке при 30С или 37С в течение 16 часов Приготовление образцов и проведение денатурирующего электрофореза Все операции по подготовке проб для электрофореза до стадии осаждения ацетоном выполняли на 50 холоду (ледяная баня). В полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл вносили аликвоты растворимой фракции клеточного лизата биомассы штамма-трансформанта, производного от E. coli TG1, несущего конструкцию pQE-PAG2, содержащие по 2 мкг общего белка, доводят объем до 100 мкл забуференным физиологическим раствором (NaCl 100 мМ, фосфат натрия 10 мМ, рН 7,2), тщательно перемешивали и добавляли 100 мкл ацетона. Выдерживали при +4С 30 минут и осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 12 тыс. G. Супернатант тщательно удаляли с помощью водоструйного насоса, а осадок подсушивали в открытых пробирках в воздушном термостате при +37С в течение 10 минут. В каждую пробирку вносят 20 мкл свежеприготовленного буфера Лэммли (не допускается хранение этого буфера с добавленным восстановителем более 24 часов) для денатурации образцов и прогревали в сухом термостате при 96С в течение 5 мин. Прогретые образцы тщательно гомогенизировали и осветляли центрифугированием в течение 10 мин при 12 тыс. G. С целью приготовления серии разведений с шагом падения концентрации в 10 раз готовили 3 пробирки, содержащие по 20 мл буфера Лоури для денатурации образцов. Из денатурированной пробы отбирали аликвоту 2 мкл и переносили в первую пробирку с буфером, тщательно перемешивают. Операцию аналогичным образом повторяли со следующими двумя пробирками, перенося аликвоты образца объемом по 2 мкл в буфер объемом 20 мкл. В лунки денатурирующего ПААГ вносили по 10 мкл каждого разведения образца (соответствует 1, 0,1, 0,01 и 0,001 мкг общего белка в растворимой клеточной фракции). Полиакриламидный гель для выполнения электрофореза готовят согласно прописи, приведенной в таблице 4. Таблица 4 - Состав денатурирующего полиакриламидного геля 51 Состав раствора Концентрирующи Разделяющий гель й гель (5 мл) (10 мл) Конечная концентрация 6,0 12,5 Объем буфера (мл) 1,25 2,5 Объем воды (мл) 2,37 1,87 0,75 3,12 0,52 2,22 Объем ТЕМЕД (мл) 0,015 0,015 Объем 10% ПСА (мл) 0,037 0,075 акриламида, % Объем 40% раствора акриламида (мл) Объем 1,5% раствора бисакриламида (мл) Для электрофореза использовали следующие стандартные растворы: электродный буфер - 25 мМ трис, 192 мМ глицин, 0,1% SDS, pH 8,6; верхний (концентрирующий) буфер (4) - 50 мМ трис-HCl, 0,4% SDS, pH 6,8; нижний (разделяющий) буфер (4) - 150 мМ трис-HCl, pH 8,8 0,4% SDS; буфер Лэммли с мочевиной- 25 мМ трис, 192 мМ глицин, pH 8,6, 1% SDS, 7 М мочевина, 50 мМ ДТТ, 0,001% бромфеноловый синий; буфер Лэммли без мочевины- 25 мМ трис, 192 мМ глицин, pH 8,6, 1% SDS, 60% сахароза, 50 мМ ДТТ, 0,001% бромфеноловый синий; Концентрирование белков в концентрирующем геле проводили при напряжении 80 В, разделение белков по молекулярным массам в разрешающем геле проводят при напряжении 250 В и длине пробега около 5 см. После проведения электрофореза в ПААГ белки растворимой клеточной фракции штамма-трансформанта, производного от TG1, несущего конструкцию pQE-PAG2, переносили на нитроцеллюлозный фильтр в приборе «Mini-Protean 3 Cell» (фирмы Bio-Rad) в течение 1,5 ч и токе 0,8 мА/см при 20˚С. После переноса фильтр окрашивали в растворе 1% 52 Понсо красного, растворенного в 10% уксусной кислоте и фиксируовали расположение полос молекулярно-весового стандарта и наиболее ярких полос образцов. После этого обесцвечивали фильтр 10 кратным промыванием в деионизованной воде и помещали в 25 мл раствора 0,1%-ного сывороточного альбумина быка (BSA) в буфере PBS для блокирования неспецифического связывания. Блокирование проводили в течение 4-20 часов при 20С, затем отмывают в буфере PTBS (5 раз по 25 мл), после чего инкубировали в растворе PBS, содержащем аффинно очищенные антитела лошади, трехкратно гипериммунизированной живой противосибиреязвенной вакциной (ФКП Орловская биофабрика) в течение 2 ч при 20С и слабом качании. Разведение исходного раствора антител составляло 1:20000. Фильтр трехкратно тщательно отмывали в буфере PBST отъемом 20 мл. После отмывки фильтр инкубировали в растворе PBS, содержащем конъюгат стафилококкового белка А с пероксидазой хрена (ЗАО «Иннотех-21», Москва) в разведении 1: 10 000 в течение 2 ч при 20С и слабом качании. Фильтр трехкратно тщательно отмывали в буфере PBST отъемом 20 мл и прокрашивали в растворе 0,065 H2O2 в присутствии хромофорного субстрата пероксидазы (N,N’-диаминобензидин), в течение 5-10 мин до появления окрашенных полос. Затем реакцию останавливали инкубацией фильтра в 10% серной кислоте и ополаскивали водой. Фиксация результатов определения проводилась в форме титра путем выявления последнего разведения, реагирующего с антителами в блоттинге. Поскольку нанесенные на дорожки геля количества материала соответствует 1, 0,1, 0,01 и 0,001 мкг общего белка в растворимой клеточной фракции, а чувствительность использованных аффинно очищенных антител лошади, трехкратно вакциной гипериммунизированной (ФКП Орловская живой биофабрика) противосибиреязвенной согласно спецификации производителя составляет 50 пг в точке, содержание рекомбинантного белка – слитого протективного антигена B. anthracis в биомассе E. coli может быть оценено с помощью таблицы 5. 53 Таблица 5 - Расчет доли слитого PAG от общего растворимого белка в клеточном лизате (%) методом предельных разведений в иммуноблоттинге Последнее Содержание общего Доля слитого PAG от реагирующее белка, пг общего растворимого разведение белка, % 1 1 000 000 0,0050,0025 2 100 000 0,050,025 3 10 000 0,50,25 4 1 000 52,5 Результаты работ по подбору условий культивирования представлены в таблице 6. Таблица 6 - Выход белка-антигена PAG20 при культивировании рекомбинантного штамма E. coli TG1 (pQE-PAG2) в раздичных условиях. Температура ферментации 30С Номер среды 1. Пептон, % Дрожжевой NaCl, % экстракт 1 1 0,1 IPTG 2 Выход белка, % 0,050,25 2. 1 1 0,5 IPTG 2 0,50,25 3. 1 1 1 IPTG 2 0,50,25 4. 1 1 2 IPTG 2 0,050,25 5. 1 1 0,1 IPTG 0,5 0,050,25 6. 1 1 0,5 IPTG 0,5 0,50,25 7. 1 1 1 IPTG 0,5 0,50,25 8. 1 1 2 IPTG 0,5 0,050,25 9. 1 1 0,1 лактоза 0,050,25 10. 1 1 0,5 лактоза 0,050,25 54 Индуктор, мМ 11. 1 1 1 лактоза 0,050,25 12. 1 1 2 лактоза 0,010,25 13. 1 1 0,1 нет 0,50,25 14. 1 1 0,5 нет 50,25 15. 1 1 1 нет 0,50,25 16. 1 1 2 нет 0,50,25 17. 2 1 0,1 IPTG 2 0,050,25 18. 2 1 0,5 IPTG 2 0,050,25 19. 2 1 1 IPTG 2 0,050,25 20. 2 1 2 IPTG 2 0,050,25 21. 2 1 0,1 IPTG 0,5 0,050,25 22. 2 1 0,5 IPTG 0,5 0,050,25 23. 2 1 1 IPTG 0,5 0,050,25 24. 2 1 2 IPTG 0,5 0,050,25 25. 2 1 0,1 лактоза 0,050,25 26. 2 1 0,5 лактоза 0,050,25 27. 2 1 1 лактоза 0,050,25 28. 2 1 2 лактоза 0,050,25 29. 2 1 0,1 нет 0,50,25 30. 2 1 0,5 нет 50,25 31. 2 1 1 нет <0,50,25 32. 2 1 2 нет 0,50,25 33. 1 2 0,1 IPTG 2 0,050,25 34. 1 2 0,5 IPTG 2 0,50,25 35. 1 2 1 IPTG 2 0,50,25 36. 1 2 2 IPTG 2 0,050,25 37. 1 2 0,1 IPTG 0,5 0,050,25 55 38. 1 2 0,5 IPTG 0,5 0,50,25 39. 1 2 1 IPTG 0,5 0,50,25 40. 1 2 2 IPTG 0,5 0,050,25 41. 1 2 0,1 лактоза 0,050,25 42. 1 2 0,5 лактоза 0,050,25 43. 1 2 1 лактоза 0,050,25 44. 1 2 2 лактоза 0,010,25 45. 1 2 0,1 нет 0,50,25 46. 1 2 0,5 нет 50,25 47. 1 2 1 нет <0,50,25 48. 1 2 2 нет 0,50,25 49. 2 2 0,1 IPTG 2 0,050,25 50. 2 2 0,5 IPTG 2 0,050,25 51. 2 2 1 IPTG 2 0,050,25 52. 2 2 2 IPTG 2 0,050,25 53. 2 2 0,1 IPTG 0,5 0,050,25 54. 2 2 0,5 IPTG 0,5 0,050,25 55. 2 2 1 IPTG 0,5 0,050,25 56. 2 2 2 IPTG 0,5 0,050,25 57. 2 2 0,1 лактоза 0,050,25 58. 2 2 0,5 лактоза 0,050,25 59. 2 2 1 лактоза 0,050,25 60. 2 2 2 лактоза 0,050,25 61. 2 2 0,1 нет 0,50,25 62. 2 2 0,5 нет 5 63. 2 2 1 нет >5 64. 2 2 2 нет 0,50,25 Температура ферментации 37С 56 Номер среды 1. Пептон, % 2. 1 1 0,5 Индуктор, мМ IPTG 2 IPTG 2 3. 1 1 1 IPTG 2 0,005 4. 1 1 2 IPTG 2 0,005 5. 1 1 0,1 IPTG 0,5 0,005 6. 1 1 0,5 IPTG 0,5 0,005 7. 1 1 1 IPTG 0,5 0,005 8. 1 1 2 IPTG 0,5 0,005 9. 1 1 0,1 <0,005 10. 1 1 0,5 лактоза лактоза 11. 1 1 1 лактоза 0,005 12. 1 1 2 лактоза <0,005 13. 1 1 0,1 <0,005 14. 1 1 0,5 нет нет 15. 1 1 1 нет <0,005 16. 1 1 2 нет <0,005 17. 2 1 0,1 <0,005 18. 2 1 0,5 IPTG 2 IPTG 2 19. 2 1 1 IPTG 2 <0,005 20. 2 1 2 IPTG 2 0,005 21. 2 1 0,1 IPTG 0,5 0,005 22. 2 1 0,5 IPTG 0,5 0,005 23. 2 1 1 IPTG 0,5 0,005 24. 2 1 2 IPTG 0,5 0,005 25. 2 1 0,1 <0,005 26. 2 1 0,5 лактоза лактоза 27. 2 1 1 лактоза <0,005 28. 2 1 2 лактоза <0,005 1 Дрожжевой NaCl, % экстракт 1 0,1 57 Выход белка, % 0,005 0,005 0,005 <0,005 <0,005 <0,005 29. 2 1 0,1 <0,005 0,5 нет нет 30. 2 1 31. 2 1 1 нет 0,005 32. 2 1 2 нет <0,005 33. 1 2 0,1 <0,005 34. 1 2 0,5 IPTG 2 IPTG 2 35. 1 2 1 IPTG 2 <0,005 36. 1 2 2 IPTG 2 <0,005 37. 1 2 0,1 IPTG 0,5 0,005 38. 1 2 0,5 IPTG 0,5 0,005 39. 1 2 1 IPTG 0,5 0,005 40. 1 2 2 IPTG 0,5 0,005 41. 1 2 0,1 <0,005 42. 1 2 0,5 лактоза лактоза 43. 1 2 1 лактоза <0,005 44. 1 2 2 лактоза <0,005 45. 1 2 0,1 <0,005 46. 1 2 0,5 нет нет 47. 1 2 1 нет 0,005 48. 1 2 2 нет <0,005 49. 2 2 0,1 <0,005 50. 2 2 0,5 IPTG 2 IPTG 2 51. 2 2 1 IPTG 2 0,005 52. 2 2 2 IPTG 2 <0,005 53. 2 2 0,1 IPTG 0,5 <0,005 54. 2 2 0,5 IPTG 0,5 0,005 55. 2 2 1 IPTG 0,5 0,005 56. 2 2 2 IPTG 0,5 <0,005 57. 2 2 0,1 лактоза <0,005 58 0,005 <0,005 <0,005 0,005 0,005 58. 2 2 0,5 лактоза <0,005 59. 2 2 1 лактоза <0,005 60. 2 2 2 лактоза <0,005 61. 2 2 0,1 <0,005 62. 2 2 0,5 нет нет 63. 2 2 1 нет 0,005 64. 2 2 2 нет <0,005 0,005 Представленные результаты оптимизации условий культивирования штамма-трансформанта TG1, несущего конструкцию pQE-PAG2, с целью повышения выхода целевого белка-антигена в нативной форме позволили предложить условия, обеспечивающие максимальный выход: культивирование при 30С в течение 16 часов на среде LB состава (г/л): протеозный пептон (Difco) – 10, дрожжевой экстракт (Difco) – 5, NaCl – 10, без добавления индуктора. Причина снижения выхода растворимого антигена при добавлении индуктора, по-видимому, заключатеся в его ускоренном накоплении в виде аморфных агрегатов вместо ратворимой нативной формы. 59 6 E. СOLI, ДЕПОНИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕГО ПРОДУКЦИИ СЛИТОГО ШТАММА МАКСИМАЛЬНЫЙ ПРОТЕКТИВНОГО УРОВЕНЬ АНТИГЕНА B. ANTHRACIS В НАТИВНОЙ ФОРМЕ В соответсвии с Договором о научно-техническом сотрудничестве в рамках ПНИЭР по теме: «Разработка методов получения иммунобиологических препаратов на основе протективного антигена Bacillus anthracis в составе гибридных частиц бактериофагов» от 14 января 2015 г, депонирование рекомбинантного штамма E. coli TG-1 (supE, hsd5, thi, (lacproAB) F'[traD36 proAB+ lacIq lacZ M15])) (номер во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-5837), полученного путём введения ДНК конструкции pQE-PAG2 во Всероссийской коллекции микроорганимзов выполнено Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Всероссийский научно- исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных» (ВНИИФБиП). Проверка штамма E. coli TG1(pQE-PAG2) после лиофилизации во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) выполнена заведующим лабораторией к.в.н. Е.С. Петраковым. Лиофилизованный штамм показал хорошую выживаемость (свыше 109 к.о.е. на ампулу) и является аутентичным штамму, переданному в ВКМ в связи с национальным депонированием. Идентификация штамма проводилась путем высева штамма на селектвиную среду LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина с последующим выделением ДНК и рестрикцией по сайтам KpnI/SacI. В результате электрофоретического анализа конструкции в 1% агарозном геле с использованием стандарта GeneRuler 1 kb (MBI Fermentas) установлено, что размер фрагментов точно соответствует ожидемому: 2214 и 3455 п.н. 60 Справка подписана заведующей отделом "Всероссийской коллекции микроорганизмов" д.б.н. Л.И. Евтушенко (142290, Московская обл., г. Пущино, проспект Науки, 5, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН). Оплата депонирования бюджетным научным проведена учреждением Федеральным государственным «Всероссийский научно- исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных» (ВНИИФБиП) за счёт средств субсидии. 61 7 РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ УРОВНЯ НАКОПЛЕНИЯ СЛИТОГО ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА B. ANTHRACIS В РЕКОМБИНАНТНЫХ ПРОДУЦЕНТАХ НА ОСНОВЕ E. СOLI В качестве способа определения выхода белка-антигена был использован электрофорез растворимой фракции клеточного лизата в денатруирующих условиях по Лэммли с иммунологическим окрашиванием продукта антителами лошади, иммунизированной жидкой сибиреязвенной вакциной производства ФКП «Орловская биофбарика». Расчетная масса продукта 45 кДа. Отработка методики заключалась в подборе процедуры определения конечного титра антигена, выявляемого антителами в фиксированном разведении. pTrPPA pQE-PAG2 Рисунок 33 - Отработка процедуры определения титра белка – производного протективного антигена Bacillus anthracis, кодируемого конструкции pTrPPA, методом иммуноблоттинга. На дорожки геля нанесен лизат с содержанием общего белка (пг): 62 1) 1 000 000, 2) 1 00 000, 3) 10 000, 4) 1 000, 5) 100, 6) 10 000, 7) 1 000 9) 10 К-) – лизат E. coli TG1 (pQE30), содержание общего белка 1 000 000 пг. К+) – лизат E. coli TG1 (pQE-PAG2), содержание общего белка 1 000 пг Разработанная в итоге лабораторная методика обеспечивает полуколичественное определение слитого протективного антигена Bacillus anthracis на основании установления предельного разведения (титра) белка в составе лизата рекомбинантного продуцента, дающего положительную иммунологическую реакцию. Для повышения устойчивости измеряемого сигнала измерения выполняют в варианте иммуноблоттинга, где целевой белок отделяется от примесей с помощью денатурирующего электрофореза. Определение включает следующие стадии: 7) Получение биомассы рекомбинантного штамма E. coli, обладающего способностью к продукции ВПЧ; 8) Съём и дезинтеграция биомассы; 9) Определение общего белка в образцах; 10) Приготовление образцов и проведение денатурирующего электрофореза; 11) Перенос белков на мембрану и проведение иммунохимического окрашивания; 12) Оценка результата и составление отчета. 63 8 РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ УРОВНЯ НАКОПЛЕНИЯ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ Разработанная в рамках ПНИ оригинальная лабораторная методика определения выхода вирусоподобных частиц (ВПЧ) основана на использовании гель-хроматографии растворимой фракции клеточного лизата в микроколонках с Sephadex G-100 с последующим определением во фракции элюата (свободного объёма) содержания нуклеиновых кислот по поглощению в ультрафиолетовой области при =260 нм. При выполнении разработке методики были решены следующие задачи: 1. Отработан метод обработки лизата пакреатической ДНКазой и РНКазой для удаления примесей клеточной ДНК и РНК, препятствующих спектрофотометрическому измерению концентрации ВПЧ; 2. Отработан метод нормировки сигнала на примесные концентрации свободных белков и нуклеиновых кислот, для чего был введен принцип использования внешнего стандарта – штамма E. coli, несущего нерекомбинантный вектор pQE30. 3. Подобрано оптимальное количество растворимой фракции клеточного лизата, обеспечивающего максимально полное удаление примесных белков и нуклеиновых кислот, а также объем нанесения образца в колонку. Для повышения разрешающей споосбность гельхроматографии в микроколонках был отработан метод концентрирования растворимой клеточной фракции осаждением сульфатом аммония. 4. В качестве рабочего метода оценки эффективности разрешения гель-хроматографии использовался денатруирующий электрофорез по Лэммли с выявлением целевого белка массой 45 кДа на фоне примесных белков E. coli. 64 Рисунок 34 - Подбор оптимального объёма нанесения образца растворимой клеточной фракции штамма E. coli TG1, несущего конструкцию pTrPPA и нерекомбинантный вектор pQE30 На дорожки геля нанесены элюаты, полученные при нанесении на микроколонку полным объемом 1 мл образцов сконцентрированной растворимой клеточной фракции лизатов с содержанием общего белка 2 мкг при объеме нанесения: 1) Конструкция pTrPPA, 200 мкл; 2) Конструкция pTrPPA, 400 мкл; 3) Конструкция pTrPPA, 800 мкл; 65 4) Конструкция pQE30, 200 мкл; 5) Конструкция pQE30, 400 мкл; 6) Конструкция pQE30, 800 мкл. 66 9 ПРОВЕДЕНИЕ РАБОТ, НАПРАВЛЕННЫХ НА ОСВЕЩЕНИЕ И ПОПУЛЯРИЗАЦИЮ В ходе второго этапа выполнения ПНИЭР проводилась работа по доведению информации о проекте до общественности. Эта работа выполнялась путем включения сведений о задачах и результатах проекта в образовательные курсы, проводимые участниками ПНИЭР, а также в ходе контактов со средствами массовой информации. Результаты ПНИЭР были отражены в лекциях по микробиологии, читаемых для старших школьников, интересующихся биологией в рамках работы куржков при ГБОУ «Школа-интернат «Интеллектуал» (М.А. Летарова), в курсах биохимии (Е.Е. Куликов) и молекулярной микробиологии (А.В. Летаров), читаемых для студентов МФТИ. Кроме того, результаты были А.В. Летаровым на отражены в конференции приглашенной «Ломоносов» лекции, в МГУ прочитанной на секции «Микробиология» 15 апреля 2015 г. По итогам интервью, данным представителям СМИ, появились две статьи в интернет – изданиях, популяризирующих как саму научнотехническую идею проекта и достигнутые на момент интервью результаты, так и актуальность задачи создания новых средств борьбы с бактериальными заболеваниями. «Российские ученые создают белковую вакцину» http://strf.ru/material.aspx?CatalogId=222&d_no=93113#.VYaELlWqqko «Антибиотики и бактерии. Гонка вооружений» http://www.svoboda.org/content/article/26858306.html 67 Кроме этого возможности подхода к решению данной задачи с использованием генно-инженерных технологий (которые и лежат в осове выполняемых ПНИЭР) были обсуждены в научно-популярной телевизионной передаче «На грани безумия. Синтетическая жизнь» на канале ОТР, снятой с участием А.В. Летарова http://www.otr-online.ru/programmi/sinteticheskaya-zhizn-38957.html Исполнители проекта также приняли участие в работе над научнопопулярным фильмом «Бактерии» производства ООО «Медиа-Контакт» удостоверение национального фильма № 24614 выход которого планируется в конце 2015 г. (1 канал). В результате проведенной работы широкая общественность получила информацию о важности развития современных средств контроля бактериальных заболеваний, особенно с учетом распространяющейся резистентности их возбудителей к антибиотикам. Особое внимание уделено возможностям в данной области генно-инженерных технологий, предприняты усилия к преодолению необоснованных опасений граждан, связанных с применением в медицине и ветеринарии рекомбинантных микроорганизмов. Наконец, представители общественности, имеющие особый интерес к данной тематике, получили возможность ознакомиться с ходом проекта в популярной интерпретации. 68 МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ 10 ОБЕСПЕЧЕНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТ ЭТАПА Материально-техническое обеспечение, осуществленное в соответствии с Планом-графиком и Техническим заданием за счет привлекаемых внебюджетных средств, при выполнении прикладных научных исследований (проекта) по теме: «Разработка методов получения иммунобиологических препаратов на основе протективного антигена Bacillus anthracis в составе гибридных частиц бактериофагов» этапа №2 по Соглашению от «28» ноября 2014 г. № 14.607.21.0093 составило 2 917 497,26 рублей. Индустриальным партнёром ПНИЭР ФКП «Орловская биофабрика» за счет собственных (внебюджетных) средств были проведены разработка методики количественной оценки уровня накопления слитого протективного антигена B. anthracis в рекомбинантных продуцентах на основе E. coli и разработка методики количественной оценки уровня накопления вирусоподобных частиц на сумму 2 917 497,26 рублей. Затраты были связаны с закупкой материалов для проведения ферментаций бактериальных штаммов, проведенных в интересах проекта. Переданные материалы предназначены для выполнения работ по пунктам 2.7, 2.8, 2.9, предусмотренных Планом-графиком к Соглашению от «28» ноября 2014 г. № 14.607.21.0093 о предоставлении субсидии, а также пунктом 2.10 «Материально-техническое обеспечение выполнения работ этапа». Материально-техническое обеспечение полностью соответствует требованиям Технического задания к Соглашению о предоставлении субсидии от «28» ноября 2014 г. № 14.607.21.0093 индустриальным партнером. 69 и Договора с ЗАКЛЮЧЕНИЕ Исследования по ПНИЭР «Разработка методов получения иммунобиологических препаратов на основе протективного антигена Bacillus anthracis в составе гибридных частиц бактериофагов» на 2 этапе работ выполнены в полном объёме в соответствии с Планом-графиком и требованиями Технического задания Соглашения № 14.607.21.0093 от «28» ноября 2014 г. Работа по отчетному периоду была направлена на реализацию ранее принятых решений по созданию новой технологии промышленнного получения вирусо-подобных частиц, несущих на поврехности антиген Bacillus anthtracis. Уделялось внимание требованиям к технологии в части экономической эффективности, простоты и высокой технологической устойчивостью. Основной научно-технической задачей являлось обспечение свойства суперантигенности – повышенной иммуногенностью полимеризованного антигена по сравнению с его растворимой формой, сопоставимое с иммуногенностью природных вирусных частиц. В течение отчетного периода работы были получены следующие наиболее важные результаты, удовлетворяющие требованиям Технического задания: 1. В соответствии с требованиями пунктов 3.6 и 6.1.6 ТЗ выполнен скрининг коллекции (16 изолятов) с целью отбора патентно-чистых бактериофагов, пригодных для дисплея антигена на поверхностных белках вириона и/или содержащих гены полимеризующихся белков, пригодных в качестве скаффолда для дисплея антигенов. 2. Получены две экспрессионные конструкции pTTPx (белок трубки хвоста Т5-подобного бактериофага DT5C) и pTrP (белок, терминирующий хвост, Т5-подобного бактериофага DT5C) на базе вектора pET28a (Novagen), обеспечивающие продукцию в клетках E.coli белков бактериофагов, потенциально пригодных для дисплея 70 антигенов на вирусоподобных частицах (в соответствии с требованиями п. 3.7, 4.13, 4.2.2, 6.1.8 ТЗ). 3. Получена продукцию экспрессионная конструкция, полимеризующегося белка обеспечивающая бактериофага порядка Caudovirales, слитого с целевым антигена PAG20 (в соответствии с требованиями п. 3.7, 4.2.2, 6.15 ТЗ). 4. Путм скрининга 20 единиц хранения ВКПМ проведен подбор (селекция) штамма E.coli для обеспечения максимального уровня продукции вирусоподобных частиц (в соответствии с требованиями п. 4.2.3 ТЗ). Наилучшие показатели по сравлнению с другими штаммами дал штамм TG1. 5. Отработаны условия культивирования рекомбинантных продуцентов на основе E. coli, обеспечивающие максимальный уровень продукции слитого протективного антигена B. anthracis в нативной форме – свыше 5% (в соответствии с требованиями п. 4.1.2 ТЗ) 6. Соисполнителем ПНИЭР ФГБНУ ВНИИФБиП выполнено депонирование рекомбинантного штамма E. сoli, обеспечивающего максимальный уровень продукции слитого протективного антигена B. anthracis в нативной форме, во Всероссийской коллекции микрорганизмов (в соответствии с требованиями п. 3.10 и 6.1.11 ТЗ). 7. За счет внебюджетных средств разработана методика количественной оценки уровня накопления слитого протективного антигена B. anthracis в рекомбинантных продуцентах на основе E. coli (в соответствии с требованиями п. 2.8, 3.16 и 6.1.12 ТЗ). 8. За счет внебюджетных средств разработана методика количественной оценки уровня накопления вирусоподобных частиц (в соответствии с требованиями п. 3.17 и 6.1.13 ТЗ). 9. За счет внебюджетных средств проведены работы, направленные на освещение и популяризацию промежуточных результатов ПНИЭР. 71 10.Проведено материально-техническое обеспечение выполнения работ этапа за счет внебюджетных средств индустриального партнера ПНИЭР. Область применения: В настоящее время существует необходимость в создании вакцины против сибирской язвы для крупного рогатого скота и северного оленя, производство которой будет экономически эффективным и безопасным, при этом выработка иммунного ответа будет обеспечивать пожизненный иммунитет привитых животных. Вакцина, адаптированная для использования в отдаленных и труднодоступных районах РФ, в частности, на Крайнем Севере, должна обладать повышенным сроком хранения без утраты иммуногенной активности. Помимо этого, для снижения себестоимости производства, предотвращения риска заражения людей и животных производственными штаммами желательно использовать полностью безопасные микроорганизмы, трансформация которых генетическими конструкциями, несущими гены ключевых антигенов B. anthracis, позволит получить высокоэффективную субъединичную рекомбинантную вакцину против сибирской язвы сельскохозяйственным животным. Планируемые к разработке в рамках проекта способы получения комплексных препаратов, в частности, разработанная технологическая документация (лабораторный регламент) на изготовление экспериментального образца комплексной вакцины, позволят перейти к стадии доклинических испытаний разработки. Основным типом потребителя разработки представляются крупные и средние биофабрики, обладающие опытом производства и испытания вакцин против особо опасных инфекций и дистрибьютерской сетью. Примерами таких предприятий могут служить ФКП «Щелковский биокомбинат» и ФКП «Орловская биофабрика». Помимо этого, производство вакцины может быть 72 организовано на мощностях небольших компаний биотехнологического профиля, обладающих мощностями по производству сухой стерильной биомассы и имеющих сертификаты и лицензии на производство парентеральных лечебных препаратов ветеринарного назначения. 73 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Letarov AV, Golomidova AK, Tarasyan KK. Ecological basis for rational phage therapy. Acta Naturae. 2010 Apr;2(1):60-72. 2. Letarov A1, Kulikov E. The bacteriophages in human- and animal body- associated microbial communities. J Appl Microbiol. 2009 Jul; 107(1):1-13. doi: 10.1111/j.1365-2672.2009.04143.x. Epub 2009 Feb 23. 3. Miernikiewicz P, Owczarek B, Piotrowicz A, Boczkowska B, Rzewucka K, Figura G, Letarov A. et al. Recombinant expression and purification of T4 phage Hoc, Soc, gp23, gp24 proteins in native conformations with stability studies. PLoS One. 2012; 7(7):e38902. doi: 10.1371/journal.pone.0038902. Epub 2012 Jul 13. 4. Miernikiewicz P, Dąbrowska K, Piotrowicz A et al. T4 phage and its head surface proteins do not stimulate inflammatory mediator production. PLoS One. 2013 Aug 16;8(8):e71036. doi: 10.1371/journal.pone.0071036. eCollection 2013. 5. Berche P. Louis Pasteur, from crystals of life to vaccination. Clin Microbiol Infect. 2012 Oct; 18 Suppl 5:1-6. 6. Liu S, Moayeri M, Leppla SH. Anthrax lethal and edema toxins in anthrax pathogenesis. Trends Microbiol. 2014 Jun; 22(6):317-25. 7. Zakowska D, Bartoszcze M, Niemcewicz M, Bielawska-Drózd A, Kocik J. New aspects of the infection mechanisms of Bacillus anthracis. Ann Agric Environ Med. 2012; 19(4):613-8 8. Шулепов Д.В. 2009 Аспорогенный рекомбинантный штамм Bacillus anthracis – продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба. Автореферат канд. дисс. ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов. 9. Wang HC, An HJ, Yu YZ, Xu Q. Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors. Immunol Lett. 2014 Aug 4. pii: S0165-2478(14)00152-7. 10. Liu S, Zhang Y, Hoover B, Leppla SH. The receptors that mediate the direct lethality of anthrax toxin. Toxins (Basel). 2012 Dec 27; 5(1):1-8. 74 11. Lowe DE, Glomski IJ. Cellular and physiological effects of anthrax exotoxin and its relevance to disease. Front Cell Infect Microbiol. 2012 Jun 1; 2:76. doi: 10.3389/fcimb.2012.00076. 12. Dhasmana N, Singh LK, Bhaduri A, Misra R, Singh Y. Recent Developments in Anti-dotes Against Anthrax. Recent Pat Antiinfect Drug Discov. 2014 Aug 30. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 25174439. 13. Kaur M, Singh S, Bhatnagar R. Anthrax vaccines: present status and future prospects. Expert Rev Vaccines. 2013 Aug; 12(8):955-70. 14. Garman L, Smith K, Farris AD, Nelson MR, Engler RJ, James JA. Protective antigen-specific memory B cells persist years after anthrax vaccination and correlate with humoral immunity. Toxins (Basel). 2014 Aug 13; 6(8):2424-31 15. Petosa C, Collier RJ, Klimpel KR, Leppla SH, Liddington RC. Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen. Nature. 1997 Feb 27; 385(6619):833-8. 16. Santelli E, Bankston LA, Leppla SH, Liddington RC. Crystal structure of a complex between anthrax toxin and its host cell receptor. Nature. 2004 Aug 19; 430(7002):905-8. 17. Feld GK, Thoren KL, Kintzer AF, Sterling HJ, Tang II, Greenberg SG, Williams ER, Krantz BA. Structural basis for the unfolding of anthrax lethal factor by protective antigen oligomers. Nat Struct Mol Biol. 2010 Nov; 17(11):1383-90. 18. Rezaee M, Honari H, Kooshk MR. Cloning, expression and purification of binding domains of lethal factor and protective antigen of Bacillus anthracis in Escherichia coli and evaluation of their related murine antibody. Mol Biol Rep. 2014 Apr; 41(4):2445-52. 19. Ma Y, Yu YZ, Zhu YF, Xu Q, Sun ZW. In vitro and in vivo activities of recombinant anthrax protective antigen co-expressed with thioredoxin in Escherichia coli. Hum Vaccin Immunother. 2013 Nov; 9(11):2371-7. 20. Abboud N, Casadevall A. Immunogenicity of Bacillus anthracis protective antigen domains and efficacy of elicited antibody responses depend on host genetic 75 background. Clin Vaccine Immunol. 2008 Jul;15(7):1115-23. doi: 10.1128/CVI.00015-08. 21. United States Patent: 20020034512. Method of making a vaccine // Ivins В., Worsham P., Friedlander A., Farchaus J., Welkos S. - №520215. - 07.03.00. 21.03.2002. 22. Reason DC, Ullal A, Liberato J, Sun J, Keitel W, Zhou J. Domain specificity of the human antibody response to Bacillus anthracis protective antigen. Vaccine. 2008 Jul 29; 26(32):4041-7. 23. Тедиков В.М., Добрица А.П. Клонирование и экспрессия детерминанты протективного антигена Bacillus anthracis в клетках Escherichia coli, Bacillus subtilis и Bacillus anthracis // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1993. - №2. - С.13-16. 24. Chroboczek J, Szurgot I, Szolajska E. Virus-like particles as vaccine. Acta Biochim Pol. 2014; 61(3):531-9. 25. Zeltins A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 2013 Jan; 53(1):92-107. 26. Manayani DJ, Thomas D, Dryden KA, Reddy V, Siladi ME, Marlett JM, Rainey GJ, Pique ME, Scobie HM, Yeager M, Young JA, Manchester M, Schneemann A. A viral nanoparticle with dual function as an anthrax antitoxin and vaccine. PLoS Pathog. 2007 Oct 5; 3(10):1422-31. 27. Ebrahimizadeh W, Rajabibazl M. Bacteriophage vehicles for phage display: biology, mechanism, and application. Curr Microbiol. 2014 Aug; 69(2):109-20. 28. Rakonjac J, Bennett NJ, Spagnuolo J, Gagic D, Russel M. Filamentous bacteriophage: biology, phage display and nanotechnology applications. Curr Issues Mol Biol. 2011; 13(2):51-76. 29. Marvin DA, Symmons MF, Straus SK. Structure and assembly of filamentous bacteriophages. Prog Biophys Mol Biol. 2014 Apr; 114(2):80-122. 30. Danner S, Belasco JG. T7 phage display: a novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Nov 6; 98(23):12954-9. 76 31. Gan L, Speir JA, Conway JF, Lander G, Cheng N, Firek BA, Hendrix RW, Duda RL, Liljas L, Johnson JE. Capsid conformational sampling in HK97 maturation visualized by X-ray crystallography and cryo-EM. Structure. 2006 Nov; 14(11):1655-65. 32. Fokine A, Rossmann MG. Molecular architecture of tailed double-stranded DNA phages. Bacteriophage. 2014 Jan 1; 4(1):e28281. Epub 2014 Feb 21. Review. PubMed PMID: 24616838. 33. Fokine A, Islam MZ, Zhang Z, Bowman VD, Rao VB, Rossmann MG. Structure of the three N-terminal immunoglobulin domains of the highly immunogenic outer capsid protein from a T4-like bacteriophage. J Virol. 2011 Aug; 85(16):8141-8. doi: 10.1128/JVI.00847-11. 34. Barr JJ, Auro R, Furlan M, Whiteson KL, Erb ML, Pogliano J, Stotland A, Wolkowicz R, Cutting AS, Doran KS, Salamon P, Youle M, Rohwer F. Bacteriophage adhering to mucus provide a non-host-derived immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Jun 25; 110(26):10771-6. 35. Shivachandra SB, Li Q, Peachman KK, Matyas GR, Leppla SH, Alving CR, Rao M, Rao VB. Multicomponent anthrax toxin display and delivery using bacteriophage T4. Vaccine. 2007 Jan 26; 25(7):1225-35. 36. Gamkrelidze M, Dąbrowska K. T4 bacteriophage as a phage display platform. Arch Microbiol. 2014 Jul; 196(7):473-9. 37. Fraser JS, Yu Z, Maxwell KL, Davidson AR. Ig-like domains on bacteriophages: a tale of promiscuity and deceit. J Mol Biol. 2006 Jun 2; 359(2):496-507. 38. Minot S, Grunberg S, Wu GD, Lewis JD, Bushman FD. Hypervariable loci in the human gut virome. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Mar 6; 109(10):3962-6. 39. Casjens SR, Molineux IJ. Short noncontractile tail machines: adsorption and DNA delivery by podoviruses. Adv Exp Med Biol. 2012;726:143-79. 77