Использование новых генетических маркеров для слежения за

АНАЛИЗ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ МУТАЦИЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ
УСТОЙЧИВОСТИ К ИНГИБИТОРАМ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1 СРЕДИ ПАЦИЕНТОВ
ГОРОДА МОСКВЫ
Лаповок И.А., Лага В.Ю., Васильев А.В., Саламов Г.Г., Казеннова Е.В., Бобкова М.Р.
НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва, Россия
Введение. За десятилетия, минувшие с момента открытия вируса иммунодефицита
человека первого типа (ВИЧ-1), одним из наиболее важных достижений в борьбе с ВИЧинфекцией стал прогресс в области антиретровирусной терапии (АРТ). Однако
антиретровирусная терапия, в то же время, является мощным фактором отбора,
действующим на непрерывно меняющуюся вирусную популяцию и благоприятствующим
отбору вариантов вируса, которые смогли приспособиться к размножению в присутствии
противовирусных препаратов. Этот факт диктует необходимость в постоянном
совершенствовании существующих подходов АРТ и в поиске новых ингибиторов ВИЧ-1.
Новым перспективным классом АРТ–препаратов являются ингибиторы вирусной
интегразы (ИИН). Они отлично зарекомендовали себя в клинических испытаниях, в том
числе - против вирусов со множественной лекарственной устойчивостью. Это позволяет
использовать препараты данной группы для «спасательной терапии» ВИЧинфицированных, когда в организме пациента присутствуют устойчивые варианты
вируса, не чувствительные к другим классам препаратов.
Из химических соединений, способных ингибировать активности интегразы ВИЧ-1
лучше всего себя зарекомендовали два соединения: ралтегравир (RAL, MK-0518) и
элвитегравир (ELV, GS-9137). Оба этих препарата действуют преимущественно на
реакцию переноса донорской (провирусной) ДНК цепи на акцепторную (клеточную) ДНК.
Под действием этих препаратов, вырабатываются устойчивые к ним вирусы. В
случае ралтегравира было описано три основных пути достижения устойчивости:
1. Первичная мутация N155H с возможным существованием дополнительных
мутаций L74M, E92Q, V151I, T97A, G163R.
2. Первичная мутация Q148K/R/H с возможными дополнительными мутациями
E138K, G140A/S.
3. Первичная мутация Y143H/R/C с возможным существованием дополнительных
мутаций L74A/I, E92Q, I203M, S230R.
Для элвитегравира существуют два основных пути достижения устойчивости
1. Мутация E92Q с возможным существованием мутаций H51Y, S147G и E157Q.
2. Мутация T66I с возможными дополнительными мутациями F121Y и S153Y.
Проведение анализа на наличие и распространение описанных мутаций является
важной частью эпидемиологического мониторинга ВИЧ-инфекции и необходимой
работой для прогнозирования эффективности применения препаратов в терапии.
Цели и задачи. В связи со всем вышесказанным целью настоящего исследования
было изучение полиморфизма области гена pol, кодирующей интегразу ВИЧ-1, у
пациентов г. Москвы и определение частоты распространения в пределах исследованной
группы мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ-1 к препаратам ралтегравир и
элвитегравир.
Материалы и методы. Была подобрана панель из образцов мононуклеарных клеток
периферической крови и сыворотки крови, полученных от 36 пациентов из г. Москвы.
Предварительный анализ гена env показал, что по области этого гена 19 образцов (52,78%)
принадлежали к вирусу подтипа А1, а 17 (47,22%) – к подтипу B.
Для амплификации области провирусной ДНК, кодирующей белок интегразу с 1 по
254 аминокислоту проводили реакцию гнездовой ПЦР, после чего осуществляли
автоматическое секвенирование. Последовательности сравнили с последовательностями и
консенсусами ВИЧ-1 группы М из базы GeneBank. Филогенетический анализ
нуклеотидных последовательностей проводили с помощью метода "ближайших соседей" с
использованием пакета программ MEGA3.1. Работу по определению подтипа вируса по
исследуемой области генома проводили в on-line программах COMET v0.1
(http://comet.retrovirology.lu/) и REGA v2.0 (http://dbpartners.stanford.edu/RegaSubtyping/).
Основные результаты. В 92 построениях из 100 все анализированные образцы,
предварительно отнесенные к подтипу А1, кластеризовались на одной ветви
филогенетического древа с изолятами ВИЧ-1 варианта IDU-A подтипа A1, выделенными
на территории России и стран СНГ. Все исследованные образцы подтипа B в 79
построениях из 100 кластеризовались совместно с изолятами подтипа B, выделенными в
других странах.
Полученные последовательности были проанализированы в on-line программах для
генотипирования REGA v0.1 и COMET v2.0. Данные филогенетического анализа
полностью подтверждались анализом в COMET. При использовании программы REGA не
удалось получить результат генотипирования для 7 (19,4%) образцов. Все 7 образцов по
результатам предварительного анализа гена env, филогенетического анализа и
исследования в программе COMET относились к подтипу B. Таким образом, частота
неопределенного результата при генотипировании в программе REGA исследованных
российских образцов подтипа B составила 41,2%.
При анализе полученных нуклеотидных последовательностей основных замен,
связанных с лекарственной устойчивостью вируса к ИИН (в положениях 155, 148, 143, 92
и 66) обнаружено не было. Замена L74I, часто сочетающаяся с мутациями Y143H/R/C,
присутствовала во всех образцах подтипа A1.
Все полученные и исследованные в ходе работы последовательности депонированы
в GeneBank (номера HM466977 – HM467012)
Выводы. Результаты филогенетического и генотипического анализа области гена
pol, кодирующей интегразу ВИЧ-1 в исследуемых образцах подтипа A1 подтверждают
принадлежность исследуемых образцов подтипа А1 к варианту IDU-A, доминирующему в
России.
Тот факт, что 7 из 17 образцов подтипа B не были генотипированы в программе
REGA, вероятнее всего, связан с недостатком информации о российских образцах в
Стэндфордской базе данных. В связи с этим можно сделать вывод о том, что применение
данной программы для генотипирования вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России
менее эффективно, чем применение программы COMET.
Отсутствие среди исследованной группы пациентов наиболее значимых мутаций
лекарственной устойчивости к ингибиторам интегразы позволяет прогнозировать
потенциальную эффективность применения данных препаратов в схемах ВААРТ среди
пациентов г. Москвы.
Полученные нами данные о 100%-ной распространенности в пределах исследуемой
группы образцов варианта IDU-A мутации L74I позволяют предположить, что в случае
применения препарата ралтегравир наиболее вероятным путем достижения устойчивости
к нему будет путь накопления мутаций Y143H/R/C.
Данная работа выполнена при финансовой поддержке Седьмой рамочной
программы Европейского Союза по проекту: «Collaborative HIV and Anti-HIV Drug
Resistance Network (CHAIN)» № 223131 и Международного Научно-технического Центра
(МНТЦ), проект №3826.