Измерение механических и кинетических характеристик изолированных

Измерение механических и кинетических характеристик изолированных
молекул сердечного миозина с помощью оптической ловушки
С.Р. Набиев и С.Ю. Бершицкий
Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург
Миозин – это молекулярный биологический мотор, совершающий механическую работу за
счет химической энергии гидролиза АТФ. Мышечный миозин II является димером и
обеспечивает сокращение скелетных, сердечной и гладких мышц. Каждый мономер миозина
состоит из одной тяжелой и двух легких цепей [1]. Каждая тяжелая цепь содержит глобулярный
каталитический, или моторный, домен, который и обеспечивает моторную функцию белка.
В сердечной мышце имеется две изоформы миозина, отличающиеся разными типами
тяжелых цепей (ТЦ): -ТЦ и -ТЦ [2]. Соотношение этих изоформ зависит от вида,
возраста и гормонального состояния животного [3-4]. У мелких взрослых млекопитающих
(крыса, мышь) превалирует быстрая изоформа миозина – -ТЦ, называемая мышечным
миозином V1. Мышечный миозин V3 – гомодимер -ТЦ, или медленный миозин,
преобладает у крупных млекопитающих [5], в том числе и у человека [6].
При большинстве сердечных патологий, вызванных перегрузкой давлением или объемом сердца,
обнаруживается сдвиг в составе изоформ миозина [7]. Функциональные свойства сердечных
изоформ миозина исследовались, главным образом, на сердечной ткани грызунов. Например,
было найдено, что актин-активируемая ATPазная активность V1, выделенного из левого
желудочка крысы или кролика, в 2–3 раза выше, чем у V3 [8]. В экспериментах на искусственной
подвижной системе (in vitro motility assay) было показано, что скорость ненагруженного
движения актиновой нити по поверхности, покрытой изомиозином V1 в 2–3 раза большей, чем
для изомиозина V3 [9-10]. Различия в средней изометрической силе между двумя изоформами
миозина зависят от вида животных: так у крыс сила, развиваемая этими изоформами, была
одинаковой [11], а у кроликов миозин V3 развивает силу в два раза большую, чем миозин V1[10].
Для исследования функциональных свойств одиночных молекул изоформ сердечного миозина мы
использовали метод оптической ловушки [12-15]. Схема эксперимента показана на рис. 1.
Чистые изоформы сердечных изомиозинов V1 и V3 получали из левых желудочков сердец
гипер- и гипотиреоидных кроликов. Миокард левого желудочка гипертиреоидных кроликов
содержит преимущественно изоформу миозина V1, гипотиреоидных – изоформу V3. Для
получения чистых изоформ сердечных миозинов кролики подвергались медикаментозной
обработке [16]. Использовались стандартные методики получения и хранения сократительных
белков [17]. Чистоту изоформ проверяли гель-электрофорезом.
Положение объекта в ловушке
60
положение, нм
40
20
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
-20
-40
-60
время, мс
Рис. 1. Концы нити актина длиной в несколько микрон
крепятся к 1 мкм полистироловым шарикам, которые
удерживаются двумя лучами ИК лазера вблизи
покрытой миозином поверхности проточной камеры с
фиксированными на ней стеклянными шариками
диаметром 2 мкм, образующими пьедесталы на
поверхности [13].
Рис. 2. Пример экспериментальной записи
отклонений
микросферы
из
центрального
положения при кратковременных присоединениях
молекулы миозина к актиновой нити. Сигнал
записан с частотой 5 кГц.
В экспериментах на оптической ловушке концентрация миозина, загружаемого в
экспериментальную ячейку была 3-6 мкг/мл. Все экспериментальные записи получены при
концентрации АТФ 5 мкМ. Пример экспериментальной записи показан на рис. 2.
Были измерены «рабочие шаги» двух изоформ сердечного миозина (рис. 3), а также его кинетические параметры: среднее время, которое изоформы проводят в присоединенном к актину
состоянии (рис. 4), а также средняя вероятность пребывания молекулы миозина в
присоединенном к актину состоянии.
Распределение длительностей событий для сердечных
изоформ миозина
Средний размер рабочего шага сердечных миозинов
250
100
80
V3
V1
60
-20
-10
V1
150
Экспоненци
альный (V3)
Экспоненци
альный (V1)
100
50
0
50
100
150
200
250
300
время, мс
20
-30
V3
200
0
40
0
-40
Число событий
Нормированное число
событий
120
0
10
20
30
40
50
60
Положение, нм
Рис. 3 Сравнение среднего рабочего шага изоформ
сердечного миозина. Шаг для изоформы V1
составил 8±4 нм, для изоформы V3 – 10±2 нм.
Рис. 4 Распределение длительностей событий
(присоединенное
состояние
миозина)
для
сердечных изоформ миозина. Среднее время
нахождения миозина в присоединенном состоянии
определяют
как
обратный
показатель
экспоненциального распределения. Среднее время
присоеди-ненного
состояния
для
изоформы
миозина V1 составило 46.2±11 мс, а для изоформы
V3 58.6±12 мс.
Среднюю вероятность пребывания молекулы миозина присоединённом к актину состоянии
определяли как отношение суммарного времени присоединённого состояния в течение одной
записи, к длительности всей записи. Для изоформы V1 средняя вероятность составила 6.9±2.5%, а
для изоформы V3 – 10.6±3.9%.
Достоверные отличия были обнаружены только в средней длительности событий, то есть,
в среднем времени пребывания молекулы миозина в присоединённом к актиновой нити
состоянии. Изоформа V1 находится в этом состоянии меньше времени, чем изоформа V3,
что согласуется с данными по измерению скорости движения актиновых нитей по этим
изоформам миозина в in vitro экспериментах.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Weeds A.G. and Lowey S. (1971). J. Mol. Biol. 61: 701—725.
2. Hoh J.F.Y., Yeoh G.P.S., Thomas M.A.W. and Higgenbottom L. (1979). FEBS Lett. 97: 330—334.
3. Everett A., Sinha A., Umeda P., Jakovcic S., Rabinowitz M., Zak R. (1984). Biochemistry 23: 1596—1599.
4. Lompre A.M., Nadal-Ginard B., Mahdavi V. (1984). J. Biol. Chem. 259: 6437—6446.
5. Hamilton N. and Ianuzzo C.D. (1991). Mol. Cell. Biochem. 106: 133—141.
6. Mercadier J.J., Bouveret P., Gorza L., Schiaffino S., Clark W.A., Zak R., Swynghedauw B. and Schwartz K.
(1983). Circ. Res. 53: 52—62.
7. Litten R.Z., Martin B.J., Low R.B. and Alpert N.R. (1982). Circ. Res. 50: 856—864.
8. Pope B., Hoh J.F.Y. and Weeds A. (1980). FEBS Lett. 118: 205—208.
9. Sata M., Sugiura S., Yamashita H., Momomura, S., Serizawa, T. (1993). Circ. Res. 73: 696–704.
10. VanBuren, P., Harris, D.E., Norman, R.A., and Warshaw, D.M. (1995). Circ. Res. 77: 439–444.
11. Malmqvist U.P., Aronsham A. and Lowey S. (2004). Biochemistry 43: 15058–15065.
12. Ashkin A. (1970). Phys. Rev. Lett. 24:156-159.
13. Finer J.T., Simmons R.M., Spudich J.A. (1994). Nature 368:113-118.
14. Svoboda K., Block S.M. (1994). Cell 77:773-784.
15. Набиев С.Р., Д.А. Овсянников, Б.Ю. Бершицкий, С.Ю. Бершицкий. (2008). Оптическая ловушка как
инструмент для исследования моторных белков. Биофизика, 53.6, с.929-935.
16. Никитина Л.В., Копылова Г.В., Щепкин Д.В., Кацнельсон Л.Б. (2008). Биохимия 73:178-184.
17. Margossian, S.S., and Lowey, S. (1982) Meth. Enzymol., 85: 55–71.