Е.М. Соколова, Т.Н. Руднева Эритроциты как модельная система в исследованиях биядерных тетранитрозильных комплексов железа - доноров оксида азота Установление роли оксида азота в качестве сигнального регулятора сердечнососудистой системы организма одновременно акцентировало внимание на его участии в возникновении многих сердечно-сосудистых патологий. Было доказано, что в развитии таких заболеваний как стенокардия, атеросклероз, многие виды тромбозов присутствует общая патогенетическая составляющая, связанная с недостаточностью ферментативного синтеза NO из его естественного субстрата L-аргинина. При этом оказалось, что уже более столетия, используемые в кардиологии препараты, такие как нитроглицерин, попадая в организм, разлагаются с выделением оксида азота, что и определяет их фармакологическое действие в качестве экзогенных источников оксида азота. Многолетнее использование органических нитратов в клинической практике выявило у них ряд серьезных недостатков, связанных с развитием толерантности. В настоящее время в Лаборатории структурной химии (при непосредственном участии соавтора данной работы Т.Н. Рудневой) синтезированы представители нового класса экзогенных доноров оксида азота биядерные тетранитрозильные комплексы железа (Б-ТНКЖ) с тиолсодержащими лигандами на основе азагетероциклических тиолов и алифатических тиоаминов. Выделение оксида азота указанными комплексами не требует какого-либо внешнего воздействия и происходит в ходе спонтанной гидролитической диссоциации. К настоящему времени синтезировано уже более 30 таких комплексов. В то же время, реализация химически обусловленной NO-донорной активности в условиях организма сталкивается с проблемами, требующими проведения биохимических и клинико-фармакологических исследований. В связи с этим изучение взаимодействия Б-ТНКЖ с биосубстратами и донирование ими оксида азота непосредственно в биологических средах представляет собой актуальное научное направление, имеющее несомненное практическое значение. В ИПХФ РАН его развитие осуществляется силами нескольких лабораторий, включая Лабораторию кинетического моделирования, которую представляет докладчик работы. Как известно, характерным местом реализации фармакологического эффекта доноров NO являются кровеносные сосуды, заполненные кровью, клеточная фракция которой на 90 % состоит из эритроцитов. В связи с этим в данной работе мы использовали суспензию эритроцитов в качестве модельной клеточной среды, в которой реализуется фармакологический эффект доноров оксида азота в отношении середечно-сосудистой системы. Данный подход позволяет решать задачи трех типов: 1. Количественно анализировать NO-донирующую способность Б-ТНКЖ в клеточной среде. 2. Исследовать метаболические превращения оксида азота в эритроцитах. 3. Исследовать цитотоксические свойства оксида азота. В данном докладе представлены результаты исследований в рамках первой из указанных задач: изучение влияния клеточной среды на кинетику донирования оксида азота пятью Б-ТНКЖ, содержащими в качестве S-лигандов 2-меркаптопиримидин (ПИМ), 2-меркаптобензтиазол (БТЗ), 1-метил-2-меркаптоимидазол (МИМ), цистеамин (ЦАК), пеницилламин (ПЕН). Количественную оценку NO-донирующей способности Б-ТНКЖ производили с помощью специально разработанной методики определения концентрации внутриэритроцитарного метгемоглобин по реакции: keff [ HbFe 2 ]O2 NO HbFe 3 NO3 Была изучена кинетика выделения оксида азота Б-ТНКЖ в двух сериях экспериментов: с варьированием объемного содержания клеток в суспензии (гематокрит суспензии) при постоянной начальной концентрации комплекса (серия I) и с варьированием начальной концентрации комплекса при неизменном гематокрите (серия II). Кинетика образования метгемоглобина в присутствии Б-ТНКЖ хорошо описывалась уравнением первого порядка. Это позволяло характеризовать NOдонирующую способность Б-ТНКЖ эффективной константой скорости первого порядка образования внутриэритроциарного метгемоглобина. Согласно полученным результатам четыре из пяти изученных комплексов (МИМ, ПИМ, БТЗ, ЦАК) за стандартное время эксперимента, 15-17 минут, выделяли в раствор приблизительно четвертую часть имеющихся NO-групп. При этом их NOдонирующая способность, оцениваемая по величине keff, оказалась переменной величиной, которая монотонно снижалась с увеличением гематокрита суспензии (серия I) и монотонно возрастала с увеличением начальной концентрации комплекса (серия II). Наблюдаемые в экспериментах кинетические закономерности образования внутриэритроцитарного метгемоглобина в суспензиях эритроцитов под действием БТНКЖ получают свое объяснение на основе предположения об образовании в системе двух равновесных пулов Б-ТНКЖ, свободного и мембраносвязанного, различающихся своей NO-донирующей способностью. А именно, скорость гидролиза мебраносвязанного пула Б-ТНКЖ должна быть сниженной из-за ограничения контакта комплекса с водной средой. В результате, определяемая в эксперименте эффективная константа скорости накопления метгемоглобина, являющегося ловушкой NO, будет переменной величиной, зависящей от соотношения концентраций мембраносвязанного и «водного» пулов комплекса. Поведение комплекса ПЕН в нашей системе принципиально отличалось от остальных Б-ТНКЖ. Во-первых, примерно за одну минуту происходило практически полное выделение всех содержащихся в данном комплексе NO-групп. Во-вторых, NOдонирующая способность ПЕН не снижалась с увеличением концентрации эритроцитов. Предполагается, что эта особенность связана с высокой гидрофильностью ПЕН, в сравнении с остальными комплексами, что было определено по критерию коэффициента распределения в системе октанол-вода. Высокий уровень гидратации данного комплекса в водной среде препятствует его связыванию с поверхностью клеток. Зависимость NO-донирующей способности Б-ТНКЖ от среды инкубации может считаться уникальной особенностью данного класса доноров NO, которая непосредственно связана с механизмом донирования NO, основанном на гидролитической диссоциации комплекса. Как видно из результатов данной работы, уровень липофильности S-лигандов Б-ТНКЖ может оказывать влияние на NOдонирующую способность Б-ТНКЖ в биологических средах, что следует учитывать в прогнозе их фармакологической активности в качестве доноров NO. Список публикаций 1. Н.И. Нешев, Б.Л. Психа, Е.М. Соколова, Н.А. Санина, Т.Н. Руднева, С.В. Блохина. Кинетические закономерности гемолиза эритроцитов и окисления гемоглобина под действием сера-нитрозильных комплексов железа - доноров оксида азота// Известия РАН, сер. химическая. – 2010. - № 12. - С. 2160-2163. 2. Н.И. Нешев, Е.М. Соколова, Б.Л. Психа, Н.А. Санина, Т.Н. Руднева. Влияние липофильности лигандов на NO-донирующую способность биядерных тетранитрозильных комплексов железа в суспензии эритроцитов. // Известия РАН, сер. химическая. – 2014. - № 9. - С. 2020-2025. 3. E.M. Sokolova, T.N. Rudneva, N.I. Neshev, B.L. Psikha, N.A. Sanina and S.V. Blokhina. Hemolysis of erythrocytes under exposure to sulfur nitrosyl iron complexes – nitric oxide donors// In «Kinetics, Catalysis and Mechanism of Chemical Reactions: From Pure to Applied Science Volume 2 – Tomorrow and Perspectives. New Your.: Nova Science Publishers, Inc., 2012. P. 173-178. ISBN: 9781614707127 4. Е.М. Соколова. Эритроцитарная модель цитотоксичности оксида азота// Вестник молодых ученых ИвГУ. – 2011. - №11. - С. 40-42. 5. T.N. Roudneva, N.I. Neshev, B.L. Psikha, N.A. Sanina, E.M. Sokolova. Kinetic regularities of hemoglobin oxidation and hemolysis of erythrocytes under exposure to nitric oxide donors// The 6th International Conference on the Biology, Chemistry, and Therapeutic Application of Nitric Oxide. June 14-18, 2010. Kyoto, Japan. Abstracts. Nitric Oxide. – 2010. – V. 22, Suppl. – P. 63. 6. Е.М. Соколова, Т.Н. Руднева, Н.И. Нешев, Б.Л. Психа, Н.А. Санина, С.В. Блохина. О механизме разложения биядерных нитрозильных комплексов железа в суспензии эритроцитов//ХII ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН «Биохимическая физика». Москва 29-31 октября 2012. Сборник трудов, Москва, 2012. С. 165-169. 7. Е.М. Соколова, Т.Н. Руднева, Н.И. Нешев, Б.Л. Психа, Н.А. Санина, С.В. Блохина. Влияние липофильности лигандов на NO-донирующую способность биядерных нитрозильных комплексов железа в суспензии эритроцитов/II-я Всероссийская молодежная конференция «Успехи химической физики». Черноголовка, 19 – 24 мая 2013. Тезисы докладов. С. 185. 8. Е.М. Соколова, Т.Н. Руднева, Н.И. Нешев, Б.Л. Психа, Н.А. Санина, С.В. Блохина. Донирование оксида азота биядерными динитрозильными комплексами железа с тиолсодержащими лигандами в присутствии эритроцитов //ХIII ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН «Биохимическая физика». Москва 28-30 октября 2013. Сборник трудов, Москва, 2013. С. 206-210. 9. Н.И. Нешев, ЕМ. Соколова, Б.Л. Психа, Н.А. Санина, Т.Н. Руднева. NOдонирующая способность биядерных динитрозильных комплексов железа с тиолсодержащими лигандами в суспензии эритроцитов//Восьмая национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксида азота, антиоксиданты и здоровье человека». Смоленск, 25-29 мая 2014. Тезисы докладов. С. 147-148.