На правах рукописи Овчинникова Ольга Андреевна МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЯ СТРУКТУРЫ КОЛЛАГЕНА ПРИ
advertisement
На правах рукописи Овчинникова Ольга Андреевна МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЯ СТРУКТУРЫ КОЛЛАГЕНА ПРИ ДЕСТАБИЛИЗАЦИИ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ БЛЯШКИ В КЛИНИКЕ И ЭКСПЕРИМЕНТЕ 14.00.06 – кардиология 14.00.16 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук . Санкт-Петербург 2008 Работа выполнена в ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова» Научные руководители: доктор медицинских наук член корр. РАМН профессор Евгений Владимирович Шляхто доктор медицинских наук профессор Наталья Алексеевна Гавришева Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор Алексей Владимирович Панов доктор медицинских наук профессор Андрей Глебович Васильев Ведущее учреждение: Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова Защита состоится « 15 » декабря 2008 года в 13 ч. 15 мин. на заседании диссертационного Совета Д. 208.090.01 при ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова» (197089, г. СанктПетербург, ул. Л. Толстого, 6/8) в зале заседаний Ученого совета С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета Автореферат разослан «____» ноября 2008 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор Т.В. Антонова 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ОКС – острый коронарный синдром ЛПНП - липопротеины низкой плотности ЛПВП - липопротеины высокой плотности IFN- - интерферон- (interferon-) TGF- - трансформирующий фактор роста-β (transforming growth factor-β) IL-1β - интерлейкин-1β (interleukin-1β) MHC - главный комплекс гистосовместимости (major-histocompatibilitycomplex) П4Г - пролил-4-гидроксилаза LOX - лизил-оксидаза (lysyl-oxidase) ММР - матричные металлопротеиназы (matrix metalloproteinase) TIMP - тканевой ингибитор металлопротеиназ (tissue metalloproteinases) ПЦР - полимеразная цепная реакция иАПФ – ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента inhibitor of 4 АКТУАЛЬНОСТЬ Сердечно-сосудистые заболевания, связанные с атеросклеротическим поражением сосудов, занимают ведущее место среди причин летальности во многих странах мира, в том числе в России. Существует угроза стремительного роста заболеваемости атеросклерозом уже в молодом возрасте в результате прогрессирующего увеличения метаболических факторов риска и недостаточной эффективности существующих методов диагностики, профилактики и лечения данной патологии (Харченко В.И. и соавт., 2005; Hansson G.K., 2005; Lopez A.D. et al., 2006). Согласно современным представлениям атеросклероз представляет собой многофакторное заболевание, в основе которого лежат два взаимосвязанных процесса: нарушение метаболизма липидов и воспаление сосудистой стенки (Климов А.Н. и соавт., 1999; Hansson G.K. et al., 2006; Libby P. et al., 2008). Воспалительный процесс играет ведущую роль на всех этапах атерогенеза, начиная с формирования атеросклеротической бляшки и заканчивая нарушением структуры атеромы с развитием тромботических осложнений (Нагорнев В.А. и соавт., 2001; Hansson G.K. et al., 2007; Ridker P.M. et al., 2008). Стабильность атеромы зависит от целостности ее фиброзной капсулы, основными компонентами которой являются миофибробласты и фибриллярный коллаген I и III типов (Шехонин Б.В. и соавт., 1984; Barnes M.J. et al., 1999; Libby P. et al., 2005; Hansson G.K., 2005). К признакам нестабильной атеромы относят увеличение липидного “ядра”, истончение фиброзной капсулы, а также воспалительную инфильтрацию (Falk E. et al., 1995; Hansson G.K., 2005; Aikawa М. et al., 2006). Одной их причин дестабилизации атеросклеротической бляшки является дисбаланс между синтезом коллагена и его протеолизом в атероме, в результате чего возникает нарушение механической прочности фиброзной капсулы (Libby P. et al., 2005; Hansson G.K. et al., 2006; Schwartz S.M. et al., 2007). 5 Показано, что нарушение синтеза коллагена в атеросклеротической бляшке может быть связано с действием провоспалительных факторов, среди которых ведущую роль играет медиатор Т-лимфоцитов - интерферон-, обладающий способностью уменьшать пролиферацию миофибробластов и снижать экспрессию гена коллагена (Robertson A.K. et al., 2006; Tedgui A. et al., 2006). Протеолитическая деградация коллагеновых волокон в фиброзной капсуле происходит под влиянием активных ферментов, в том числе матричных металлопротеиназ и цистеиновых протеаз, источником которых являются макрофаги, тучные клетки и другие (Aikawa M. et al., 2004; Newby A.C., 2005; Kovanen P.T., 2007; Raffetto J.D. et al., 2008). Результаты многочисленных исследований по изучению патогенетических звеньев дестабилизации атеросклеротической бляшки имеют неоднозначный характер и в полной мере не освещают механизмы нарушений структуры коллагена в атероме, особенно на этапе до развития сердечно-сосудистых осложнений. Использование линий генетически-модифицированных мышей позволяет целенаправленно изучать влияние факторов воспаления на морфофункциональные свойства и метаболизм коллагена на этапах, предшествующих разрыву фиброзной капсулы (Heeneman S. et al., 2008). Исследование клинического материала атеросклеротических бляшек открывает возможности для поиска взаимосвязи между патогенетическими факторами дестабилизации атером и особенностью течения атеросклероза, а также проводимой медикаментозной терапией (Niessner A. et al., 2008). Понимание механизмов нарушения структуры коллагена в нестабильной бляшке на этапах, предшествующих развитию острых сосудистых катастроф, может служить основой для разработки диагностических и профилактических методов решения данной проблемы. 6 В настоящей работе для выполнения поставленных задач был использован комплексный подход с применением экспериментального и клинического материала. Представленная работа проводилась на кафедре факультетской терапии СПбГМУ им. И.П. Павлова, а также в Центре молекулярной медицины Каролинского Института (Стокгольм, Швеция) при научной консультации профессора Göran K. Hansson в рамках совместной международной исследовательской программы. Цель исследования: Исследовать патогенетические факторы нарушения структуры коллагена при дестабилизации атеросклеротической бляшки у пациентов и в эксперименте. Задачи исследования: 1. Исследовать структуру и метаболизм волокон коллагена на экспериментальной модели нестабильной атеросклеротической бляшки. 2. Оценить особенности структуры коллагена в зависимости от активности воспаления в атеросклеротической бляшке у пациентов. 3. Определить влияние воспаления на процессы модификации коллагена при дестабилизации атеросклеротической бляшки у пациентов. 4. Исследовать взаимосвязь между морфологическими характеристиками атеромы, биосинтезом коллагена в атеросклеротической бляшке и клиническими проявлениями атеросклероза. Основные положения, выносимые на защиту. Преобладание незрелых волокон коллагена в нестабильной атероме у пациентов и в эксперименте связанно со снижением экспрессии внеклеточного коллаген-модифицирующего фермента лизил-оксидазы. 7 Нарушение структурной стабильности коллагена в условиях активного воспаления может быть фактором дестабилизации атеросклеротической бляшки. Научная новизна. В комплексном исследовании с использованием клинического и экспериментального материала показано, что дестабилизация атеросклеротической бляшки связана с нарушением структуры коллагена в результате снижения экспрессии фермента лизил-оксидазы, участвующего в формировании зрелых коллагеновых волокон. Установлена отрицательная тесная корреляционная связь между экспрессией гена лизил-оксидазы и активностью воспаления в атеросклеротических бляшках пациентов и генно-модифицированных мышей. У пациентов с сахарным диабетом обнаружено значительное снижение экспрессии фермента лизил-оксидазы в атеромах. Научно - практическая значимость. Полученные результаты о снижении экспрессии фермента лизил-оксидазы, как патогенетического звена нарушения структуры коллагена при дестабилизации атеромы до разрыва фиброзной капсулы, позволяют целенаправленно вести исследования по изучению предикторов острых сосудистых катастроф. Снижение экспрессии фермента лизил-оксидазы в атеромах у пациентов, особенно при сахарном диабете, можно рассматривать одним из рисков дестабилизации атеросклеротической бляшки и патогенетической основой для проведения более активной противовоспалительной терапии, направленной на обеспечение структурной стабильности коллагена. Создание биобанка атеросклеротических бляшек человека расширяет возможности для проведения исследований по изучению фундаментальных и клинических аспектов атеросклероза с целью разработки новых методов диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых осложнений. 8 Апробация работы. Материалы диссертации были представлены в виде докладов и тезисов на конгрессе европейского общества по изучению атеросклероза (Прага, 2005), международном конгрессе «Артериальная гипертензия – от Короткова до наших дней», Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы кардиологии» (Москва, 2005), третьей европейской научной конференции «Сосудистая биология и медицина» (Гамбург, 2005), конгрессе международного общества по изучению атеросклероза (Рим, 2006), Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2006). По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК. Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в учебный и лечебный процесс кафедры факультетской терапии и в работу кафедры патофизиологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова, а также Центра молекулярной медицины Каролинского Института (Стокгольм, Швеция). Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания характеристик обследованных пациентов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, и практических рекомендаций. Список литературы содержит 244 источника, в том числе 24 отечественных и 220 иностранных. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 17 рисунками. 9 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика обследованных пациентов. Для изучения структурных особенностей и биосинтеза коллагена был использован материал атеросклеротических бляшек из сонных артерий человека, полученных в ходе операции эндартерэктомии по стандартному протоколу на основании диагноза ишемическая болезнь мозга, стеноз одного из брахиоцефальных сосудов более 80% (White C.J. et al., 2008). Контролем служили биопсийные образцы стенки артерий, не имеющие микро- или макро- признаков атеросклеротического поражения, которые были взяты у доноров во время операций трансплантации почки. Исследования проводили на материале двух биобанков атером человека - на базе Каролинского института (Стокгольм, Швеция), включающего 310 пациентов в возрасте от 40 до 88 лет (средний возраст 69 лет) (Paulsson-Berne G. et al., 2006), а также биобанка атеросклеротических бляшек от 117 пациентов в возрасте от 45 до 79 лет (средний возраст 62 года), созданного на клинической базе ФГУ «Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии имени В.А. Алмазова Росмедтехнологий» и на отделении сосудистой хирургии городской многопрофильной больницы №2 Санкт- Петербурга. Большую часть обследованных пациентов составили мужчины (80%). Средний процент стеноза внутренних сонных артерий по данным ультразвукового сканирования был 75,7 1,5%. У большинства обследованных пациентов наблюдалось генерализованное атеросклеротическое поражение сосудистого русла, при этом 83% пациентов страдали ишемической болезнью сердца различной степени тяжести и 37% пациентов имели атеросклеротическое поражение артерий нижних конечностей. У 38% пациентов в анамнезе были сведения о перенесенном остром коронарном синдроме (ОКС). 10 Все пациенты, включенные в обследование, имели один или несколько факторов риска атеросклероза. На момент операции эндартерэктомии курили 33% больных. Средний показатель холестерина крови составил 4,7 0,6 ммоль/л. Артериальная гипертензия была диагностирована у 78% больных, сахарный диабет типа 2 был у 23% больных. Индекс массы тела составил в среднем 26 0,3 кг/м2. Во время операции эндартерэктомии удаленную атерому разрезали на две равные части поперечно ходу сосуда и использовали для анализа мРНК или гистологических исследований. При создании информационной базы данных учитывали основной и сопутствующие диагнозы, симптоматическую картину на момент операции, анамнез, факторы риска развития атеросклероза, данные лабораторных и инструментальных исследований, а также сведения о медикаментозной терапии. Генетически-модифицированные мыши. Экспериментальные исследования проводили на 2 группах генетическимофицированных животных. Для контроля были использованы мыши с врожденной гиперлипидемией - Apoe-/- нокаутные (далее, контрольные мыши). У мышей из опытной группы (далее, трансгенные мыши), созданной на основе контрольной, на Т-лимфоцитах отсутствовал нормально функционирующий рецептор к противовоспалительному и основному профиброгенному цитокину трансформирующему ростовому фактору-β (TGF-β), что приводило к гиперактивации Т-лимфоцитов и проявлялось большей инфильтрацией атеросклеротических бляшек макрофагами и Т-лимфоцитами, а также увеличенной экспрессией главного комплекса гистосовместимости II класса (MHC) на поверхности большинства клеток атером по сравнению с группой контрольных мышей (Robertson A.K. et al., 2003). Таким образом, у трансгенных мышей воспаление 11 протекало более активно и, как следствие, наблюдалось раннее развитие и нестабильное течение атеросклеротического процесса. В работе использовали самок трансгенных мышей в возрасте 12 недель и самок контрольных мышей в возрасте 18 недель, по 9 животных в каждой группе. Подобная разница в возрасте была обусловлена тем, что сравнимые по величине атеросклеротические бляшки формировались у мышей контрольной группы позже, чем у трансгенных мышей (Robertson A.K. et al., 2003). Все эксперименты проводили в соответствии с принятыми этическими нормами по работе с лабораторными животными (Baumans V., 2005; Radzikowski C., 2006). Методы исследования. 1. Исследование структуры коллагеновых волокон в атеросклеротических бляшках пациентов и экспериментальных мышей проводили гистологическим методом с красителем пикро-сириус красным (Picro-sirius Red) с последующей количественной оценкой содержания коллагена с помощью компьютерной морфометрии (Junqueira L.C. et al., 1979; Whittaker P. et al., 1994); 2. Иммуногистохимическое окрашивание на маркеры миофибробластов (актин гладкомышечных клеток), макрофагов (CD163) и Т-лимфоцитов (CD3) осуществляли на поперечных срезах атером пациентов и экспериментальных мышей с последующей количественной оценкой положительного сигнала в ткани с помощью компьютерной морфометрии (Автандинов Н.Г., 1990; Robertson A.K. et al., 2003); 3. Определение экспрессии генов проводили с помощью метода количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (Heid C.A. et al., 1996; Tricarico C. et al., 2002). В ходе экспериментальной части работы исследовали экспрессию мышиных генов интерферона- (IFN-), интерлейкина-1 (IL-1β), α-цепей проколлагена типа I и III, α- 12 субъединицы коллаген-специфичного фермента пролил-4-гидроксилазы, фермента лизил-оксидазы, матричных металлопротеиназ (MMP) -2, -3, -8, -9, -12, -13 и -14, цистеиновых протеаз - катепсинов К, L и S, тканевого ингибитора металлопротеаз-1 (TIMP-1) и ингибитора цистеиновых протеаз - цистатина C. При анализе клинического материала оценивали экспрессию генов пролил-4-гидроксилазы и лизил-оксидазы, а также генов маркеров макрофагов (CD68) и главного комплекса гистосовместимости II класса (MHC). И в экспериментальных, и в клинических исследованиях определяли экспрессию гена ТАТА-бокс связывающего белка (ТАТАbbp), который принимали за внутренний контроль качества РНК. Результаты выражали в относительных единицах (отн.ед); 4. Количественный анализ суммарной активности фермента пролил-4гидроксилазы в атеромах мышей проводили методом оценки прироста радиоактивного продукта (4-гидрокси-14С-пролин). Результаты выражали в процентах от активности фермента у контрольных мышей (Kivirikko K.I. et al., 1982); 5. Количественное определение белка фермента лизил-оксидазы в атеромах мышей проводили методом иммуноблоттинга (Вестерн блот гибридизация, Western blot). Результаты выражали в условных единицах (усл.ед.) (Csiszar K., 2001); 6. Количественную оценку продуктов деградации коллагена в атеросклеротических бляшках мышей осуществляли методом иммуноферментного анализа (тест-система RatLaps, Дания) на автоматическом фотометре для микропланшетов (DRG Eliza-Mat 2000). Результаты выражали в нг/мл. (Garnero P. et al., 2003). 13 Методы статистической обработки. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel 2003, StatView (SAS Institute, США) и Statistica 6 (StatSoft, Inc.). При проведении сравнительного анализа подсчитывали среднее арифметическое и стандартную ошибку средней. В случае нормального распределения анализ достоверности различий между группами выполняли с помощью t-критерия Стьюдента. В противном случае, а также с учетом малой выборки (экспериментальная часть работы), для оценки достоверности применяли непараметрические критерии Манна-Уитни. Для поиска связей и оценки их достоверности применяли корреляционный анализ с использованием показателя линейной корреляции Пирсона (r). Результаты считались достоверными при значении доверительной вероятности (риск ошибки, р) менее 0.05 (StatSoft, 1999). РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Результаты исследований метаболизма коллагеновых волокон атеросклеротической бляшки в эксперименте. По современным представлениям, метаболизм коллагена на посттрансляционном этапе включает процессы внутри- и внеклеточных модификации. Этапы внутриклеточной модификации заключаются в гидроксилировании некоторых остатков проколлагеновых -цепей под действием гидроксилаз, в том числе пролил-4-гидроксилазы, что является основой для образования внутри- и межмолекулярных связей и формирования трехспиральной конформации молекулы. После секреции проколлагена происходят отщепление N- и C- концевых пептидов и фермент-зависимая агрегация молекул в фибриллы с формированием поперечных связей зрелых волокон под действием фермента лизил-оксидазы (Замараева Т.В. и соавт., 1985; Буржанидзе Т.В., 1992, Myllyharju, 2001 #303; 14 Gelse K. et al., 2003). В дальнейшем коллагеновые волокна утилизируются под действием большого спектра протеолитических ферментов (Steins M.B. et al., 1999; Aikawa M. et al., 2004; Newby A.C., 2005; Lutgens S.P. et al., 2007; Kovanen P.T., 2007). Анализ состояния коллагеновых волокон атеросклеротических бляшек экспериментальных мышей выявил, что содержание зрелых коллагеновых волокон в атеромах трасгенных мышей составило 1,4 ± 0,4%, что было достоверно ниже, чем в атеромах контрольных мышей (3,6 ± 0,4%; p < 0,05). Незрелые волокна коллагена преобладали в бляшках трансгенных мышей по сравнению с контролем, однако указанное различие не достигло статистической достоверности (2,8 ± 0,4% и 1,8 ± 0,3%, соответственно; p = 0,09). Коэффициент соотношения толстых волокон к тонким (далее, “коэф. коллаген”) был значительно меньше в группе трансгенных мышей по сравнению с контрольной группой (0,6 и 2,6, соответственно). При этом общее количество коллагеновых волокон (4,4 ± 0,7% у трасгенных мышей и 5,4 ± 0,7% у контрольных мышей; p = 0,34) и количественное содержание миофибробластов, экспрессирующих -актин, достоверно не различалось в бляшках двух групп мышей (9,2 ± 1,7% и 6,0 ± 1,1%, соответственно; p = 0,22). Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что у мышей с нестабильной бляшкой несостоятельность коллагена могла быть обусловлена как уменьшением экспрессии генов цепей коллагена в отдельных клетках, изменением посттрансляционной модификации волокон, так и повышенной их утилизацией. В нашей работе мы последовательно изучили все эти этапы метаболизма коллагена. У трансгенных мышей экспрессия генов IFN-γ и IL-1β была достоверно выше по сравнению с контрольной группой, что является подтверждением высокой степени активности воспаления в атеромах этих животных. При этом до- 15 стоверных изменений экспрессии генов α-цепей проколлагенов типов I и III в атеросклеротических бляшках опытной группы не отмечалось (табл. 1). Анализ экспрессии генов ферментов пролил-4-гидроксилазы и лизилоксидазы, принимающих участие в посттрансляционной стабилизации коллагеновых волокон, выявил достоверное снижение уровня экспрессии этих генов в атеромах трансгенных мышей (табл. 1). Таблица 1. Показатели экспрессии генов в атеросклеротических бляшках у экспериментальных животных. Экспрессия гена (отн.ед.) Название гена Трансгенные мыши Контрольные мыши IFN-γ 9,7 ± 0,9 *** 0,2 ± 0,03 IL-1β 1,6 ± 0,2 *** 0,6 ± 0,1 Проколлаген I типа, альфа цепь 4,4 0,5 5,0 0,3 Проколлаген III типа, альфа цепь 5,9 0,5 6,9 0,7 П4Г, -1 субъединица 7,3 0,5 * 11,3 1,0 LOX 0,6 0,2 * 1,0 0,2 MMP-13 8,4 ± 0,5 * 2,8 ± 0,3 Катепсин S 10,1 ± 0,8 * 3,5 ± 0,2 ММР-9 1,5 ± 0,3 * 1,0 ± 0,3 0,42 ± 0,06 * 0,82 ± 0,14 Цистатин C *** - р < 0,001; * - р < 0,05 В атеромах трансгенных мышей, несмотря на снижение экспрессии гена внутриклеточного фермента пролил-4-гидроксилазы, отмечалось повышение суммарной активности этого фермента на 33% по сравнению с контрольными животными. Полагают, что данные результаты могут быть связаны с компенсаторным увеличением экспрессии других изоформ фермента пролил-4гидроксилазы для стабилизации ткани (Myllyharju J. et al., 2004). Проверка дан- 16 ной гипотезы требует проведения дальнейших целенаправленных исследований. При изучении изменений внеклеточного коллаген-модифицирующего фермента лизил-оксидазы нами было обнаружено достоверное уменьшение количества активной формы данного фермента в атеромах трансгенных мышей (607 ± 364 усл. единиц и 1875 ± 696 усл. ед., соответственно; p < 0,05). При исследовании двух групп протеолитических ферментов - ММР и цистеиновых протеаз - в атеросклеротических бляшках мышей показано, что у трансгенных мышей экспрессия генов ММР-13 и катепсина S были, соответственно, в 3 и 2,9 раза выше, чем у животных контрольной группы, а экспрессия генов ММР-9 и цистатина C была достоверно меньше (табл. 1). Нами не были обнаружены достоверные различия экспрессии генов MMP-2: MMP-3; ММР-8; ММР-12; ММР-14, TIMP-1, а также катепсинов К и L между двумя группами мышей. В то же время, сравнительная оценка содержания фрагментированного коллагена не выявила достоверных различий количества продуктов протеолитического распада коллагена в атеромах экспериментальных животных (6,07 ± 1,36 нг/мл в группе трансгенных мышей и 5,1 ± 0,42 нг/мл – в контрольной группе; p = 0,53). Таким образом, анализ экспериментальных результатов показал, что у трансгенных мышей в атеросклеротических бляшках с выраженным воспалением, нарушен синтез и активность фермента, участвующего во внеклеточной модификации коллагена, лизил-оксидазы, что позволяет сделать предположение об участии этого фермента в механизме дестабилизации атеромы. 17 Структура коллагена у пациентов в атеросклеротических бляшках с различной степенью выраженности воспаления. Для исследования взаимосвязи между факторами нарушения структуры коллагена при дестабилизации атером и клиническими показателями течения атеросклероза нами были использованы образцы атеросклеротических бляшек их сонных артерий. Рис. 1. Морфометрические показатели атеросклеротических бляшек: корреляция между структурой коллагена (“коэф. коллаген”) и маркерами макрофагов-CD163 (А) и Т-лимфоцитов-CD3 (Б). Исследования гистологических препаратов обнаружили, что в атеромах пациентов с выраженной лимфоцитарной и макрофагальной инфильтрацией преобладали тонкие, незрелые волокна коллагена. В то время, как в участках атером с менее выраженной воспалительной инфильтрацией или в местах, где воспалительные клетки практически отсутствовали, были обнаружены толстые, зрелые коллагеновые волокна. При проведении морфометрического анализа окрашенных срезов, была выявлена достоверная линейная отрицательная корреляция между коэффициентом соотношения толстых волокон коллагена к тон- 18 ким, как показателем структурных свойств коллагена (“коэф. коллаген”), и содержанием макрофагов (СD163) или Т-лимфоцитов (CD3) (рис. 1). Инфильтрация атером макрофагами была достоверно выше у курящих пациентов по сравнению с некурящими (3,4 ± 0,3 баллов и 2,2 ± 0,4 баллов, соответственно; р = 0,03). Анализ взаимосвязи других клинических показателей (функциональный класс стенокардии напряжения, сведения о перенесенном ОКС, степень артериальной гипертензии, а также терапия ингибиторами АПФ (иАПФ) или статинами) со структурой коллагена или показателями воспалительной инфильтрации атером пациентов не выявил достоверных связей. Биосинтез коллагена у пациентов в атеросклеротических бляшках с различной степенью выраженности воспаления. Экспрессия гена лизил-оксидазы, фермента ответственного за внеклеточную стабилизацию коллагена, была достоверно ниже в атеромах пациентов по сравнению с ее экспрессией в стенке атеросклеротически неизмененной артерии (190,7 отн.ед. и 466,9 отн.ед, соответственно; p<0,0001). Экспрессия гена пролил-4-гидроксилазы, внутриклеточного фермента посттрансляционной модификации коллагена, в тканях атеромы и стенке контрольной артерии не различалась (4,8 отн.ед. и 4,8 отн.ед, соответственно; p = 0,95). При исследовании корреляционной связи между экспрессией обоих коллаген-модифицирующих ферментов и генов маркеров воспаления в образцах атеросклеротических бляшек, была обнаружена отрицательная достоверная линейная корреляционная связь между экспрессией гена лизил-оксидазы и генами маркеров макрофагов (CD68) (r = - 0.63; p < 0,0001) и MHC II класса (r = -0,44; p = 0,002). В то время, как связи экспрессии гена пролил-4-гидроксилазы с теми же маркерами воспаления обнаружено не было (для макрофагов: r = - 0,23; p > 0,05, для MHC II класса: r = -0,05; p > 0,05). 19 Показано, что атеромы с низкой экспрессией гена фермента лизилоксидазы (ниже 180 отн.ед.) характеризовались меньшим содержанием зрелых коллагеновых волокон (коэффициент соотношения зрелых толстых волокон к незрелым тонким: 0,97 ± 0,08). Тогда как в атеромах с высокой экспрессией гена лизил-оксидазы (более 180 отн.ед) преобладали зрелые волокна коллагена (коэффициент - 1,69 ± 0,27; p < 0,05). Группы пациентов с разным уровнем экспрессии гена лизил-оксидазы в атеросклеротических бляшках не отличались по возрасту и лабораторным показателям крови (табл.2). Таблица 2. Возраст и лабораторные показатели крови у пациентов с разным уровнем экспрессии гена лизил-оксидазы в атеромах. Группа с высокой Группа с низкой экспрессией LOX экспрессией LOX (>180 отн.ед) (<180 отн.ед) 70,8 ± 1,7 71,5 ± 0,8 25 ± 0,7 26 ± 0,35 Уровень С- реактивного белка (мг/л) 4,46 ± 0,9 6,5 ± 1,4 Уровень холестерина (ммоль/л) 4,58 ± 0,16 4,73 ± 0,12 Уровень триглицеридов (ммоль/л) 1,9 ± 0,19 1,73 ± 0,13 Уровень ЛПНП (ммоль/л) 2,6 ± 0,16 2,9 ± 0,12 Уровень ЛПВП (ммоль/л) 1,19 ± 0,07 1,2 ± 0,04 Показатели Возраст (лет) Индекс массы тела (кг/м2) * - р < 0,05 Актуальной клинической проблемой являются сосудистые осложнения атеросклероза у пациентов с сахарным диабетом (Toutouzas K. et al., 2005; Bouhanick B. et al., 2006). Результаты проведенных нами исследований показали, что в атеромах у пациентов с сахарным диабетом типа 2 экспрессия гена лизил-оксидазы была достоверно ниже, чем при отсутствии данной патологии (log LOX = 0,37 ± 0,11 и 0,65 ± 0,08, соответственно; р = 0,02) (рис. 2). 20 Ретроспективный анализ образцов атером пациентов, получавших иАПФ и без терапии этими препаратами, показал отсутствие достоверных различий экспрессии гена лизил-оксидазы между этими группами больных, в то же время, отмечалась тенденция к положительному влиянию данных препаратов на экспрессию гена этого фермента (log LOX: при приеме иАПФ 0,55 ± 0,11, без приема иАПФ 0,47 ± 0,07; р = 0,94). Рис. 2. Показатели экспрессии гена лизил-оксидазы (LOX) в ткани атеросклеротически неизмененной стенки артерии (контроль) и в атеромах пациентов с сахарным диабетом тип 2 и без данной патологии. *** - p < 0,001 по сравнению с контролем; # - p < 0,05 по сравнению с пациентами без сахарного диабета тип 2. Таким образом, проведенные клинические и экспериментальные исследования выявили однонаправленные изменения структуры и биосинтеза коллагена атеросклеротических бляшек. Полученные результаты свидетельствуют о значении нарушения стабильности волокон коллагена фиброзной капсулы вследствие снижения синтеза фермента лизил-оксидазы, как патогенетического звена при дестабилизации атеросклеротической бляшки. ВЫВОДЫ 21 1. В нестабильной атеросклеротической бляшке у трансгенных мышей преобладают незрелые волокна коллагена в результате уменьшения синтеза внеклеточного коллаген-модифицирующего фермента лизил-оксидазы. 2. У пациентов в атероме со значительной воспалительной инфильтрацией отмечаются структурные нарушения коллагена за счет преобладания незрелых волокон. При курении активность воспаления в атеросклеротических бляшках выражена в большей степени. 3. В пораженных атеросклерозом сосудах пациентов наблюдается снижение экспрессии гена фермента лизил-оксидазы. В атеросклеротических бляшках с низкой экспрессией гена лизил-оксидазы отмечается уменьшение содержания зрелых волокон коллагена. 4. При дестабилизации атеросклеротических бляшек пациентов установлена отрицательная корреляционная связь между экспрессией гена лизилоксидазы и клеточно-молекулярными факторами воспаления (макрофаги и главный комплекс гистосовместимости II класса). 5. В атеромах пациентов с сахарным диабетом экспрессия фермента лизилоксидазы достоверно ниже, чем в атеромах больных без данной сопутствующей патологии. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ У пациентов для снижения риска осложнений при дестабилизации атеросклеротической бляшки, особенно при сахарном диабете, следует рекомендовать отказ от курения и проведение более активной противовоспалительной терапии для обеспечения структурной стабильности коллагена. 22 С целью разработки новых методов диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых осложнений атеросклероза можно использовать биобанк атеросклеротических бляшек человека для изучения патогенетических и клинических аспектов атерогенеза. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Шляхто Е.В. Влияние индуцированного воспаления на метаболизм коллагена в атеросклеротических бляшках у мышей / Гавришева Н.А, Овчинникова О.А., Ханссон Г.К. // Медицинская иммунология, - 2008, - том 11, - № 6, - С.527- 536. 2. Шляхто Е.В. Состояние межклеточного матрикса в атеросклеротической бляшке в условиях воспаления / Гавришева Н.А, Овчинникова О.А., Робертсон АК., Ханссон Г.К. // Бюллетень НИИ Кардиологии им В.А. Алмазова, - 2005, - том 3, - №1, - с.29. 3. Шляхто Е.В. Нарушение организации коллагена как причина нестабильности атеросклеротической бляшки при выраженном воспалении / Гавришева Н.А, Овчинникова О.А., Робертсон АК., Ханссон Г.К. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы кардиологии», - 2005, - С.38. 4. Ovtchinnikova O.A. Reduced collagen maturation in atherosclerotic lesions with excessive T cell-mediated inflammation / Robertson AKL, Gavrisheva NA, Shlyakhto EV, Hansson GK. // Atherosclerosis, suppl., - 2005, - № 6, P.17. 5. Ovchinnikova O.A. Atherosclerotic lesions with exaggerated inflammation show impaired collagen maturation / Robertson A-K, Gavrisheva NA, Shlyakhto EV, Hansson G.K. // J. Vasc. Research, suppl, - 2005, - P.II/80. 23 6. Ovchinnikova O.A. Inhibited collagen maturation, but only modest proteolytic activity in hyperinflamed atherosclerotic lesions / Robertson AKL, Chaoyong Z, Ericsson P, Gavrisheva NA, Shlyakhto EV, Hansson GK. // Atherosclerosis, suppl., - 2006, - Vol.7, - Р. 242. 7. Ovchinnikova OA. Mechanisms behind plaque vulnerability / Robertson AKL, Chaoyong Z, Ericsson P, Gavrisheva NA, Shlyakhto EV, Hansson GK. // CIS Cardiology, - 2006, - Vol.4, -№1, - P.108. 8. Шляхто Е.В. Нарушение посттрансляционной модификации коллагена как причина дестабилизации атеросклеротической бляшки при экспериментальном воспалении / Гавришева Н.А, Овчинникова О.А., Робертсон АК, Ханссон ГК. // Тезисы Российского национального конгресса кардиологов, - 2006. – P.76.