На правах рукописи РОМАНЕНКО СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЦИТОГЕНЕТИКА ГРЫЗУНОВ ГРУППЫ MYOMORPHA 03.00.15 ГЕНЕТИКА Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2008 Работа выполнена в лаборатории цитогенетики животных Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель: доктор биологических наук, Графодатский Александр Сергеевич, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Беляева Елена Сергеевна кандидат биологических наук, Саблина Ольга Валентиновна Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии РАН, г. Москва Защита диссертации состоится «__» ________ 2008 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, тел. (383)-333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан «__» __________2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Сравнительные цитогенетические исследования являются неотъемлемой частью изучения видов животных, давая значительный вклад в решение спорных вопросов систематики, в установление филогенетических связей между таксонами различного ранга. В отличие от морфологических подходов, сравнительный анализ кариотипов отражает не только филогенетическое родство исследуемых видов, но и дает информацию об изменениях в их геномной организации. В распоряжении современной цитогенетики имеются несколько мощных инструментов для установления районов гомологии хромосом. Наибольшие успехи в быстром и эффективном анализе геномов млекопитающих достигнуты при сочетании методов дифференциального окрашивания хромосом и метода сравнительного хромосомного пэйнтинга. К настоящему времени с помощью хромосомного пэйнтинга изучено около 150 видов млекопитающих, большинство из которых относят к отрядам хищных и приматов (Графодатский, 2007). Результатом сравнительных цитогенетических исследований стало определение двух основных направлений кариотипической эволюции: 1. Медленное преобразование генома: небольшое число перестроек, незначительно изменяющих вид предкового кариотипа (кошачьи, куницеобразные, ластоногие); 2. Быстрая реорганизация генома, характеризующаяся высокой частотой перестроек и приводящая к массовой перетасовке предковых синтенных групп (мышевидные грызуны, собачьи, гиббоновые). Было показано, что хромосомные перестройки могут служить хорошими филогенетическими маркерами радиации млекопитающих (O’Brien et al., 1999). В то же время цитогенетические данные редко использовались для кладистического анализа, так как вопрос о принципах их кодирования оставался спорным. В настоящее время разработан подход, позволяющий использовать хромосомных ассоциации как геномные характеристики, и, таким образом, применять кладистический анализ для обсчета цитогенетических данных – в первую очередь, данных сравнительного хромосомного пэйнтинга (Dobigny et al., 2004). Одной из важнейших задач современной цитогенетики является реконструкция предкового кариотипа. Известно, что в геномах различных видов имеются консервативные районы хромосом, сохраняющие высокий уровень гомологии на протяжении тысяч и миллионов лет эволюции. С использованием данных сравнительного хромосомного пэйнтинга для некоторых отрядов и для всего класса млекопитающих предложены предковые кариотипы, состоящие из наиболее вероятных комбинаций консервативных сегментов хромосом, реконструированы события перетасовки консервативных сегментов хромосом, происходившие при формировании кариотипов ныне живущих видов. Сейчас, когда с помощью пэйнтинга исследованы представители почти всех отрядов млекопитающих, актуальным является детальное изучение кариотипических взаимоотношений между представителями родов и семейств. В основном из каждого отряда исследовано несколько видов. Для создания полной картины эволюции кариотипов требуется детальное исследование таксонов всех рангов. Настоящая работа посвящена изучению кариотипических взаимоотношений внутри подотряда Myomorpha (мышевидные грызуны) отряда Rodentia (грызуны) с помощью метода сравнительного хромосомного пэйнтинга. Цели и задачи работы. Подотряд мышевидных грызунов характеризуются одной из самых высоких скоростей кариотипической эволюции среди млекопитающих. Значительная перестроенность кариотипов мышевидных грызунов существенно осложняет их исследование с помощью традиционно используемых пэйнтинг-проб человека. Целые семейства до сих пор остаются слабо охваченными исследованиями по сравнительному хромосомному пэйнтингу, что делает невозможным создание целостной картины кариотипической эволюции отряда грызунов. Решению этой проблемы может способствовать как увеличение числа исследуемых видов, так и вовлечение в сравнительные исследования дополнительных наборов пэйнтинг-проб. Целью настоящей работы является исследование кариотипических взаимоотношений млекопитающих из подотряда Myomorpha отряда Rodentia. Для составления полной картины кариотипических эволюционных изменений в подотряде были поставлены следующие задачи: 1. Описать кариотипические отношения в подотряде Myomorpha с помощью пэйнтинг-проб хромосом китайского и золотистого хомячков, копытного лемминга и домовой мыши. 2. Проанализировать данные сравнительного хромосомного пэйнтинга, реконструировать предковый кариотип таксонов и возможный ход перестроек, приведших к формированию наборов хромосом современных мышевидных грызунов. 3. Локализовать пэйнтинг-пробы хромосом человека на хромосомах одного из базальных представителей подотряда Myomorpha. 4. С использованием кладистического анализа выявленных хромосомных характеристик установить филогенетическую позицию подотряда Myomorpha внутри отряда Rodentia. Научная новизна и практическая ценность работы. В работе приведена характеристика двух новых наборов пэйнтинг-проб: золотистого хомячка и копытного лемминга. На широком круге видов продемонстрирована эффективность использования этих наборов для исследования кариотипической эволюции в надсемействе Muroidea подотряда Myomorpha. Впервые выполнена локализация полного набора пэйнтинг-проб человека на хромосомах представителя подотряда мышевидных грызунов. С применением современных молекулярно-цитогенетических методов идентифицированы и описаны число и границы консервативных районов хромосом у значительного числа видов мышевидных грызунов. Для 28 видов мышевидных грызунов из 15 родов и 7 подсемейств построены сравнительные хромосомные карты. Для хомяковых такая работа проведена впервые. В построение карт включены хромосомные наборы двух видов с детально картированными геномами (домовая мышь, китайский хомячок). В дальнейшем хромосомные карты могут быть использованы в качестве первичного материала для картирования геномов исследованных видов. С применением кладистического анализа выявленных хромосомных характеристик установлены филогенетические связи между представителями подоряда Myomorpha, определено положение таксона на филогенетическом древе грызунов. На основании данных сравнительного хромосомного пэйнтинга реконструирован предковый кариотип подотряда Myomorpha и общий предковый кариотип подотрядов Anomaluromorpha, Castorimorpha, Myomorpha и Sciuromorpha. Этот этап необходим для воссоздания полной картины кариотипической эволюции, приведшей к формированию хромосомных наборов ныне живущих видов. В работе построены предковые кариотипы для каждого исследованного подсемейства и рода. Предложенная схема кариотипических взаимоотношений, позволяет представить кариотипические изменения, сопровождавшие хромосомную эволюцию в подотряде Myomorpha отряда Rodentia. Апробация работы. Результаты исследования были доложены на следующих конференциях: а) III конференция молодых ученых, посвященная М.А. Лаврентьеву. Новосибирск, 1-3 декабря 2003 г.; б) XLII международная научная студенческая конференция "Студент и научно-технический прогресс". Новосибирск, 13-15 апреля 2004 г.; в) Международное рабочее совещание "Происхождение и эволюция биосферы". Новосибирск, 26-29 июня 2005 г.; г) ХV Всероссийское совещание "Структура и функции клеточного ядра". Санкт-Петербург, 18-20 октября 2005 г.; д) Отчетная конференция "Динамика генофондов растений, животных и человека". Москва, 2005; е) Отчетная конференция "Динамика генофондов растений, животных и человека". Москва, 2007; ж) V конференция молодых ученых СО РАН, посвященная М.А. Лаврентьеву. Новосибирск, 20-22 ноября 2007 г. Кроме того, результаты работы были представлены на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН в феврале 2005 и 2007 годов. Публикации. По результатам работы опубликовано девять статей. Вклад автора. Автором были выполнены работы по получению и культивированию используемых в исследовании первичных линий фибробластов грызунов, получению суспензий хромосом большей части животных, вовлеченных в исследование, дифференциальное окрашивание кариотипов всех исследованных видов, микродиссекция библиотеки хромосомы 16 золотистого хомячка. Автор готовил препараты для гибридизации in situ, анализировал результаты локализации пэйнтинг-проб, идентифицировал хромосомы и принимал непосредственное участие в обработке и анализе полученных данных. Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 212 ссылок, и 3 приложений. Диссертация изложена на 213 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 36 рисунков. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Список видов, вовлеченных в исследование. Надсемейство тушканчиковых (Dipodoidea). Семейство тушканчиков (Dipodidae). Подсемейство Zapodinae: род Sicista – лесная мышовка (Sicista betulina, SBE, 2n=32). Надсемейство мышиные (Muroidea). Семейство мышевидных хомячков (Calomyscidae), подсемейство Calimyscinae: род Calomyscus – мышевиднй хомячок (Calomyscus sp., CSP, 2n=52). Семейство хомяковых (Cricetidae). Подсемейство Cricetinae: род Allocricetulus – хомячок Эверсманна (A. eversmanni, AEV, 2n=26), род Cricetus – обыкновенный хомяк (C. cricetus, CCR, 2n=22), род Cricetulus – барабинский хомячок (C. barabensis, CBA, 2n=20), китайский хомячок (C. griseus, CGR, 2n=22), длиннохвостй хомячок (C. longicaudatus, CLO, 2n=24), серый хомячок (C. migratorius, CMI, 2n=22), род Mesocricetus – золотистый хомячок (M. auratus, MAU, 2n=44), турецкий хомячок (M. brandti, MBR, 2n=42), кавказский хомячок (M. raddei, MRA, 2n=44), род Phodopus – хомячок Кэмпбелла (P. campbelli, PCA2n=28), хомячок Роборовского (P. roborovskii, PRO, 2n=34), джунгарский хомячок (P. sungorus, PSU, 2n=28), род Tscherskia – крысовидный хомячок (T. triton, TTR, 2n=28). Подсемейство Arvicolinae: род Arvicola – водяная полевка (A. terrestris, ATE, 2n=36), род Clethrionomys – красная полевка (C. rutilus, CRU, 2n=56), род Dicrostonyx – копытный лемминг (D. torquatus, DTO, 2n=45+B), род Ellobius – горная слепушонка (E. lutescens, ELU, 2n=17), обыкновенная слепушонка (E. talpinus, ETA, 2n=54), род Microtus – полевка-экономка (M. oeconomus, MOE, 2n=30). Подсемейство Neotomynae: род Peromyscus – кактусовый хомячок (P. eremicus, PER, 2n=48). Семейство мышиных (Muridae). Подсемейство Gerbillinae: род Meriones – краснохвостая песчанка (M. lybicus, MLY, 2n=44). Подсемейство Murinae: род Mus – домовая мышь (M. musculus, MMU, 2n=40). Культуры клеток и суспензии хромосом. Культивирование клеток, получение суспензий хромосом и приготовление препаратов проводили по стандартным методикам (Графодатский, Раджабли, 1988; Henegariu et al., 2001). Суспензия хромосом E. lutescens предоставлена к.б.н. И.Ю. Баклушинской и к.б.н. Е.А. Ляпуновой (ИБР им. Кольцова, Москва). Дифференциальные окраски хромосом. GTG-бэндинг проводили по методике Сибрайт (Seabright, 1971), модифицированной Графодатским и Раджабли (1988). С-окрашивание проводили по методике Самнер (Sumner, 1972), модифицированной Графодатским и Раджабли (1988). ДНК-библиотеки сортированных хромосом китайского хомячка, золотистого хомячка, копытного лемминга, домовой мыши и человека, использованные в работе, предоставлены группой ветеринарной цитогенетики Кембриджского университета (Великобритания). Дополнительный набор пэйнтинг-проб мыши предоставлен центром сравнительной молекулярной цитогенетики Национального института рака (Фредерик, США). Хромосомный пэйнтинг проводили на дифференциально окрашенных метафазных хромосомах по методу, описанному Yang et al., 1995, с некоторыми модификациями. Флуоресцентная in situ гибридизация проведена научным сотрудником лаборатории цитогенетики животных Н.А. Сердюковой. Микродиссекция. Получение микродиссекционных хромосомоспецифичных ДНК-проб проводили в соответствии с методикой, описанной Rubtsov et al., 2000. Микродиссекционные пробы хромосом 15 и 21 золотистого хомячка получены научным сотрудником лаборатории цитогенетики животных к.б.н. В.А. Трифоновым (ИЦиГ СО РАН). Филогенетический анализ проводился согласно Dobigny et al., 2004. Матрица хромосомных признаков анализировалась Г. Добиньи в лаборатории при Национальном музее истории природы, происхождения, структуры и эволюции биоразнообразия (Париж, Франция) методом максимальной экономии с использованием программного обеспечения PAUP 4.01b (Swofford, 1998). РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Реципрокный хромосомный пэйнтинг. Реципрокный хромосомный пэйнтинг был выполнен для следующих пар видов: C. griseus и M. auratus, M. auratus и M. musculus, M. auratus и D. torquatus. Сходство рисунка G-бэндинга на гомологичных хромосомах и хромосомных сегментах исследованных видов указывает на отсутствие видимых внутрихромосомных перестроек. Впервые показано, что две пары хромосом в кариотипе D. torquatus, ранее рассматриваемые как В-хромосомы, являются аутосомами. 2. Однонаправленный хромосомный пэйнтинг. В работе использованы наборы пэйнтинг-проб C. griseus, M. auratus и M. musculus для установления районов гомологии хромосом между геномами 24 видов мышевидных грызунов. Пробы M. auratus локализованы на хромосомах грызунов из 6 подсемейств: Calomyscinae, Cricetinae, Gerbillinae, Arvicolinae, Muridae, Neotominae. Наборы пэйнтинг-проб C. griseus и M. musculus были локализованы на хромосомах отдельных видов. Дополнительно в сравнение были включены кариотипы четырех представителей семейства Cricetidae подсемейства Cricetinae: монгольский хомячок (Allocricetulus curtatus, ACU, 2n=20), гобийский хомячок (C. sokolovi, CSO, 2n=20), забайкальский хомячок (C. pseudogriseus, CPS, 2n=24), румынский хомячок (M. newtoni, MNE, 2n=38). Дифференциальные окраски хромосом этих видов были любезно предоставлены д.б.н. А.С. Графодатским. На рис. 1 приведена сравнительная хромосомная карта для девяти видов хомячков. На хромосомах лесной мышовки не удалось провести локализацию пэйнтинг-проб грызунов, но была успешно проведена локализация полного набора проб человека. 3. Анализ перестроек хромосом. Надсемейство Dipodoidae. Анализ хромосомных характеристик S. betulina проводился независимо от остальных видов, исследованных в данной работе. Ранее с помощью пэйнтинг-проб человека были исследованы кариотипы пяти видов грызунов: многополосной белки Menetes berdmorei, гигантской летяги Petaurista albiventer, каролинской белки Sciurus carolinensis (Sciuridae, Sciuromorpha) (Richard et al., 2003; Li et al., 2004), речного бобра Castor fiber (Castoridae, Castormorpha) и долгонога Pedetes capensis (Pedetidae, Anomaluromorpha) (лаборатория цитогенетики животных ИЦиГ, неопубликованные данные). Для пяти этих видов и S. betulina был проведен филогенетический анализ. В качестве внешней группы был выбран кролик Oryctolagus cuniculus – представитель отряда Lagomorpha (Korstanje et al., 1999). Для исследованных видов была определена 81 хромосомная характеристика и построена матрица хромосомных характеристик. В результате анализа было получено древо, отражающие каротипические отношения между исследованными видами. Изученные виды грызунов четко разделились на две ветви: а) представители семейства Sciuridae – базальная ветвь на древе, б) семейства Castoridae, Dipodidae и Pedetidae (рис. 2). По крайне мере 5 инверсий, 74 слияния и 6 разрывов зафиксировались в ходе эволюции внутри группы. Полученные результаты совместно с данными, опубликованными ранее, позволили предположить возможную структуру предкового кариотипа для исследованных видов. Вероятно, общий предок группы Sciurognathi (Anomaluromorpha+Castorimorpha+Myomorpha+Sciuromorpha, по Carleton, Musser, 1993) – Ancestral Sciurognathi Karyotype, ASK – имел 2n=50 и содержал следующие ассоциации хромосом и хромосомных сегментов человека: HSA1pq, 1q/10p, 2pq, 2q, 3a, 3b/19p, 3c/21, 4b, 5, 6, 7a, 7b/16p, 8p/4a/8p, 8q, 9/11, 10q, 12a/22a, 12b/22b, 13, 14/15, 16q/19q, 17, 18, 20, X и Y (рис. 3). Надсемейство Muroidea Для проведения филогенетического анализа в надсемействе была построена таблица гомологии районов хромосом всех изученных видов. Дополнительно в анализ были включены ранее опубликованные данные по сравнительному хромосомному пэйнтингу между M. musculus и следующими видами мышевидных грызунов: Cricetulus griseus (Yang et al., 2000), Mus platythrix (Matsubara et al., 2003), Rattus norvegicus (Stanyon et al., 1999), R. rattus (Cavagna et al., 2002), Apodemus sylvaticus, A. peninsulae, A. agrarius, A. semotus, A. speciosus, A. argenteus, A. gurkha (Matsubara et al., 2004; Stanyon et al., 2004). Для 37 исследованых видов были определены хромосомные характеристики и построена матрица хромосомных характеристик. Рисунок 1. Сравнительная хромосомная карта девяти видов хомячков (CCR – C. cricetus, CMI – C. migratirius, CBA – C. barabensis, CGR – C. griseus, CLO – C. longicaudatus, CSO* – C. sokolovi, CPS* – C. pseudogriseus, AEV – A. eversmanni, ACU* – A. curtatus). Слева черными вертикальными линиями показана гомология хромосом M. auratus. Черными точками маркирована позиция центромеры. Виды отмеченные «*» включены в сравнение только на основании G-бэндинга. Номенклатура хромосом соответствует Sablina et al., 2006 и Radjabli et al., 2006. Рисунок 2. Схема кариотипической эволюции мышевидных грызунов. ASK – предковый кариотип группы Sciurognathi, AMK – предковый кариотип надсемейства Muroidea. Цифрами над каждой веткой показано количество перестроек хромосом, где «-» - разрыв предковой хромосомы, «+» - слияние. Для некоторых узлов древа показаны диплоидные числа хромосом. «?» - тип и количество перестроек неизвестны. Рисунок 3. Реконструированный на основании данных пэйнтинга предковый кариотип группы Sciuragnathi. Каждая предковая хромосома пронумерована в соответствии с гомологичными сегментами в геноме человека (цифры справа). При анализе в качестве внешней группы рассматривался Calomyscus sp., как представитель самой базальной ветви (из изученных видов) ствола Muroidea (Michaux et al., 2001; Jansa, Weksler, 2004; Steppan et al., 2004). По результатам филогенетического анализа все исследованные виды достоверно разделились на следующие группы: a) виды подсемейства Cricetinae; б) виды подсемейства Murinae; в) виды подсемейства Arvicolinae+Gerbillinae и г) вид подсемейства Neotomynae. Внутри подсемейства Cricetinae были выделены 4 группы: a) виды рода Phodopus; б) виды рода Mesocricetus; в) Tscherskia triton и г) виды родов Cricetulus, Cricetus и Allocricetulus. В подсемействе Murinae были выделены три подклады, соответствующие исследованным родам. Виды подсемейства Arvicolinae с помощью кладистического анализа разделить на подклады не удалось (рис. 2). На основании выявленных в кариотипах всех исследованных видов хромосомных синтений был предложен предковый кариотип надсемейства Muroidea (Ancestral Muroidea Karyotype, AMK). Вероятно, AMK имел диплоидное число хромосом 2n=56 и содержал следующие хромосомы, гомологичные MAU1 (MMU2a), 2/21 (MMU19/7), 3a/11a (MMU18), 3b/13 (MMU4), 4a (MMU5a), 4b (MMU16a), 5a (MMU15a), 5b (MMU1a/17a), 5c (MMU1b/17b), 5d (MMU10a), 6/9a (MMU6), 7 (MMU8a/2b/13a), 8a (MMU1c), 8b/10a (MMU12a/17c), 9b (MMU8b), 9c (MMU17d), 10b (MMU16b/17e/11a), 11b (MMU13b/15a), 12 (MMU9), 14a (MMU10b/17f), 14b (MMU11b), 15 (MMU14a), 16 (MMU5b/14b), 17/19a (MMU3), 18 (MMU12b), 19b (MMU10c), 20 (MMU15b), X и Y (рис. 4). Мы использовали AMK и данные филогенетического анализа для обсуждения типов хромосомных перестроек, которые привели к формированию генома каждого исследованного вида. Для каждой ветви филогенетического древа подсчитано количество вероятных слияний и разделений предковых хромосом (рис. 2). ОБСУЖДЕНИЕ Отряд грызунов – самый многочисленный, но наиболее слабо исследованный отряд млекопитающих. Ряд вопросов таксономии и систематики отряда был решен благодаря сравнительным молекулярным исследованиям протяженных последовательностей ДНК. Однако некоторые вопросы до сих пор остаются спорными. Известно, что массовая радиация надсемейств грызунов происходила 55-65 млн лет назад (Huchon et al., 2002). Такой краткий в эволюционном плане промежуток времени создает проблемы при использовании замен нуклеотидов в качестве характеристик для филогенетического анализа. Напротив, хромосомные характеристики дают достаточное разрешение, поскольку они вовлечены в процессы видообразования (King, 1993) и могут фиксироваться в течение короткого периода времени (Britton-Davidian et al., 2000; Wang, Lan, 2000; Dobigny et al., 2005; Aniskin et al., 2006). Рисунок 4. Предковый кариотип надсемейства Muroidea (AMK) и интеграция с наборами пэйнтинг-проб хромосом M. auratus (MAU, нумерация справа от идиограммы) и M. musculus (MMU, нумерация слева от идиограммы, курсивом). Каждая хромосома предкового кариотипа (нумерация снизу) представлена в виде фрагментов хромосом M. auratus. По результатам нашего исследования подотряд Sciuromorpha занял базальную позицию на общем древе грызунов (рис. 2). Одна сегментная ассоциация (HSA1/7) и разрывы трех синтений (HSA1/10, 7/16 и 9/11) подтверждают существование клады Castorimorpha+Anomaluromorpha+Myomorpha, что полностью согласуется с данными молекулярных исследований. Четыре сегментные ассоциации (HSA3/10, 3/12, 5/17 и 11/15) и разрыв синтении HSA14/15 были идентифицированы как синапоморфии для Castorimorpha+Myomorpha. Дополнительно результаты сравнительного хромосомного пэйнтинга показывают, что ассоциация HSA12/22 представлена в виде единичного фрагмента в геномах C. fiber и S. betulina, но в виде двух фрагментов у O. cuniculus. Это подтверждает справедливость объединения Castorimorpha и Myomorpha. Несмотря на то, что некоторые выявленные характеристики были гомоплазическими для Castorimorpha, Anomaluromorpha и Myomorpha (4 для Castor и Pedetes, 2 для Sicista и Pedetes), проведенный анализ четко показывает, что Castorimorpha и Myomorpha филогенетически более близки друг другу, чем Anomaluromorpha. На рис. 2 приведена схема кариотипических отношений для всех исследованных в работе видов мышевидных грызунов. Схема отражает предполагаемый ход эволюции кариотипов. В основании древа лежит предковый кариотип группы Sciurognathi. Известно, что Dipodoidea и Muroidea разделились приблизительно 45 млн лет назад (McKenna, Bell, 1997). Из-за того, что для исследования геномов Dipodoidea и Muroidea были использованы различные наборы пэйнтинг проб, мы пока не можем говорить о количестве и типах хромосомных перестроек, приведших к формированию кариотипов предков этих надсемейств. Предполагаемый кариотип предка надсемейства Muroidea (AMK) имеет 2n=56 (рис. 4). Формирование кариотипа Calomyscus sp. сопровождалось двумя разрывами предковой хромосомы AMK4, слияниями AMK10+18+17 и AMK3+20+25. Два слияния предковых хромосом AMK23+25 и AMK21+27 привели к формированию общего предкового кариотипа семейств Cricetidae и Muridae. Предполагается, что он характеризовался диплоидным числом хромосом 2n=52. Формирование кариотипов предков семейств Cricetidae (приблизительно 34 млн лет назад, McKenna, Bell, 1997) и Muridae (23-16 млн лет назад, обзор: Musser, Carleton, 2005) сопровождалось небольшим числом хромосомных перестроек: AMK12+26 (для Cricetidae), разрывами AMK3 и AMK7 (для Muridae). Таким образом, для этого этапа эволюции Muroidea характерна скорость кариотипических изменений, сравнимая со средней скоростью кариотипической эволюции млекопитающих (Графодатский, 2001). Род Peromyscus подсемейства Neotomynae отделился от ствола Cricetidae 511 млн лет назад (из: Musser, Carleton, 2005). Кариотипическая эволюция таксона сопровождалась разрывом AMK17 и слияниями AMK13+AMK17a, AMK20+24. Разрывами предковых хромосом AMK2 и AMK12 характеризовалось возникновение общего предка подсемейств Arvicolinae и Cricetinae. Датировки возникновения современных Arvicolinae и Cricetinae сильно расходятся (из: Musser, Carleton, 2005). Со времени отделения от общего предка в геноме предка Cricetinae произошло восемь перестроек хромосом: разрывы ассоциации AMK23+25, разрыв хромосомы AMK17, слияния AMK19+25, AMK6+15, AMK10+13+AMK17a, AMK5+AMK17b, AMK8+20. Для подсемейства Arvicolinae характерны 18 перестроек предковых хромосом: разрывы AMK1, 2, 3, 4, 7 (дважды), 8, 12+26, 19, слияния AMK15+18, 19+2a+7a+22, 12+17, 7b+13, инверсия внутри сегмента AMK 7b+13. Из подсемейства Cricetinae наибольшую скорость хромосомных изменений демонстрируют представители родов Tscherskia и Phodopus, среди Arvicolinae существенная перестроенность кариотипа характерна для E. lutescence. Интересно, что второй представитель рода Ellobius (E. talpinus) характеризуется одним из наименьших чисел разрывов/слияний предковых хромосом среди Arvicolinae. Дивергенция Gerbillinae и Murinae происходила около 18 млн лет назад (Musser, Carleton, 2005). Предковый кариотип подсемейства Murinae характеризуется четырьмя разрывами (AMK17 дважды, AMK19 и AMK21) и двумя слияниями (AMK10+17a, AMK 17b+21a) предковых хромосом относительно предка Muridae. Формирование предкового кариотипа подсемейства Gerbillinae сопровождалось огромным числом хромосомных перестроек: со времени отделения от общего предка семейства Muridae 20 разрывов, 26 слияний и, по крайней мере, 4 инверсии произошли в геноме предка таксона. Скорость хромосомной эволюции для M. lybicus составляет примерно 2,5 перестройки на млн лет. В среднем скорость геномных перестроек в надсемействе Muroidea оценивается как одна перестройка на 1 млн лет (Murphy et al., 2001a), таким образом, M. lybicus демонстрирует высокую скорость кариотипической эволюции даже среди Muroidea. По различным данным от 8 (Steppan et al., 2004) до 10-20 (Guilly et al., 1999; Stanyon et al., 1999; Guilly et al., 2001) млн лет эволюции разделяют роды Mus и Rattus. Эволюционное возникновение рода Apodemus датируют 7.5-11.1 млн лет (из: Musser, Carleton, 2005). Скорость кариотипической эволюции при формировании общего предка родов Apodemus и Rattus не превышала среднюю скорость эволюции в таксоне Muroidea. Значительными преобразованиями кариотипа сопровождалось формирование предка рода Mus. Ранее для этого рода была показана неравномерность темпов хромосомных преобразований в различных ветвях филогенетического древа (Veyrunes et al., 2006). По данным пэйнтинга видно, что для кариотипа M. platythrix характерно в 3 раза больше перестроек хромосом, чем для M. musculus. Напротив, для представителей рода Apodemus показан удивительный консерватизм геномной организации. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Применение метода сравнительного хромосомного пэйнтинга и бэндинга позволило провести сравнительный анализ кариотипов 1 представителя Dipodoidea и 27 видов Muroidea; еще 10 видов мышиных грызунов были включены в анализ из литературных источников. Из изученных видов 18 являются представителями подсемейства Cricetinae, что делает этот таксон наиболее исследованным с помощью современных молекулярноцитогенетических методов. По результатам работы была составлена детальная картина кариотипической эволюции грызунов. Путем анализа данных локализации пэйнтинг-проб на хромосомах видов из отряда грызунов и из других отрядов млекопитающих, на основании принципов кладистики и парсимонии, были идентифицированы консервативные сегменты хромосом, унаследованные от общего предка. В результате удалось реконструировать вероятный предковый кариотип группы Sciurognathi c 2n=50, для которого характерны следующие ассоциации сегментов хромосом человека: HSA1/10, 3/19, 3/21, 7/16, 8/4/4, 9/11, 12/22, 12/22, 14/15, 16/19. Пока представители подотряда Hysticomorpha не включены в сравнительные цитогенетические исследования, предложенную структуру кариотипа можно считать предковой для всего отряда грызунов. Перестройки, описанные с помощью проб M. auratus, являются хорошими филогенетическими маркерами на уровне подотрядных отношений. Из суммы имеющихся на сегодняшний день данных G-бэндинга и пэйнтинга хромосом представителей надсемейства Muroidea, в том числе и наши данные, можно утверждать, что предковый кариотип таксона состоял из 27 элементов и половых хромосом. Кладистический анализ хромосомных характеристик, выявленных в геномах Muroidea, позволил установить детальную схему филогенетических связей между исследованными видами грызунов. Феномен катастрофической эволюции, описанный для грызунов подотряда Myomorpha, гиббоновых и собачьих, нашел многочисленные подтверждения в рамках данной работы, при этом была показана неравномерность скоростей кариотипических преобразований, установленная ранее только для мышей рода Mus. Формирование кариотипов ныне живущих видов Muroidea сопровождалось разрывами предковых хромосом, их слияния в самых различных комбинациях, инверсиями. Среди исследованных в работе видов особый интерес вызывают T. triton, E. lutescens и M. lybicus кариотипы которых, по сравнению с другими видами, характеризуются огромным числом разрывов и слияний предковых хромосом. В заключение следует отметить, что общее число видов Myomorpha, изученных нами и другими авторами методом сравнительного хромосомного пэйнтинга, составляет около 3% от всех видов подотряда. Принимая во внимание разнообразие кариотипов в этом таксоне, мы можем предвидеть получение интересных результатов по мере включения в сравнительные цитогенетические и геномные исследования других представителей подотряда Myomorpha. ВЫВОДЫ 1. По результатам локализации наборов пэйнтинг-проб золотистого хомячка (Mesocricetus auratus), китайского хомячка (Cricetulus griseus) и домовой 2. 3. 4. 5. 6. 7. мыши (Mus musculus) на хромосомах 27 видов Myomorpha построена интегративная карта хромосом всех исследованных видов. Исследованы кариотипические взаимоотношения между 17 видами из подсемейства хомяковых Cricetinae (Cricetidae, Myomorpha). Построены сравнительные хромосомные карты для 6 родов хомяковых: Allocricetulus, Cricetulus, Cricetus, Mesocricetus, Phodopus и Tscherskia. Показано, что основными перестройками, сопровождавшими дивергенцию хомяковых, были слияния и разделения предковых хромосомных элементов, инверсии, приобретение блоков гетерохроматина. Исследованы кариотипические взаимоотношения между 6 видами из подсемейства полевковых Arvicolinae (Cricetidae, Myomorpha). Установлено, что основными перестройками, сопровождавшими эволюцию кариотипов полевковых, были Робертсоновские транслокации. Предложены предковые кариотипы семейств хомяковых (Cricetidae), мышиных (Muridae), надсемейства Muroidea. Идентифицированы маркерные слияния элементов предковых хромосом, приведшие к формированию кариотипа каждого исследованного вида. Показана неравномерность скоростей кариотипической эволюции для различных ветвей филогенетического древа Muroidea. Впервые с помощью пэйнтинг проб человека (Homo sapiens) исследован кариотип представителя подотряда Myomorpha – лесной мышовки (Sicista betulina). По результатам интеграции ранее опубликованных данных и данных настоящей работы определено положение подотряда Myomorpha на филогенетическом древе грызунов, реконструирован предковый кариотип группы Sciurognathi. Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Трифонов В.А., Перельман П.Л., Романенко С.А., Билтуева Л.С., Графодатский А.С. Филогеномика млекопитающих: цитогенетические аспекты. // Биологические мембраны 2005. Т. 22. №3. С. 210-224 2. Трифонов В.А., Перельман П.Л., Романенко С.А., Графодатский А.С. Эволюционно-цитогенетическое разнообразие млекопитающих. // В.К. Шумный, Ю.И. Шокин, Н.А. Колчанов, А.М. Федотов (ред.): Биоразнообразие и динамика экосистем: информационные технологии и моделирование. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2006. С. 361-368. (Интеграционные пректы СО РАН; вып. 7). 3. Krast C., Trifonov V., Romanenko S., Clausen U., Mrasek K., Michel S., Avner P., Liehr T. Molecular cytogenetic characterization of mouse cell line WMP2 by spectral karyotyping and multicolor banding applying murine probes. // Int. J. Mol. Med. 2006. V. 17. P. 209-213. 4. Liehr T., Starke H., Heller A., Kosyakova N., Mrasek K., Gross M., Karst C., Steinhaeuser U., Hunstig F., Fickelscher I., Kuechler A., Trifonov V., Romanenko S.A., Weise A. Multicolor fluorescence in situ hybridization (FISH) 5. 6. 7. 8. 9. applied to FISH-banding. // Cytogenet Genome Res. 2006. V. 114(3-4). P. 240244. Romanenko S.A., Perelman P.L., Serdukova N.A., Trifonov V.A., Biltueva L.S., Wang J., Li T., Nie W., O’Brien P.C.M., Volobouev V.T., Stanyon R., Ferguson-Smith M.A., Yang F., Graphodatsky A.S. Reciprocal chromosome painting between three laboratory rodent species. // Mamm Genome. 2006. V. 17. P. 1183-1192. Romanenko S.A., Volobouev V.T., Perelman P.L., Lebedev V.S., Serdukova N.A., Trifonov V.A., Biltueva L.S., Nie W., O’Brien P.C.M., Bulatova N.Sh., Ferguson-Smith M.A., Yang F., Graphodatsky A.S. Karyotype evolution and phylogenetic relationships of hamsters (Cricetidae, Muroidea, Rodentia) inferred from chromosomal painting and banding comparison. // Chromosome Res. 2007. V. 15. P. 283-297. Sitnikova N.A., Romanenko S.A., O’Brien P.C.M., Perelman P.L., Fu B., Rubtsova N.V., Serdukova N.A., Golenishchev F.N., Trifonov V.A., FergusonSmith M.A., Yang F., Graphodatsky A.S. Chromosomal evolution of Arvicolinae (Cricetidae, Rodentia). I. The genome homology of tundra vole, field vole, mouse and golden hamster revealed by comparative chromosome painting. // Chromosome Res. 2007. V. 15. P. 447-456. Romanenko S.A., Sitnikova N.A., Serdukova N.A., Perelman P.L., Rubtsova N.V., Bakloushinskaya I.Yu., Lyapunova E.A., Just W., Ferguson-Smith M.A., Yang F, Graphodatsky A.S. Chromosomal evolution of Arvicolinae (Cricetidae, Rodentia). II. The genome homology of two mole voles (genus Ellobius), the field vole and golden hamster revealed by comparative chromosome painting. // Chromosome Res. 2007. V. 15(7). P. 891-897 Graphodatsky A.S., Yang F., Dobigny G., Romanenko S.A., Biltueva L.S., Perelman P.L., Violetta R. Beklemisheva, Alkalaeva E.Z., Serdukova N.A., Ferguson-Smith M.A., Murphy W.J., Robinson T.J. Tracking genome organization in rodents by Zoo-FISH. // Chromosome Res. Doi: 10.1007/s10577-007-1191-5.