БЫКОВА Мария Валерьевна НАРУШЕНИЕ РЕДОКС-БАЛАНСА СПЕРМАТОЗОИДОВ И

На правах рукописи
БЫКОВА
Мария Валерьевна
НАРУШЕНИЕ РЕДОКС-БАЛАНСА СПЕРМАТОЗОИДОВ И
СЕМЕННОЙ ПЛАЗМЫ МУЖЧИН ПРИ ПАТОСПЕРМИИ
03.00.04 - биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Красноярск – 2008
2
Работа выполнена на кафедре биохимии и физиологии человека и животных
ГОУ ВПО «Сибирский федеральный университет» и в Центре
репродуктивной медицины г. Красноярска
Научный руководитель:
кандидат биологических наук,
доцент
Титова Надежда Митрофановна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук
Меньщикова Елена Брониславовна
доктор медицинских наук
Душкин Михаил Иванович
Ведущая организация:
Институт биофизики СО РАН
Защита диссертации состоится «___» ______________ 2008 г. в ____часов на
заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в Государственном
учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН
по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного
учреждения Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН.
Автореферат разослан «___» _____________ 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Русских Г.С.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Мужская репродуктивная система, являясь одной из наиболее
чувствительных и ранимых в организме, подвергается воздействию целого
ряда неблагоприятных факторов, которые, влияя на эндокринные железы,
центральную нервную систему и непосредственно на гонады, вызывают
дистрофические изменения в семенных канальцах и межуточной ткани
яичек. Это приводит к снижению оплодотворяющей способности эякулята и,
как следствие, к нарушению репродукции в супружеской паре (бесплодию,
невынашиванию беременности, рождению неполноценного потомства). В
литературе последнего десятилетия появляются данные, что важным
патогенетическим звеном при развитии мужской инфертильности
(независимо от этиологии) является наличие окислительного стресса (Sharma
RK. et al, 1999; Gil-Guzman E. et al, 2001; Sikka S., 2001).
В эякуляте источниками образования АФК являются как сами
сперматозоиды (при неправильной дифференциации клеток во время стадий
сперматогенеза), так и лейкоциты. Генерация АФК в сперме может иметь как
позитивные последствия, так как во время капацитации и акросомальной
реакции АФК подготавливают спермий для связывания и оплодотворения
яйцеклетки (deLamirande Е. et al, 1997; O’Flaherty CM. et al, 1999), так и
негативные, приводя к снижению жизнеспособности клетки. Положительный
эффект связан с умеренной продукцией АФК, тогда как гиперпродукция
приводит к неблагоприятными последствиям. Кроме того, окислительный
стресс в эякуляторных спермиях может быть вызван активацией синтеза
АФК в комбинации с бедностью антиоксидантных компонентов в семенной
плазме. Нарушение редокс-баланса может быть важной причиной мужского
бесплодия (Sharma RK. et al, 1999; Gil-Guzman E. et al, 2001; Sikka S., 2001).
В то же время механизмы развития ОС, его выраженность при
различных видах патоспермии, а также функциональная активность АОС в
изучаемой нами литературе не имеют достаточного освещения. В
немногочисленных работах, посвященных исследованию антиоксидантного
статуса при мужском бесплодии, состояние АОС больных оценивается в
большинстве случаев по активности СОД и ГПО либо по концентрации
одного из продуктов ПОЛ, что не может дать полноценного представления о
состоянии окислительно-восстановительного гомеостаза.
Комплекс лечебных мероприятий при мужском бесплодии включает
как медикаментозное консервативное лечение, так и хирургическое
вмешательство при тяжелых формах патологии. В последнее время в
практику терапии идиопатического бесплодия внедряются методы лечения,
обеспечивающие антирадикальную защиту органа и организма в целом.
Чаще в качестве терапии антиоксидантами применяются витамины Е, С,
карнитин и др. (Rolf C. et al, 1999; Keskes-Ammar I. et al, 2003).
Приведенные данные свидетельствуют об актуальности проблемы и
целесообразности проведения исследований по изучению особенностей
4
развития окислительного стресса и состояния АОС при различных видах
нарушения сперматогенеза.
Цель исследования
Выявить
закономерности
изменения
прооксидантного
и
антиоксидантного статуса сперматозоидов и семенной плазмы у мужчин с
различными типами нарушения сперматогенеза.
Задачи исследования
1. Изучить интенсивность процессов перекисного окисления липидов в
спермиях и семенной плазме у мужчин при нормозооспермии и при
нарушении сперматогенеза.
2. Исследовать состояние антиоксидантной системы семенной плазмы
и спермиев у мужчин при патоспермии и нормозооспермии.
3. Установить характер взаимосвязи между физиологическими
параметрами и редокс-балансом эякулята и его изменение в зависимости от
вида патоспермии.
Научная новизна и теоретическая значимость
Впервые при нарушении нормального сперматогенеза проведена
оценка интенсивности ПОЛ: дифференцированно исследовано содержание
диеновых конъюгатов и малонового диальдегида в спермиях и семенной
плазме у мужчин. Впервые у мужчин при патоспермии проведено
комплексное исследование внутриклеточного и экстрацеллюлярного звена
АОС по показателям супероксиддисмутазы, каталазы, восстановленного
глутатиона,
глутатионпероксидазы,
глутатион-S-трансферазы,
глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Установлено, что у
мужчин при нарушении сперматогенеза по сравнению с нормозооспермией в
семенной плазме и спермиях происходит интенсификация процессов
перекисного окисления липидов и снижение мощности антиоксидантной
защиты.
Вычленены и охарактеризованы достоверно значимые различия в
состоянии редокс-баланса у мужчин с разными формами нарушений
сперматогенеза. Установлено, что лимитирующим фактором при развитии
разных типов патоспермии является нарушение различных звеньев
антиоксидантной защиты.
Предложен коэффициент, позволяющий оценить соотношение про- и
антиоксидантных процессов как в спермиях, так и в семенной плазме.
Впервые установлены взаимосвязи между физиологическими
параметрами эякулята с одной стороны, содержанием продуктов ПОЛ и
активностью антиоксидантной защиты с другой стороны и их изменения в
зависимости от вида патоспермии.
Материалы диссертации используются при чтении курсов:
«Биохимия», «Биохимия тканей» студентам Сибирского федерального
университета, обучающимся по специальности «Биохимия». Методики,
изложенные в диссертации, включены в разделы большого практикума по
биохимии на кафедре биохимии и физиологии человека и животных СФУ, а
5
также используются студентами при выполнении курсовых и дипломных
работ.
Практическая значимость
Исследование функциональной активности антиоксидантной системы и
продуктов липидной пероксидации позволяет оценить степень тяжести
окислительного стресса при патоспермии. В процессе исследования
установлено, что максимальная депрессия антиоксидантной способности
семенной плазмы отмечена при тератоастенозооспермии, тогда как в
спермиях – при тератозооспермии.
Изучение состояния антиоксидантной системы семени у мужчин при
нарушении сперматогенеза позволяет своевременно принимать меры,
направленные на коррекцию окислительно-восстановительного гомеостаза.
Кроме того, оценка тяжести ОС как в спермиях, так и в семенной плазме у
каждого конкретного мужчины имеет важное значение с точки зрения
прогноза развития дальнейших осложнений, что в конечном итоге влияет на
оплодотворяющую способность спермиев и развитие эмбриона из
генетического материала сперматозоидов.
Результаты исследования антиоксидантного статуса семени могут быть
использованы
при
дифференциальной
диагностике
мужского
идиопатического бесплодия (бесплодия неясного генеза). Пациентам с
выраженным ОС рекомендуется принимать антиоксидантную терапию,
позволяющую предотвратить утяжеление патологии.
Результаты проведённых исследований внедрены в практику работы
Центра репродуктивной медицины (г. Красноярск).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Независимо от вида патоспермии по сравнению с
нормозооспермией у мужчин происходит интенсификация процессов ПОЛ
как в семенной плазме, так и в спермиях.
2. Патоспермия сопровождается снижением активности большинства
антиоксидантных ферментов (каталазы, глутатионпероксидазы, глутатион-Sтрансферазы) и содержания восстановленного глутатиона в спермиях и
семенной плазме на фоне повышения активности супероксиддисмутазы.
3. Буферная емкость антиоксидантной системы семенной плазмы
превышает таковую у сперматозоидов.
4. Для патоспермии характерна отрицательная корреляционная
взаимосвязь интенсивности процессов ПОЛ с подвижностью спермиев и
положительная − с количеством аномальных форм сперматозоидов.
Апробация работы. Основные положения и результаты исследования
обсуждены на: Межрегиональной научно-практической конференции
"Объединение
субъектов
Российской
Федерации
и
проблемы
природопользования в Приенисейской Сибири" (Красноярск, 2005);
Всероссийской научно-практической конференции Российской ассоциации
репродукции человека (Чебоксары, 2005); Международном молодежном
медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения" (СанктПетербург, 2005); научной конференции молодых ученых Ростовского
6
государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2006); 63
ежегодном международном конгрессе американского общества по
репродуктивной медицине (Вашингтон, 2007); научно-практическом
симпозиуме с международным участием «Свободнорадикальная медицина и
антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2008); IV съезде Российского
общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в
том числе 3 статьи и 3 тезиса в журналах, рекомендованных ВАК для
публикации материалов кандидатских диссертационных работ.
Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 127
страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,
главы «Материалы и методы», главы «Результаты и их обсуждение»,
заключения, выводов, списка литературы, включающего 40 отечественных и
186 иностранных источников. Работа иллюстрирована 10 рисунками и 10
таблицами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для биохимического анализа использовалась сперма 176 мужчин в возрасте
22-48 лет (средний возраст 32,5±2,5 года), которые проходили
предварительное обследование в Центре репродуктивной медицины г.
Красноярска по причине подозрения на бесплодие. У пациентов получено
информированное согласие на проведение исследований. В зависимости от
показателей спермограммы были выделены 4 группы пациентов: 1 – с
нормозооспермией (n=95), 2 – с астенозооспермией (n=40), 3 – с
тератозооспермией (n=19), 4 – с тератоастенозооспермией (n=22). Первая
группа мужчин являлась контрольной (эякулят соответствовал нормативным
показателями и обладал высокой оплодотворяющей способностью).
Астенозооспермия – форма нарушения нормального сперматогенеза, когда
подвижность ниже нормативных значений, тератозооспермия – когда
морфология
ниже
нормативных
значений,
соответственно
тератоастенозооспермия − сочетанная патология. Нормативные значения
эякулята (по руководству ВОЗ, 1992): объем 2,0 мл и более, рН 7,2 и более,
концентрация 20 миллионов в 1 миллилитре, общая концентрация 40
миллионов, подвижность 50% и более подвижных, морфология менее 40%
аномальных спермиев. Для сдачи спермы мужчины использовали метод
мастурбации. Получению спермы предшествовало воздержание в течение 2-7
дней.
Анализ спермограммы включал определение времени разжижения,
цвета эякулята, измерение объема, вязкости, степени агглютинации,
концентрации спермиев, характер подвижности и морфологии спермиев по
критериям ВОЗ (WHO, 1992).
Объектами исследования послужили спермии и семенная жидкость
пациентов Центра репродуктивной медицины г. Красноярска. Для
исследования брали 1-2 мл эякулята. Спермии отделяли от семенной
жидкости центрифугированием в течение 15 мин при 1700 g. Полученный
осадок промывали в десятикратном объеме 0,9 % NaCl и вновь
7
центрифугировали в течение 10 мин с последующим удалением
надосадочной жидкости. Такую процедуру повторяли 3 раза. Полученные
объекты исследования использовались для измерения изучаемых параметров
спектрофотометрическим
и
биохемилюминисцентным
методами.
Количество белка для последующих расчетов измеряли микробиуретовым
методом.
О содержании продуктов липидной пероксидации судили по
содержанию МДА (Ko K.M. et al., 1990) и уровню ДК (Каган B.E. и др.,
1986). Определение содержания малонового диальдегида основано на
взаимодействии МДА с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) с образованием
хромогена с максимумом поглощения в красной области видимого спектра
при длине волны 532 нм. Определение содержания ДК проводили в
экстрактах сперматозоидов и семенной жидкости. Для этого липиды из
сперматозоидов экстрагировали стократным избытком смеси растворителей
(гептан-изопропанольная смесь в соотношении 1:1). В гептановом экстракте
(верхняя фаза) исследовали содержание сопряженных диенов, которые
определяли по оптической плотности пробы при 233 нм.
О состоянии АОС судили по содержанию ГSН (Beutler Е., 1990),
активности глутатионпероксидазы (Beutler Е., 1990), глутатион-Sтрансферазы (Habig W.H. et al., 1974), СОД (Сирота Т.В., 1999), каталазы
(Королюк М.А. и др, 1988).
Определение количества восстановленного глутатиона основано
на взаимодействии ГSH с ДТНБК (5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной
кислотой) с образованием окрашенного в желтый цвет аниона ''2-нитро5-тиобензоата.
Интенсивность
окраски
регистрировали
спектрофотометрически при длине волны 412нм (Beutler Е., 1990).
Мерой активности ГПО является скорость окисления ГSH в
присутствии гидроперекиси трет - бутила (ГПТБ). Концентрацию ГSH до и
после инкубации определяли спектрофотометрически. В основе развития
цветной реакции лежит взаимодействие SH-группы ГSH с 5,5'дитиобис"2-нитробензойной кислотой (ДТНБК) с образованием
окрашенного продукта - тионитрофенильного аниона (ТНФА). Количество
последнего прямо пропорционально количеству SH-групп ГSH,
прореагировавших с ДТНБК. Присутствие азида натрия (NaN3) в инкубате
подавляет каталазную и псевдокаталазную активность в пробе и не влияет
на активность ГПО (Beutler Е., 1990).
Активность глутатион-S-трансферазы определяли по скорости
образования глутатион-S-конъюгатов между ГSH и 1-хлор-2,4динитробезолом (ХДНБ). Увеличение концентрации конъюгатов в ходе
реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 340 нм
(максимум поглощения глутатион -S-ХДНБ) (Habig WH. et al., 1974).
Принцип метода определения активности СОД основан на
ингибировании реакции автоокисления адреналина в щелочной среде в
присутствии СОД вследствие дисмутации супероксидных анион-радикалов,
которые являются продуктом одного из этапов окисления и, по-видимому,
8
одновременным участником его последующих стадий. Исходная
концентрация адреналина в пробе составляет 230 мкМ. Об интенсивности его
автоокисления судили по динамическому нарастанию поглощения при длине
волны 347 нм, обусловленному накоплением продукта окисления (с
максимумом поглощения при 480 нм) (Сирота Т.В., 1999).
Принцип метода определения активности каталазы основан на
образовании окрашенного в желтый цвет комплекса не разрушенной в ходе
каталазной реакции перекиси водорода с молибдатом аммония (Королюк
М.А. и др., 1988).
Биолюминесцентным методом определяли активность глюкозо-6фосфатдегидрогеназы
(Г6ФДГ)
и
глутатионредуктазы
(ГР).
Биолюминесцентное определение активности дегидрогеназ сперматозоидов
проводили по модифицированной самостоятельно разработанной методике
(Савченко А.А., 1989). Для этого суспензию выделенных сперматозоидов,
содержащую 2 млн. клеток, после однократного замораживания −
размораживания дополнительно разрушали путем осмотического лизиса
добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему) и 1,0-2,0 мМ
дитиотреитола. В 600 мкл инкубационной смеси, содержащей
соответствующий субстрат и кофактор, вносили 200 мкл суспензии
разрушенных сперматозоидов.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием
пакета прикладных программ «Statistica 7.0» (StatSoft Inc., 2004). Для всех
данных определяли медиану (Ме) и интерквартильный разброс в виде
подсчета 25- (С25) и 75-процентилей (С75). Все полученные результаты
проверяли на нормальность с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. В
связи с тем, что распределение полученных данных не соответствовало
нормальному, использовался непараметрический U-критерий Манна-Уитни
при сравнении двух несвязанных выборок. Различия между показателями
считали достоверными при значении р≤0,05. Оценка взаимосвязи
исследуемых показателей осуществлялась подсчетом коэффициента
ранговой корреляции по Спирману.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Показатели
спермограммы
в
исследуемых
группах
Параметры спермограмм в группах пациентов, включенных в обследование,
представлены в табл.1. Пациенты с лейкоцитоспермией исключались из
группы обследуемых. Клетки сперматогенеза, эпителиальные клетки,
лейкоциты, клеточный дебрис объединялись в понятие «круглые клетки», и
средняя величина данного показателя во всех группах мужчин была в норме
и не превышала 1 000 000 клеток/мл, что говорит об отсутствии острых
воспалительных процессов (или лейкоцитоспермии) у обследованных
мужчин (WHO, 1992).
9
Таблица 1
Параметры спермограмм в обследованных группах мужчин
Группа
Нормозооспермия
(n=95)
Астенозооспермия
(n=35)
Тератозооспермия
(n=20)
Тератоастенозооcпермия (n=25)
Количество сперматозоидов (Ме(С25;С75))
Концентр.,
ПрогрессивСлабоподАномальмлн/мл
ноподвиж., %
вижные, %
ные, %
64,5
57,0
6,0
34,5
(41;105)
(52,0;63,0)
(5,0;8,0)
(31,0;39,0)
47,5*
(26,0;90,0)
34,5**
(29,0;41,0)
7,0
(5,0;10,0)
39,0*
(35,0;43,0)
53,5
(23,0;90,0)
45,0*
(39,4;51,0)
7,0*
(6,0;10,5)
52,0**
(50,0;55,0)
29,0**
(20,0;62,0)
25,0**
(21,0;34,0)
9,0**
(7,0;12,0)
56,0**
(52,0;61,0)
Примечание:*- р<0,05, **-р<0,001 в сравнении с нормозооспермией.
Обследуемые в работе группы достоверно отличались по общей
концентрации и содержанию прогрессивноподвижных сперматозоидов.
Такие параметры как pH и объем эякулята не различались достоверно между
группами.
Содержание продуктов перекисного окисления липидов в
сперматозоидах и семенной плазме при патоспермии
В ряде работ выявлено, что при мужском бесплодии происходит
повышение уровня МДА (Sanocka D. et al, 1996; Lenzi A. et al, 2000; Tavilani
H. et al, 2005), причем большинство исследователей анализировали
содержание этого соединения в основном в семенной плазме инфертильных
мужчин, не подразделяя их на группы согласно видам патоспермии. Данные
же об интенсивности процессов липопероксидации в семенной плазме и
спермиях при разных видах патоспермии
немногочисленны и
противоречивы (Alvarez JG., Storey BT., 1982; Calamera J. et al, 2003; Tavilani
H. et al, 2005). Принимая во внимание вышесказанное, нами исследовалось в
сперматозоидах и семенной плазме содержание как первичных, так и
вторичных продуктов ПОЛ в зависимости от вида нарушения
сперматогенеза.
Содержание ДК и МДА при всех формах патоспермии было повышено
по сравнению с нормозооспермией как в сперматозоидах, так и в семенной
плазме (рис 1).
10
***
***
***
*
**
*
**
***
**
**
Примечание: *-р<0,05, **-р<0,001, ***-р<0,0001 в сравнении с
нормозооспермией
Рис 1. Содержание диеновых конъюгатов и малонового диальдегида в
спермиях и семенной плазме в исследуемых группах мужчин в процентах.
В сперматозоидах при астено-, терато- и тератоастенозооспермии по
сравнению с нормозооспермией уровень ДК был достоверно выше на 76%,
47% и 126% соответственно. В семенной плазме содержание ДК при астено-,
терато- и тератоастенозооспермии по сравнению с нормозооспермией
достоверно выше соответственно на 65%, 37% и 103%.
Содержание МДА при всех формах патоспермии было повышено в
сравнении с нормозооспермией как в сперматозоидах, так и в семенной
плазме. В сперматозоидах при астено- и тератоастенозооспермии по
сравнению с нормозооспермией уровень МДА был достоверно выше на 54%
и 147% соответственно, а при тератозооспермии недостоверно повышался на
27%. В семенной плазме содержание МДА при астено- и
тератоастенозооспермии по сравнению с нормозооспермией достоверно
выше на 67% и 131% соответственно, а при тератозооспермии наблюдалась
тенденция увеличения содержания МДА на 59%.
По клиническим характеристикам спермограмма «тератоастенозооспермия» является более тяжелой формой нарушения сперматогенеза. В
нашей работе количество как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ
при тератоастенозооспермии было наибольшим по сравнению со всеми
другими формами патоспермии.
Накопление продуктов пероксидации может вести к появлению в
мембранах своеобразных пор за счет увеличения содержания гидрофильных
углеводородных хвостов, а также к увеличению ее жесткости за счет
снижения содержания ненасыщенных жирных кислот и, таким образом,
влиять на проницаемость мембран.
11
Таким образом, полученные нами результаты по увеличению
содержания как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ позволяет
считать, что клеточные мембраны при патоспермии претерпевают
существенные структурные изменения, что ведет к снижению
оплодотворяющей способности спермиев.
В результате чрезмерной интенсификации процессов ПОЛ текучесть
мембраны спермиев уменьшается и происходит перестройка фосфолипидов,
что может индуцировать снижение мембранной проницаемости. Это, в свою
очередь, является губительным для выполнения спермием своих функций
(Aitken RJ. et al, 1995; Storey BT. et al, 1997). Перекисные продукты могут
оказать негативное влияние на подвижность (Aitken RJ., 2000; Luconi M. et al,
2006), акросомальную реакцию и взаимодействие сперматозоида с ооцитом
(Nolan JP., Hammerstedt RH., 1997; O’Flaherty CM. et al, 1999), приводить к
потере оплодотворяющей способности сперматозоидов человека и негативно
коррелировать с уровнем оплодотворения in vitro (Conte G. et al, 1999;
Comhaire FH. et al, 2000; Raineri I. et al, 2001).
В группе мужчин с астенозооспермией обнаружены отрицательные
взаимосвязи между процентом прогрессивноподвижных сперматозоидов и
содержанием ДК в спермиях (r= -0,50; p<0,01) и семенной плазме (r= -0,49;
p<0,01). Кроме того, определены положительные взаимосвязи между
процентом слабоподвижных спермиев и концентрацией МДА в спермиях
(r=0,44; p<0,05) и в семенной плазме (r=0,47; p<0,01). Точно также при
увеличении содержания МДА количество слабоподвижных спермиев растет,
при этом падает процент прогрессивноподвижных спермиев. Так же как в
группе «астенозооспермия», в группе «тератозооспермия» обнаружены
положительные взаимосвязи процента cлабоподвижных и МДА в спермиях
(r=0,57; p<0,05) и в семенной плазме (r=0,70; p=<0,01). Данный факт можно
объяснить тем, что мембраны сперматозоидов богаты ПНЖК и поэтому
сильно подвержены процессам липопероксидации, в ходе которой
повреждается целостность мембраны и клеточные структуры, а также
модифицируется работа систем клеточного метаболизма, вследствие чего
снижается подвижность спермиев (Aitken RJ., 2000).
В группе «нормозооспермия» процент аномальных сперматозоидов
положительно коррелирует с содержанием ДК в семенной плазме (r=0,21;
p<0,05), с концентрацией МДА в спермиях (r=0,22; p<0,05) и в семенной
жидкости (r=0,26; p<0,05).
Активность супероксиддисмутазы и каталазы в сперматозоидах и
семенной плазме при патоспермии
В норме процессы свободнорадикального окисления, в частности,
процессы ПОЛ, поддерживаются на стационарном уровне благодаря работе
антиоксидантной системы. Клетка, и сперматозоид в том числе, имеют такие
защитные механизмы против АФК как СОД и каталаза, ГПО и др. (Lewis SE.
et al, 1995; Poveri A. et al, 2002; Sheweita S. et al, 2005).
12
В нашей работе определялась суммарная активность СОД (Cu, Zn-CОД
и Mn-СОД) и активность каталазы в спермиях, в семенной плазме −
активность внеклеточной или экстрацеллюлярной Cu, Zn-CОД (СОДэц) и
каталазоподобная активность в зависимости от типа нарушения
сперматогенеза. Результаты представлены на рис. 2.
*
**
**
*
**
**
*
**
***
Примечание: *-р<0,05, **-р<0,001, ***- р<0,0001 в сравнении с
нормозооспермией.
Рис 2. Активность СОД и каталазоподобной активности в спермиях и
семенной плазме у мужчин в норме и при патоспермии в процентах.
Активность СОД была достоверно выше при астено-, терато- и
тератоастенозооспермии по сравнению с нормозооспермией в спермиях
человека на 46, 34 и 53 %. В семенной плазме при тератозооспермии в
сравнении с нормозооспермией отмечена тенденция к достоверному
повышению активности СОД на 14%, при астено- и тератоастенозооспермии
активность супероксиддисмутазы достоверно увеличивалась на 18% и 23%.
При астено- и тератоастенозооспермии по сравнению с
нормозооспермией в спермиях человека выявлено достоверное снижение
активности каталазы соответственно на 40% и 39 %. Достоверное снижение
каталазоподобной активности наблюдается в семенной плазме на 47% и 48 %
при астено- и тератоастенозооспермии по сравнению с нормозооспермией
соответственно.
Найденное нами изменение активности СОД и каталазы может быть
связано, главным образом, с модифицирующим действием АФК на
ферментативные белки.
Модификации под действием АФК могут подвергаться все
аминокислотные остатки, но наиболее чувствительными являются остатки
триптофана, тирозина, гистидина и цистеина. Кроме того, отмечена роль
окислительной модификации лизина, аргинина, пролина и серина (Devies KJ.
et al, 1987; Арчаков А.И., Мохосеев И.М., 1989).
13
Так, возможность модификации СОД кислородными радикалами
показана в работах Дэвиса с соавт. (Devies КJ. et al, 1987). К тому же, наличие
в структуре каталитического центра СОД остатков гистидина, аргинина,
ионов меди, а также дисульфидного мостика между гистидином-58 и -160
увеличивает вероятность воздействия АФК на данный фермент.
В нашей работе негативное влияние АФК на активность СОД не имеет
места. К тому же СОД относится к ферментам, которые наиболее долго
сохраняют свою высокую активность, почти не требуют энергии активации,
скорость реакции этого энзима лимитирует лишь скорость диффузии
субстрата к активному центру (Зенков Н.К. и др., 1993).
Таким образом, повышение активности СОД в спермиях и семенной
плазме мужчин с патоспермией можно назвать компенсаторной реакцией на
увеличение интенсивности свободнорадикального окисления при нарушении
сперматогенеза.
Результатом повышения активности СОД в эякуляте является
накопление активных радикалов кислорода и, в первую очередь, Н2О2. По
данным многих авторов развитие нарушений подвижности спермиев
обусловлено в основном воздействием супероксидного радикала и Н 2О2
(deLamirande E., Gagnon C., 1995; Aitken RJ, 2000; Rivlin J. et al, 2004).
Существует точка зрения, что увеличение клеточной активности СОД
связано с увеличением длины спермия (Aitken RJ., 1996). СОД, вероятно,
происходит из цитозоля удлиненных сперматид (Fisher HM., Aitken RJ., 1997)
и ее активность используется как маркер цитоплазматических капель (Aitken
RJ., 1996). Более того, по мнению ряда исследователей, высокие активности
СОД отражают большее количество аномальных сперматозоидов с
цитоплазматическими каплями (Aitken RJ., 1996).
Высокая активность СОД косвенно свидетельствует об интенсивной
генерации
О 2 -.
Рассмотрим
возможные
источники
образования
супероксиданион-радикала. Генерация О2 может происходить при
нарушении переноса электронов в дыхательной цепочке митохондрий,
которыми так богата средняя часть (шейка) сперматозоида. Однако в
настоящее время все больше исследователей склоняется к тому, что именно
одним из основных источников супероксиданион-радикала в сперматозоидах
является НAДФH-оксидаза (NOX5). В недавних работах было
продемонстрировано, что морфологически нормальные сперматозоиды не
могут продуцировать О2- в НAДФH-оксидазной реакции.
В нашей работе установлено существенное снижение активности
каталазы. Это может быть связано с тем, что в структуре активных центров
каталазы имеются вышеперечисленные аминокислотные остатки аспарагина
и гистидина, тирозина, наиболее чувствительные к модификации АФК
(Kirkman HN., Gaetani G., 1984).
При нормозооспермии были определены положительные связи
активности СОД с уровнем ДК в спермиях (r=0,24; p<0,05) и с содержанием
МДА в спермиях (r=0,25; p<0,05). В группе «астенозооспермия» подобно
нормозооспермии содержание
МДА в спермиях положительно
14
коррелировало с активностью CОД (r=0,50; p<0,01), в группе
«тератоастенозооспермия» взаимосвязь содержания МДА с активностью
CОД в спермиях была еще сильнее (r=0,55; p<0,05). При интенсификации
липопероксидации при тератоастенозооспермии активность СОД тоже
повышалась. Для мужчин с астенозооспермией более высокое содержание
ДК и МДА в спермиях вызывает увеличение активности СОД, данная связь
при патоспермии является более выраженной, чем при нормозооспермии.
Кроме
того,
в
группе
«тератоастенозооспермия»
найдена
отрицательная связь МДА и каталазоподобной активностью в семенной
плазме (r=-0,56; p<0,01). Таким образом, при интенсификации
липопероксидации у мужчин с тератоастенозооспермией каталазная
активность снижалась.
В группе «тератоастенозооспермия» установлены положительные
взаимосвязи между процентом аномальных сперматозоидов и активностью
СОД в семенной плазме (r=0,48; p<0,05). Действительно, нами показано, что
при тератоастенозооспермии происходит значительное увеличении
активности СОД, и наличие прямой связи говорит о значительном
количестве спермиев с цитоплазматическими каплями в данной группе
мужчин. Кроме того, в группе «астенозооспермия» определены
положительные взаимосвязи между процентом слабоподвижных спермиев и
активностью СОД в семенной плазме (r=0,47; p<0,01).
Таким образом, установлено, что активность рассматриваемых
ферментов претерпевает значительные изменения при патоспермии. При
этом в группах с астено- и тератоастенозооспермией достоверно по
сравнению
с
мужчинами
с
нормозооспермией
изменяются
супероксиддисмутазная и каталазная активности (у мужчин с
тератозооспермией – лишь супероксиддисмутазная): первая повышается,
последняя снижается.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при патоспермии
происходят разнонаправленные изменения активности СОД и каталазы.
Дефицит каталазной активности косвенно может свидетельствовать о
накоплении пероксида водорода, при высоких концентрациях являющегося
ингибитором СОД. Отсутствие ингибирующего эффекта Н2О2 (активность
СОД существенно возрастала при патоспермии) можно трактовать
следующим образом: концентрация Н2О2 не достигает величин,
вызывающих инактивацию СОД вследствие
устранения пероксида
водорода глутатионпероксидазой, одним из важнейших компонентов
глутатионовой антиоксидантной системы.
Состояние глутатионового звена в сперматозоидах и семенной
плазме при патоспермии
Глутатион – важный гидрофильный антиоксидант и необходимый
кофактор для антиоксидантных ферментов – глутатионпероксидазы и
глутатион-S-трансферазы, вместе объединенных в глутатионовое звено АОС.
15
В клетках обнаруживаются высокие миллимолярные концентрации ГSH
(Кулинский В.И., Колисниченко Л.С., 1990; Arthur JR., 2000).
В семени млекопитающих неферментативное звено антиоксидантной
защиты представлено в основном глутатионом (Irvine DS., 1996; Lenzi A. et
al, 2002). Обнаружено, что уровень этого тиола уменьшается во время
процессов созревания сперматозоида (Lenzi A. et al, 2002; Montiel EI. et al,
2003).
Данные по содержанию компонентов глутатионовой системы
фрагментарны и противоречивы. Согласно сведениям некоторых авторов
(Aitken RJ., 1994), восстановленный глутатион отсутствует или содержание
его крайне низко в сперматозоидах. Тогда как по данным других
исследователей (Irvine DS., 1996; Sikka SC., Agarwal A., 1996) зрелые
сперматозоиды содержат все компоненты глутатионовой системы, несмотря
на то, что имеют ограниченный объем цитоплазмы.
Работ, в которых оценивалось бы состояние глутатионового звена АОС
при патоспермии, на сегодняшний день очень мало. В нашей работе
эффективность работы глутатионового звена АОС спермиях (рис. 3) и
семенной плазмы (рис. 4) в группах с различными характеристиками семени
оценивалась как по содержанию ГSН, так и по активности ГSН-зависимых
ферментов.
*
*
*
*
*
* *
*
*
Примечание: *-р<0,0001 в сравнении с нормозооспермией
Рис 3. Содержание восстановленного глутатиона, активность
глутатионпероксидазы и глутатион-S-трансферазы в спермиях в исследуемых
группах мужчин в процентах.
В сперматозоидах при астено- и тератозооспермии по сравнению с
нормозооспермией уровень ГSН достоверно снижался на 54% и 62%
соответственно. При тератоастенозооспермии содержание ГSН падало на
64% (рис. 3).
16
При астено- и тератозооспермии по сравнению с нормозооспермией в
спермиях человека выявлено достоверное снижение активности глутатион
пероксидазы
соответственно
на
50%
и
66%.
В
группе
«тератоастенозооспермия» активность ГПО снижалась на 70% по сравнению
с нормозооспермией.
При астено- и тератозооспермии по сравнению с нормозооспермией в
спермиях человека выявлено достоверное снижение активности ГST
соответственно на 36% и 33 %. При тератоастенозооспермии активность
глутатион-S-трансферазы снижалась на 35%.
*
**
***
***
***
***
***
***
***
Примечание: *-р<0,05, **-р<0,001, ***-р<0,0001 в сравнении с
нормозооспермией
Рис 4. Содержание восстановленного глутатиона, активность
глутатионпероксидазы и глутатион-S-трансферазы в семенной плазме в
исследуемых группах мужчин в процентах.
В семенной плазме содержание ГSН при астено- и тератозооспермии
по сравнению с нормозооспермией достоверно снижалось на 39% и 44%
соответственно, а в группе «тератоастенозооспермии» − данный показатель
по сравнению с нормой падал на 60% (рис. 4).
Достоверное снижение активности ГПО также наблюдается и в
семенной плазме на 24% и 67 % при астено- и тератозооспермии по
сравнению
с
нормозооспермией
соответственно.
В
группе
«тератоастенозооспермия» активность ГПО падала на 48% по сравнению с
нормозооспермией.
Достоверное снижение активности глутатион-S-трансферазы также
наблюдается и в семенной плазме на 5% и 62% при астено- и
тератозооспермии по сравнению с нормозооспермией соответственно. При
тератоастенозооспермии активность глутатион-S-трансферазы снижалась на
58%.
17
Концентрация восстановленного глутатиона в сперматозоидах при
патоспермии, возможно, снижается в результате непосредственного
привлечения значительного количества тиола в процессы защиты клетки от
гидроксильных и алкоксильных свободных
радикалов, а также от
источников их образования. Отчасти поэтому происходит снижение
активностей ферментов ГПО и ГSТ в сперматозоидах, поскольку ГSН для
данных энзимов является дефицитным коcубстратом.
Снижение мощности глутатионовой системы может приводить к
радикальной перестройке процессов жизнедеятельности клетки: изменению
активности ферментов, проницаемости клеточных мембран, интенсивности
метаболизма и других процессов, которые имеют большое значение в генезе
различных форм патоспермии (Foresta C. et al, 2002; Hemachand T., Shaha C.,
2003).
Найденное нами снижение активности ферментов глутатионового
метаболизма также может быть связано с действием АФК. Нужно отметить,
что в структуре активных центров рассматриваемых нами ферментов
имеются аминокислотные остатки, которые в первую очередь окисляются
под действием .ОН, Н2О2, а также свободные SH-группы. Так, в активном
центре молекулы ГSТ имеется гистидин, а также свободная SH-группа.
Фермент ГПО содержат в своем активном центре аргинин (Кулинский В.И.,
Колесниченко Л.С., 1993).
Установленное
нами
снижение
внутриклеточного
уровня
восстановленного глутатиона при патоспермии нельзя рассматривать в
отрыве от активности ферментов, участвующих в его регенерации из
окисленной формы. Такими ферментами являются глутатионредуктаза и
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.
Необходимо отметить, что активность фермента глюкозо-6фосфатдегидрогеназы ни в спермиях, ни в семенной жидкости достоверно не
различалась у мужчин с разными видами патоспермии по сравнению с
нормозооспермией.
Таблица 2
Активность глутатионредуктазы (мкмоль/мин/г белка) в спермиях и
семенной плазме в исследуемых группах
Группа
N
Сперматозоиды,
Me(С25;С75)
Семенная плазма,
Me(С25;С75)
Нормозооспермия
42
52,1 (0,01; 155)
6,07 (0,01; 101)
Астенозооспермия
13
487,3* (38,5; 1127)
27 (7,1; 97)
Тератозооспермия
11
15 (0,69; 244)
60 (0,01; 329)
Тератоастенозооспермия
8
55,7 (2,7; 104,5)
25 (2,8; 64)
Примечание: *p<0,001 в сравнении с нормозооспермией
Согласно полученным данным, активность глутатионредуктазы в
сперматозоидах при астенозооспермии достоверно выше в 9,3 раза по
сравнению с нормозооспермией. При
тератозооспермии
ГР имеет
тенденцию снижения активности на 72%, а при тератоастенозооспермии
18
активность ГР практически не изменяется. В семенной плазме изменения
активности ГР при различных видах нарушения сперматогенеза носят
недостоверный характер.
Таким образом, изменения активностей обоих ферментов, отвечающих
за рециклирование восстановленного глутатиона, в спермиях носят
следующую направленность при патоспермии: при астенозооспермии
активность ГР возрастает, а при тератозооспермии и тератоастенозооспермии
– падает. Активность ГР в семенной плазме была крайне низкой и достоверно
не различалась между группами мужчин с различными показателями семени.
Так же как и в группе «нормозооспермия», в группе
«астенозооспермия» обнаружена положительная корреляционная связь
между количеством аномальных форм сперматозоидов и активностью ГПО
спермиев (r=0,34; р<0,05 и r=0,42; р<0,05 соответственно ).
Найдена в группе «астенозооспермия» отрицательная взаимосвязь
между активностью каталазы спермиев и содержанием глутатиона (r=-0,53;
р<0,001), что может быть характерным при развитиии патоспермии.
В группе «тератозооспермия» определена положительная связь между
процентом аномальных спермиев и содержанием ГSН в спермиях (r=0,70;
р<0,001). Кроме того, в группе «тератозооспермия» обнаружены
положительные связи между процентом подвижных сперматозоидов и
активностью в них ГSТ (r=0,48; р<0,05).
Обнаруженная в группе «нормозооспермия» отрицательная связь (r=0,40; p<0,01) подвижности спермиев с активностью Г6ФДГ в семенной
плазме может быть связана с тем, что НАДФН, продуцируемый в ходе
Г6ФДГ-реакции, используется НАДФН-оксидазой для образования
супероксидного радикала. О2- провоцирует запуск процессов ПОЛ, в
результате чего подвижность спермиев падает (Fisher HM., Aitken RJ., 1997).
Оценка редокс-баланса в сперме
В некоторых работах в качестве дополнительного критерия оценки
антиоксидантной системы используется коэффициент редокс-баланса,
оцениваемый путем отношения суммарного количества прооксидантов к
суммарной активности антиоксидантов (Garrido N. et al, 2004).
В нашей работе для расчета подобного коэффициента использованы в
относительных величинах следующие параметры: содержание МДА, ДК,
активность СОД, каталазы, ГПО. Коэффициент рассчитан как отношение
содержания прооксидантов к активности антиоксидантов. Мы использовали
два варианта расчета коэффициента редокс-баланса.
В первом случае мы рассчитали формулу редокс-баланса как
произведение в относительных единицах содержания МДА и ДК, отнесенное
к произведению активности СОД и каталазы. За единицу принимали
значения измеряемых величин при нормозооспермии.
19
8
7,33
коэффициент
7
6
5
4
4,41
3,87
3,09
3,08
3
2,39
2
1
1,00
1
0
Спермии
Семенная плазма
астенозооспернмия
тератозооспермия
тератоастенозооспермия
нормозооспермия
Рис 5. Редокс-баланс спермиев и семенной плазмы при различных
формах патоспермии (ДК×МДА)/(СОД×КАТАЛАЗА).
Результаты проведенных подсчетов, представленные на рис. 5,
свидетельствуют, что при патоспермии происходит смещение редокс-баланса
в сторону увеличения количества прооксидантов. Очевидно, что
коэффициент
редокс-баланса в спермиях был максимален в группе
«тератозооспермия», тогда как в семенной плазме данный коэффициент
имеет наименьшую величину по сравнению с другими видами патоспермии.
В семенной плазме данный коэффициент был максимален в группе с
тератоастенозооспермией. Для групп «астено-» и «тератоастенозооспермия»
редокс дисбаланс был выше в семенной плазме, чем в спермиях.
При расчете другим способом формула редокс-баланса выглядела как
произведение в относительных единицах МДА и ДК, отнесенное к
произведению активности СОД, каталазы и ГПО. За единицу принимали
значения измеряемых величин при нормозооспермии.
Рис 6. Редокс-баланс спермиев и семенной плазмы при различных
формах патоспермии (ДК×МДА)/(СОД×КАТАЛАЗА×ГПО).
20
Из рисунка 6 видно, что коэффициент редокс-баланса и в спермиях был
максимален в группе «тератозооспермия», а в семенной плазме − в группе
«тератоастенозооспермия». Следует отметить, что в клетках, за исключением
группы «тератоастенозооспермия», данный коэффициент имеет большее
значение по сравнению с семенной плазмой.
Интересно, что сопоставляя коэффициенты, рассчитанные первым и
вторым путем, можно увидеть несколько иной характер редокс нарушений в
семенной плазме и спермиях. В группах «астено-» и «тератозооспермия»
дисбаланс прооксидантов и антиоксидантов в семенной плазме был ниже,
чем в сперматозоидах. Это может говорить о том, что семенная плазма у
таких мужчин обладала большей антиоксидантной мощностью по сравнению
с семенной жидкостью в группе «тератоастенозооспермия».
Итак, полученные в ходе нашей работы результаты исследования
антиоксидантного
статуса
указывают
на
дефицит
мощности
антиоксидантной защиты как в спермиях, так и в семенной плазме при
астено-,
тератои
тератоастенозооспермии
по
сравнению
с
нормозооспермией.
Обнаружено снижение уровня ГSН, активности
каталазы, ГПО, ГSТ и в сперматозоидах, и в семенной плазме при всех видах
патоспермии по сравнению с нормозооспермией. При этом падение
активности указанных ферментов и снижение уровня ГSН при
тератоастенозооспермии является более значительными, чем при других
формах нарушения сперматогенеза.
Повышение ферментативной активности было зафиксировано для СОД
в спермиях и семенной плазме во всех группах мужчин с нарушением
сперматогенеза по сравнению с нормозооспермией, тогда как достоверное
увеличение активности ГР в спермиях наблюдалось только в группе
«астенозооспермия», а при терато- и тератоастено- можно было говорить о
тенденции к увеличению активностей ферментов ГР и Г6ФДГ.
Вероятно, наиболее важной причиной снижения мощности
антиоксидантной защиты cемени у мужчин с нарушением сперматогенеза
является развитие окислительного стресса. Известно, что лейкоциты в
семени являются мощным источником АФК, способных вызвать
окислительную модификацию белков ферментов, следствием которой
является потеря их активности (Shekarriz M. et al, 1995).
Обнаруженное снижение в спермиях содержания ГSН может быть
связано с тем, что на начальных этапах развития окислительного стресса
ферментативная защита, в силу ряда причин, оказывается менее эффективной
по
сравнению
с
протекторным
действием
низкомолекулярных
антиоксидантов. При этом ГSН, способный непосредственно перехватывать
О2 и ОН, становится главной мишенью для атаки АФК. Помимо
собственного защитного действия, с которым связан его усиленный расход,
ГSН принимает участие в ГПО- и ГSТ- реакциях, а также в регенерации
других компонентов АОС - -токоферола и аскорбата, что дополнительно
снижает его концентрацию в спермиях. Поддержание необходимого клетке
21
уровня ГSН обеспечивается восстановлением ГSSГ системой «Г6ФДГ-ГР».
Активность Г6ФДГ в группах достоверно не различалась, активность ГР
при астенозооспермии достоверно повышалась, а при терато- и
тератоастенозооспермии она понижалась по сравнению с нормой.
Результатом повышенной генерации АФК является усиление
интенсивности липидной пероксидации, что проявляется накоплением ДК и
МДА в сперматозоидах и семенной плазме, концентрация продуктов ПОЛ
во всех группах мужчин с патоспермией превышает показатели в группе
«нормозооспермия».
Нарушение
стационарного
состояния
ПОЛ,
сочетающееся
с
накоплением
ДК
и
МДА,
обладающих
мембранотоксическими эффектами, снижает способность спермиев
выполнять свои физиологические функции (Tavilani H. et al, 2005).
Изменение активности ферментов под влиянием АФК объясняют в
основном локальными нарушениями в области активного центра. Эти
нарушения могут быть связаны с окислительной модификацией
аминокислотных остатков (серосодержащих аминокислот, гистидина),
изменением валентности и нарушением координационной геометрии
металлов для ряда металлзависимых ферментов. К. Дэвис и др. (Davies КJ. et
al, 1987) убедительно показали, что любое влияние АФК на белки различного
типа приводит к сложным окислительным модификациям в структуре
белковой молекулы и изменениям ее физико-химических и биологических
свойств.
Таким
образом,
причины,
вызывающие
интенсификацию
свободнорадикальных процессов, могут быть разными, но изменения на
молекулярном уровне носят однотипный характер. Общим для всех видов
патоспермии является усиление процессов липопероксидации, снижение
буферной емкости АОС, нарушение мобилизации ее в ответ на повышение
активности прооксидантной системы.
Все компоненты АОС в норме находятся во взаимокомпенсаторных
отношениях. Как правило, снижение концентрации или активности одних
антиоксидантов приводит к соответствующему изменению других. При
патоспермии нарушение редокс-баланса приводит к перестойке системы
корреляционных связей, затрудняя выполнение сперматозоидом его
физиологической функции.
ВЫВОДЫ
1. У мужчин при нарушении сперматогенеза по сравнению с
нормозооспермией в семени происходит интенсификация процессов
перекисного окисления липидов и снижение мощности антиоксидантной
защиты.
2. По сравнению с нормозооспермией при астено-, терато-,
тератоастенозооспермии у мужчин происходит увеличение содержания
продуктов липопероксидации, ДК и МДА, в семенной плазме и спермиях.
22
3. Нарушение сперматогенеза сопровождается снижением каталазной
активности на фоне повышения активности СОД в спермиях и семенной
плазме.
4.
Патоспермия
сопровождается
снижением
активности
глутатионпероксидазы,
глутатион-S-трансферазы
и
содержания
восстановленного глутатиона в спермиях и семенной плазме.
5. При астенозооспермии
в спермиях происходит увеличение
активности глутатионредуктазы, тогда как в других группах достоверных
изменений активности фермента не обнаружено. Активность Г6ФДГ при
патоспермии по сравнению с нормозооспермией достоверно не изменяется.
6. Введенный нами коэффициент редокс-баланса в спермиях был
максимален в группе «тератозооспермия», а в семенной плазме − в группе
«тератоастенозооспермия». Коэффициент дисбаланса прооксидантов и
антиоксидантов в спермиях имеет большее значение, чем в семенной плазме.
7. При астено- и тератозооспермии обнаружена отрицательная
корреляционная связь между интенсивностью процессов ПОЛ и
подвижностью спермиев.
8. При патоспермии обнаружена положительная корреляционная связь
между состоянием некоторых компонентов глутатионового звена (ГSН для
терато- и ГПО для астенозооспермии) и количеством аномальных форм
сперматозоидов.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ДИССЕРТАЦИИ
1. Быкова М.В., Артюхова В.Г., Титова Н.М., Светлаков А.В. Влияние
криоконсервации на состояние перекисных процессов и антиоксидантную
систему в сперматозоидах человека // Материалы Итоговой научной
конференции ГУНИИ медицинских проблем Севера СО РАМН «Вопросы
сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири». − Красноярск,
2004. − С.164-165.
2. Быкова М.В., Маркова Е.В., Светлаков А.В., Серебренникова О.А., Титова
Н.М. Интенсивность перекисных процессов в сперматозоидах мужчин //
Вестник Красноярского государственного университета. Естественные
науки. – 2005. − №5. − С.264-267.
3.Быкова М.В. Процессы перекисного окисления липидов и активность
антиоксидантных ферментов в сперматозоидах человека при патоспермии //
Материалы Международного молодежного медицинского Конгресса "СанктПетербургские научные чтения". − Санкт-Петербург, 2005. − С.111.
4. Быкова М.В., Маркова Е.В., Светлаков А.В., Филлимонов С.Ф. Влияние
криоконсервации на процессы перекисного окисления липидов и активность
антиоксидантных ферментов в сперматозоидах человека при патоспермии
//Сборник материалов работы конференции Российской Ассоциации
Репродукции Человека (РАРЧ) «Вспомогательные репродуктивные
технологии сегодня и завтра». − Чебоксары, 2005. − С.74-76.
5. Быкова М.В. Анти- и прооксидантный статус сперматозоидов при
патоспермии// Сборник тезисов и материалов Межрегиональной научно-
23
практической конференции "Объединение субъектов Российской Федерации
и проблемы природопользования в Приенисейской Сибири". − Красноярск,
2005.− С.311-312.
6. Быкова М.В. Состояние проксидантной и антиоксидантной систем в
сперме мужчин при астенозооспермии // Сборник тезисов научной
конференции молодых ученых Ростовского государственного медицинского
университета. − Ростов-на-Дону, 2006. − С. 161.
7. Быкoва М.В., Титова Н.М., Маркова Е.В., Светлаков А.В. Про/антиоксидантный статус в сперматозоидах и семенной плазме мужчин при
астенозооспермии // Сборник материалов работы XVI международной
конференции Российской Ассоциации Репродукции Человека (РАРЧ)
«Вспомогательные репродуктивные технологии сегодня и завтра». − Ростовна-Дону, 2006. − С.47-48.
8. Bykova M., Titova N., Sharma R., Agarwal A. Association of classical semen
parameters with superoxide dismutase and catalase activities in human semen//
Fertil Ster. − 2007.− №88, Sup.1 – P.302-303.
9. Bykova M., Titova N., Sharma R., Agarwal A. Malondialdehyde and diene
conjugate levels in sperm and seminal plasma of infertile and normozoospermic
men// Fertil Ster. − 2007. − №88, Sup.1 – P.303-304.
10. Bykova M., Titova N., Sharma R., Agarwal A. Glutathione and glutathionedependent enzymes in sperm and seminal plasma from infertile men// Fertil Ster.
− 2007. − №88, Sup.1 – P.366-367.
11. Mahfouz R., Sharma R., Jianbo L., Bykova M., Sabanegh E., Agarwal A.
Diagnostic value of the total antioxidant capacity assay in human seminal plasma
by receiver operating characteristic curve analysis // Fertil Ster. − 2007. − №88,
Sup.1– P.269.
12. Bykova M., Athayde K., Sharma R., Jha R., Sabanegh E., Agarwal A. Defining
the reference value of seminal reactive oxygen species in a population of infertile
men and normal healthy volunteers // Fertil Ster. − 2007. − №88, Sup.1 – P.305.
13. Mahfouz R., Aziz N., Sharma R., Bykova M., Sabanegh E., Agarwal A.
Simultaneous evaluation of intracellular superoxide and hydrogen peroxide in
different sperm fractions // Fertil Ster. 2007.-№88, Sup.1 –P.363-364.
14. Быкова М.В., Титова Н.М., Маркова Е.В., Светлаков А.В. «Глутатион и
глутатионзависимые ферменты в сперматозоидах и семенной плазме мужчин
при патоспермии» // Материалы Всероссийской научно-практической
конференции «Актуальные вопросы современной биохимиии». − Вятский
медицинский вестник. – 2007. − №4. −С.41-43.
15. Быкова М.В. Оценка про-/антиоксидантного статуса в спермиях и
семенной плазме у мужчин при патоспермии// Материалы научнопрактического
симпозиума
«Свободнорадикальная
медицина
и
антиоксидантная терапия». − Волгоград, 2008. − С.6.
16. Быкова М.В. Глутатион и глутатионзависимые ферменты в
сперматозоидах и семенной плазме мужчин при патоспермии // Материалы
24
IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. −
Новосибирск, 2008. − С. 466.
17. Быкова М.В., Титова Н.М. Процессы перекисного окисления липидов и
состояние антиоксидантной системы в сперматозоидах и семенной плазме
мужчин при патоспермии // Материалы XI межрегиональной научнопрактической конференции «Актуальные проблемы медицины». − Абакан,
2008. − С.62-67.
18. Быкова М.В., Титова Н.М., Савченко А.А., Маркова Е.В. Активность
ферментов полиольного пути в спермиях и семенной плазме мужчин при
патоспермии // Материалы научно-практической конференции молодых
ученых «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов
Сибири». − Красноярск, 2008. − С.21-23.
19. Быкова М.В., Титова Н.М., Маркова Е.В., Светлаков А.В. Про/антиоксидантный статус в сперматозоидах и семенной плазме мужчин при
патоспермии //Проблемы Репродукции. – 2008. − №3. − С.63-67.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АОС – антиоксидантная система
АФК – активные формы кислорода
Г6ФДГ – глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
ГSH – глутатион
ГSТ – глутатион-S-трансфераза
ГПО – глутатионпероксидаза
ГР – глутатионредуктаза
ДК – диеновые конъюгаты
КТ – каталаза
МДА – малоновый диальдегид
ОС – окислительный стресс
ПОЛ – перекисное окисление липидов
ПФП – пентозофосфатный путь
ПНЖК – полиненасыщенные жирные кислоты
СОД – супероксиддисмутаза
Автор выражает благодарность заведующему кафедрой биохимии и
физиологии человека и животных ГОУ ВПО «Сибирский федеральный
университет» д-ру мед. наук, профессору А.А. Савченко, кандидату биол.
наук, директору Центра репродуктивной медицины г. Красноярска А.В.
Светлакову, кандидату биол. наук, доценту, заместителю директора по науке
Центра репродуктивной медицины Е.В. Марковой за проявленный интерес к
работе, ценные теоретические и методологические советы, а также за помощь
в организации проведения исследования.