- Cellagon

Наука о еде и питании, 2014, 5, 341-350
Опубликовано на сайте в феврале 2014г. (http://www.scirp.org/ioumal/fnsl
http://dx.doi.org/10.4236/fns.2014.54041
Научное
Исследование
Иммуномодулирующие свойства концентрированного
фруктового и овощного сока, проверенные в
рандомизированном, плацебо-контролируемом,
двойном слепом клиническом испытании с участием
здоровых добровольцев
Манфред Шмольц1, Рейнхард В. Марц2’3, Марко Шаудт4, Корнелия Шаудт4, Карола Лаустер4 'EDI GmbH, Ройтлинген,
Германия; 2SCIRM, Фюрт, Германия; 3Technische Hochschule, Нюрнберг, Германия; 4analyze & realize GmbH, Берлин, Германия.
Email: mschaudt@analvze-realize.com
Получено 4 ноября 2013г.; пересмотрено 4 декабря 2013г.; утверждено 11 декабря 2013г.
Авторское право © 2014 Манфред Шмольц и др. Настоящая статься с открытым доступом распространяется в соответствии с лицензией
«С указанием авторства», которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение в любой среде цитат из
оригинальной работы. В соответствии с лицензией «С указанием авторства» все Авторские права © 2014 зарезервированы для SCIRP, а
владелец интеллектуальной собственности Манфред Шмольц и др. Авторское право © 2014 охраняется законом и SCIRP в качестве
опекуна.
КРАТКИЙ ОБЗОР
В рандомизированном, плацебо-контролируемом пилотном исследовании по изучению иммуномодулирующего
действия концентрированного сока, содержащего ингредиенты 80 разных фруктов, трав, грибов, масел и других
(Cellagon aurum®, «CA») приняли участие 22 здоровых добровольца. 11 человек получали концентрированный сок,
а другие 11 исследуемых были определены в группу плацебо. Для оценки связанных с терапией изменений ответа
лейкоцитов на экспериментальную активацию иммунных клеток использовали стимулированные культуры
цельной крови. Для каждого добровольца были приготовлены 5 культур непосредственно перед, во время или через
3 три после завершения 7-недельной терапии. Активность лейкоцитов определялась путем изменения уровня
цитокинов в супернатантах после стимуляции в течение 48 часов (индуцированной добавлением LPS + SE-B + антиCD28 антител). Несмотря на относительно небольшое количество добровольцев, мультиплексные анализы
цитокинов показали типичный Т-образный отпечаток цитокинов, значительно увеличенный в ходе терапии с CA по
сравнению с плацебо (GM-CSF, IFNγ, IL-4, IL-10, IL-17, TNFβ, во всех случаях p < 0,05). Эти предварительные
результаты показывают, что препарат CA может поддерживать активацию лейкоцитов, в частности Т-лимфоцитов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
Рандомизированное плацебо-контролируемое клиническое испытание; Ex Vivo; Цитокин; Концентрат сока
1. Введение
Травы, овощи и фрукты были тщательно исследованы на предмет
защитных свойств, которые они проявляют в тканях человека.
Установлено, что многие их свойства связаны с утилизацией
радикалов кислорода (проверено, например [1]), хотя другие ставят
под сомнение клинический эффект таких пищевых компонентов
[2]. Обнаружено, что некоторые такие поглотители радикалов, а
также многочисленные травяные, овощные и фруктовые
субстанции обладают противовоспалительным действием (напр.,
[3,4]). Менее описанными являются препараты с так называемыми
иммуномодулирующими компонентами, которые обычно являются
основными составляющими растительных лекарственных средств,
таких как рудбекия (Эхинацея). Иммуномодуляция характеризует
действие вещества, поддерживающее или угнетающее активность
OPEN ACCESS
иммунных клеток; это довольно старая концепция, которая
получила широкое признание за последнее десятилетие, особенно
в терапии комплексных заболеваний, таких как аутоагрессивные
расстройства [5,6].
Клиническое исследование, представленное в этом издании,
было разработано для решения вопроса, может ли препарат
Cellagon aurum® (CA) влиять на деятельность иммунных клеток in
vivo. Препарат CA – это концентрированный сок, состоящий из 80
различных натуральных продуктов (Таблица 1), таких как
фруктовые соки, экстракты из овощей, грибов и трав, а также
различные масла и микроэлементы (кальций, железо, коэнзим Q10,
FNS
Иммуномодулирующие свойства концентрированного фруктового и виноградного сока, проверенные в
рандомизированном,
двойном
слепом клиническом испытании с участием здоровых добровольцев
Таблица 1. Питательная
ценность Cellagon
aurum.
342
Питательная ценность
Ежедневный прием по 20
мл CA в 260 мл воды % RDI
Калорийность кДж/ккал
150/35
Белок г
0,7
Общие углеводы г
5,0
Сахар г
3,6
Общий жир г
0,5
Насыщенные жирные кислоты г
0,1
Полиненасыщенные жирные
кислоты г
0,3
Волокна г
3,0
Натрий г
0,008
Витамины
Витамин C мг
120
150
Витамин E мг
18
150
Ниацин мг
12
75
Пантотеновая кислота мг
9
150
Витамин B6 мг
2,1
150
Витамин B2 мг
2,1
150
Витамин B1 мг
1,7
150
Фолиевая кислота мкг
200
100
Биотин мкг
75
150
Витамин B12 мкг
3,8
150
2. Материалы и методы
Минералы
Кальций мг
-
-
Железо мг
4,2
30
Магний мг
56
15
Цинк мг
3,0
30
Марганец мг
0,60
30
Медь мг
0,15
15
Селен мкг
8,3
15
Хром мкг
6,0
15
Молибден мкг
7,5
15
лецитин или L-карнитин). Учитывая сложность препарата и
тот факт, что, по крайней мере, некоторые его компоненты
точно содержат составляющие с иммуномодулирующим
действием, напр., ромашка [7,8], хмель [9], виноградные
косточки [10], брокколи[11], витамины [12-17] и т.д.,
настоящее
исследование
направлено
именно
на
тестирование изменений в функционировании иммунных
ОТКРЫТЫЙ ДОСТУП
клеток во время приема CA. С этой целью мы выбрали тестсистему
TruCulture®,
так
как
она
позволяет
проанализировать активность лейкоцитов ex vivo, т.е.: после
воздействия биологически активных веществ препарата CA
in vivo на эти клетки [18]. Тест-система TruCulture® основана
на «прикроватных клеточных культурах» и, следовательно,
позволяет избежать многочисленных артефактов, частых
для других способов исследования функций лейкоцитов. Это
достигается путем культивирования периферических
кровяных иммунных клеток непосредственно в шприце,
используемом для забора крови, т.е. в их естественной среде
(цельной крови). Таким образом, эти культуры могут
создаваться без задержки между забором крови и началом
получения культур. Кроме того, исследование деятельности
иммунных клеток может выполняться без обычной
подготовки лейкоцитов, что в противном случае дает
дополнительную нагрузку на клетки. И наконец,
изменчивость между сериями сводится к минимуму, так как
вся процедура состоит из одного этапа, т.е.: забора крови.
Это дает возможность получить надежные результаты с
достаточно низким количеством испытуемых.
Клетки инкубировали в этих шприц-тюбиках, затем
стимулировали,
имитируя
наличие
бактериальной
инфекции:
бактериальный
полисахарид
(LPS,
стимулирующий клетки врожденного иммунного ответа;
[19]) комбинировали со стафилококковым энтеротоксиномB
(SE-B,
активирующий
Т-лимфоциты
антигенспецифическим образом, вовлекая врожденные антигенпредставляющие клетки; [20]), а также антителами от CD28,
поверхностной молекулы, которая требуется для усиления
деятельности Т-клеток [21]. Такой вид активации является
физиологически соответствующим триггером защитного
ответа иммунных клеток.
2.1. План исследования
Настоящее исследование питания проводили в виде
диагностического,
моноцентрического,
рандомизированного,
двойного слепого, плацебоконтролируемого исследования с участием здоровых
добровольцев в условия амбулатории в Германии (Берлине)
с августа по декабрь 2012г. Влияние препарата Cellagon
aurum® (CA) на изменения в ответе лейкоцитов (экспрессия
цитокинов ex vivo), связанные с терапией, сравнивали с
плацебо. Исследование получило одобрение Комитет по
Этике г. Шарите, Берлин (Германия) и проводилось в
соответствии
с
Хельсинской
декларацией/Гонконг
1989/Сомерсет 1996г., а также с рекомендациями ICH-GCP
(CPMP/ICH/135/95).
2.2 Исследуемая популяция и лечение
В исследовании принимали участие двадцать два здоровых
добровольца, соответствующие следующим критериям
включения: возраст
FNS
Иммуномодулирующие свойства концентрированного фруктового и виноградного сока, проверенные в
рандомизированном, двойном слепом клиническом испытании с участием здоровых добровольцев
18 - 40 лет, некурящие с хорошим общим состоянием
здоровья, подписавшие письменное согласие на участие.
Основные критерии исключения: любое острое или
хроническое заболевание, известные аллергии, вакцинация
или хирургическое вмешательство за последние 6 месяцев
до или во время клинического испытания, прием любых
пищевых добавок, пре-/пробиотиков или препаратов,
влияющих на иммунную систему, за 14 дней (д) до или во
время исследования, установленная чувствительность к
одному из компонентов препарата, а также беременность и
лактация.
CA – это концентрат из 80 компонентов (Hans- Gtinter
Berner GmbH & Co. KG, Германия), в качестве плацебо,
сходного по внешнему виду, использовали концентрат
фруктового сока, содержащий апельсиновый и яблочный
сок, минеральную воду, фруктозу, яблочный экстракт,
лимонную кислоту, сорбат калия, сукралозу, бета-каротин и
кармин, натуральные ароматизаторы без дополнительных
витаминов или минералов, по калорийности сопоставимый с
препаратом CA (Hans-Gtinter Berner GmbH & Co. KG,
Германия).
Исследуемых в случайном порядке распределяли в
группы, получающие препарат СА или плацебо. Участники
исследования получили указание принимать 10 мл
препарата CA или плацебо два раза в день, смешивая его со
120 мл питьевой или минеральной воды, предпочтительно во
время завтрака и обеда в течение 7 недель.
Двадцать два исследуемых соответствовали критериям
включения и не нарушали критерии исключения, и были
включены в исследование. Двое из 22 участников были
исключены во время посещения V3 (один: из-за
завышенного уровня CRP вследствие солнечного ожога;
второй: по причине венозного заболевание). Для этих
пациентов отсутствуют данные об эффективности во время
посещения V4 и V5, так как их исключили из полного
множества пациентов для анализа (FAS-популяции). Таким
образом, полное множество пациентов для анализа (FASпопуляция) включает 20 пациентов (см. Рисунок 1). Так как
все они придерживались протокола, то они представляют
достаточное множество пациентов для анализа (VCASпопуляция).
20 исследуемых полного множества пациентов для
анализа (FAS-популяции) - это 13 женщин и 7 мужчин. Все
участники исследования принадлежат к европеоидной расе.
По базовым характеристикам статистически значимых
различий между двумя группами не было выявлено
(Таблица 2).
Во
время
исследования
участники
посещали
исследователя 5 раз (см. Таблицу 3: посещение V1—
скрининг, посещение V2 — рандомизация и распределение
исследуемого препарата; посещение V3 — на четвертый
343
день приема исследуемого препарата; первая культура
TruCulture® из клеток крови; посещение V4 — через 14 дней
приема исследуемого препарата; вторая культура
TruCulture® из клеток крови; посещение V5 — последнее
посещение в 56 ± 2 и 3 дня после последнего приема
исследуемого препарата; третья культура TruCulture® из
клеток крови).
2.3 Критерии оценки
Испытания Ex Vivo TruCulture®
Тест-системаTruCulture® состоит из закрытого шприцатюбика, подробно описанного выше [18]. В двух словах,
кровь забирается в эти тюбики с культуральной средой и
добавлением экспериментальных стимуляторов LPS (из E.
coli, O55: B5; Calbiochem,
Рисунок 1. Схема исследуемой популяции.
Таблица 2. Средние (±SD) исходные характеристики
вошедшей в исследование популяции.
Исследуемая популяция
Возраст (лет)
Пол(м/ж)
CA (n = 9)
Плацебо (n - 11)
27,9 ± 5.7
32,7 ± 6,9
0,107
4/7
1,0
3/6
p-значение
Рост (см)
173,1 ± 7,2
170,4 ± 8,7
0,467
Вес (кг)
67,9 ± 7,5
62,0 ± 7,9
0,131
22,6 ± 1,5
21,3 ± 1,7
0,070
ИМТ
кг/м2
Таблица 3. Ход исследования.
Visit purpose
Кровь
V1 (1 - 7 дней до V2)
V3 (д 4)
V4 (д 14 ± 2)
V5 (д 56 ± 2)
№ 3 Окончание
Контроль № 2 Конец приема черезКонтроль
исследования
53 дня
Скрининг
Контроль №
X
X
X
X
X
Основные
№1
№2
#3
X
X
X
X
TruCulture®
ОТКРЫТЫЙ ДОСТУП
Моча
V2 (д 0)
Распределение включения:
CA Плацебо
X
FNS
344
Иммуномодулирующие свойства концентрированного фруктового и виноградного сока, проверенные в
рандомизированном, двойном слепом клиническом испытании с участием здоровых добровольцев
Германия), SE-B (из S. aureus; Bernhard-Nocht-In- stitute,
Германия), а также анти-CD28 антител (Beckmann-Coulter,
Германия). В течение 15 минут после забора крови поршни
шприцев-тюбиков вынимают, а тюбики помещают в сухой
блок термостата (VLM GmbH, Германия), где их
инкубируют в течение 48 ч при температуре 37°C. Затем
культуральные супернатанты собирают и хранят при
температуре ниже -18°C до отправки на сухом льду в
компанию EDI GmbH, где их хранят при температуре ниже 18°C до получения концентрации для тестирования
цитокинов, без прерывания холодной цепи.
Анализы цитокинов
Для определения концентрации цитокинов, хемокинов,
факторов роста и других маркеров активации лейкоцитов в
супернатантах культур из цельной крови TruCulture®
использовали Мультиплексные аналитические профили
(МАП, Myriad RBM, Остин, Техас, США). Кратко: после
поступления в EDI GmbH, все образцы хранили при
температуре -80°C до тестирования. Смесь из образцов и
микросфер захвата тщательно смешивали и инкубировали
при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем
добавляли
мультиплексные
коктейли
из
биотинилированных антител оповестителей и инкубировали
в течение одного часа при комнатной температуре.
Мультиплексы обрабатывали в избытке раствора стрептавидин-фикоэритрина. Анализ проводили на приборе
Luminex 100/200, а полученный поток данных
интерпретировали при помощи собственного программного
обеспечения для анализа данных, разработанного «RulesBased Medicine». Неизвестные значения для каждого
анализируемого вещества, находящегося в определенном
мультиплексе, определяли при помощи 4-5 параметров,
взвешенных и невзвешенных алгоритмов аппроксимации
кривой, включенных в пакет анализа данных.
Список маркеров активации, представленный в Таблице
4, измеряли при помощи этих образцов.
Безопасность и переносимость
Как и сопутствующие переменные, переносимость
Таблица 4. Измеренные маркеры.
Цитокин человека MAP A*
IL-8
BDNF
IL-15
IFN-γ
IL-10
Эотаксин
IL-17
IL-2
MCP-1
ICAM-1
IL-23
IL-3
MIP-1α
IL-1α
MMP-3
IL-4
MIP-1β
IL-1β
SCF
IL-5
TNFα
IL-1ra
VEGF
IL-6
TNFβ
IL-12p40
IL-12p70
*Список аббревиатур: см. дополнительные данные.
исследуемого препарата оценивалась как исследуемыми, так
и исследователями по завершении исследования. Для ее
ОТКРЫТЫЙ ДОСТУП
2.4 Статистическая оценка
Данные были предоставлены компанией «EDI GmbH»,
поставщиком необработанных данных для анализа
цитокинов. Статистический анализ проводили при помощи
программного обеспечения SYSTAT (Версия 12.0, Systat
Software Inc.).
Цитокины проявляют высокие отличия между
индивидами, одновременно с поразительной долгосрочной
стабильностью у каждого индивида [18, 22]. Также в
настоящем исследовании цитокины человека с самыми
низкими значениями и человека с самыми высокими
значениями отличались факторами от 3 (IL-10) до 1072 (IL2). Ни параметрические, ни непараметрические методы не
могут в достаточной мере обработать такие различия. В
таких ситуациях, как правило, применяется индивидуальная
z-стандартизация, но для этой цели
для каждого
исследуемого необходимо минимум 5 значений без влияния
лечения, что невозможно в рамках настоящего
исследовательского
изучения
или
исследования
подтверждения концепции. Таким образом, для сравнения
групп мы подсчитали разницу от посещения № 2 (исходные
характеристики, сразу после начала терапии) до № 3 (через
3 дня терапии = отмечены как «острое» влияние в графиках
ниже), от посещения № 2 до № 4 (2 недели терапии = «2
нед»), и от посещения № 4 до № 5 (2 - 4 дня после окончания
терапии = «EOTrt- mt») для каждого исследуемого и
проанализировали эти переменные при помощи t-критерия
для независимых образцов, а также U-критерия МаннаУитни в случае значительных расхождений в переменных
между группами, которые следовало ожидать.
Изо всех цитокинов, определенных в настоящем
исследовании, мы выбрали ГМ-КСФ, IFNγ, IL-2, IL-4, IL-10,
IL-17 и TNFβ для более подробного анализа, основанного на
первой графической оценке в период действия препарата для
всех лиц.
3
Цитокин человека MAP B*
ГМ-КСФ
IL-7
оценки использовались следующие параметры: «очень
хорошо», «хорошо», «средне» или «плохо». Безопасность и
переносимость препарата дополнительно оценивалась
документацией побочных явлений.
Результаты
Во время стадии наблюдения клинического исследования
отсева исследуемых в связи с нежелательными явлениями не
произошло. 11 из 11 исследуемых из группы плацебо и 9 из
11 из группы активной терапии завершили испытание с
достаточным количеством посещений и точек данных для
проведения надлежащей статистической оценки их
результатов.
3.1. Ответ цитокинов
Как и ожидалось, не все цитокины одинаково хорошо
отвечали на терапию. По сравнению с исходными данными
не наблюдались никакие существенные изменения
следующих параметров во время приема препарата CA
(данные не отображены в данной работе): IL-3, BDNF,
Эотаксин, Фактор VII, ICAM-1, IL-7, IL-15,
FNS
Иммуномодулирующие свойства концентрированного фруктового и виноградного сока, проверенные в
рандомизированном, двойном слепом клиническом испытании с участием здоровых добровольцев
MMP-3, SCF, VEGF.
Для ряда других функциональных конечных точек
изменения наблюдались только у одного или нескольких
исследуемых (IL-1a, IL-1β IL-1ra, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12p40,
IL-12p70, IL-18, IL-23, MIP-1α, MIP-1β MCP-1, TGFβ TNFα).
Однако так как изменение возникло в обеих группах (CA и
плацебо), невозможно достоверно дифференцировать
эффекты лечения от случайных сдвигов клеточной
активности
(напр.,
вследствие
незначительного
экологического воздействия на некоторых лиц, что можно
считать нормальным явлением у здоровых лиц). Эти
результаты также не представлены в данной работе.
345
С
другой
стороны,
шесть
параметров
были
скорректированы более значительно (ГМ-КСФ, IFNγ, IL-4,
IL-10, IL-17, а также TNFβ). Они достигли статистически
значимых различий между группами через 3 дня после
приема CA (такие различия не наблюдались между этими
двумя группами в исходной точке), и/или внутри группы CA
при сравнении посещения № 2 (сразу после начала приема
препарата CA) и посещения № 3 (через 3 дня терапии);
очевидных изменений в ходе лечения не было обнаружено в
группе плацебо. Более подробно результаты приведены
ниже (см. Рисунки 2 и 3).
Рисунок 2. Высвобождение ГМ-КСФ (a), IFNγ (b) и IL-4 (c) в стимулированных культурах цельной крови.
Сравнение группы плацебо и группы CA, верхняя строка = дельта-ответ через 3 дня терапии (посещение № 3—
исходное посещение № 2); центральная строка = дельта-ответ при посещении № 4 (14 дней терапии)—исходное,
нижняя строка = дельта-ответ при посещении № 5 (2 - 4 дня после окончания терапии)—посещение № 4. MWU = Uкритерий Манна Уитни. ↑ = стимулированный, ↓ = ингибированный; красные круги: группа плацебо; синий крест:
терапия с CA.
ОТКРЫТЫЙ ДОСТУП
FNS
346
Изменения от
Иммуномодулирующие свойства концентрированного фруктового и виноградного сока, проверенные в
рандомизированном, двойном слепом клиническом испытании с участием здоровых добровольцев
a) IL-10 (Тест для непарных
образцов)
b) IL-17 (Тест для непарных
образцов)
c) TNFβ (Тест для непарных
образцов)
посещения № 2
до посещения №
3
t-критерийt: p = 0,036 ↑
U-критерий Манна-Уитни: p =
0,063 (↑)
t-критерий: p = 0,022 ↑
U-критерий Манна-Уитни: p =
0,014 ↑
t-критерий: p = 0,018 ↑
U-критерий Манна-Уитни: p =
0,006 ↑
t-критерий: p = 0,100
U-критерий Манна-Уитни: p =
0,020 ↑
t-критерий: p = 0,168
U-критерий Манна-Уитни: p =
0,102
t-критерий: p = 0,147
U-критерий Манна-Уитни: p =
0,119
t-критерий p = 0,692
U-критерий Манна-Уитни: p =
0,970
t-критерий: p = 0,368
U-критерий Манна-Уитни: p =
0,239
t-критерий: p = 0,155
U-критерий Манна-Уитни: p =
0,119
посещения № 2
до посещения № 4
посещения № 4
до посещения № 5
Рисунок 3. Высвобождение IL-10 (a), IL-17 (b), and TNFβ (c) в стимулированных культурах цельной крови. Сравнение группы
плацебо и группы CA, верхняя строка = дельта-ответ через 3 дня терапии (посещение № 3—исходный визит № 2); центральная
строка = дельта-ответ посещение № 4 (14 дней терапии)—исходное, нижняя строка = дельта-ответ посещение № 5 (2 - 4 дня после
завершения терапии)—посещение № 4. MWU = U-критерий Манна Уитни. ↑ = стимулированный, ↓ = ингибированный; красные
круги: группа плацебо; синий крест: терапия с CA.
Цитокины,
указывающие
на
существенный
иммуномодулирующий эффект вследствие терапии препаратом CA,
могут быть связаны с активностью Т-лимфоцитов: ГМ-КСФ, IFNγ, IL4, IL-10, IL-17, а также TNFβ (см. Рисунки 2 и 3). Все эти цитокины
были увеличены в культуральных супернатантах доноров при
сравнении посещения № 2 (исходное, сразу после начала приема
препарата CA) с посещением № 3 (через 3 дня приема препарата CA).
Для IFNγ разница между посещением № 4 и № 5 показала
значительное снижение стимулированного высвобождения этого
цитокина по сравнению с плацебо (Рисунок 2).
Был только один посредник, IL-10, для которого значительное
увеличение высвобождения могло быть обнаружено также во время
посещения № 4 (день 14 терапии препаратом CA, см. Рисунок 3).
ОТКРЫТЫЙ ДОСТУП
3.2. Безопасность и переносимость
Все измеренные клинические параметры, вес, температура, частота
сердечных сокращений и артериальное давление оставались
практически неизменными на протяжении всего исследования, без
существенных отличий между двумя исследуемыми популяциями
(данные не приведены). Общая оценка переносимости для обеих
терапий проводилась в конце исследования. Как исследователи, так
и исследуемые оценили переносимость препарата CA или плацебо
в 100% случаев как «хорошо» или «очень хорошо» (p = 1,00; p =
1,00 соответственно). Только один из 20 участников сообщил о
побочных явлениях (умеренная головная боль),
FNS
Иммуномодулирующие свойства концентрированного фруктового и виноградного сока, проверенные в
рандомизированном, двойном слепом клиническом испытании с участием здоровых добровольцев
которую не связывают с употреблением исследуемого
препарата.
4 Обсуждение
Описанное выше клиническое исследование проводилось для
изучения иммуномодулирующих свойств концентрированного
сока (CA), препарата из фруктов, овощей, грибов, масел и
многих других компонентов (всего около 80).
Как правило, считается, что подобные продукты оказывают
неспецифическое действие благодаря улучшению снабжения
витаминами или наличию антиоксидантов. Несмотря на то, что
в соке CA, проанализированном в настоящем клиническом
исследовании,
содержится
значительное
количество
витаминов
и
антиоксидантов
(напр.,
полифенолов,
флавоноидов и т.д.), было бы неверно предполагать, что только
эти вещества могли вызвать изменения, наблюдаемые во время
исследования. Например, другие компоненты, такие как
докогексаеновая кислота (ДГК) из Shizochytrium sp. [23], селен
[24], L-карнитин [25], цинк [26] и др., хорошо известны своим
действием на иммунные клетки. Мультикомпонентные смеси
биологически активных веществ, такие как препарат CA,
должны потенциально генерировать более сложные
взаимодействия с физиологией человека. Каждый компонент
может оказывать влияние на разные подсистемы человеческого
тела (напр., слизистые выделения, слизистую эпителиальных
клеток, различные органы, иммунные клетки, нервноэндокринную систему, и последнее, но не менее важное,
кишечную
микрофлору,
которая
может
оказывать
дополнительные вторичные эффекты). Таким образом, чем
сложнее подобная смесь, тем меньше вероятность проследить
определенное влияние одного из компонентов. В конце концов,
о препаратах подобных CA, можно судить только по их
совокупному воздействию на отдельные физиологические
функции in vivo. Поэтому цель настоящего клинического
исследования заключалась в изучении возможных сдвигов в
активации иммунных клеток, а также в том, как употребление
сока CA может отразиться на защитных реакциях или
воспалительных процессах.
Имеющиеся результаты указывают на незначительное
влияние или его полное отсутствие на врожденную часть
иммунной системы человека in vivo, но они позволяют
предположить, что основную пользу от приема препарата СА
получают Т-клетки. Это вызвало удивление, так как до сих пор
считалось, что типичные иммуномодуляторы растительного
происхождения,
такие
как
эхинацея,
улучшаю
функционирование клеток врожденной иммунной системы,
таких как макрофаги [27], что также может быть подтверждено
клиническими испытаниями [28]. Одним из наибольших
преимуществ анализа воздействия субстанций ex vivo после
перорального применения является то, что этот способ
введения обычно устраняет риск искусственной активации
иммунных клеток веществом LPS, которое обычно является
примесью (безвредной при проглатывании) натуральных
препаратов. Кроме того, это одно из наиболее мощных
веществ, активирующих лейкоциты, принадлежащее к
ОТКРЫТЫЙ ДОСТУП
347
молекулам молекулярного паттерна, связанного с патогенами
(PAMP-молекулам). При нормальной кишечной проходимости
кишечный
эпителий
может
блокировать
запуск
воспалительных реакций бактериальными эндотоксинами, но
этот процесс нарушается при нарушении целостности
кишечника или употреблении блюд с высоким содержанием
жира [29]. В экспериментах in vitro подобные молекулы часто
имитируют или даже перевешивают возможное воздействие,
вызываемое растительными компонентами [30].
Культуральная модель из цельной крови, используемая в
таких
экспериментах
для
обнаружения
иммуномодулирующего действия CA, позволила исследовать
иммуномодулирующее
воздействие
ex
vivo
в
патофизиологических условиях, сопоставимых с in vivo.
Последнее стало возможным благодаря использованию провоспалительных активаторов, триггеров ответа иммунных
клеток, сходных с теми, которые наблюдаются во время
инфекционных
заболеваний
(путем
комбинирования
активатора моноцитов LPS, поликлонального стимулятора Тклеток SE-B и стимулирующего антитела, анти-CD28). Это
позволяет
достичь
умеренной
физиологической
(=комбинированной) активации различных популяций
лейкоцитов, что оказывает стимулирующее и ингибирующее
действие компонентов препарата CA. Несмотря на то, что в
эксперименте участвовала относительно небольшая группа
добровольцев (n = 20 в обеих группах сыворотки и плацебо),
профиль активности показывает относительно ясную картину:
Все цитокины, которые показали значительные изменения
после приема CA (ГМ-КСФ, IFNγ, IL-4, IL-10, IL-17, TNFβ)
могут быть отнесены к разных подмножествам Т-клеток [31].
За исключением IL-10 (см. ниже), все остальные цитокины
достигли своего максимума на 3 день терапии (по сравнению
с исходными характеристиками в день 0). Кинетика
предполагает, что вскоре после начала применения CA, Тлимфоциты более эффективно отвечают на стимуляцию
(способ действия до сих пор не известен). При повторном
анализе после 14 дней применения, усиливающее действие на
ГМ-КСФ, IFNγ, IL-4, IL-17 и TNFβ уже не наблюдалось.
Вместо этого, при экспериментальной активации через 2
недели приема CA, формирование IL-10 все еще усиливалось
на этом этапе терапии препаратом CA. IL-10 также мог
вырабатываться лейкоцитами врожденной иммунной системы
или определенными Т-лимфоцитами. Однако, на остальные
маркеры цитокинов врожденных иммунных клеток (IL-1,
TNFα, IL-6 и др.) терапия CA не подействовала. Поэтому
разумно предположить, что секреция ингибирующего
цитокина генерируется либо помощником Т-клеток 2 типа
(Th2; [32]) или регуляторными Т-клетками (Treg; [33]). Как
известно, последние две клетки откладывались в ходе
активации по сравнению с клетками Th1 и Th17, которые
считаются источником дополнительных ГМ-КСФ, IFNγ, IL-17
и TNFβ, обнаруженных в супернатантах лиц, получавших CA,
через 3 дня приема. Единственным Th2 цитокином, который
ответил на применение CA, был IL-4, хотя его увеличение
произошло только во время посещения № 3.
FNS
348
Иммуномодулирующие свойства концентрированного фруктового и виноградного сока, проверенные в
рандомизированном, двойном слепом клиническом испытании с участием здоровых добровольцев
Тот факт, что значительный эффект отмены для IFNγ
наблюдался при посещении № 5 может считаться еще одним
признаком того, что препарат CA действует в основном на Тклетки.
Так как IL-10 является одним из немногих цитокинов,
обладающих
противовоспалительным
действием
(подавляющим активность), эти результаты указывают на то,
что реальное модулирующее действие препарата CA
проявляется в том, что он улучшает возможности иммунных
клеток к секреции, а после активации, про- и антивоспалительные медиаторы. Кроме того, IL-10 действительно
обладает дополнительными функциями в окончательной
дифференциации герминативного центра В-клеток в
иммуноглобулин-секретирующие клетки плазмы. Таким
образом, можно предположить, что препарат CA, более
косвенным образом, также помогает урегулировать антигенспецифическое производство антител [34]. Это можно легко
исследовать в следующем клиническом испытании с
измерением титров антител у вакцинированных добровольцев,
получавших СА или плацебо.
Небольшая популяция исследования является ограничением
настоящего исследования. Поэтому эти результаты могут
считаться только предварительными, они должны быть
подтверждены большей исследуемой популяцией.
Тем не менее, эти результаты указывают на четкую
корреляцию между приемом CA и изменениями в активности
иммунных клеток у здоровых добровольцев, что доказано
анализами цельной крови. Эти эффекты приводят к усилению
ответа Т-лимфоцитов на активацию, как это происходит при
инфекционных заболеваниях. Очень низкий уровень побочных
реакций и общая хорошая податливость демонстрируют
безопасность и приемлемость исследуемого препарата для
потребителей.
Признательность
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
Исследование финансировалось компанией Hans-Gunter Berner
GmbH & Co. KG (Альтенхольц; Германия).
Конфликт интересов
[11]
M. Шмольц выполнил аналитическую часть при помощи
системы Tru-Culture® и написал основную часть рукописи; Р.
Марц провел оценку данных и статистический анализ; M.
[12]
Шаудт в основном участвовал в управлении исследованием; К.
Шаудт: в основном участвовала в планировании исследования;
К. Лаустер выступал главным исследователем.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
[1]
[2]
[13]
J. L. Rios, M. C. Recio, J. M. Escandell and I. Andujar, “Inhibition of
Transcription Factors by Plant-Derived Compounds and Their
Implications in Inflammation and Cancer,” Current Pharmaceutical
[14]
Design,
Vol. 15, No. 11, 2009, pp. 1212-1237.
http://dx.doi.org/10.2174/138161209787846874
S. A. Stanner, J. Hughes, C. N. Kelly and J. Buttriss, “A Review of
the Epidemiological Evidence for the ‘Antioxidant Hypothesis’,”
[15]
Public Health Nutrition, Vol. 7, No. 3, 2004, pp. 407-422.
http://dx.doi.org/10.1079/PHN2003543
ОТКРЫТЫЙ ДОСТУП
M. Dell’Agli, C. Di Lorenzo, M. Badea, E. Sangiovanni, L. Dima, E.
Bosisio and P. Restani, “Plant Food Supplements with AntiInflammatory Properties: A Systematic Review (I),” Critical Reviews
in Food Science and Nutrition, Vol. 53, No. 4, 2013, pp. 403-413.
http://dx.doi.org/10.1080/10408398.2012.682123
C. Di Lorenzo, M. Dell’agli, E. Colombo, E. Sangiovanni and P.
Restani, “Metabolic Syndrome and Inflammation: A Critical Review
of in Vitro and Clinical Approaches for Benefit Assessment of Plant
Food Supplements,” Evidence-Based Complementary and
Alternative Medicine, Vol. 2013, 2013, Article ID: 782461.
N. Iyer, S. A. Marathe, D. Chaudhuri, P. Garai and D. Chakravortty,
“Immunomodulation Using Agonists and Antagonists: Potential
Clinical Applications,” Expert Opinion on Investigational Drugs,
Vol.
21,
No.
1,
2012,
pp.
67-81.
http://dx.doi.org/10.1517/13543784.2012.642367
J. M. van Dieren, E. J. Kuipers, J. N. Samsom, E. E. Nieuwenhuis and
C. J. van der Woude, “Revisiting the Immunomodulators Tacrolimus,
Methotrexate, and My- cophenolate Mofetil: Their Mechanisms of
Action and Role in the Treatment of IBD,” Inflammatory Bowel Diseases,
Vol.
12,
No.
4,
2006,
pp.
311-327.
http://dx.doi.org/10.1097/01.MIB.0000209787.19952.53
M. Ramadan, S. Goeters, B. Watzer, E. Krause, K. Loh- mann, R.
Bauer, B. Hempel and P. Imming, “Chamazu- lene Carboxylic Acid
and Matricin: A Natural Profen and Its Natural Prodrug, Identified
through Similarity to Synthetic Drug Substances,” Journal of Natural
Products, Vol. 69, No. 7, 2006, pp. 1041-1045.
http://dx.doi.org/10.1021/np0601556
V. M. Chandrashekhar, K. S. Halagali, R. B. Nidavani, M. H.
Shalavadi, B. S. Biradar, D. Biswas and I. S. Much- chandi, “AntiAllergic Activity of German Chamomile (Matricaria recutita L.) in
Mast Cell Mediated Allergy Model,” Journal of Ethnopharmacology,
Vol. 137, No. 1, 2011, pp. 336-340.
http://dx.doi.org/10.1016/i.iep.2011.05.029
X. Gao, D. Deeb, Y. Liu, S. Gautam, S. A. Dulchavsky and S. C.
Gautam, “Immunomodulatory Activity of Xan- thohumol: Inhibition
of T Cell Proliferation, Cell-Mediated Cytotoxicity and Th1 Cytokine
Production
through
Suppression
of
NF-KappaB,”
Immunopharmacology and Immunotoxicology, Vol. 31, No. 3, 2009,
pp. 477-484. http://dx.doi.org/10.1080/08923970902798132
U. Svajger and M. Jeras, “Anti-Inflammatory Effects of Resveratrol
and Its Potential Use in Therapy of Im- mune-Mediated Diseases,”
International Reviews of Immunology, Vol. 31, No. 3, 2012, pp.
202-222. http://dx.doi.org/10.3109/08830185.2012.665108
J. H. Park, J. W. Kim, C. M. Lee, Y. D. Kim, S. W. Chung, I. D. Jung,
K. T. Noh, J. W. Park, D. R. Heo, Y. K. Shin, J. K. Seo and Y. M.
Park, “Sulforaphane Inhibits the Th2 Immune Response in
Ovalbumin-Induced Asthma,” BMB Reports, Vol. 45, No. 5, 2012,
pp. 311-316. http://dx.doi.org/10.5483/BMBRep.2012.45.5.311
Y. Zhang, D. Y. Leung, B. N. Richers, Y. Liu, L. K. Re- migio, D. W.
Riches and E. Goleva, “Vitamin D Inhibits Monocyte/Macrophage
Proinflammatory Cytokine Production by Targeting MAPK
Phosphatase-1,” Journal of Immunology, Vol. 188, No. 5, 2012, pp.
2127-2135. http://dx.doi.org/10.4049/iimmunol.1102412
J. M. Carcamo, O. Borquez-Ojeda and D. W. Golde, “Vitamin C
Inhibits Granulocyte Macrophage-Colony-Stimulating FactorInduced Signaling Pathways,” Blood, Vol. 99, No. 9, 2002, pp.
3205-3212. http://dx.doi.org/10.1182/blood.V99.9.3205
C. Hartel, T. Strunk, P. Bucsky and C. Schultz, “Effects of Vitamin
C on Intracytoplasmic Cytokine Production in Human Whole Blood
Monocytes and Lymphocytes,” Cytokine, Vol. 27, No. 4-5, 2004,
pp. 101-106. http://dx.doi.org/10.1016/i.cyto.2004.02.004
J. J. Casciari, H. D. Riordan, N. Mikirova and J. Austin, “Effect of
Vitamin C Supplementation on ex Vivo Immune Cell Functioning,”
FNS
Иммуномодулирующие свойства концентрированного фруктового и виноградного сока, проверенные в
рандомизированном, двойном слепом клиническом испытании с участием здоровых добровольцев
[16]
[17]
[18]
[19]
[20]
[21]
[22]
[23]
[24]
[25]
[26]
[27]
[28]
[29]
Journal of Orthomolecular Medicine, Vol. 18, No. 2, 2003, pp. 8392.
J. Tamura, K. Kubota, H. Murakami, M. Sawamura, T. Matsushima,
T. Tamura, T. Saitoh, H. Kurabayshi and T. Naruse,
“Immunomodulation by Vitamin B12: Augmentation of CD8+ T
Lymphocytes and Natural Killer (NK) Cell Activity in Vitamin B12Deficient Patients by Me- thyl-B12 Treatment,” Clinical &
Experimental Immunology, Vol. 116, No. 1, 1999, pp. 28-32.
http://dx.doi.org/10.1046/i.1365-2249.1999.00870.x
H. K. Kwak, C. M. Hansen, J. E. Leklem, K. Hardin and T. D. Shultz,
“Improved Vitamin B-6 Status Is Positively Related to Lymphocyte
Proliferation in Young Women Consuming a Controlled Diet,”
Journal of Nutrition, Vol. 132, No. 11, 2002, pp. 3308-3313.
S. C. Mueller, R. Marz, M. Schmolz and B. Drewelow,
“Intraindividual Long Term Stability and Response Corridors of
Cytokines in Healthy Volunteers Detected by a Standardized WholeBlood Culture System for Bed-Side Application,” BMC Medical
Research Methodology, Vol.
12, 2012, p. 112.
M. Triantafilou and K. Triantafilou, “Lipopolysaccharide
Recognition: CD14, TLRs and the LPS-Activation Cluster,” Trends
in Immunology, Vol. 23, No. 6, 2002, pp. 301-304.
http://dx.doi.org/10.1016/S1471-4906(02)02233-0
T. Nagashima, T. Aranami, C. Iclozan and K. Onoe, “Analysis of T
Cell Responses to a Superantigen, Staphylococcal Enterotoxin-B,”
Journal of Clinical and Experimental Hematopathology, Vol. 44, No.
1, 2004, pp. 25-32. http://dx.doi.org/10.3960/islrt.44.25
M. E. van Berkel and M. A. Oosterwegel, “CD28 and ICOS: Similar
or Separate Costimulators of T Cells?” Immunology Letters, Vol.
105, No. 2, 2006, pp. 115-122.
http://dx.doi.org/10.1016/i.imlet.2006.02.007
M. M. Wurfel, W. Y. Park, F. Radella, J. Ruzinski, A. Sandstrom, J.
Strout, R. E. Bumgarner and T. R. Martin, “Identification of High and
Low Responders to Lipopo- lysaccharide in Normal Subjects: An
Unbiased Approach to Identify Modulators of Innate Immunity,”
Journal of
Immunology, Vol. 175, No. 4, 2005, pp. 2570-2578.
N. Serhan, “Resolvins and Protectins: Novel Lipid Mediators in AntiInflammation and Resolution,” Scandinavian Journal of Food and
Nutrition, Vol. 50, No. S2, 2006, pp. 68-78.
http://dx.doi.org/10.1080/17482970601066298
Z. Huang, A. H. Rose and P. R. Hoffmann, “The Role of selenium in
Inflammation and Immunity: From Molecular Mechanisms to
Therapeutic Opportunities,” Antioxidants & Redox Signaling, Vol.
16, No. 7, 2012, pp. 705-743.
http://dx.doi.org/10.1089/ars.2011.4145
G. Fortin, “L-Carnitine and Intestinal Inflammation,” Vitamins &
Hormones, Vol. 86, 2011, pp. 353-366.
H. Haase and L. Rink, “Zinc Signals and Immune Function,”
Biofactors, 2013.
A. M. Sullivan, J. G. Laba, J. A. Moore and T. D. Lee, “EchinaceaInduced Macrophage Activation,” Immuno- pharmacology and
Immunotoxicology, Vol. 30, No. 3, 2008, pp. 553-574.
http://dx.doi.org/10.1080/08923970802135534
M. R. Ritchie, J. Gertsch, P. Klein and R. Schoop, “Effects of
Echinaforce (R) Treatment on ex Vivo-Stimu- lated Blood Cells,”
Phytomedicine, Vol. 18, No. 10, 2011, pp. 826-831.
http://dx.doi.org/10.1016/i.phvmed.2011.05.011
A. P. Moreira, T. F. Texeira, A. B. Ferreira, C. Peluzio Mdo and C.
Alfenas Rde, “Influence of a High-Fat Diet on Gut Microbiota,
Intestinal Permeability and Metabolic Endotoxaemia,” British
Journal of Nutrition, Vol. 108, No. 5, 2012, pp. 801-809.
ОТКРЫТЫЙ ДОСТУП
349
http://dx.doi.org/10.1017/S0007114512001213
[30] N. D. Pugh, C. R. Jackson and D. S. Pasco, “Total Bacterial Load
within Echinacea Purpurea, Determined Using a New PCR-Based
Quantification Method, Is Correlated with LPS Levels and in Vitro
Macrophage Activity,” PlantaMedica, Vol. 79, No. 1,2013, pp. 9-14.
[31] T. R. Mosmann and S. Sad, “The Expanding Universe of T-Cell
Subsets: Th1, Th2 and More,” Immunology Today, Vol. 17, No. 3,
1996, pp. 138-146. http://dx.doi.org/10.1016/0167-5699(96)80606-2
[32] E. Maier, A. Duschl and J. Horejs-Hoeck, “STAT6-De- pendent and
-Independent Mechanisms in Th2 Polarization,” European Journal
of Immunology, Vol. 42, No. 11, 2012, pp. 2827-2833.
http://dx.doi.org/10.1002/eii.201242433
[33] T. L. Geiger and S. Tauro, “Nature and Nurture in Foxp3(+)
Regulatory T Cell Development, Stability, and Function,” Human
Immunology, Vol. 73, No. 3, 2012, pp. 232-239.
http://dx.doi.org/10.1016/i.humimm.2011.12.012
[34] S. O. Yoon, X. Zhang, P. Berner and Y. S. Choi, “IL-21 and IL-10
Have Redundant Roles but Differential Capacities at Different Stages
of Plasma Cell Generation from Human Germinal Center B Cells,”
Journal of Leukocyte Biology, Vol. 86, No. 6, 2009, pp. 1311-1318.
http://dx.doi.org/10.1189/ilb.0409268
FNS
350
Иммуномодулирующие свойства концентрированного фруктового и виноградного сока, проверенные в
рандомизированном, двойном слепом клиническом испытании с участием здоровых добровольцев
Аббревиатуры
BDNF: Нейротрофический фактор мозга
Eotaxin: Эотаксин
ГМ-КСФ:
Гранулоцитарно-моноцитарный
колониестимулирующий фактор
ICAM-1: Молекула клеточной адгезии-1
IFN-γ: Интерферон гамма
IL-1α: Интерлейкин-1 альфа
IL-1β: Интерлейкин -1 бета
IL-1ra: Антагонист рецептора интерлейкина-1
IL-2: Интерлейкин-2
IL-3: Интерлейкин-3
IL-4: Интерлейкин-4
IL-5: Интерлейкин-5
IL-6: Интерлейкин-6
IL-7: Интерлейкин-7
ОТКРЫТЫЙ ДОСТУП
IL-8: Интерлейкин-8
IL-10: Интерлейкин-10
IL-12p40: Интерлейкин-12 p40 IL12p70: Интерлейкин-12 p70
IL-15: Интерлейкин-15 IL17: Интерлейкин-17 IL-23:
Интерлейкин -23
MCP-1: Моноцитарный хемоаттрактантный
белок-1
MIP-1α: Макрофагоцитарный воспалительный
белок-1 альфа
MIP-1β: Макрофагоцитарный воспалительный
белок -1 бета
MMP-3: Матриксная металлопротеиназа -3
SCF: Фактор роста стволовой клетки
TNFα: Фактор некроза опухоли-альфа
TNFβ: Фактор некроза опухоли-бета
VEGF: Фактор роста эндотелия сосудов
FNS