МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЛОГИКА ЖИВОГО
advertisement
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЛОГИКА ЖИВОГО МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЛОГИКА ЖИВОГО ....................................................................................................................36 БЕЛКИ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ. ......................................................................................................37 КОНФОРМАЦИЯ БЕЛКОВ...................................................................................................................................................38 КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ.....................................................................................................................39 МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ, ОСНОВАННЫЕ НА РАЗЛИЧИЯХ В ИХ КИСЛОТНО - ОСНОВНЫХ СВОЙСТВАХ ..............39 Осажденпе белков в виде солей .............................................................................................................................39 Методы разделения белков, основанные на различиях растворимости .........................................................39 Влияние концентрации солей на растворимость белков ......................................................................................................39 Влияние температуры на растворимость белков. ........................................................................................................40 Осмос и мембранное равновесие белков. .............................................................................................................40 АМИНОКИСЛОТЫ — СТРУКТУРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ БЕЛКОВ ........................................................................43 О БЫЧНЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ , ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ БЕЛКОВ ................................................................................43 АМИНОКИСЛОТЫ С НЕПОЛЯРНЫМИ ИЛИ ГИДРОФОБНЫМИ R-ГРУППАМИ ..................................................................................43 АМИНОКИСЛОТЫ С НЕЗАРЯЖЕННЫМИ ПОЛЯРНЫМИ R-ГРУППАМИ............................................................................................43 АМИНОКИСЛОТЫ С ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫМИ (КИСЛЫМИ) R-ГРУППАМИ ..........................................................................43 АМИНОКИСЛОТЫ С ПОЛОЖИТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫМИ (ОСНОВНЫМИ) R-ГРУППАМИ ....................................................................43 М ЕТОДЫ РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОГО РАЗДЕЛЕНИЯ ..........................................................................................................44 ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ........................................................................................................................................44 СОСТАВ И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В БЕЛКАХ ..........................44 СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ ...................................................................................................................................................44 ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ПЕПТИДОВ ..................................................................................................................................45 РАЗДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЕПТИДОВ ..................................................................................................................................45 ФЕРМЕНТЫ. КИНЕТИКА И ИНГИБИРОВАНИЕ .................................................................................................45 КЛАССИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ .....................................................................................................................................46 КОФАКТОРЫ ФЕРМЕНТОВ ...............................................................................................................................................46 ХИМИЧЕСКАЯ КИНЕТИКА ................................................................................................................................................47 КАТАЛИЗ ............................................................................................................................................................................47 О ПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ФЕРМЕНТА ПО ЕГО АКТИВНОСТИ ................................................................................48 ПО МЕЖДУНАРОДНОМУ СОГЛАШЕНИЮ ЗА ЕДИНИЦУ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ПРИНИМАЕТСЯ КОЛИЧЕСТВО ФЕРМЕНТА, СПОСОБНОЕ ВЫЗВАТЬ ПРЕВРАЩЕНИЕ ОДНОГО МИКРОМОЛЯ СУБСТРАТА В МИНУТУ ПРИ 25 °С В ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ. УДЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ФЕРМЕНТА НАЗЫВАЮТ ЧИСЛО ЕДИНИЦ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В РАСЧЕТЕ НА 1 МГ БЕЛКА. ЭТУ ВЕЛИЧИНУ ИСПОЛЬЗУЮТ В КАЧЕСТВЕ КРИТЕРИЯ ЧИСТОТЫ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА; ОНА ВОЗРАСТАЕТ ПО МЕРЕ ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТА И ДЛЯ ИДЕ АЛЬНО ЧИСТОГО ПРЕПАРАТА ДОСТИГАЕТ МАКСИМАЛЬНОГО ЗНАЧЕНИЯ. ПОД ЧИСЛОМ ОБО РОТОВ ПОНИМАЮТ ЧИСЛО МОЛЕКУЛ СУБСТРАТА , ПОДВЕРГАЮЩИХСЯ ПРЕВРАЩЕНИЮ ЗА ЕДИНИЦУ ВРЕМЕНИ В РАСЧЕТЕ НА ОДНУ МОЛЕКУЛУ ФЕРМЕНТА (ИЛИ НА ОДИН АКТИВ НЫЙ ЦЕНТР) В УСЛОВИЯХ, КОГДА СКОРОСТЬ РЕАКЦИИ ЛИМИТИРУЕТСЯ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ ЭЛЕМЕНТА. И НГИБИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ ....................................................................................................................................48 ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ .........................................................................................................................49 ЛИПИДЫ, ЛИПОПРОТЕИДЫ И МЕМБРАНЫ.......................................................................................................49 ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ .........................................................................................................................................................49 Н ЕЙТРАЛЬНЫЕ ЖИРЫ ( АЦИЛГЛИЦЕРИНЫ ) ..................................................................................................................50 СВОЙСТВА АЦИЛГЛИЦЕРИНОВ .........................................................................................................................................50 ФОСФОГЛИЦЕРИДЫ ..........................................................................................................................................................50 В ОСКА .............................................................................................................................................................................51 О МЫЛЯЕМЫЕ И НЕОМЫЛЯЕМ ЫЕ ЛИПИДЫ ................................................................................................................51 СТЕРОИДЫ ........................................................................................................................................................................51 ТЕРПЕНЫ ..........................................................................................................................................................................51 ЛИПОПРОТЕИДЫ ..............................................................................................................................................................52 САХАРА .............................................................................................................................................................................52 В АЖНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ МОНОСАХАРИДОВ И ГЛИКОЗИДОВ .......................................................................................52 С АХАРНЫЕ КИСЛОТЫ ....................................................................................................................................................53 АМИНОСАХАРА ................................................................................................................................................................53 37 ДИСАХАРИДЫ ..................................................................................................................................................................53 ТРИСАХАРИДЫ .................................................................................................................................................................53 ПОЛИСАХАРИДЫ (ГЛИКАНЫ) ..........................................................................................................................................54 Крахмал .........................................................................................................................................................................54 Гликоген .........................................................................................................................................................................54 Целлюлоза ...................................................................................................................................................................54 НУКЛЕОТИДЫ И ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ ................................................................................................................55 КОМПОНЕНТЫ МОНОНУКЛЕОТИДОВ ..............................................................................................................................55 ПИРИМИДИНОВЫЕ И ПУРИНОВЫЕ ОСНОВАННЯ ...........................................................................................................55 НУКЛЕОЗИДЫ.....................................................................................................................................................................55 НУКЛЕОТИДЫ ...................................................................................................................................................................55 ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ .........................................................................................................................................................55 ДНК .................................................................................................................................................................................56 РНК ..................................................................................................................................................................................57 Информационная, или матричная РНК ................................................................................................................57 Транспортная РНК ....................................................................................................................................................57 Рыбосомная РНК ........................................................................................................................................................58 Живая материя нуждается всего в 22 химических элементах из 100, при сутствующих в земной коре, причем у большинства организмов на четыре элемента — углерод, водород, азот и кислород — приходится 99% общей массы. Почти все компоненты живых клеток содержат соединения углерода, распространение которого в земной коре очень невелико. По-видимому, это связано с тем, что углерод в высшей степени подходит для создания струк- турного остова биомолекул благодаря способности его атомов образовывать / стабильные ковалентные связи с атомами водорода, кислорода и азота, а также I с другими атомами углерода. Молекулярная организация клетки начинается с простых молекул-предшественников, поступающих из окружающей среды. С помощью фер ментативных реакций они превращаются в строительные блоки, которые, связываясь ковалентно друг с другом, образуют макромолекулы клетки. Макромолекулы при помощи нековалентных связей объединяются в надмо лекулярные комплексы и в конечном итоге образуют клеточные органеллы Первые клетки могли образоваться из 30 первичных биомолекул, в том числе 20 аминокислот, 5 пуриновых и пиримидиновых оснований, 2 Сахаров, 1 жирной кислоты, глицерина и холина.- От этих биомолекул происходят сотни других, выполняющих более специализированные и обособленные функции у. различных организмов. Первичные биомолекулы, по-видимому, имеют абиогенную природу; они образовались в результате взаимодействия компонентов примитивной атмосферы под влиянием излучений и грозовых разрядов. Предполагается, что в первичном океане присутствовали в высо кой концентрации простые органические соединения, из которых отбирались те молекулы, которые в наибольшей степени способствовали выживанию пер вых живых организмов. Повидимому, биомолекулы — это самые простые из всех возможных и в то же время наиболее многосторонние и наилучшим образом соответствующие своим многочисленным функциям в клетке моле кулы. Размеры, форма и свойства поверхности биомолекул играют исключи тельно, важную роль в определении специфичности их поведения в биологи ческих системах, а также в выполняемой ими роли строителнаьбг'тмки. структурных компонентов клеток. БЕЛКИ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ. Среди органических соединений, встречающихся в клетке, первое месте занимают белки — на их долю приходится не менее 50% сухого веса клетки Белки играют первостепенную роль в структуре и функциях клетки, так как именно они являются теми молекулярными инструментами, с помощью кото рых реализуется генетическая информация. 38 Состав белков Многие белки были выделены в чистом кристаллическом виде. В состав всех белков входят углерод, водород, азот и кислород; кроме того, почти все они содержат серу. В некоторых белках присутствуют и другие элементы, чаще всего фосфор, железо, цинк и медь. Белки обладают очень большим молекулярным весом, но при кислотном гидролизе из них образует ся ряд простых, низкомолекулярных органических соединений. Эти соеди нения, относящиеся к классу аминокислот, отличаются друг от друга по строению своих R-групп, или боковых цепей. В качестве структурных элементов (или, как их принято называть, строительных блоков) белков встречаются обычно только 20 различных аминокислот. В белковых молекулах последовательно расположенные аминокислотные остатки ковалентно связаны друг с другом, образуя длинные неразветвлен-ные полимерные цепи. Аминокислоты располагаются таким образом, что конец одной аминокислоты связан с на чалом другой пептидной связью. Пеп тидная связь образуется в результате вделения молекулы воды из карбоксильной группы одной аминокислоты и аминогруппы другой. Такие поли-мерные молекулы, называемые поли пептидными цепями. Белковая молекула может состоять либо из одной, либо из нескольких полипептидных цепей. По своему составу белки разделяют ся на два основных класса. Простые белки при гидролизе дают только амино кислоты и не образуют никаких других органических или неорганических про дуктов; они обычно содержат углерод, водород, ки слород, азот и серу. Сложные белки при гидролизе дают не только аминокислоты, но также и дру гие органические или неорганические продукты. Небелковую часть молекулы сложного белка (т. е. часть, не состоя щую из аминокислот) называют его простетической группой. Сложные белки можно классифицировать, исходя из химической природы их простетических групп. Так, например, среди них можно выделить нуклеопротеиды и липопротеиды (которые содержат соот ветственно нуклеиновые кислоты и липиды) или фосфопротеиды, металлопротеиды и гликопротеиды. Конформация белков Белковая молекула любого типа в нативном состоянии обладает харак терной для нее пространственной структурой, которую часто называют конформацией. В зависимости от конформации белки можно разделить на два основных класса. Первый класс составляют фибриллярные белки. Это устойчивые, нерастворимые в воде и в разбавленных солевых рас творах вещества. Располагаясь параллельно друг другу вдоль одной оси, полипептидные цепи образуют длинные волокна (фибриллы) или слои. Фиб риллярные белки — основные структурные элементы соединительной ткани ВЫСШИХ животных. Коллаген сухожилий и костной ткани, кератин волос, роговых образований, кожи, ногтей и перьев, эластин упругой соединитель ной ткани — все это фибриллярные белки. Другой класс составляют глобу лярные белки, полипептидные цепи которых плотно свернуты в компактные сферические или глобулярные структуры. Большинство глобу лярных белков растворимо в водных растворах и легко диффундирует. Эти белки обычно несут в клетке динамические функции. К глобулярным белкам относятся почти все известные в настоящее время ферменты, а также антитела, некоторые гормоны и многие белки, выпоняющие транспортную функцию, например сывороточный альбумин и гемо глобин. Некоторые белки принадлежат к промежуточному типу. Подобно фиб риллярным белкам, они состоят из длинных, палочковидных структур, и в то же время они, как глобулярные белки, растворимы в водных солевых рас творах. К таким белкам относится миозин — важный структурный элемент мышц — и фибриноген — предшественник фибрина, основного компонента сгустка крови. Для обозначения различных уровней структуры белка обычно исполь зуют специальные термины. Термин первичная структура характеризует последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи, связан ных ковалентными связями. Термин вторичная структура относится к вытя нутой или спирально скрученной конформации полипептидных цепей, в част ности, например, к типу укладки полипептидных цепей, характерному для фибриллярных белков. Термин третичная структура относится к способу укладки цолипептидной цепи с образованием 39 компактной, плотно упакован ной структуры, характерной для глобулярных белков. Более общий термин конформация используют, имея в виду одновременно вторич ную и третичную структуру пептидной цепи, т. е. ее пространственную конфигурацию. Термин четвертичная структура характеризует способ объе-зинения (расположения в пространстве) отдельных полипептидных цепей з белковой молекуле, состоящей из нескольких таких цепей. Молекулы боль шинства крупных белков, как фибриллярного, так и глобулярного типа, состоят из двух или нескольких полипептидных цепей, которые могут быть не связаны между собой ковалентными связями. Кислотно-основные свойства белков Кислотно-основные свойства белков определяются, главным образом, ионизируемыми Rгруппами пептидной цепи (или цепей); на способность R-групп к ионизации могут оказывать влияние соседние группы. Характер кривых титрования большинства белков определяется аддитивным вкладом всех ионизируемых групп белковой молекулы. Для каждого белка характер но определенное значение рН, соответствующее изоэлектрической точке, при котором белок остается неподвижным в электрическом поле. При значениях рН, лежащих выше изоэлектрической точки, белок несет суммарный отрица тельный заряд, а при значениях рН ниже изоэлектрической точки — суммар ный положительный заряд. Методы разделения белков, основанные на различиях в их кислотно- основных свойствах Различия в кислотно-основных свойствах белков лежат в основе двух методов, разработанных для разделения и анализа белковых смесей, а именно методов электрофореза и ионообменной хроматографии. Осажденпе белков в виде солей Большинство белков можно полностью осадить из водного раствора при добавлении некоторых кислот, например трихлоруксусной и хлорной. Они образуют с белками кислотонерастворимые соли. Методы разделения белков, основанные на различиях растворимости Глобулярные белки сильно различаю тся по своей растворимости в водных системах; эти различия можно использовать для разделения белковых смесей. Четыре фактора оказывают существенное влияние на растворимость белков: 1) рН, 2) ионная сила, 3) диэлектрические свойства растворителя, 4) температура. Поскольку разные белки имеют раз ные изоэлектрические точки, их можно отделить друг от друга с помощью прие ма, известного под названием изоэлектрического осаждения. При достижении значения рН, соответствующего изоэлектрической точке одного из компо нентов белковой смеси, этот компонент целиком или почти целиком выпадает в осадок, тогда как белки, изоэлектриче ские точки которых лежат при более низких или более высоких значениях рН, остаются в растворе. Влияние концентрации солей на растворимость белков Нейтральные соли оказывают заметное влияние на растворимость глобулярных белков. В низких концентрациях они повышают растворимость многих бел ков. Этот эффект не зависит от при роды нейтральной соли; он зависит от концентрации соли и числа зарядов каждого из ионов, присутствующих в растворе. Соли, содержащие двухва лентные ионы, например MgCl2 или MgSO4, значительно эффективнее повы шают растворимость белков, чем такие соли, как NaCl, NH4C1 и КС1. Повы шение растворимости вызывается изме нениями в степени диссоциации ионизи руемых групп белка. При значительном повышении кон центрации нейтральных солей раство римость белков начинает опять пони жаться, и при очень высоких концентра циях соли белок может полностью выпасть в осадок. Это явление называет ся высаливанием. Физико-химическая основа высаливания до конца не выясне на. Оба описанных эффекта, т. е. повы шение растворимости белков при низких 40 концентрациях соли и понижение при высоких концентрациях, широко исполь зуются для разделения белковых смесей, так как белки отличаются друг от друга по своей реакции на изменение концен трации нейтральных солей. Влияние температуры на растворимость белков. Растворимость большинства белков возрастает при повышении тем пературы. Но правило это, однако, имеет исключения. При температурах, выше 50-60° С, большинство белков утрачивает стабильность; начинается их денатурация (процесс сворачивания белка). При этом теряется их способность к растворимости в разных растворителях,но улутшается их усвоение. Осмос и мембранное равновесие белков. Многие биологически важные свойства белков в растворе объясняются чрезвычайно большими размерами белковых молекул. Белковые молекулы диффундируют через некоторые мембраны, легко пропускающие воду и растворенные в ней низкомолекулярные вещества. Целлофановые мембраны используются, например, для удаления низкомолекулярных растворенных веществ из растворов, содержащих белки. Этот процесс носит название диализа. Диализ часто применяют при очистке белков для удале ния из белковых растворов таких веществ, которые способны осаждать белки, например нейтральных солей или этанола. Большинство биологиче ских мембран непроницаемо для белков, но свободно пропускает воду и простые незаряженные растворенные вещества. Если раствор белка отделен от какого-нибудь раствора, не содержащего бел ка, полупроницаемой мембраной, которая пропускает воду, но не пропуска ет белок, то вода поступает из этого второго раствора в белковый раствор. Этот процесс называется осмосом. Кон центрация или, точнее, термодинамическая активность молекул воды в белковом растворе меньше, чем в чистой воде, и система компенсирует это различие за счет суммарного перемещения воды из пространства, заполнен ного чистой водой, в пространство, содержащее белковый раствор. Пер мещение продолжается до тех пор, пока концентрации воды по обе стороны мем браны не выровняются. Осмотическое давление — это та сила, которую нужно приложить, чтобы предотвратить осмо тическое движение воды. Осмотическое давление — одно из кол-лигативных свойств растворов; оно за висит от числа растворенных частиц на единицу объема и не зависит от моле кулярной природы растворенного веще ства. Измерение осмотического давления в определенных условиях может быть использовано для определения молеку лярного веса белков. Диффузией называется движение молекул в направлении более низкой их концентрации. Скорость диффузии белков мала по сравнению со скоростью диффузии молекул небольшого размера. КАТАЛИТИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ БЕЛКИ В списке ферментов, датированном 1972 г., содержит ся 1769 белков, каждый из которых обладает той или иной каталитической активностью. Около 200 из них по лучено в кристаллическом состоянии. У 180 ферментов выяснена первичная структура (данные на август 1975 г.), у 27 — третичная структура (данные на конец 1971 г.) и у нескольких сотен — четвертичная структура. Специфика строения ферментов сводится к следующе му: а-структура присутствует в их молекулах в неболь шом количестве; это же относится к слоистой, упорядо ченной р-структуре. Таким образом, в большей части структура молекул ферментов представлена прихотливо извитой под разными углами, переплетающейся во всех направлениях полипептидной цепью. Большинство ферментов располагает аллостерическими центрами, которые служат для контакта с аллостериче скими регуляторами их активности. Большая часть ка талитически активных белков обладает четвертичной структурой, которая в значительной мере предопределяет способность ферментов давать изоферменты; с изучением последних связана новая и увлекательная область фер ментологии. Между структурой их молекул и способностью ускорять протекание соответствующих хи 41 мических реакций существует теснейшая взаимосвязь, характерная именно для этой обширной группы белко вых тел. БЕЛКИ-ГОРМОНЫ Характерной особенностью этой группы белков явля ется способность воздействовать на фундаментальные ме ханизмы, участвующие в регуляции обмена веществ: проницаемость клеточных мембран, процессы транскрип ции и трансляции при биосинтезе нуклеиновых кислот и белков, изменение третичной структуры ферментов за счет взаимодействия с их аллостерическими центрами. Изучена структура и биологическая активность ряда белковых гормонов, в том числе инсулина, соматотропина, пролактина, плацентарного лактогена, лютеинизирующего гормона, фолликулостимулирующего гормона, хорионического гонадотропина, тиреотропина, тиреоглобулина и паратиреоидного гормона. Молекулярные массы подавляющего их числа лежат между 20 000 и 30 000 дальтон; лишь инсулин и паратиреоидный гормон имеют молекулярные массы 6000 и 9000 соответственно, а тиреоглобулин является крайне высокомолекулярным соеди нением с молекулярной массой в несколько сотен тысяч дальтон. Характерной особенностью структуры белковых гор монов является то, что многие из них представляют собой димеры, т. е. состоят из А- и В-цепей. Еще более любопытной особенностью струк туры белковых гормонов является наличие в составе их полипептидных цепей относительно небольших фрагмен тов (из нескольких десятков аминокислотных остатков), которые являются носителями гормональной активно сти. БЕЛКИ — РЕГУЛЯТОРЫ АКТИВНОСТИ ГЕНОМА Исследование группы белков, регулирующих актив ность генома, осуществляется в последние годы необы чайно интенсивно, так как их функциональная активность связана с репрессией и дерепрессией генома и, следова тельно, с регуляцией таких важнейших процессов, как рост, развитие и морфогенез растений и животных. Одной из наиболее изученных подгрупп указанных белков являются гистоны, т. е. белки, в составе которых суммарное содержание аргинина, лизина и гистидина превышает 30%. Гистоны локализованы в хроматине клеточных ядер, где они ассоциированы с ДНК. Вместе с тем в хроматине ядра содержатся также негистоновые белки, принимающие в регуляции активности генома, воз можно, даже большее участие, чем гистоны. В последнее время удалось выделить, например, совершенно специ фические белки, блокирующие биосинтез некоторых РНК,— это белки-репрессоры. Соединяясь с ДНК ионными связями и силами сла бых взаимодействий, гистоны стабилизируют ее структу ру. Естественно, что дестабилизация ДНК, необходимая для проявления ее матричной активности, осуществима лишь при ослаблении, в силу тех или иных причин, свя зей между ДНК и гистонами, чем и определяется регуляторная роль гистонов в функционировании генома. Негистоновые белки изучены в гораздо меньшей сте пени, чем гистоновые. Они крайне гетерогенны, склонны к агрегации, что затрудняет их фрак ционирование. Негистоновые белки не принимают участия в репрессировании генома, но актив но участвуют в его дерепрессии, препятствуя образова нию суперспирализованной ДНК на тех ее участках, где они присоединились в 5-периоде цикла деления клетки. Несомненно, что изучение структуры и функций бел ков-регуляторов активности генома открывает перспекти ву познания наиболее глубоких основ регуляции процес сов жизнедеятельности. ЗАЩИТНЫЕ БЕЛКИ К группе защитных белков принадлежат антитела — вещества белковой природы, вырабатываемые животным организмом в ответ на введение антигенов. Взаимодейст вуя с последними, они инактивируют их, защищая, таким образом ,организм от воздействия чужеродных соедине ний, вирусов, бактерий, клеток и тканей. Для обозначе ния белков, синтезирующихся в организме в ответ на ан тигенное воздействие, предложен термин — иммуногло булин. Согласно современной классификации, существует 5 видов иммуноглобулинов (1§О, 1§М, 1§А, 1§Е) и 1дЕ), структурные элементы молекул которых представлены легкими и тяжелыми 42 полипептидными цепями (см. рис. 27). Их молекулярные массы лежат в пределах 150 000— 1 000 000 дальтон. Тяжелые цепи различных им муноглобулинов обозначают строчными буквами грече ского алфавита соответственно прописным буквам латин ского алфавита, которые служат для указания вила им муноглобулина, т. е.для 1§О — 7 (гамма); 1§М — (л (мю), 1§А — а (альфа), 1§Б — б (дельта) и 1§Е — е (эпсилон). Тяжелые полипептидные цепи (Н-цепи, от англ. Ьеауу — тяжелый) у разных видов иммуноглобулинов отличают ся друг от друга. Наоборот, легкие полипептидные цепи (Ь-цепи, от англ. 1щп1 — легкий) у разных иммуноглобу линов одни и те же, либо типа % (каппа), либо типа А, (ламбда). В свою очередь, среди перечисленных 5 видов иммуноглобулинов отмечено существование подвидов, например 1§Оь 1&О, - в небольшой мере от личающихся друг от друга первичной структурой поли пептидных цепей. Молеку лы всех иммуноглобулинов-мономеров состоят всегда из двух легких и двух тяжелых цепей с очень близким по рядком расположения соединяющих их дисульфидных связей. Определенную роль в функционировании иммуногло булинов играют и углеводы, входящие в их состав в коли честве от 2 до 12%. ТОКСИЧЕСКИЕ БЕЛКИ Группа токсических белков в последние годы изуча ется весьма интенсивно ввиду ее большого практическо го значения. С точки зрения первичной структуры наиболее пол ная информация получена о токсических белках змей: она расшифрована у 36 токсинов, полученных из ядов лесной, африканской, азиатской, египетской, королев ской, мозамбикской, индийской и других видов кобры, африканской зеленой и черной древесной змей, морской змеи и др. Токсины ядов змей в подавля ющем большинстве являются нейротоксинами, так как, взаимодействуя с холинэргическими белками, блокируют передачу нервных импульсов. Их нейротоксическое действие зависит от третичной структуры. Из других токсических белков внимание привлекают токсины микроорганизмов. По крайней мере, один из них — энтеротоксин В. В от личие от токсинов змеиного яда энтеротоксин В пред ставлен белком из 239 аминокислотных остатков. К высокомолекулярным белкам относятся дифтерийный (М = 63 000), холерный (М = 85 000) и столбнячный (М = 150 000) токсины, а так же токсин ботулизма (М= 150000). ТРАНСПОРТНЫЕ БЕЛКИ Представителем транспортных белков является сыво роточный альбумин. Его основной функцией является перенос различных веществ, особенно жирных кислот. Кроме высших жирных кислот, • сродство к которым у сывороточного альбумина весьма высоко, он переносит разнообразные анионы и катионы. Сывороточный альбумин связывает до 50% кальция, на ходящегося в крови, служит переносчиком ионов меди из кишечника в печень, является носителем стероидных гормонов. Молекулярная масса сывороточного альбуми на человека равна 65 000. Из других белков сыворотки крови человека транс портными функциями обладают церулоплазмин, трансферрин. БЕЛКИ — ИНГИБИТОРЫ ФЕРМЕНТОВ Вещества белковой природы составляют самую мно гочисленную группу ингибиторов ферментов, причем наиболее изучены из ее состава белки, ингибирующие активность протеаз. Белковые ингибиторы образуют с протеолитичёскими ферментами стойкие при физиоло гических условиях комплексы, в составе которых фер мент полностью или частично теряет свою активность. Так как константы диссоциации этих комплексов лежат в пределах 10~9—10~12 моль, они действительно отли чаются высокой прочностью, а ингибиторы, входящие в их состав,— большой мощностью действия. Выделено и изучено несколько десятков белковых ингибиторов, подавляющих активность трипсина, химотрипсина, карбоксипептидазы, калликреина, эластазы, плазмина и других протеолитических ферментов. Мно гие из них получены в гомогенном кристаллическом со стоянии. Молекулярные массы ингибиторов белковой природы колеблются от нескольких тысяч до 43 нескольких сотен тысяч, но в основном они представлены белками с молекулярными массами около 6000 дальтон. Многие из белков — ингибиторов ферментов являются гликопротеидами. Первичная структура 18 ингибиторов расшиф рована; среди них — ингибиторы трипсина I и II из под желудочной железы свиньи и быка, соевых бобов, ара хиса и фасоли, ингибиторы протеина из яда гадюки, лимских бобов и ананаса, ингибитор химотрипсина из картофеля, ингибитор карбоксипептидазы из картофеля, инактиватор калликреина (тразилол) из легких быка, ингибитор субтилизина из стрептомицета и др. АМИНОКИСЛОТЫ — СТРУКТУРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ БЕЛКОВ Обычные аминокислоты, входящие в состав белков Как было написано выше, в состав белков входит около 20 аминокислот. Общим признаком, характерным для всех аминокислот, входящих в состав белков, (исключение составляет пролин), является наличие свободной карбоксильной группы и свободной незамещенной аминогруппы у углеродного атома. Пролин, у которого имеется замещенная аминогруппа, по существу представляет собой иминокислоту. Каждая амино кислота содержит, кроме того, характерную R-группу. Эти Rгруппы служат «буквами» в молекулярном алфавите белковой структуры. Были предложены разнообразные способы классификации аминокислот, основанные на различиях в природе их R-групп. Наиболее рациональный способ основан на различиях в полярности R-rpynn. R-группы подразделяют ся на четыре основных класса: 1) неполярные, или гидрофобные, 2) полярные, но незаряженные, 3) положительно заряженные и 4) отрицательно заряжен ные (при рН 6—7, т. е. при значениях рН, соответствующих условиям, сущест вующим внутри клетки). В пределах любого из указанных классов R-rpynn имеются значительные различия в размерах и форме этих групп, а также в степени их полярности. Аминокислоты обычно обозначают трехбуквенными символами. Аминокислоты с неполярными или гидрофобными R-группами К этому классу принадлежит пять амино кислот с алифатическими углеводородными Rгруппами (аланин, лейцин изолейцин, валин и пролин), две аминокислоты с ароматическими кольцами (фенилаланин и триптофан) и одна аминокислота, содержащая серу (метионин). Общим признаком всех этих аминокислот является их более низкая по сравнению с полярными аминокислотами растворимость в воде. В наименьше! степени гидрофобные свойства выражены у аланина. Аминокислоты с незаряженными полярными R-группами Эти аминокислоты более растворимы в воде, чем гидрофобные аминокислоты, так как их полярные R-группы могут образовать водородные связи с молекулами воды. Полярность серина, треонина и тирозина обуслов-лена их гидроксильными группами, полярность аспарагина и глутамина — их амидными группами, а полярность цистеина — его SH-группой. Глицин трудно отнести к какому-либо определенному классу аминокислот. Аспарагин и глутамин представляют собой амиды соответственно аспара-гиновой и глутаминовой кислот. При кислотном или щелочном гидролизе они легко переходят в эти последние соединения. Цистеин и тирозин содержат наиболее полярные группы, а именно тио-ловую группу и гидроксильную группу фенола соответственно. Хотя эти груп пы значительно легче отщепляют протоны, чем R-группы других аминокислот этого класса, они оказываются лишь слабо ионизованными при рН 7. Аминокислоты с отрицательно заряженными (кислыми) R-группами К этому классу относятся аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Каж дая из них имеет не по одной, а по две карбоксильные группы и несет при рН 7 суммарный отрицательный заряд. Аминокислоты с положительно заряженными (основными) R-группами К основным аминокислотам,R-группы которых несут при рН 7 суммарный положительный заряд, относятся лизин, содержащие вторую аминогруппу, и аргинин, содер жащий положительно 44 заряженную гуанидиновую группу. Гистидин, кото рый содержит слабоосновную имидазольную группу, занимает по своим свойствам промежуточное положение. При рН 6 положительно заряженными оказываются R-группы более чем у 50% молекул гистидина, но при рН 7,0 положительный заряд несет уже 10% молекул. Методы распределительного разделения Если какое-нибудь растворенное вещество распределено между равными объемами двух несмешивающихся жидкостей, то отношение его концентраций в этих двух фазах в состоянии равновесия при данной температуре называют коэффициентом распределения. Аминокислоты могут быть распределены, в частности, между двумя жидкими фазами в таких системах, как, например, фенол — вода или н-бутанол — вода; для каждой аминокислоты характерен определенный коэффициент распределения, соответствующий данной паре несмешивающихся растворителей. Смесь веществ с различными коэффициен тами распределения можно количественно разделить при помощи метода, известного под названием противоточного распределения. Принцип метода: вещество Z с низким коэффи циентом распределения «движется» по ряду распределительных пробирок быстрее, чем вещество Y, обладающее более высоким коэффициентом рас пределения. При этом наблюдается тенденция к концентрированию каждого из веществ в ряду пробирок в виде пика. Если противоточное распределение продолжить с использованием значительно большего числа пробирок, то можно добиться того, чтобы два пика полностью отделились друг от друга. Такое разделение производится в настоящее время при помощи автомати ческого оборудования. Распределительная хроматография — это основанный на описанном выше принципе распределения метод разделения сходных веществ. Разделе ние, достигаемое за счет огромного числа отдельных стадий распределения, проводится в колон ке высотой от 10 до 100 см, наполненной гранулами какого-либо гидратированного нерастворимого инертного вещества, например крахмала. Точно тот же принцип разделения лежит в основе бумажной хроматографии аминокислот. Хроматографическое разделение смеси аминокислот на бумаге можно проводить последовательно в двух направлениях на квадратном листе фильтровальной бумаги с использованием двух различных систем раствори телей. В результате получают двумерную карту («фингерпринт») расположе ния различных аминокислот. Получение аминокислотных и пептидных карт при помощи двумерной бумажной хроматографии или электрофореза на бумаге широко применяется при установлении аминокислот ной последовательности полипептидных цепей. Ионообменная хроматография Дальнейшим усовершенствованием принципа распределительного разде ления явился метод ионообменной хроматографии (на ионообменных колонках), при котором разделение аминокислот основывается на различиях в их кислотно-основных свойствах. СОСТАВ И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В БЕЛКАХ Структура пептидов Простые пептиды, содержащие два, три, четыре или большее число аминокислотных остатков (т. е. дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и т.д.). Названия пептидов образуют из названий входящих в их состав аминокислотных остатков (начиная с КН 2 -концевого остатка). Пептидная связь — единственная ковалентная связь, при помощи которой остатки аминокислот соединены друг с другом в остове полипептид ной цепи. Кислотно-основные свойства полипептида определяются конце выми NH2- и СООН-группами и теми R-группами, которые способны к иони зации. При частичном гидролизе полипептидных цепей — под действием ферментов или при кипячении с кислотой — образуются смеси более корот ких пептидов, которые можно разделить методами хроматографии или элект рофореза. При полном гидролизе белка все 45 составляющие его аминокислоты выделяются в свободном состоянии. Белки не обязательно содержат все аминокислоты, а те аминокислоты, которые входят в их состав, содержатся в них в неравных количествах. Помимо пептидной связи, существует еще не только один важный тип ковалентной связи между аминокислотами в белках,а именно дисулъфидный мостик, или поперечная связь между двумя остатка ми полуцистина в двух отдельных пептидных цепях (межцепочечная — S — S-связь) или в двух разных положениях одной и той же цепи (внутри-цепочечная — S — S-связь). Химические реакции пептидов Для свободных NH2-концевых аминогрупп пептидов характерны те же химические реакции, что и для аминогрупп свободных аминокислот, в частности реакция ацилирования, а также реакции с 2,4-динитрофторбен-золом или фенилизотиоцианатом. СООН-концевая карбоксильная группа пептидов (так же как соответствующая группа свободных амино кислот) может этерифицироваться или восстанавливаться. ГШ2-концевой аминокислотный остаток пепти дов также количественно реагирует с нингидрином с образованием окрашен ных производных; эта реакция широко используется для обнаружения и количественного определения пептидов при разделении их электрофоретическими или хроматографическими методами. Одной из широко применяемых цветных реакций, характерных для пептидов и белков, но не для свободных аминокислот, является биуретовая реакция. В результате обработки пептида или белка CuSO4 в щелочном растворе образуется фиолетовое комплексное соединение Gu2+ и пептида, количество которого можно определить при помощи спектрофотометра. Разделение и анализ пептидов Наиболее эффективными методами разделения и анализа сложных смесей пептидов, образующихся при частичном гидролизе белков, являются методы ионообменной хроматографии и электрофореза на бумаге, основанные на использовании различий в кислотно-основных свойствах пептидов. По сравнению с анализом аминокислот анализ пептидов представляет собой более сложную и трудоемкую задачу, потому что число различных пептидов, которые могут встретиться в гидролизатах, намного больше. Часто пептид ные смеси подвергают сначала предварительному, грубому разделению на кислые, основные и нейтральные пептиды с помощью электрофореза при рН 6,0. При этом значении рН кислые пептиды (т. е. пептиды, содержа щие избыточное количество остатков аспарагиновой или глутаминовой кислот) имеют суммарный отрицательный заряд и движутся к аноду, а основ ные пептиды (т. е. пептиды, содержащие избыточное количество остатков аргинина и лизина) имеют суммарный положительный заряд и движутся к катоду. Нейтральные пептиды (т. е. пептиды, либо совсем не содержащие кислых и основных остатков, либо содержащие равное число тех и других) практически не перемещаются в электрическом поле при этом значении рН. Каждый класс пептидов можно затем разделить на отдельные компоненты с помощью повторного электрофореза при подходящем значении рН или с помощью ионообменной хроматографии. ФЕРМЕНТЫ. КИНЕТИКА И ИНГИБИРОВАНИЕ Ферменты — самый крупный и наиболее высокоспециализированный класс белковых молекул. Они — тот рабочий аппарат, при помощи которого реализуется действие генов. Именно они катализируют тысячи химических реакций, из которых, в конечном счете, слагается клеточный обмен. История биохимии — это в значительной степени история изучения фер ментов. Открытие процессов ферментативного разложения пищи в желудке и посвященные этому вопросу исследования, проведенные в период с 176С по 1825 г., побудили к постановке первых важных экспериментов в областЕ химического катализа. Пастер хорошо понимал, что процессы брожения ката лизируются ферментами, однако он полагал (1860 г.), что эти ферменты неот делимы от структуры дрожжевых клеток и от всего того, что поддерживаег клетку в живом состоянии. Поэтому столь важным событием в истории изуче ния ферментов явилось открытие Э. Бухнера, которому в 46 1897 г. удалось показать, что экстрагированные из дрожжевых клеток ферменты способны катализировать спиртовое брожение. Тем самым было доказано, что эти важ ные ферменты, катализирующие основные метаболические процессы, связан ные с производством энергии, могут функционировать независимо от клеточ ной структуры. Прошло, однако, немало лет, прежде чем, наконец, удалось получить чистый фермент в кристаллическом виде. Впервые это сдела.1 Дж. Самнер, закристаллизовавший фермент уреазу, выделенный из семян Сапа-valia. Самнер представил доказательства того, что полученные им кристалла состоят из белка. К настоящему времени идентифицировано около тысячи различных фер ментов. Из них многие выделены в виде чистых гомогенных препаратов и свы ше 150 получено в кристаллическом виде. Сравнительно недавно были сделаны крайне важные открытия, давшие начало целой новой области энзимологических исследований и породившие новый взгляд на роль ферментов в биологии клетки. Эти открытия касаются генетического контро ля синтеза ферментов, способности к са морегуляции, характерной для многих ферментных систем, и, наконец, той роли, которую играют ферменты в процессах развития и дифференцировки. Классификация ферментов Названия многих ферментов образуют путем добавления суффикса -аза к названию субстрата, т. е. того соединения, на которое воздействует дан ный фермент. Уреаза катализирует гидролиз мочевины (urea) до аммиака н СО2, аргиназа катализирует гидролиз аргинина до орнитина и мочевины, фосфатаза катализирует гидролиз эфиров фосфорной кислоты и т. д. Однако такая номенклатура очень часто оказывается неоднозначной, в связи с чем широкое применение получили тривиальные (рабочие), не несущие химиче ской информации и несистематизируемые названия, такие, как пепсин, трип син, каталаза и т. п. Учитывая это обстоятельство, а также быстро растущее число вновь открытых ферментов, Международная комиссия по ферментам разработала новую классификацию и номенклатуру. По этой классификации ферменты подразделяются на шесть главных классов, каждый из которых в свою очередь делится на подклассы и подподклассы. Каждый фермент получает свой идентификационный номер (шифр) и си стематическое название, которое несет химическую информацию, т. е. указывает природу химической реакции, катализируемой данным ферментом. Кофакторы ферментов Подобно другим белкам, ферменты в зависимости от их химического со става часто делят на простые и сложные. Существует, однако, и другая, более содержательная классификация, имеющая непосредственное отношение к функции ферментов. Активность ряда ферментов зависит только от структу ры самого белка, тогда как для других требуется, кроме того, присутствие определенных групп небелковой природы — так называемых кофакторов. В роли кофакторов могут выступать или ионы металлов, или сложные орга нические соединения, называемые коферментами; иногда для каталитической активности необходимо наличие тех и других. Кофакторы, как правило, термо стабильны, тогда как большинство ферментов при нагревании инактивиру-ется. Связывание кофакторов с ферментами характеризуется разной степенью сродства. Чаще всего кофактор можно отделить от ферментного белка путем диализа или каким-либо другим способом, но существуют и кофакторы, кова-лентно связанные с белком. Природный комплекс фермента с кофактором на зывают холоферментом, а неактивный белок, остающийся после удаления кофактора — апоферментом. Некоторым ферментам кофакторами слу жат ионы металлов. У ферментов ион металла может служить мостиком, связывающим фермент с субстратом в результате образования координацион ного комплекса, или он может непосредственно выполнять каталитическую функцию. Обычно коферменты играют роль промежуточных пере носчиков электронов, а также некоторых атомов или функциональных групп, которые в результате ферментативной реакции переносятся с одного соедине ния на другое. Некоторые коферменты очень прочно связаны с ферментным белком; такой кофермент называют обычно простетической группой фермен та. Примером может служить гемогруппа цитохрома с, ковалентно связан ная с его пептидной цепью. 47 Однако во многих других случаях кофермент связан с ферментным белком сравнительно слабо и ведет себя в какой-то степени аналогично субстрату. Мно гие коферменты содержат в качестве активных компонентов вещества, при сутствующие в организме в следовых количествах, например рибофлавин, тиамин, пантотеновую кислоту или никотинамид; все эти вещества абсолютно необходимы для нормальной жизнедеятельности клеток. Для ряда организ мов они являются витаминами, т. е. организм должен получать их в готовом в ьиде. Химическая кинетика Прежде чем перейти к рассмотрению каталитических свойств ферментов, следует ознакомиться в общих чертах с терминологией и основными соотно шениями, используемыми при измерении скоростей и описании кинетики хими ческих реакций. Один из способов классификации химических реакций исхо дит из числа молекул, которые должны прореагировать для образования конечных продуктов. В рамках такой классификации различают мономолеку лярные, бимолекулярные и тримолекулярные реакции. Химические реакции можно также классифицировать на основе кине тических характеристик и, в частности, исходя из порядка реакции. Различают реакции нулевого, первого, второго или третьего порядка в зависимости оттого, как при данных условиях скорость реакции зависит от концентрации реа гирующих веществ. К реакциям первого порядка отно сятся реакции, скорость которых строго пропорциональна концентрации одного реагирующего вещества. К реакциям второго порядка относятся реакции, скорость которых про порциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ или второй степени концентрации одного из этих веществ. Реакции третьего порядка встречаются сравнительно редко. В этом слу чае скорость реакции пропорциональна произведению трех концентраций. Известны реакции, скорость которых вообще не зависит от концентрации реа гирующих веществ; их называют реакциями нулевого порядка. Во многих ка тализируемых реакциях порядок реакции оказывается нулевым по отношению к реагирующим веществам; скорость реакции зависит в этом случае от кон центрации катализатора или от какоголибо другого фактора, но не от кон центрации реагирующих веществ. Скорости реакций не обязательно должны в точности соответствовать первому или второму порядку; при определенных условиях часто наблюдаются реакции смешанного порядка. Катализ Химическая реакция, скажем реакция А+В-»- Р, протекает потому, что некоторая доля молекул А в любой данный момент обладает большей энер гией, чем остальная часть молекул, и этой энергии оказывается достаточно для перехода в активированное состояние, в котором появляется возможность разрыва или образования новой химической связи, ведущего к появлению продукта (продуктов) Р. Энергией активации называется количество энергии (выраженное в калориях), которое необходимо для перевода при данной тем пературе всех молекул одного моля вещества в активированное состояние. Во всякой химической реакции существует переходное состояние, кото рое характеризуется высокой свободной энергией и определяется как состоя ние взаимодействующих молекул, соответствующее вершине активационного барьера. Скорость реакции пропорциональна концентрации молекул в переходном состоянии. При повышении температуры энергия теплового движения моле кул увеличивается, в результате чего число молекул, способных достичь пере ходного состояния, возрастает; во многих реакциях при повышении темпе ратуры на 10° С скорость возрастает приблизительно в 2 раза. Катализаторы ускоряют химические реакции, понижая свободную энер гию активации. Связывание реагирующих веществ с катализатором приводит к появлению нового переходного состояния, характеризующегося меньшей свободной энергией активации по сравнению с переходным состоянием нека тализируемой реакции. Образование продуктов реакции сопро 48 вождается регенерацией свободного катализатора. Определение количества фермента по его активности Содержание фермента в данном растворе или в тканевом экстракте можнс определить, измеряя его каталитический эффект. Для этого необходимо знать: 1) общую стехиометрию катализируемой реакции; 2) возможную потребность в кофакторах — в ионах металлов или коферментах; 3) зависимость актив ности фермента от концентраций субстрата и кофактора, т. е. величины Кт как для субстрата, так и для кофактора; 4) значение рН, соответствующее максимальной активности фермента; 5) область температур, при которых фер мент устойчив и сохраняет высокую активность. Кроме того, необходимо иметь в своем распоряжении какую-нибудь достаточно простую аналитиче скую методику, позволяющую определять скорость исчезновения субстрата или скорость появления продуктов реакции. Всегда, когда это возможно, анализ на содержание фермента проводится в стандартных условиях, при которых поддерживается оптимальное значение рН и концентрация субстрата, превышающая концентрацию насыщения; в этом случае начальная скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и пропорциональна только концентрации фермента. Для ферментов, нуждающихся в кофакторах — ионах металлов или кофер ментах, концентрация этих кофакторов также должна превышать концентра цию насыщения, с тем, чтобы фактором, лимитирующим скорость реакции, была концентрация фермента. Скорость образования продукта (или продуктов) реакции можно измерять химическими или спектрофотометрическими мето дами. Второй способ более удобен, поскольку он позволяет непрерывно реги стрировать ход реакции на ленте самописца. По международному соглашению за единицу ферментативной активности принимается количество фермента, способное вызвать превращение одного микромоля субстрата в минуту при 25 °С в оптимальных условиях. Удельной активностью фермента называют число единиц ферментативной активности в расчете на 1 мг белка. Эту величину используют в качестве критерия чистоты ферментного препарата; она возрастает по мере очистки фермента и для иде ально чистого препарата достигает максимального значения. Под числом обо ротов понимают число молекул субстрата, подвергающихся превращению за единицу времени в расчете на одну молекулу фермента (или на один актив ный центр) в условиях, когда скорость реакции лимитируется концентрацией элемента. Ингибирование ферментов В ходе изучения ингибиторов была получена ценная информация отно стельно таких вопросов, как субстратная специфичность ферментов, природа функциональных групп, составляющих активный центр, механизм действия фермента и участие определенных функциональных групп в поддержании конформации молекулы фермента. Особое значение имеет тот факт, что ингибирование различных ферментов специфическими клеточными s: мпонентами служит одним из факторов, регулирующих ход ферментативных реакций в интактной клетке. Различают, прежде всего, обратимое и необратимое ингибирование. Н обратимое ингибирование обычно сопровождается разрушением или модификацией одной или нескольких функциональных групп фермента. Обратимое ингибирование может быть предметом количественного изучения с использованием уравнения Михаэлиса — Ментена. В свою очередь подразделяется на два типа: конкурентное и неконкурентное ингибирование. Конкурентные ингибиторы ферментов — это такие ингибиторы, дей ствие которых может быть ослаблено или устранено в результате увеличения концентрации субстрата; для них, как правило, характерно структурное сходство с субстратом, с которым они конкурируют за активный центр фермента. Ингибиторы этого класса обратимо связываются с ферментом. 49 Неконкурентное ингибирование не может быть снято добавлением субстрата; в основе его лежит обратимое взаимодействие ингибитора с какой-либо группой молекулы фермента, существенной для ферментативной активности, но не входящей в активный центр, например с — SH-группой. Необратимые ингибиторы обычно вызывают постоянное, т. е. необратимое изменение какой-нибудь важной функциональной группы фермента. В тех случаях, когда ингибитор связывается необратимо, теория Михаэлиса — Ментен неприменима. Необратимый ингибитор, взятый в концентрации, превышающей эквимолярную (по отношению к ферменту), может вначале не давать полного ингибирования, но со временем степень ингибирования будет нарастать, так как действию ингибитора будет подвергаться все большее число молекул фермента; осталные молекулы фермента, не успевшие прореагировать с ингибитором, будут, однако, сохранять при этом полную активность. Возможен и другой вариант, при котором необратимый ингибитор «портит» молекулу фермента, несколько модифицируя его химическую структуру. В этом случае модифицированный фермент сохраняет способность функционировать, но активность его оказы вается пониженной. Для выявления такого типа ингибирования нужны специальные методы. Фермент-субстратные комплексы Одной из важных стадий каталитического процесса является обратимое связывание фермента с субстратом, т. е. образование фермент-субстратного комплекса. Получить на этот счет прямые дока зательства очень трудно, поскольку такие комплексы крайне неустойчивы я быстро распадаются. Тем не менее некоторые прямые доказательства существования фермент-субстратных комплексов все же удалось получить. Они были получены, в частности, для случаев, когда на одной из стадий каталитического цикла фермент оказывается связанным с субстратом ковалентной связью. Примером может служить реакция гидролиза и нитрофенилацетата, катализируемая, хотя и очень слабо, химотрипсином. Наличие фермент-субстратных комплексов удается иногда установить с помощью спектроскопических методов, отличающихся высокой чувстви тельностью. Гемсодержащие ферменты — каталаза, пероксидаза и цитохромы — имеют характерные спектры поглощения в видимой области. Если каталаза или пероксидаза реагируют с перекисью водорода, то в их спектрах поглощения наблюдаются изменения, отражающие, по-видимому, образование фермент-субстратных комплексов. ЛИПИДЫ, ЛИПОПРОТЕИДЫ И МЕМБРАНЫ Липидами называют нерастворимые в воде органические вещества, которые содержатся в живых клетках и могут быть экстрагированы из них неполярными растворителями, такими, как хлороформ, эфир или бензол. Известно несколько главных классов и подклассов липидов; в каждом из них имеется ряд молекулярных форм, отличающихся друг от друга при родой остатков жирных кислот, входящих в состав липида. В организме липиды выполняют, по-видимому, четыре основные функции: 1) они являются ет^уетурашш компонентами мембран; 2) служат формой, в которой депо нируются запасы метаболического топлива; 3) служат формой, в которой транспортируется это топливо, и 4) выполняют защитную роль. Некоторые вещества, относимые к липидам, обладают высокой биологической активностью; эта группа включает ряд витаминов и их предшественников, а также некоторые гормоны. Жирные кислоты Свободные жирные кислоты содержатся в большинстве клеток и тканей лишь в следовых количествах. Эти соединения играют роль строи тельных блоков для липидов нескольких классов, таких, как нейтральные жиры, фосфоглицериды, гликолипиды, эфиры холестерина и некоторые воска. Из разных клеток и тканей было выделено свыше 70 различных жирных кислот. Молекулы их представляют собой длинные углеводородные цепи с концевой карбоксильной группой. Углеводородная цепь может быть насыщенной или же она может содержать одну или несколько двойных связей; тройные связи встречаются редко. Жирные кислоты различаются по длине 50 углеводородной цепи, а также по числу и положению ненасыщен ных связей. Жирные кислоты, входящие в состав липидов высших растений и животных, обладают рядом общих свойств. Почти все они содержат четное число атомов углерода, от 14 до 22; чаще всего встречаются жирные кислоты с 16 или 18 атомами углерода. Содержание ненасыщенных жирных кислот, как правило, выше, чем насыщенных. Ненасыщенные жирные кислоты имеют более низкую температуру плавления. Большинство нейтральных жиров, богатых ненасыщенными жирными кислотами, остается в жидком состоянии до 5 °С и ниже. В липидах высших организмов двойная связь ненасыщенных жирных кислот находится в большинстве случаев между 9-м и 10-м углеродом; дополнительные двойные связи обычно встречаются на участке между С-10 и мегильным концом цепи. В жирных кислотах,содержащих две или большее число двойных связей, эти двойные связи никогда не находятся в сопряжении между ними всегда имеется хотя бы одна метиле-новая группа (—СН=СН—СН2—СН = = СН—). Жирные кислоты с длинной цепью (содержащие 16 или 18 атомов угле рода) практически нерастворимы в воде, но их натриевые или калиевые соли, называемые мылами, образуют в воде мицеллы, стабилизируемые за счет гидрофобных взаимодействий. Ненасыщенные жирные кислоты участвуют в реакциях присоединения по двойным связям. К ним легко присоединяются, в частности, иод или хлор. Поэтому, используя метод количественного титрования галогенами, можно оценить относительное содержание двойных связей в данном образце жирной кислоты или липида. Нейтральные жиры (ацилглицерины) Глицериновые эфиры жирных кислот называются ацилглицеринами, нейтральными жирами или глицеридами. Они составляют главный компо нент жиров, запасаемых в растительных и животных клетках, особенно в жировых клетках позвоночных. Если жирными кислотами этерифицированы все три гидроксильные группы глицерина, то такое соединение называется триацилглицерином. Существует много различных типов триацилглицеринов, различающихся природой и расположением трех остатков жирных кислот, связанных с гли церином сложноэфирной связью. Если во всех трех положениях стоят остатки одной и той же жирной кислоты, то мы имеем так называемые простые триа цилглицерины, названия которых определяются названием соответствующей жирной кислоты. Триацилглицерины, содержащие остатки двух или трех разных жирных кислот, называются смешанными триацилглицеринами. Свойства ацилглицеринов Температура плавления нейтральных жиров определяется их жирно-кислотными компонентами. Как правило, она повышается с увеличением числа и длины насыщенных жирнокислотных компонентов. Все триацилглицерины сравнительно плохо растворимы в воде и сами по себе не обнаруживают тенденции к образованию высокодисперсных мицелл. Ацилглицерины растворимы в эфире, хлороформе и бензоле, а также в горячем спирте. Все ацилглицерины легче воды. Для разделения и идентификации ацилглицеринов применяется метод тонкослойной хроматографии, широко используемый для разде ления и анализа самых различных классов соединений. Фосфоглицериды Липиды этого класса, называемые также глицерофосфатами, содержатся практически только в клеточных мем бранах; лишь очень небольшие коли чества фосфоглицеридов обнаружива ются в составе жировых отложений. В фосфоглицеридах одна из первич ных гидроксильных групп глицерина этерифицирована не жирной, а фосфор ной кислотой. Таким образом, исходным для построения всей серии соединений является не глицерин, а глицерофосфорная кислота. Молекулы всех фосфоглицеридов содержат полярную голову и два непо лярных углеводородных хвоста; поэтому их называют амфипатическими или полярными липидами. Легко видеть, что фосфоглицериды отличаются друг от друга главным образом по размерам, форме, полярности и заряду Х-групп полярной головы молекулы. Каждый тип фосфоглицеридов может быть представлен большим числом разных соединений, различающихся природой остатков двух 51 жирных кислот. Обычно они содержат один остаток насыщенной и один остаток ненасыщен ной жирной кислоты, причем последняя стоит в положении 2 глицерина. Простейшим типом фосфоглицерида является фосфатидная кислота, не имеющая Х-группы, которая могла бы связываться с фосфорной кислотой сложноэфирной связью. В клетках фосфатидная кислота содер жится лишь в очень малых количествах, однако она является важным про межуточным продуктом в синтезе других фосфоглицеридов. Воска По своей структуре и свойствам к ацилглицеринам близки воска — эфиры высших жирных кислот и монооксиспиртов с длинной цепью. Воска образуют защитную смазку на коже, шерсти и перьях, покрывают листья и плоды высших растений, а также кути кулу наружного скелета у многих насекомых. Ланолин (жир овечьей шерсти) представляет собой смесь жирнокислотных эфиров двух стеринов — лано-стерина и агностерина (см. ниже). Главными компонентами пчелиного воска являются эфиры пальмитиновой кислоты и жирных спиртов с длинной цепью. Воска, образующие налет на листьях растений, представляют собой эфиры жирных кислот и спиртов, содержащих от 26 до 34 атомов углерода. Омыляемые и неомыляемые липиды Рассмотренные выше липиды часто называют омыляемыми, поскольку при их нагревании образуются мыла (в результате отщепления жирных кис лот). В клетках содержатся также, хотя и в меньшем количестве, липиды другого класса, которые называют неомыляемыми, потому что они не гидро-лизуются с освобождением жирных кислот. Известны два основных типа неомыляемых липидов: стероиды и терпены. Эти химические соединения относятся к двум разным классам, однако у них имеется ряд очень сходных черт, которые обусловлены тем, что все они построены из одних и тех же пяти-углеродных строительных блоков. Стероиды Стероиды являются производными пергидроциклопентанфенантренового ядра, содержащего три конденсированных циклогексановых кольца. Наиболее распростра ненный стерин животных тканей — хо лестерин — содержится в организме, как в свободной, так и в этерифицированной форме. Кристалличе ский холестерин представляет собой белое, оптически активное вещество, плавящееся при 150 СС. Он нераство рим в воде, но легко экстрагируется из клеток хлороформом, эфиром, бен золом или горячим спиртом. Холестерином богаты плазматические мембраны многих животных клеток. Важ ным промежуточным продуктом в биосинтезе холестерина является ланостерин, входящий в состав ланолина (жира овечьей шерсти). В растениях холестерин не обнаружен. У растений имеются другие сте-рины, известные под общим названием фитостеринов. Терпены К числу липидных компонентов, встречающихся в клетках в сравни тельно небольшом количестве, принадлежат терпены, молекулы которых построены путем объединения нескольких молекул пятиуглеродного угле водорода изопрена (2-метил-1,3-бутадиена). Терпены, содержащие две изопреновые группировки, называются монотерпенами, а содержащие три такие группировки — сесквитерпенами; терпены, содержащие 4, 6 и 8 изопреновых группировок, называются соответственно дитерпенами, три-терпенами и mempamepпенами. Молекулы терпенов могут иметь линейное или циклическое строение; встречаются также терпены, в молекулах которых имеются как линейные, так и циклические компоненты. В растениях обнаружено очень большое число моно- и сесквитерпенов.Так, монотерпены гераниол, лимонен, ментол, пинен, камфора и карвон служатглавными компонентами соответственно гераниевого, лимонного, мятного,скипидарного, камфарного и тминного масел. Примером сесквитерпеновможет служить фарнезол. К дитерпенам относится фитол, являющийся компонентом 52 фотосинтетического пигмента хлорофилла, а также витамин А. К числу тритерпенов относятся сквален и ланостерин, играющие роль важных предшественников при био синтезе холестерина. Из других высших терпенов следует назвать кароти- ноиды, принадлежащие к группе тетратерпенов. Липопротеиды Полярные липиды ассоциируют с некоторыми специфичными белками, образуя липопротеиды из которых наиболее известны транспортные липо протеиды, присутствующие в плазме крови млекопитающих. В таких слож ных белках взаимодействия между липидом (липидами) и белковыми компо нентами осуществляются без участия шуналлунтных. связей. Липопротеиды содержат обычно как полярные, так и нейтральные липиды, а также холе стерин и его эфиры. Они служат той формой, в которой липиды транспорти руются из тонкого кишечника в печень и из печени в жировую ткань, а так же в различные другие ткани. В плазме крови было обнаружено несколько классов липопротеидов; классификация этих липопротеидов основана на раз личиях в их плотности. САХАРА Углеводами или сахаридами называют полиоксиальдегиды и полиокси-кетоны с общей формулой (СН2О) П., а также производные этих соединений. Моносахариды, или простые сахара, состоят из одной полиоксиадьдегидной или полиоксикетонной единицы. Наиболее распространенным моносахаридом является шестиуглеродный сахар D-глюкоза; это исходный моносахарид,от которого происходят все другие сахариды. Молекулы D-глюкозы служат главным видом клеточного топлива у большинства организмов и выступают в роли строительных блоков, или предшественников, наиболее распростра ненных полисахаридов. Олигосахариды содержат от 2 до 10 моносахаридных единиц, соединен ных гликозидной связью. Молекулы полисахаридов представляют собой: очень длинные цепи, построенные из многих моносахаридных единиц; цепи могут быть как линейными, так и разветвленными. Большинство полисахари- дов содержит повторяющиеся моносахаридные единицы одного и того же вида или двух чередующихся видов; поэтому они не могут выполнять роль-информационных макромолекул. В биосфере, по всей вероятности, больше углеводов, чем всех других органических соединений, вместе взятых. Объясняется это главным образом повсеместным распространением в больших количествах двух полимеров D-глюкозы, а именно целлюлозы и крахмала. Целлюлоза — главный внекле точный структурный компонент волокнистых и одревесневших раститель ных тканей. Крахмал тоже содержится в растениях в чрезвычайно больших количествах; он служит той главной формой, в которой запасается клеточное топливо. Важные производные моносахаридов и гликозидов Альдогексозы легко реагируют со спиртами в присутствии неорганиче ских кислот, образуя аномерные а- и ф-гликозиды. Гликозиды представляют собой асимметричные смешанные ацетали, образующиеся в результате взаи модействия между альдегидным атомом углерода внутримолекулярной полу-ацетальной (пиранозной) формы альдогексоз и второй спиртовой гидроксиль-ной группой молекулы спирта. Гликозидная связь образуется так же в результате реакции моносахарида с гидроксильными группами других моносахаридов. Продуктом такой реак ции является дисахарид. Полисахари ды представляют собой цепи моносаха ридов, соединенных такими гликозидными связями. Гликозидная связь устойчива к действию оснований, но гидролизуется при кипячении с кисло той с образованием свободного моно сахарида и свободного спирта. Кроме того, гликозиды гидролизуются ферментами, специфичность которых опреде ляется природой моносахаридных еди ниц и природой спирта. Чтобы выяснить, в какой форме на ходится гликозид — фуранозной или пиранозной — проводят его окислитель ную деградацию в кислом растворе в присутствии солей йодной кислоты (периодатов). Периодатное окисление — ценный метод исследования структуры олигосахаридов. 53 Сахарные кислоты Существует три важных класса са харных кислот: альдоновые, альдаро-вые и уроновые. В присутствии слабых окислителей (например, гипоиодита на трия) или под действием специфич ных ферментов альдозы окисляются по альдегидному атому углерода, об разуя соответствующие карбоновые кислоты, которые носят общее назва ние алъдоновых кислот. При использовании более силь ных окислителей, таких, как азотная кислота, окисляются как альдегидный углерод, так и углерод, несущий пер вичную гидроксильную группу; обе группировки преобразуются в карбо ксильные группы, в результатеполучаются алъдаровые кислоты. В отличие от них весьма важен в биологическом отношении третий класс сахарных кислот, а именно уроновые ки слоты. В уроновых кислотах окислен с образованием карбоксильной группы только тот углеродный атом альдозы, который несет первичную гидроксиль-ную группу. Уроновые кислоты являются компонентами многих поли сахаридов. Одна из наиболее важных сахар ных кислот — это аскорбиновая кислота (витамин С). Аминосахара Широко распространены в природе два аминосахара — D-глюкозамин и D-галактозамин, в которых гидроксильная группа при 2-м углеродном атоме замещена на аминогруппу. D-глюкозамин входит в состав многих полисахаридов, содержащихся в тканях позвоночных, и является главным компонентом хитина — структурного полисахарида, образующего наружный скелет насекомых и ракообразных. D-галактозамин является компонентом гликолипидов и входит в состав главного полисахарида хря щей — хондроитинсульфата. Дисахариды Среди дисахаридов особенно широко известны мальтоза, лактоза и саха роза. Мальтоза, образующаяся в качестве промежуточного продукта при действии амилаз на крахмал, содержит два остатка D-глюкозы. Она представ ляет собой смешанный ацеталь аномерного углеродного атома Dглюкозы;при образовании его одну гидроксильную группу поставляет 5-й углеродный атом, а другую 4-й углерод соседнего остатка D-глюкозы (фиг. XI-25). Обе глюкозные половины находятся в пиранозной форме, а конфигурация гли-козидной связи, в образовании которой участвует аномерный атом углерода, относится к а-типу. Мальтозу можно поэтому назвать 4-О-а-Б-глюкопира-нозил-Р-Оглюкопиранозой. У второго остатка глюкозы имеется свободный аномерный атом углерода, который мо жет находиться как в а-, так и в Р-форме (преобладает, однако, ji-форма). Гликозидную связь между остатками г люк озы принято изображ ать как а (1 —»-4)-связь. Целлобиоза— повторяющаяся струк турная единица целлюлозы — имеет гли козидную связь Р (1 -> 4)-типа; следо вательно, полное ее название будет 4-O-P-D- глюкопиранозил-О-а-глюкопи-раноза. Дисахарид лактоза содержится только в молоке; больше она в при роде нигде не обнаружена. Гидролиз лактозы дает D-галактозу и D-глюкозу. Поскольку в молекуле лактозы имеется свободный аномерный атом углерода (в остатке глюкозы), она принадлежит к числу редуцирующих дисахаридов Сахароза, или тростниковый са хар, представляет собой дисахарид, состоящий из остатков глюкозы и фрук тозы. Этот дисахарид чрезвычайно широко распространен в растительном мире. В отличие от боль шинства дисахаридов и олигосахари-дов сахароза не имеет свободного ано-мерного атома углерода; два ее аномер-ных углерода связаны между собой. Таким образом, сахароза не являет ся ни полуацеталем, ни полукеталем. Она не подвергается мутаротации, не дает с фенилгидразином озазонов и не принадлежит к числу редуцирующих Сахаров. Гидролизуется она намного легче других дисахаридов. Трегалоза, состоящая из двух остатков D-глюкозы, может служить дру гим примером нередуцирующего дисахарида, в котором два аномерных ато ма углерода связаны друг с другом. Этот дисахарид — главный сахар гемо лимфы многих насекомых. Трисахариды 54 Ряд трисахаридов встречается в природе в свободной форме. Рафиноза (фруктоза, глюкоза, галактоза) содержится в больших количествах в сахар ной свекле и во многих других высших растениях. Мелецитоза (глюкоза, фруктоза, глюкоза) обнаружена в соке некоторых хвойных деревьев. Полисахариды (гликаны) Большинство углеводов, встречающихся в природе, существует в форме-высокомолекулярных полисахаридов. Их полный гидролиз в присутствии кислот или специфичных ферментов дает моносахариды и (или) их простые тгрстизнодные. Чгре|5о"яа"да1сщё1а -моиасаха^яжднхйд "едании^ы пглтассахагртгдаь является D-глюкоза, но встречаются также полисахариды D-маннозы, Dфруктозы, D- и L-галактозы, D-ксилозы и D-арабинозы. Среди производных моносахаридов, присутствующих в составе продуктов гидролиза природных полисахаридов, чаще других встречаются D-глюкозамин, D-галактозамин, D-глюкуроновая кислота, N-ацетилмурамовая кислота и N-ацетилнейрами-новая кислота. Полисахариды (называемые также гликанами) отличаются друг от друга природой повторяющихся моносахаридных единиц, длиной цепи и степенью ее ветвления. Различают гомополисахариды, состоящие из моносахаридных единиц только одного типа, и гетерополисахариды, содержащие моносахарид-ные единицы двух или нескольких типов цепей. Главными резервными полисахари дами растений и животных являются соответственно крахмал и гликоген, которые откладываются в цитоплазме ридов. Крахмал Крахмал существует в двух фор мах, а именно в форме амилозы и в форме амилопектина. Амилоза состоит из длинных неразветвленных цепей, в которых все U-глюкозные единицы соединены а (1 - 4)-связями. В воде амилоза не дает истинного раствора, но- . образует гидратированные мицеллы которые при добавлении иода окрашиваются в синий цвет. В таких мицеллах полисахаридные цепи амилозы скру чены в спираль. Цепи амилопектина сильно разветвлены. Молекулы амилопектина имеет глико-зидные связи а (1 - 4)-типа, но связи в точках ветвления относятся к а (1 - 6)-типу. Амилопектин также образует коллоидные или мицеллярные растворы, однако при добавлении иода эти растворы окрашиваются не в си ний, а в краснофиолетовый цвет. Молекулярный вес амилопектина может достигать. 1 млн. Основные компоненты крахмала гидролизуются ферментативным путем двумя разными способами. Амилоза может быть гидролизована ферментом, известным под названием амилазы. Этот фермент, присутствующий в соке подже лудочной железы и в составе слюны. Полисахариды с промежуточной длиной цепи, образующиеся в результате действия амилаз, называются декстрина ми. Амилопектин также гидролизуется а-и в-амилазами, однако, поскольку ни та, ни другая амилаза не способна расщеплять а (1 - 6)-связи (в точках ветвления амилопектина), конечным продуктом при действии амилаз на ами лопектин оказывается крупная, сильно разветвленная «сердцевина» полиса харида, называемая остаточным декстрином. а-(1-6)-связи, находящиеся в точках ветвления, гидролизуются особыми ферментами — а (1 - 6)-глюкозидазами. Таким образом, при совместном действии а-ами-лазы и а (1 —у 6)-глюкозидазы амилопектин может быть полностью расщеп лен на глюкозу и мальтозу. Гликоген Этот резервный полисахарид содержится в животных тканях; особенно много его в печени и мышцах. Так же как и амилопектин, гликоген представ ляет собой полисахарид, в котором Dглюкозные единицы соединены а (1 - 4)-связями. Однако от амилопектина он отличается значительно более высокой степенью ветвления; точки ветвления располагаются у него в среднем через каждые 8—10 остатков D-глюкозы. Связи в точках ветвления принадлежат к а (1 - 6)-типу. Глико ген легко гидролизуется а- и р-амилазами, которые отщепляют от него соот ветственно глюкозу и мальтозу; в этом случае тоже образуется остаточный декстрин. Целлюлоза 55 В состав целлюлозы (клетчатки) входит более 50% всего органического углерода биосферы. Целлюлоза — простейший и наиболее широко распро страненный структурный полисахарид растительного мира. При полном гидролизе целлюлозы (который может быть осуществлен при помощи концентрированных кислот) образуется только D-глюкоза, однако при частичном гидролизе образуется редуцирующий дисахарид целлобиоза. НУКЛЕОТИДЫ И ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ Компоненты мононуклеотидов Мононуклеотиды построены из трех главных компонентов: 1) азотистого' основания, 2) сахара пентозы и 3) фосфорной кислоты. При полном гидроли зе мононуклеотидов эти компоненты высвобождаются в эквимолярных коли чествах. Пиримидиновые и пуриновые основання В нуклеотидах обнаружены два класса азотистых оснований, являю щихся производными двух ароматических гетероциклических соединений — пиримидина и пурина. Сам пурин тоже является производным пиримидина: его молекула состоит из конденсированных колец пиримидина и имидазола. В составе нуклеотидов встречается три главных пиримидиновых основа ния, а именно: урацил, тимин и цитозин, обозначаемые соответственно У, Т и Ц. Кроме того, известно некоторое число так называе мых минорных пиримидинов, встречающихся реже, например 5метилцито-зин и 5-оксиметилцитозин. Два главных пуриновых основания, найденные в нуклеотидах,— это аденин и гуанин, обозначаемые соответствен но А и Г. В нуклеотидах найдены также и некоторые минорные пурины, в частности 2-метиладенин и 1-метилгуанин. Свободные пуриновые и пиримидиновые основания легко разделить и идентифицировать методами хроматографии на бумаге или в тонком слое. Нуклеозиды Если подвергнуть нуклеотиды частичному гидролизу, так, чтобы от них отщеплялась только фосфатная группа, то при этом образуются нуклеозиды. Нуклеозиды — это N-гликозиды пиримидиновых или пуриновых оснований, в которых 1-й углеродный атом пентозы связан гликозидной связью с N-1 пиримидина или N-9 пурина. Нуклеозиды значительно лучше растворимы в воде, чем исходные азо тистые основания. Их легко можно разделить и идентифицировать методами хроматографии на бумаге или в тонком слое. Подобно всем гликозидам, нуклеозиды относительно устойчивы к щелочам, но легко гидролизуются при нагревании в кислоте. При гидролизе нуклеозидов образуются свобод ные основания и свободные пентозы. Пиримидиновые нуклеозиды значитель но более устойчивы к гидролизу, чем пуриновые. Оба типа нуклеозидов гид ролизуются специфичными нуклеозидазами. Нуклеотиды Нуклеотиды представляют собой фосфорнокислые эфиры нуклеозидов, в которых фосфорная кислота связана сложноэфирной связью с одной из сво бодных гидроксильных групп пентозы. Свободные нуклеотиды содержатся в значительных количествах во всех клетках. Они образуются либо путем синтеза, либо в результате частичного гидролиза нуклеиновых кислот — в частности, под действием группы ферментов с общим названием нуклеазы. В зависимости от того, содержат ли нуклеотиды 2-дезокси-Б-рибозу или же D-рибозу, они называются соответственно дезоксирибонуклеотидами или рибонуклеотидами. Полинуклеотиды Мононуклеотиды — это повторяющиеся мономерные единицы олиго-муклеотидов и полинуклеотидов. Олигонуклеотиды построены из нескольких мономеров, полинуклеотиды — из многих. Полинуклеотиды, состоящие из ковалентно связанных между собой дезоксирибонуклеотидов, называются дезоксирибонуклеиновыми кислотами (ДНК); полинуклеотиды, состоящие из рибонуклеотидов, называются соответственно рибонуклеиновыми кисло тами (РНК). ДНК и РНК имеют много общих химических и физических свойств, так как и те, и другие представляют собой цепи из мононуклеотидных единиц, ковалентно связан ных между собой с помощью фосфодиэфирных мостиков, соединяющих З'-положение одного мононуклеотида с 5'-положением его соседа. Нуклеи новые кислоты плохо растворимы в водных растворах кислот. 56 Однако их можно экстрагировать из клеток растворами нейтральных солей или фено лом ДНК СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ За последнее десятилетие достигнут огромный про гресс как в методах выделения и фракционирования ДНК, так и в познании особенностей их структуры. Суммарный препарат ДНК получают одним из ру тинных методов — солевым или фенольным фракционированием (учебник, с. 96). Дальнейшее разделение ДНК на фракции ведут более тонкими методами, из которых достаточно эффективны хроматография на геле фосфата кальция или ЭКТЭОЛА-целлюлозе, ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-электрофорез и т.д. В последнее время получило распространение термическое фракционирование ДНК, которое используется для сопоставления ДНК различных биологических видов в таксономических целях. Все молекулы ДНК из клеток всех типов построены из четырех основ ных мононуклеотидных единиц, а именно дАМФ, дГМФ, дТМФ и дЦМФ, связанных в различные последовательности ?>\ 5'фосфодиэфирными мостами. Препараты ДНК, выделенные из разных организмов, различаются как по соотношениям, так и по последовательности этих четырех мононуклео-тидных единиц. Они различаются также по молекулярному весу. Помимо обычных оснований — аденина, гуанина, тимина и цитозина, обнаруживае мых во всех препаратах ДНК, эти препараты содержат также небольшие количества метилированных производных этих оснований. Содержание последних особенно значительно в ДНК некоторых вирусов. Молекулы ДНК имеют определенный молекулярный вес ВИДЫ ДНК И ИХ ЛОКАЛИЗАЦИЯ В КЛЕТКЕ Содержание ДНК в клетках организма определенного вида отличается необыкновенным постоянством. Количество ДНК в клетке измеряется пикограммами (10~12 г) и колеблется от 0,01 г у кишеч ной палочки до нескольких пикограммов в гаплоидных клетках высших организмов. В зависимости от места локализации ДНК в клетке различают ядерную, митохондриальную, хлоропластическую, центриольную и эписомальную ДНК. Ядерн а я Д Н К у э ук а р и о т о в р е з к о п р е в а л и р уе т н а д ДНК других субклеточных структур, так, в митохондриях обнаружено от 0,5-Ю-16 до 5-10~16 г ДНК, в хлоропластах — от К)-16 до 150-10~16 г, а в центриолях — 2-10~16 г, что составляет несколько процентов от ядер ной ДНК. В таком же соотношении находится содержание ДНК в бактериальной хромосоме и эписомах. Кроме внутриклеточной ДНК существует также ДНК, входящая в состав вирусов и фагов. Количество ее в вирусах и фаговых частицах значительно ниже, чем в клетках бактерий (тысячные доли пикограмма и менее). ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ДНК В числе постоянно присутствующих в составе ДНК элементов (С, Н, N. О, Р) в последние годы обнаружили кремний. Его содержание в препаратах ДНК составляет от 0,26 до 0,31 %. Кроме того, появились указания на постоянное при сутствие в составе ДНК ряда микроэлементов (Ыа, Са, Ва, А1, Сг, Ре, Со, Си, РЬ и др.), играющих, как полагают, существенную роль в стабили зации и дестабилизации ее структуры. В составе отдельных фаговых ДНК присутствует глюкоза, связанная гликозидной связью по оксиметильному радикалу. Классические химические методы анализа нуклеотидного состава ДНК путем определения азотистых основа ний после ее гидролитического расщепления практически полностью заменены физическими методами — опреде лением содержания ГЦ-пар по температуре плавления ДНК и по величине ее плавучей плотности. В первом случае содержание ГЦ-пар связано с температурой плавления ДНК следующей зависимостью: 57 ГЦ (мол. % )*= (Гпл — 69,3) -2,44 Во втором случае содержание ГЦ-пар прямо пропорцио нально значению плавучей плотности ДНК, определяе мой при ее ультрацентрифугировании в градиенте плот ности хлорида цезия. В при роде распространены два типа ДНК: У хордовых и бес< позвоночных животных, высших растений, дрожжевидных организмов, сине-зеленых водорослей, ряда бакте рий и вирусов преимущественно АТ-тип ДНК, а у недрожжевидных грибов, актиномицетов, водорослей и ряда бактерий и вирусов в основном ГЦ-тип ДНК. Это заложило основы для дальнейшей разработки проблем химической таксо номии. МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА ДНК Молекулярную массу ДНК определяют в основном гидродинамическим и электронномикроскопическим ме тодами, хотя это можно делать, измеряя светорассеяние растворов ДНК и некоторыми другими способами. В основе гидродинамического метода лежит линейная зависимость константы седиментации ДНК, определяе мой при ультрацентрифугировании растворов ДНК, от величины ее молекулярной массы, которую можно уста новить по калибровочной кривой или рассчитать по фор муле; 0,4451бЛ1 = 1,819 + 1§ (з°20 т -- 2,7) Электронно-микроскопический метод определения молекулярной массы ДНК основан на измерении длины вытянутых молекул ДНК. Выделить нативную ДНК из клеток эукариотов необыкновенно трудно, так как еще не создано соответству ющих методов, позволяющих избежать разрыва выделяемых молекул ДНК. Поэтому надежные цифры получе ны только для ДНК вирусов и фагов, откуда проще извлечь ДНК, осторожно сняв белковую оболочку. РНК Существует три главных типа рибонуклеиновых кислот г информационная, или матричная РНК (мРНК), рибосомная РНК (рРНК) и транспортная РНК (тРНК). Все эти три типа РНК характеризуются опре деленным молекулярным весом и определенным нуклеотидным составом (табл. ХП-1). Молекулы у всех трех типов РНК одноцепочечные. Каждый из типов РНК включает несколько молекулярных видов. Информационная, или матричная РНК Матричная РНК содержит только четыре основания — А, Г, Ц и У. Она синтезируется в ядре в процессе транскрипции, в ходе которого нуклео-тидная последовательность одной из цепей хромосомной ДНК ферментатив ным путем «переписывается» (транскрибируется) с образованием одиночной цепи мРНК. Основания образующейся цепи мРНК комплементарны осно ваниям соответствующей цепи ДНК. После завершения транскрипции мРНК переходит на рибосомы, где она используется в качестве матрицы, определяю щей последовательность аминокислот в растущей полипептидной цепи. Транспортная РНК Для транспортных тРНК харак терно наличие, наряду с обычными основаниями А, Г, Ц и У, довольно значи тельного количества необычных, или минорных оснований. Содержание их доходит до 10% общего содержания оснований. Минорные основания пред ставляют собой главным образом метилированные формы обычных оснований или их производные. Кроме того, молекулы тРНК содержат другие необыч ные мононуклеотиды, такие, как псевдоуридиловая или риботимидиловая кислоты. Для транспортных тРНК харак терно наличие, наряду с обычными основаниями А, Г, Ц и У, довольно значи тельного количества необычных, или минорных оснований. Содержание их доходит до 10% общего содержания оснований. Минорные основания пред ставляют собой главным образом метилированные формы обычных оснований или их производные. Кроме того, молекулы тРНК содержат другие необыч ные мононуклеотиды, такие, как псевдоуридиловая или риботимидиловая кислоты. 58 тРНК переносит остатки аминокислот на рыбосомы. Рыбосомная РНК На долю рибосомной РНК приходится до 65 % массы рибосом Хотя рРНК составляет значительную часть всей клеточной РНК, ее функция в рибосомах еще не вполне выяснена. Она содержит четыре главных основания А, Г, Ц и У; некоторые из оснований в ней метилированы. НАЗВА ДОКУМЕНТУ Змн. Арк. № докум. Підпис Дата Арк. 58
