Модуляция росиглитазоном экспрессии COX-2 в глиальных клетках, как новый тип противовоспалительных лекарств
advertisement
Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова Модуляция росиглитазоном экспрессии COX-2 в глиальных клетках, как новый тип противовоспалительных лекарств Курсовая работа Выполнил: Александр-Павел Эрмидис ученик 10 класса СУНЦ МГУ руководитель: Марина Глебовна Сергеева факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ Москва 2014 Содержание Принятые сокращения Введение Глава 1. Обзор литературы по теме исследования 1.1 Воспалительный процесс 1.2 Роль врожденного иммунитета в воспалительном процессе 1.3 Воспалительный процесс при аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваниях 1.4 Нестероидные противовоспалительные препараты 1.5 Циклооксигеназа — основной белок воспалительного ответа 1.6 Простагландины — основные противовоспалительные молекулы 1.7 TLR и PPARs как участники активации и развития воспалительного процесса 1.7.1. TLR — мембранные рецепторы патогенных молекул 1.7.2. PPARs – ядерные белки и факторы транскрипции 1.8 Росиглитазон как возможный представитель нового типа противовоспалительных лекарств. 1.9 Глиальные клетки Глава 2. Экспериментальная часть 2.1 Материалы и методы 2.1.1. Культивирование клеток глиомы линии С-6 2.1.2. Спектрофотометрия 2.1.3. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией 2.1.4. Агарозный электрофорез и анализ кривых плавления 2.2 Результаты исследования Выводы Литература Принятые сокращения НПВП — нестероидные противовоспалительные препараты PG — простагландины ( E, G, H и т.д. ) COX - циклооксигеназа TLR – толл-подобные рецепторы PPAR - рецепторы, активируемые пероксисомными пролифераторами NF-kB – ядерный фактор «каппа-би» RG - росиглитазон LPS — липополисахарид ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота РНК — рибонуклеиновая кислота NTP – нуклеозидтрифосфаты мРНК — матричная РНК TBE – трис-боратный буфер кДНК — клональная ДНК ПЦР — полимеразная цепная реакция T – тимин Actin – ген актина ЭПР — эндоплазматический ретикулум Введение На сегодняшний день большое количество людей сталкиваются с проблемами, связанными с нарушениями воспалительного ответа (изменениями в ответах врожденного иммунитета). Эти нарушения могут приводить к большому количеству различных заболеваний, среди которых: атеросклероз, диабет второго типа, нейродегенеративные (например, болезнь Альцгеймера), аутоиммунные болезни и даже некоторые виды рака (глиома). Поэтому поиск новых способов борьбы с этими заболеваниями ведется по всему миру. В 1897 году Феликс Хоффман впервые открыл лечебные свойства ацетилсалициловой кислоты (жаропонижающий эффект) и внес ее в список разрешенных медицинских препаратов под названием «Аспирин». С этого и началась эпоха нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП). На сегодняшний день самые известные и часто встречаемые из них это: ибупрофен, индометацин. Все представители НПВП являются ингибиторами ключевого белка воспаления - циклооксигеназы (COX), который играет основную роль в синтезе провоспалительных молекул (простагландинов, лейкотриенов и др.), которые в свою очередь влияют на окружающие клетки и ткани, включая защитную реакцию организма. Большой недостаток этих препаратов в том, что они не лечат сами заболевания, а лишь скрывают их симптомы, при этом они имеют большое количество побочных и неблагоприятных эффектов (язва желудка, почечная недостаточность и др.). Поэтому важно исследовать кардинально другие вещества, влияющие на механизм развития заболеваний. Таким веществом может стать росиглитазон. Сейчас это вещество продается как противодиабетический препарат, но из-за его влияния на ядерные рецепторы PPARs, которые являются факторами транскрипции молекул метаболической, энергетической и иммунной систем, можно предположить многообещающий результат применения этого препарата при лечении выше перечисленных заболеваний. Глава 1. Обзор литературы по теме исследования 1.1 Воспалительный процесс Воспаление представляет из себя достаточно сложную последовательность воздействий молекул на клетки и их взаимодействия между собой, основная функция которой распознавание, выведение или уничтожение посторонних молекул и тел в живой системе, репарация изменений, образовавшихся после воспаления, и защита организма от воздействия патогена. Для этого в клетке есть четко устроенная система рецепторов (TLRx, PPARs) и других белков (NFkB, MyD88 и др.), а также разнообразие противовоспалительных молекул (простагландинов G, F и др.). В организме же воспаление напрямую связано с системой врожденного иммунитета. 1.2 Роль врожденного иммунитета в воспалительном процессе Врожденный иммунитет — это система распознавания и выведения патогена из организма. Реализация ответа врожденного иммунитета происходит за счет системы комплемента — комплекса белков, активация которых, путем связывания с концами антител, нашедших антиген, приводит к выполнению различных биологических функций, но в случае с воспалением это ведет к разрушению и выделению из тканевых базофилов и базофильных гранулоцитов крови биологически активных веществ (гистамина, серотонина, брадикинина — медиаторов воспаления), которые стимулируют воспалительную реакцию. 1.3 Воспалительный процесс при аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваниях На сегодняшний день неизвестен точный механизм возникновения аутоиммунных заболеваний, известно только, что во время них клетки врожденного иммунитета внезапно начинают атаковать и уничтожать здоровые клетки хозяина, считая их патогенными. По видимому нарушается процесс опознавания окружающих молекул или клеток, что может быть связано с неисправностью клеточных рецепторов, последующих путей белковых преобразований и др. Насчет же нейродегенеративных заболеваний можно сказать, что было статистически показано благоприятное влияние НПВП при болезни Альцгеймера. 1.4 Нестероидные противовоспалительные препараты НПВП — это вещества, подавляющие каталитическую активность COX. Среди них есть различные вариации по обратимости и цели ингибирования. Среди всех ингибиторов COX-1 (известных на сегодняшний день) только аспирин необратимо инактивирует этот фермент путем ацетилирования серина в активном центре белка. Механизм же обратимого ингибирования ЦОГ-1 (ибупрофен, алкафенак) представляет из себя связывание с активным центром фермента и изменение его конформации (при этом все обратимые ингибиторы COX-1 связываются и переводят фермент в новую конформацию совершенно одинаково, разница заметна лишь в скорости и эффективности, с которой они занимают активный центр). Ингибирование же COX-2 также выражено необратимыми изменениями в строении белка без какого-либо ковалентного взаимодействия. Но помимо полезного эффекта на организм во время воспалительного процесса все НПВП имеют достаточно широкий и разнообразный список неблагоприятных побочных эффектов. Дело в том, что некоторые из противовоспалительных молекул (например, PGE2) в небольших количествах защищают слизистую желудка, регулируют нормальную работу эндотелия сосудов и свертывания крови и многое другое. Поэтому при длительном приеме НПВП могут пострадать желудок, сердце, легкие, почки. 1.5 Циклооксигеназа - основной белок воспалительного ответа Циклооксигеназа — основной интегральный белок клеток, участвующий в воспалительном процессе. Основная задача фермента — проведение двух каталитических реакций: циклооксигеназной - присоединение двух кислородов к углеродному скелету арахидоновой кислоты, что сопровождается циклизацией молекулы, и пероксидазной с образованием PGH2. Важно отметить, что этот фермент способен к саморегуляции, что, по-видимому, является основным фактором регуляции синтеза простагландинов в живых системах. Первый способ инактивации протекает в процессе реакции через лабильные промежуточные соединения, возникающие и исчезающие в процессе каталитического действия фермента, но это относительно медленный процесс. Второй способ основан на изменении третичной структуры белка, что происходит намного быстрее. Такое изменение ведет к увеличению скорости гидролиза фермента трипсином. Циклооксигеназа имеет 2 изоформы: конститутивную (COX-1) и индуцируемую (COX-2). Было выяснено, что эти белки на 60% гомологичны: основные каталитические участки ферментов одинаковы для каждой изоформы, оба варианта белка локализованы в ЭПР и на ядерной мембране. Однако имеются и некоторые различия. Размер активного центра COX-1 меньше, чем у COX-2, что являлось важным аспектом в разработке селективных ингибиторов COX-2. Так же можно отметить разницу в активаторах и регуляторах экспрессии для каждой из изоформ. 1.6. Простагландины - основные провоспалительные молекулы Среди большого количества выделяемых клетками провоспалительных молекул наиболее важные — простагландины. Простагландины образуются из PGH2 под воздействием различных конвертаз - ферментов выполняющих роль обеспечения разнообразия всего спектра простаноидов путем осуществления трех видов каталитических реакций: изомеризации, восстановления и смешанной реакции изомеризации/восстановления. Простагландины являются медиаторами важнейших процессов в организме. Наиболее ярко это проявляется в поддержании тонуса сосудов и регуляции нормального свертывания крови, в регуляции функций почек и желудочнокишечного тракта, развитии иммунного ответа и воспаления, в репарации тканей. Все они действуют преимущественно через связывание с рецепторами плазматической мембраны. Главный из многочисленных эффектов простагландинов — поддержание равновесия между индивидуальными веществами с противоположными действиями. Например, PGE2 вызывает расслабление сосудов, в то время как PGF2 способствует их сжатию. Отметив важность простагландинов в регуляции организма, можно еще раз отметить, что при медикаментозном вмешательстве в систему синтеза простагландинов должна предшествовать корректная оценка факторов риска побочных эффектов, так как на сегодняшний день не существует ни одного метода, способного повлиять на уровень одного-единственного представителя этого класса веществ. 1.7. TLR и PPARs как участники активации и развития воспалительного процесса. 1.7.1. TLR — мембранные рецепторы патогенных молекул Для определения типа вредоносного патогена на мембранах клетки расположены толл-подобные рецепторы (TLR). Найдены они почти у всех животных, начиная с амфибий и заканчивая млекопитающими. Всего известно 13 различных видов этого интегрального белка, каждый из которых способен связывать свой определенный вид молекул (двух-цепочечные молекулы РНК, LPS и др.), передавая сигнал дальше в клетку и в ядро по огромному разнообразию белковых путей. В моей работе основное внимание было уделено TLR4, так как они отвечают за активацию воспалительного ответа при добавлении к клеткам липополисахарида (который входит в строение мембран бактериальных организмов и является основным маркером при их появлении в организме или рядом с клетками). После интеграции LPS к TLR4 в клетке запускается последовательность белков, ведущая к образованию NF-kB, который в свою очередь проходит в ядро, садится на промотер гена COX-2 и запускает ее транскрипцию. Из-за этого в клетке повышается уровень циклооксигеназы, поэтому можно сделать вывод, что COX — показатель, маркер, воспалительного процесса, а TLR — активатор ее транскрипции. 1.7.2 PPARs – ядерные белки и факторы транскрипции PPARs — группа ядерных рецепторов, функционирующих в качестве фактора транскрипции генов метаболической, энергетической и иммунной систем, поэтому играет большую роль в регуляции клеточной дифференцировки, развития и обмена веществ у высших организмов. На сегодняшний день известно 3 различных вида этих рецепторов. Все PPARs после активации путем связывания с лигандом образуют димер с белком RXR, который способен проникать в ядро и садиться на ДНК последовательность AGGTCAXAGGTCA. После этого процесс транскрипции гена может как ускориться, так и замедлиться, что регулируется точной формой лиганд-связывающего домена, обусловленной присоединением лиганда, а также белков-коактиваторов или белков-корепрессоров. Среди лигандов PPAR - жирные кислоты, простагландин J2 и др. Можно заметить, что молекулы, участвующие в воспалении, регулируют ядерные рецепторы, что доказывает связь этих рецепторов с воспалительным процессом. 1.8 Росиглитазон как возможный представитель нового типа противовоспалительных лекарств Росиглитазон является антидиабетическим препаратом тиазолидиндионового класса. Его влияние на PPARs, которые участвуют в регуляции транскрипции генов метаболической, энергетической и, что более важно, врожденного иммунитета, позволяет предположить его угнетающее влияние на воспалительный процесс. Встраиваясь в рецептор, он запускает процесс образования комплекса способного садиться на промотеры генов, тем самым ускоряя или замедляя их транскрипцию. Сейчас же его возможность присоединяться к ядерным рецептором используется для борьбы с сахарным диабетом 2 типа, ускоряя процесс разложения сахара и его поглощение из межклеточного пространства. Уже было показано влияние этого препарата на экспрессию COX в клетках глиомы, но не было точно известно как происходит это действие и на сколько оно сильное. Поэтому можно сделать вывод, что росиглитазон может стать новым противовоспалительным препаратом и, что самое важное, с новым путем воздействия на экспрессию основного белка воспалительного процесса. Рис.1 Росиглитазон 1.9. Глиальные клетки Особый интерес для изучения взаимосвязи TLR и PPAR представляют астроциты головного мозга. Именно астроциты играют важную роль в поддержании жизнеобеспечения нейронов, являясь основным звеном на пути продвижения веществ от кровеносных сосудов к нейронам, участвуя в формировании гематоэнцефалического барьера. Первоначально астроцитам отводили вспомогательную роль в поддержании деятельности нейронов, однако сейчас их стали считать равноправными участниками нервной системы, вплоть до регуляции проведения сигналов в синаптических контактах. Также астроциты участвуют в синтезе некоторых физиологически активных веществ, необходимых для развития иммунного и воспалительного ответов в ткани головного мозга и играют важную роль в защите при его повреждениях различного характера. В ряде случаев повреждения головного мозга астроциты становятся реактивными, и развивается астроглиоз. Не смотря на защитные функции «астроглиоза» избыточное развитие этого процесса приводит к нарушению процесса регенерации нервной ткани, формированию глиальных рубцов, а также к переходу воспаления в хроническую стадию. Астроциты участвуют в комплексной регуляции развития воспалительного ответа в ЦНС, и обладают способностью выбрасывать различные про- и противо- воспалительные сигнальные молекулы в ответ на различные типы стимуляций. Изучение этих процессов на клеточном уровне и исследование возможности их регуляции является важным направлением современных нейробиологических исследований. Глава 2. Экспериментальная часть 2.1 Материалы и методы 2.1.1 Культивирование клеток глиомы линии С-6 Для работы мне были предоставлены клетки глиомы крысы линии С-6. В течении всей работы проводились действия по смене среды, которая проходила раз в 2-3 дня, и рассадки клеток на новые матрасы при необходимости, когда их плотность превышала допустимую. Для смены среды мы использовали DMEM среду, содержащую 10% эмбриональное телячьей сыворотки, глутамин и 100000 ед./мл пенициллина и стрептомицина (все перечисленные вещества добавляются к солевому раствору непосредственно перед использованием среды), раствор Хэнкса — солевой раствор, автоматическую пипетку, а вся работа проводилась под ламинарным шкафом с постоянной обработкой 70% этанолом и ультрафиолетом. При смене среды сначала сливается старая среда. После этого флакон с клетками промывается раствором Хэнкса 2 раза по 5 мл. Затем Автоматической пипеткой отбирается 10 мл новой среды и аккуратно переносится во флакон. После завершения работы клетки помещаются обратно в CO2-инкубатор при 37 градусах и 10% CO2. Для рассадки клеток на новые матрасы были использованы трипсин, раствор Хэнкса, DMEM среда, автоматическая пипетка, 2 флакона на 75 мл. Сначала старая среда сливается, а флакон промывается раствором Хэнкса 2 раза по 5 мл. После этого добавляется 5 мл трипсина для разрушения связей между клетками и субстратом и возвращается в инкубатор на 5 минут при 37 градусах. Потом к полученному раствору добавляется 7 мл среды DMEM для частичного ингибирования фермента. С помощью центрифуги клетки отделяют от общего раствора. За тем клетки разбавляют 10 мл среды и ресуспензируют. Из полученного раствора в каждый из флаконов переливают 1 мл и 9 мл среды. По окончании работы флаконы возвращаются в CO2-инкубатор при 37 градусах и 10% CO2. Рассадка клеток проводилась из расчета на 106 клеток на флакон. Подсчет количества клеток проводили с помощью камеры Горяева. За 24 часа до начала эксперимента клетки были рассажены на 6-луночную плашку с плотностью 106 клеток на лунку. За два часа до экспериментальных обработок питательная среда в каждой лунке менялась на свежую (по 2 мл среды на лунку). 2.1.2 Спектрофотометрия Для определения концентрации РНК, полученной после очистки лизатов клеток (в качестве лизирующего буфера использовался TR1) путем различных обработок и с помощью разделительной колонки, был использован метод спектрофотометрии. Этот метод основан на замерах поглощения определенной длины волны раствором известного вещества. После чего расчетами через уравнения и отношения можно точно определить концентрацию вещества и проверить чистоту образца от других веществ. В нашей работе требовалось определить концентрацию РНК в полученном лизате. Для этого из каждого раствора было взято по 10 мкл РНК (уже очищенной и обработанной ДНКазой) и разбавлено в 990 мкл воды в мензурке на 1 мл. После этого были проведены замеры поглощения образцов на длинах волн от 200 до 290 нм. В качестве контроля был взят 1 мл воды, результаты которой вычитались из результатов каждого образца. Полученные данные были представлены таблицей и графиками. Для расчета концентрации использовалось уравнение C=A260*k*100, где С — концентрация, А260 — поглощение раствором волны в 260 нм, k — коэффициент, показывающий концентрацию РНК в растворе необходимой для поглощения равного 1, для определения С — концентрации. Для проверки чистоты РНК от ДНК было использовано отношение А260/А280, которое для чистых растворов равно 1,9-2,0. В моих растворах это значение колебалось от 1,8-2,1, что свидетельствует о чистоте полученных мною растворов РНК. 2.1.3 Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией Для проведения ПЦР в реальном времени нужно было получить 70 нг ДНК из имеющихся молекул РНК. Для этого нам пришлось воспользоваться методом обратной транскрипции. От каждого образца был отобран определенный объем раствора с содержанием 70 нг РНК. Позже к каждому образцу были добавлены олиго (dT) праймеры, обратная транскриптаза, ингибитор РНКаз, буфер и dNTP в общем объеме 5 мкл. Водой объем доводился до 10 мкл. Все растворы помещались в термоциклер для амплификации на 65 минут. На выходе было получено 70 нг кДНК. Для ПЦР были использованы праймеры для гена COX-2 и Actin, по которому нормализовались все данные, ДНК полимераза, SYBR green, способный встраиваться только в 2-цепочечные молекулы ДНК и давать световой сигнал, dNTF и буфер в общем объеме 14,8 мкл. К полученным растворам добавляли по 5,2 мкл раствора кДНК. Затем образцы помещались в амплификатор на 40 циклов ПЦР. По окончании были получены данные по замерам световых сигналов, которые проводились перед началом нового цикла на протяжении всего ПЦР, и представлены в виде графиков. По этим данным было возможно определить начальное количество ДНК, а, следовательно, РНК, что равно количеству белка изучаемого нами гена. 2.1.4 Агарозный электрофорез и анализ кривых плавления Для проверки специфичности праймеров и чистоты растворов от лишних продуктов ПЦР и геномной ДНК был проведен агарозный электрофорез. Для агарозного геля были использованы 10х буфер TBE 20 мл, агароза 5, 180 мл воды и 6 мкл этидиум бромида, который встраивается в пространство между нуклеотидами и дает свечение под ультрафиолетом. Ванночка состояла из 40 мл 10х TBE, 360 мл воды. Параметры тока: 100 В, 50 мА, 5 Вт. Помимо агарозного электрофореза для проверки специфичности праймеров и отсутствия лишних продуктов ПЦР были проанализированы кривые плавления, которые характеризуют длину полученных последовательностей. Кривые выдали схожие результаты с результатами агарозного электрофореза. 2.2 Результаты исследования Мы хотели определить влияние росиглитазона и ее степень при воспалительном процессе. Для этого был проведен первый эксперимент с замером изменения уровня мРНК COX-2 при обработке LPS и RG. Перед началом эксперимента к клеткам в лунки был добавлен LPS в размере 1 мкг/мл, позже из этой группы отделялось несколько лунок, которые потом были дополнительно обработаны росиглитазоном в течение 30 минут. После этого проводились все выше сказанные методы. По полученным данным удалось отметить, что LPS запускает воспалительный процесс в клетках глиомы крыс, а следовательно, повышает уровень мРНК COX-2. Но предварительная обработка росиглитазоном привела к почти полному спаду уровня мРНК после активации воспаления, а обработка нестимулированных клеток привела к уменьшению и так низкого уровня белка в клетке. Это говорит о том, что росиглитазон действительно можно прибавить к списку противовоспалительных лекарств. Погрешности построены на основе 2 кратного технического повтора. Уровень экспрессии РНК COX-2 4 Выводы 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Контроль LPS LPS+RG RG Экспериментальные обработки После проведенн ого эксперимента стало очевидно, что росиглитазон обладает возможностью предотвращения воспалительного процесса. При этом происходит это через ингибирование процесса транскрипции основного гена воспаления. Поэтому можно считать росиглитазон кардинально новым (возможным) провоспалительным препаратом, который, в отличии от НПВП, будет бороться с болезнью. Помимо этого можно отметить, что липополисахарид может запускать воспалительный процесс путем увеличения количества экспрессируемого фермента — COX-2 — в клетках глиомы линии С-6. Литература 1. Heneka M. T. and Landreth G. E. (2007) Biochim. Biophys. Acta 1771, 1031– 1045. 2. Aleshin S., et al. (2013) Neurochem. Int. 63, 322–330. 3. Chistyakov DV, et al. (2014) J Neurochem. 130(4), 563-74. 4. Ivliev AE, et al. (2010) Cancer Res. 70(24), 10060-70. 5. Anderson P. (2010) Nat. Rev. Immunol. 10, 24–35. 6. Wang J1,Tan L2,Wang HF3,Tan CC1,Meng XF1,Wang C1,Tang SW4,Yu JT5, Anti-inflammatory drugs and risk of Alzheimer's disease: an updated systematic review and meta-analysis.
