Материалы и методы исследований

На правах рукописи
Пауль Галина Александровна
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ И КАЧЕСТВЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ МОЧИ
ПРИ МУКОПОЛИСАХАРИДОЗАХ И САХАРНОМ ДИАБЕТЕ
03.00.04 – биохимия
14.00.16 – патологическая физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Новосибирск – 2007
Работа выполнена в Государственном
учреждении Научноисследовательском институте физиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук
Научный руководитель:
доктор медицинских наук,
профессор
Короленко Татьяна Александровна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук
Усынин Иван Федорович
доктор медицинских наук
Ким Лена Борисовна
Ведущая организация:
ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава
Защита состоится _____________2007 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 при Государственном учреждении Научноисследовательском институте биохимии Сибирского отделения Российской
академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел.: 8-3832-33-54-81).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения научно-исследовательского института биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул.
Академика Тимакова, 2).
Автореферат разослан ________________2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
2
Г.С. Русских
Общая характеристика работы
Актуальность исследования. В последнее десятилетие существенно
пересмотрены структурные и функциональные характеристики внеклеточного матрикса. Протеогликаны внеклеточного матрикса играют важную
роль в межклеточных взаимодействиях (Iozzo, 1998; Roseman, 2001), участвуют в регуляции дифференцировки, созревании и росте клеток специализированных тканей (Hegewald et al., 2004; Schulthz et al., 2004; Stern et al.,
2006), в защите сосудистой стенки и регуляции проницаемости базальных
мембран (Nigro et al., 2005). Протеогликаны регулируют фибриллогенез
коллагена, вовлечены в процессы роста и инвазии опухолевых клеток
(Кабак и соавт., 1990; Kuo et al., 1991; Stern et al., 2004), участвуют в восстановительных процессах, выполняя компенсаторно-приспособительные
функции (Raman et al. , 2005; Taylor et al., 2006).
Нарушения функционирования компонентов внеклеточного матрикса
наблюдаются при многих заболеваниях человека, поскольку протеогликаны
вовлечены в основные типовые патологические процессы (воспаление,
склероз, ишемия, старение и др.). Гликозаминогликаны (ГАГ) являются
важным компонентом протеогликанов (Taylor et al., 2006).
При наследственных лизосомных заболеваниях мукополисахаридозах
описаны генетические дефекты лизосомных ферментов, отвечающих за
деградацию ГАГ (Neufeld et al., 1970, 1975). Эти данные стимулировали
изучение
патогенеза,
диагностики,
лечения
больных
мукополисахаридозами, особенно при заместительной ферментной терапии
и трансплатации костного мозга. Накопление ГАГ в тканях и повышенное
выделение их с мочой, как результат значительного снижения активности
лизосомных
гидролаз
в
клетках,
подтверждает
предполагаемый
клинический диагноз у больных мукополисахаридозами и позволяет
проведение первого этапа диагностики лизосомных болезней накопления
(Видершайн,
1980;
Краснопольская,
3
2005).
Для
количественного
определения ГАГ мочи предложено несколько методов, которые нуждаются
в совершенствовании.
Изменения экскреции и качественного состава ГАГ мочи изучаются
при ряде заболеваниий: диабетической нефропатии (De Muro et al., 2002);
аутоиммунных заболеваниях - системной красной волчанке (Bicer et al.,
2003), ревматоидном артрите (Ueta et al., 1994), аутоиммунном тиреоидите
(Winsz-Szczotka et al., 2006); амилоидозе (Linker et al., 1987; Magnus et al.,
1992); нефролитиазе (Tsujihata et al., 2006). Изменения состава ГАГ мочи
наравне
с
микроальбуминурией
рассматриваются
как
показатель
кардиоваскулярного риска (Russo et al., 2004; Ballinger et al., 2004).
Многолетний
сульфатированных
опыт
ГАГ
биохимического
у
пациентов,
селективного
направленных
скрининга
на
медико-
генетическое консультирование с целью выявления наследственных
болезней обмена, обнаружил большой контингент больных с повышенной
экскрецией
сульфатированных
ГАГ,
не
связанных
с
наличием
мукополисахаридозов. Дальнейшие исследования показали, что среди
пациентов с повышенной экскрецией сульфатированных ГАГ выделяется
значительная группа больных с нарушением углеводного обмена (сахарного
диабета I и II типа). В связи с этим возникла необходимость проведения
дифференциальной диагностики выведения ГАГ с мочой при разных
механизмах нарушения обмена протеогликанов.
В этой ситуации изучение роли одного из основных компонента внеклеточного матрикса – ГАГ в патогенезе генетически обусловленных мукополисахаридозов и диабетической нефропатии чрезвычайно актуально. Известно, что у 40-45 % больных сахарного диабета как типа 1, так и типа 2
развивается диабетическая нефропатия, которая является основной причиной смертности больных (Дедов, Шестакова, 2000).
Цель работы. Изучить особенности экскреции и качественного
состава
сульфатированных
гликозаминогликанов
4
мочи
при
мукополисахаридозах и сахарном диабете, как клинических моделях
нарушения протеогликанов и углеводного обмена.
Задачи исследования:
1. Выявить частоту гиперэкскреции и изменений качественного
состава сульфатированных гликозаминогликанов мочи при проведении
биохимического скрининга наследственнных болезней обмена человека.
2. Изучить экскрецию и качественный состав сульфатированных
гликозаминогликанов
мочи,
активность
лизосомных
ферментов
в
лейкоцитах и плазме крови, активность хитотриозидазы в плазме крови у
больных мукополисахаридозами и болезнью Гоше.
3. Оценить количество и качественный состав сульфатированных
гликозаминогликанов мочи у больных сахарным диабетом с разной
степенью выраженности диабетической нефропатиии.
4.
Изучить
особенности
экскреции
сульфатированных
гликозаминогликанов с мочой у крыс в эксперименте при воспроизведении
модели мукополисахаридоза и сопоставить изменения показателей с
соответствующими данными у больных мукополисахаридозами.
Научная новизна. Впервые
встречаемости
синдрома
представлены данные о частоте
гиперэкскреции
сульфатированных
гликозаминогликанов с мочой в сибирской популяции. Установлено, что
качественный состав сульфатированных гликозаминогликанов зависит от
характера заболеваний.
Проведение определения экскреции и качественного состава ГАГ
мочи и оценки активности хитотриозидазы плазмы крови уже на первом
этапе
биохимического
скрининга
наследственных
болезней
обмена
человека позволяет отдифференцировать мукополисахаридозы и болезнь
Гоше.
Прогрессирование диабетической нефропатии сопровождается не
только увеличением экскреции сульфатированных гликозаминогликанов,
5
но и нарушением соотношения сульфатированных гликозаминогликанов за
счет увеличения гепарансульфата.
Практическая значимость. Материалы диссертации использованы
при подготовке методического пособия для врачей «Наследственные болезни обмена веществ: общие принципы выявления нарушений обмена аминокислот, сахаров, гликозаминогликанов» (Новосибирск, 2004). Результаты
работы внедрены в практическую деятельность клинико-диагностической
лаборатории Государственного Новосибирского областного клинического
диагностического центра и медико-генетической консультации МУЗ
Муниципального центра планирования семьи и репродукции. Диагностическое значение исследования подтверждено патентом на изобретение №
2196988 «Способ диагностики мукополисахаридозов» (БИПМ, №2 от
20.01.2003) и рационализаторским предложением «Диагностический тест
тяжести состояния и эффективности лечения больных с хронической интоксикацией» №3253/2 от 28 декабря 1993г НФ НПО «Гигиена и профпатология». Обнаруженные различия качественного состава сульфатированных
ГАГ мочи и активности хитотриозидазы плазмы крови позволяют проводить дифференциальную диагностику между мукополисахаридозами и болезнью Гоше на I этапе биохимического селективного скрининга наследственных болезней обмена.
Положения, выносимые на защиту:
1.
Синдром гиперэкскреции сульфатированных ГАГ встречается с
высокой частотой (60%) при заболеваниях, которые сопровождаются
нарушениями обмена протеогликанов и углеводного обмена.
2.
Выраженное
повышение
гликозаминогликанов
и
экскреции
различия
сульфатированных
качественного
состава
гликозаминогликанов мочи, активность хитотриозидазы в плазме крови
имеют
значимость
мукополисахаридозов
для
и
дифференциальной
болезни
Гоше,
фенотипические проявления.
6
которые
диагностики
имеют
общие
3.
Прогрессирование нефропатии у больных сахарным диабетом
сопровождается гиперэкскрецией сульфатированных ГАГ, изменением
соотношения хондроитинсульфата и гепарансульфата и появлением
нетипичного
дерматансульфата
в
моче,
свидетельствующие
о
выраженности диабетической нефропатии.
4.
Модель мукополисахаридоза, вызванная введением сурамина
крысам Вистар, воспроизводит изменения экскреции сульфатированных
гликозаминогликанов аналогичные наблюдаемым у больных мукополисахаридозами: резкое повышение количества сульфатированных гликозаминогликанов и появление нетипичных гликозаминогликанов (дерматансульфата) в моче.
Апробация
работы.
Материалы,
изложенные
в
диссертации,
представлены на рабочем совещании (с международным участием)
«Лизосомные болезни, модели, терапия» (Новосибирск, 28-29 сентября,
2000); 5-ом Международном симпозуме по мукополисахаридозам (5 th International Symposium on Mucopolysaccharidoses and Related Diseases, Vienna,
March 18 – 21, 1999); 13-м Рабочем совещании Европейской группы по
изучению лизосомных болезней (13th European Study Group on Lysosomal
Diseases Workshop, Septemer 20-23, 2001, Woudschoten, The Netherlands); 2ой межрегиональной научно-практической конференции «Клинические
аспекты
использования
молекулярно-биологической
диагностики
в
медицине» (Новосибирск, 2003); межрегиональной научно-практической
конференции «Молекулярная генетика нейродегенеративных заболеваний»
(Новосибирск, 2005); V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005);
на межлабораторном семинаре ГУ НИИ физиологии
СО РАМН,
(Новосибирск, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано
27
печатных работ, в том числе 7 статей в рекомендованных ВАК журналах.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из следующих
разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и
7
обсуждение, заключение, выводы и список литературы, включающий 216
ссылок. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста,
иллюстрирована 26 рисунками, содержит 17 таблиц..
Материалы и методы исследования
Работа проводилась в подразделении биохимического селективного
скрининга наследственных болезней обмена клинико-диагностической лаборатории Государственного Новосибирского областного клинического диагностического центра (главный врач к. м. н. Ю. И. Бравве) и в лаборатории
клеточной биохимии и физиологии ГУ НИИ физиологии СО РАМН.
1. Характеристика клинических групп
1 группа состояла из 1523 пациентов, в возрасте от 1 месяца до 68 лет
(мужчин - 49,1%, женщин - 50,9%. Исследование проводилось в течение
трех лет. Все пациенты были направлены на обследование медицинскими
генетиками для проведения биохимического селективного скрининга
наследственных болезней обмена.
2 группа - пациенты с лизосомными болезнями накопления в возрасте
от 2 до 40 лет: 8 больных мукополисахаридозами и 4 больных болезнью
Гоше. Диагноз верифицирован на основании результатов клинического обследования, данных биохимического скрининга и энзимодиагностики. Характерными клиническими проявлениями мукополисахаридозов были лицевые дисморфии (запавшая переносица, густые брови, вывернутые ноздри,
толстые губы и язык, низко посаженные уши, долихоцефалической формы
голова, выраженные лобные бугры), изменения скелета (укороченная грудная клетка, кифоз в нижнегрудном или верхнепоясничном отделе позвоночника, ограниченная подвижность в суставах, особенно в плечевых и
межфаланговых, контрактуры, шея короткая, низкий рост), гепатоспленомегалия, изменения органов зрения (очаги помутнения на роговице, атрофия зрительного нерва), снижение слуха, нарушения со стороны нервной
системы, снижение интеллекта.
3 группа - 55 больных сахарным диабетом (СД), 30 мужчин и 25
женщин, в возрасте от 16 до 63 лет (средний возраст 34,3+1,8 года). 46 обследованных страдали СД 1 типа, 9 - СД 2 типа. Длительность заболевания
варьировала от 3 месяцев до 36 лет, составляя в среднем 9,8+1,1 года. В зависимости от наличия и выраженности диабетической нефропатии больные
этой группы были распределены на 3 группы: в 1-ю вошли больные с нормальной экскрецией белка с мочой – 12 человек, во 2-ю – больные с микроальбуминурией или протеинурией до 0,3 г/сут – 31 человек, в 3-ю - больные с выраженной протеинурией – 12 человек. Выделенные группы были
сопоставимы по половому, возрастному составу и степени компенсации сахарного диабета. Пациенты с выраженной нефропатией отличались большей длительностью заболевания и тенденцией к повышению систолического и диастолического артериального давления.
8
Контрольную группу составили 156 человек в возрасте от 5 месяцев
до 58 лет, практически здоровые люди. Женщин было 87 человек (56 %),
мужчин 69 (44 %). Пациенты были разделены на возрастные группы согласно возрастной периодизации онтогенеза человека (Доскин и соавт.,
1997).
Забор крови осуществляли по добровольному согласию пациентов
утром натощак. Для выделения взвеси лейкоцитов и получения плазмы крови использовали гепарин. Пробы хранили при -20˚ С и использовали для
определения активности лизосомных ферментов.
Определение количества и качественного состава ГАГ проведено в
случайных порциях мочи человека и экспериментальных животных в различных группах. Забор биологических образцов проводили согласно требованиям этического комитета.
2. Экспериментальные исследования
В эксперименте воспроизведена модель мукополисахаридоза с помощью однократного введения сурамина крысам (Короленко, 1990). Исследования выполнены на 26 половозрелых крысах Вистар обоего пола в возрасте 2-2,5 мес., с массой 200-290 г (виварий ГУ НИИ физиологии СО
РАМН).
Для воспроизведения модели мукополисахаридоза у крыс был использован сурамин (любезно предоставлен проф. П. Д. Хартом, Великобритания). Сурамин вводили однократно внутрибрюшинно в виде раствора (50
мг/мл) на 0,9% NaCl в дозе 250 мг/кг массы. В этой дозе сурамин вызывает
накопление ГАГ в лизосомах печени, снижает скорость внутрилизосомального протеолиза, не подавляя захват клетками печени белка и не нарушая
целостности лизосом (Davies et al, 1969, 1971). Крысам контрольной группы
вводили однократно внутрибрюшинно физиологический раствор.
Общее количество сульфатированных ГАГ, креатинин определяли у
крыс в случайных порциях мочи, собранных на 2, 5, 14 сутки после введения препаратов. Проводилось также выделение ГАГ из мочи для последующего разделения ГАГ на отдельные виды методом электрофореза на ацетатцеллюлезных мембранах. У крыс после введения сурамина на 2 сут проводили исследование активности кислой фосфатазы, катепсина D и βгалактозидазы в гомогенате печени, а также исследование срезов печени
светооптически и электронномикроскопически с использованием электронного микроскопа JEM – 7A (Япония).
Основные биохимические методы, использованные в работе:
1. Количественное определение кислых сульфатированных ГАГ в моче (Gold, 1981) в модификации (Пауль, Русова, 1995).
2. Выделение ГАГ мочи и электрофорез ГАГ на ацетатцеллюлезных
мембранах в 0,1 М барий ацетатном буфере (рН 4,8) (Pennock, 1976).
3. Обработка гликозаминогликанов хондроитиназами АС и АВС (Saito, 1967).
9
4. Определение активности лизосомных ферментов в лейкоцитах и
плазме крови (-D-галактозидаза (КФ 3.2.1.23), -D-гексозаминидаза общая
(КФ 3.2.1.52), -гексозаминидаза А (КФ 3.2.1.30), -глюкуронидаза (КФ
3.2.1.31), β-глюкоцереброзидаза (КФ 3.2.1.45), -галактозидаза (КФ
3.2.1.22), α-идуронидаза (КФ 3.2.1.76), -фукозидаза (КФ 3.2.1.51), маннозидаза (КФ 3.2.1.24), определяли с помощью флюоресцентных субстратов, производных метилумбеллиферона (Sigma, ICN), для определения
активности арилсульфатазы А и В (КФ 3.1.6.8) использовали в качестве
субстрата производное нитрокатехола, согласно Wenger et al. (1991); активность хитотриозидазы оценивали по методу Guo et al.(1995); активность
идуронатсульфатазы (КФ 3.1.6.13) согласно методу Voznyi et al. (2001),
кислой фосфатазы по методике Barrett A.L. (1972). Инкубационная смесь
для оценки активности фермента (60 - 200мкл) содержала 0,1-0,5 М ацетатный или цитратный буфер (pH 5,0); 0,5 –10 мМ раствор субстрата. В каждую реакционную смесь добавляли взвесь лейкоцитов или плазму как источник фермента (4 – 120мкг) и инкубировали при 37С в течение 15 – 120
мин. Реакцию останавливали добавлением 2 мл 0,085М глицин – натриевого буфера, рН 10,5. Об активности ферментов судили по количеству освобожденного метилумбеллиферона, измеряемого на флюориметре «Квант –
9» (Россия) при  возбуждения 365 нм и  эмиссии 448 нм. Активность
фермента выражали в нмолях образовавшегося 4-метилумбеллиферона в
расчете на 1 мг белка в 1 ч. В контрольных опытах инкубировали только
субстрат и буфер и добавляли фермент после остановки реакции.
5. Определение белка в суспензии лейкоцитов проводили по методу
Бредфорда как описано Шоно и соавт. (1988).
6. Креатинин в моче определяли по цветной реакции Яффе с помощью набора «Креатинин-ново» («Вектор-Бест», Россия)
7. Определение уровня глюкозы в крови проводили глюкозоксидазным методом с помощью набора «Новоглюк-м» («Вектор-Бест», Россия);
клубочковая фильтрация и канальцевая реабсорбция определялась по клиренсу эндогенного креатинина, протеинурия определялась стандартным методом с сульфосалициловой кислотой (трехкратно) (Меньшиков, 2002). У
больных сахарным диабетом без явной протеинурии оценивали альбуминурию иммунохимическим полуколичественным методом с помощью тестполосок «Микраль-Тест-II» фирмы Boehringer «Mannheim» (Австрия).
Статистическую обработку результатов проводили методом параллельных рядов вариационной статистики с вычислением среднего арифметического (М) и ошибки среднего арифметического (m). Достоверность
различий экспериментальных данных рассчитывали с использованием t критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р < 0,05. Вероятность различий составляла 95 % (Гланц, 1999). Обработку результатов производили с использованием пакета компьютерных прикладных программ
Statistica 6.0.
10
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
1.
Экскреция сульфатированных гликозаминогликанов с мочой,
прошедших биохимический селективный скрининг наследственных
болезней обмена.
Определение концентрации общих сульфатированных ГАГ в моче у
1523 человек, прошедших биохимический селективный скрининг наследственных болезней обмена (1996-1998 г.г.) выявило повышенную экскрецию ГАГ с мочой у 918 человек, что составило 60,3 % от числа обследованных пациентов. Частота встречаемости пациентов с повышенным содержанием сульфатированных ГАГ в моче в зависимости от возраста представлена в таблице 1.
Экскреция сульфатированных ГАГ мочи пациентов во всех возрастных группах значительно превышала содержание сульфатированных ГАГ в
моче в контрольной группе (таблица 2).
Таблица 1.
Частота встречаемости гиперэкскреции сульфатированных
гликозаминогликанов у пациентов, прошедших биохимический
селективный скрининг наследственных болезней обмена
Возраст
Общее
количе- Гиперэкскреция ГАГ мочи
ство пациентов
Количество паци- %
ентов (абсолют- (относительное)
ное)
До 1 года
111
52
46,8 %
1-3 год
219
125
57,1 %
4-7 лет
288
150
52,1 %
8-12 лет
290
187
64,5 %
13-16 лет
193
147
76,2 %
17-21 год
105
76
72,3 %
22-60 лет
316
181
57,3 %
11
Таблица 2
Концентрация гликозаминогликанов в моче пациентов
по возрастным группам (мг ГАГ/ ммоль креатинина)
Возраст
Контрольная группа
(M ± m)
Группа с повышенной экскрецией
ГАГ
(M ± m)
До 1 года
12,8  3,7 (n=6)
25,4  2,3* (n=52)
1-3 года
8,2  0,5 (n=17)
14,0  0,9* (n=125)
4-7 лет
5,8  0,4 (n=17)
9,9  0,7* (n=150)
8-12 лет
4,1  0,3 (n=14)
7,2  0,4* (n=187)
13-16 лет
2,7  0,7 (n=17)
6,4  0,5* (n=147)
17-21 года
2,7  0,1 (n=17)
4,1  0,3* (n=76)
22-60 лет
3,4  0,2 (n=68)
5,5  0,3* (n=181)
Примечание - * р < 0,001, достоверность различий по сравнению с контролем; n –
количество обследованных.
Среди пациентов с повышенной экскрецией сульфатированных ГАГ
выделена группа пациентов с лизосомными болезнями накоплениями – 8
человек с мукополисахаридозами и 4 человека с болезнью Гоше, и группа
пациентов с сахарным диабетом, часто встречающимся нарушением
углеводного обмена - 73 человека.
2.
Экскреция сульфатированных гликозаминогликанов с мочой у
пациентов с лизосомными болезнями накопления
Лизосомные болезни накопления являются результатом мутаций в генах, отвечающих за синтез лизосомных ферментов (Видершайн, 1980;
Краснопольская, 2005; Neufeld et al., 1970.,1975; McKusick, 2006). В случае
мукополисахаридозов снижена или отсутствует активность лизосомных
ферментов, отвечающих за деградацию гликозаминогликанов. Развитие болезни Гоше связано с мутациями в гене β-глюкоцереброзидазы и снижением ее активности в лизосомах всех клеток в организме больных. Лабора12
торные исследования для диагностики лизосомных болезней накопления
включили в себя: анализ количества и качественного состава сульфатированных ГАГ мочи (таблица 3, рисунок 1) и определение активности лизосомных ферментов в лейкоцитах и плазме крови (таблица 4). Диагноз мукополисахаридоза был установлен 8 пациентам. Обнаружено отсутствие активности идуронат-сульфатазы в лейкоцитах периферической крови у 4 пациентов, что позволило верифицировать МПС II типа. Активность арилсульфатазы В в лейкоцитах периферической крови отсутствовала у 1 пациента, что характерно для МПС VI. Содержание сульфатированных ГАГ в
моче у отдельных больных МПС превышало средний уровень показателей
в возрастной группы в 3 - 10 раз (рисунок 2). Качественный состав ГАГ
также изменялся: в моче методом электрофореза обнаружен дерматансульфат в значительном количестве; усилилось выделение хондроитинсульфата
и гепарансульфата.
Диагноз болезнь Гоше выставлен 4 пациентам на основании клинических данных, снижения активности β-глюкоцереброзидазы лейкоцитов,
повышении активности хитотриозидазы и кислой фосфатазы в плазме крови. Количество ГАГ в моче у этих пациентов было увеличено в 3 случаях,
но не более чем в 2 раза (рисунок 2).
ХС
ГС
1
2
3
4
5
6
Рисунок 1. Электрофорез ГАГ мочи больных мукополисахаридозами.
Линии 1, 2, 3, 4, 5: ГАГ, выделенные из мочи больных мукополисахаридозами.
13
Линия 6: Стандарты: ХС – хондроитинсульфат; ГС – гепарансульфат.
Таблица 3
Содержание и качественный состав сульфатированных гликозаминогликанов мочи у пациентов с мукополисахаридозами
№ пациента п/п
Возраст, в котором установлен диагноз
№1
2 г 8 мес
Возрастная норма содержания
ГАГ в моче (мг
ГАГ / ммоль
креатинина)
8,2  0,5
Количественное
содержание ГАГ
в моче (мг ГАГ /
ммоль креатинина)
39,9
Качественный состав ГАГ мочи
ГС++; ДС+++
ХС+++
№2
2 г 1 мес
38,6
ГС++++;
ДС++++
8,2  0,5
ХС++++
№3
25 лет
5,4
ГС+;
ДС++
3,4  0,2
ХС+
№4
8 лет 11мес
36,0
ГС+;
ДС+++
4,1  0,3
ХС+
№5
3 г 5 мес
19,5
ГС++;
ДС++++
5,8  0,4
ХС+++
№6
17 лет
26,2
ГС++;
ДС+++++
2,7  0,1
ХС++++
№7
4 г 10 мес
13,1
ГС++;
ДС+++
5,8  0,4
ХС+++
№8
6 лет 11 мес
34,7
ГС++;
ДС+++++
5,8  0,4
ХС++++
Обозначения: ГАГ - гликозаминогликаны; ГС - гепарансульфат; ДС дерматансульфат; ХС - хондроитнсульфат.
+ -признак присутствует: + ; ++ ; +++ -степень выраженности признака
Таблица 4
Активность лизосомных ферментов в лейкоцитах крови
у больных мукополисахаридозами и болезнью Гоше (в % от контроля)
Название фермента
β - галактозидаза
β – N - гексозаминидаза
β - глюкуронидаза
β - глюкоцереброзидаза
α - идуронидаза
Идуронатсульфатаза
Арилсульфатаза А
Арилсульфатаза В
1
МПС
II
186
275
Пациенты
2
3
4
5
1
МПС МПС МПС МПС Гоше
II
VI
II
II
301
130
286
171
26
168
171
143
208
137
0,02
64
0
279
120
60,5
129
49
192
0
111
0,9
179
162
63
0
2
Гоше
3
Гоше
4
Гоше
136
183
228
181
98
208
86
31
15
118
22,6
50
98
79
0,04
133
94
223
3. Активность хитотриозидазы плазмы крови у больных мукополисахаридозами
14
Хитотриозидаза человека идентифицирована относительно недавно,
является ферментом, принадлежащим к семейству хитиназ, которые расщепляют хитин. Хитин это полимер, структурной единицей которого является N-ацетилглюкозамин (Fusetti et al., 2002). При болезни Гоше происходит повышение активности хитотриозидазы сыворотки в сотни и тысячи раз
по сравнению с группой здоровых людей (Hollak et al., 1994, 2001; Guo et
al., 1995). Исследовали активность хитотриозидазы в плазме крови у больных с мукополисахаридозами в сравнении с соответствующими данными
пациентов с болезнью Гоше и группой контроля (рисунок 2).
2500
*
% от контроля
2000
1500
1000
*
500
0
Контроль
МПС
ГАГ
Б-нь Гоше
Хитотриозидаза
Примечание: * - р < 0,01
Рисунок 2. Концентрация сульфатированных гликозаминогликанов в моче и
активность хитотриозидазы в плазме крови у больных мукополисахаридозами и болезнью Гоше
Обнаружено, что активность хитотриозидазы плазмы крови у пациентов с мукополисахаридозами составила 41,3 12,16 нмоль МУФ/мл в час,
что не отличалось от активности хитотриозидазы у здоровых людей (р >
0,05); у пациентов с болезнью Гоше активность хитотриозидазы в плазме
крови превышала показатель у здоровых лиц более чем в 500 раз (рисунок
15
2), что имеет важное значение для дифференциальной диагностики МПС и
болезни Гоше.
4. Экскреция сульфатированных гликозаминогликанов с мочой у
больных сахарным диабетом
Нарушение углеводного обмена – СД – встречается намного чаще,
чем мукополисахаридозы. Анализ содержания ГАГ в моче у больных сахарным диабетом с различной степенью выраженности диабетической
нефропатии показал значительное (в 2,5 раза) увеличение суммарной экскреции с мочой сульфатированных ГАГ у больных СД в сравнении с контролем (5,90+0,38 и 2,7+0,19 мг/ммоль креатинина соответственно, р<0,001)
(рисунок 3). Повышенная концентрация ГАГ в моче обнаружена у большинства пациентов: в 87,3% случаев показатель превышал верхнюю границу доверительного интервала в контроле (1,39-3,25 мг/ммоль). Гиперэкскреция сульфатированных ГАГ наблюдалась у больных СД с нормальной
экскрецией белка. У больных СД с микроальбуминурией гиперэкскреция
ГАГ была еще более выражена. Эти результаты согласуются с литературными данными (De Muro et al., 2002).
У большинства больных сахарным диабетом с нормальной экскрецией белка с мочой состав и соотношение фракций сульфатированных ГАГ
существенно не менялись. У всех больных СД с нормальной экскрецией
белка с мочой основным компонентом являлся хондроитинсульфат. Гепарансульфат присутствовал у 4-х человек в моче, причем только у двух - в
концентрации, близкой хондроитинсульфату. Больные СД с микроальбуминурией характеризовались значительным увеличением экскреции с мочой
гепарансульфата. Гепарансульфат обнаружен у 28 больных этой группы,
причем в 17 случаях гепарансульфат становился основной фракцией: его
экскреция приближалась к таковой хондроитинсульфата или даже превышала ее. У 7 пациентов данной группы в моче обнаружен дерматансульфат.
16
8
7
мг ГАГ/ ммоль
креатинина
6
*
*
*
5
4
3
2
1
0
К
1-я
2-я
3-я
Группы больных сахарным диабетом
Рисунок 3. Экскреция сульфатированных ГАГ с мочой у больных сахарным
диабетом в зависимости от стадии диабетической нефропатии
Примечания: К –контрольная группа; 1-я (n = 12) – с нормальной экскрецией белка; 2-я
(n = 31) – с микроальбуминурией и 3-я (n = 12) с выраженной протеинурией.
* - р < 0,001 по сравнению с контролем.
У больных СД с выраженной протеинурией качественный состав ГАГ мочи
отличался от такового в группе контроля. Гепарансульфат был выявлен у 11
больных из 12, при этом у 7 больных в качестве основного ГАГ. У 4 больных в заметных количествах выделялся с мочой дерматансульфат. Типичные изменения качественного состава ГАГ у больных СД с выраженной
протеинурией представлены на рисунке 4.
Обнаруженные изменения экскреции и качественного состава ГАГ
мочи у больных сахарным диабетом отражают нарушения обмена протеогликанов в тканях, найденные в базальной мембране клубочков почек
(Дедов, Шестаков, 2000; Schaefer et al., 2001), в межпозвонковых дисках
(Robinson et al., 1998), в капиллярах скелетных мышц (Jensen et al., 1997;
Russo, 2004) и сопровождают прогрессирование нефропатии у больных СД.
17
ХС
ГС
1
2
3
4
5
Рисунок 4. Электрофорез ГАГ мочи больных сахарным диабетом.
Линия 1, 2, 3, 4: ГАГ, выделенные из мочи больных сахарным диабетом.
Линия 6: Стандарты: ХС – хондроитинсульфат; ГС – гепарансульфат.
5. Анализ содержания гликозаминогликанов в моче у крыс с мукополисахаридозами
Согласно литературным данным, введение сурамина крысам и мышам
сопровождается снижением активности лизосомных ферментов печени,
участвующих в деградации ГАГ (идуронатсульфатазы, β-глюкуронидазы, β
- гиалуронидазы, N- ацетил-β-D-гексозаминидазы), однако активность других ферментов в печени повышена (α-идуронидазы, гепаран-N-сульфатазы
и арилсульфатазы В (Короленко, 1990, 2001; Constantopolos et al., 1980;
Schneider et al., 1997).
Электронно-микроскопически при изучении срезов печени крыс через
24 ч после введения сурамина в клетках паренхимы не обнаружено заметных изменений клеточных органоидов за исключением лизосом. Наблюдалось преобладание аутофагосом и вторичных лизосом, содержащих
нерасщепленные или частично лизированные клеточные органоиды. Результаты экспериментов показали, что введение сурамина однократно в дозе 250 мг/кг крысам Вистар вызывает усиление экскреции сульфатированных ГАГ с мочой (рисунок 5). Через 2 суток после введения сурамина концентрация сульфатированных ГАГ в моче увеличивалась в три раза (304,6
18
± 28,36 мг/л; р=0,006), через 5 суток и 14 суток высокая концентрация ГАГ
сохранялась (333,6 ± 95,34 мг/л и 321,7 ± 53,79 мг/л; р=0,006, соответственно) по сравнению с интактными крысами (104,9 ± 10,25 мг/л). В моче крыс
после введения сурамина был обнаружен дерматансульфат, у интактных
крыс он не выявлялся, а также было установлено увеличение выделения
всех типов ГАГ: хондроитинсульфатов, гепарансульфата и дерматансульфата (рисунок 6).
400
350
*
ГАГ мг/ л
*
*
300
250
200
150
100
50
0
контроль (n=10)
2 сут (n=8)
5 сут (n=4)
14 сут (n=4)
Сутки после введения сурамина
Примечание * - р < 0,01; n – количество крыс в группе.
Рисунок 5. Концентрация ГАГ в моче крыс после введения сурамина однократно внутрибрюшинно (250 мг/г).
ХС
ГС
1
2
3
4
5
Рисунок 6. Электрофореграмма ГАГ мочи крыс после введения сурамина,
7 сут спустя.
Линия 1, 2: ГАГ мочи крыс контрольной группы.
Линия 3, 5: ГАГ мочи крыс на 7 день после введения сурамина.
Линия 4: Стандарты: ХС – ходроитинсульфат, ГС – гепарансульфат.
19
ВЫВОДЫ
1. Гиперэкскреция гликозаминогликанов с мочей у пациентов,
обследованных на наличие наследственных болезней обмена, в 60 % случаев связана с нарушением обмена протеогликанов. При этом лизосомальные
болезни накопления (мукополисахаридоз и болезнь Гоше) выявлены у 0,9%
пациентов, а сахарный диабет - у 8%.
2. У больных мукополисахаридозами наблюдается выраженное
повышение
экскреции
гликозаминогликанов
(в
3-10
раз),
сопровождающееся появлением в моче дерматансульфата, хондроитинсульфата и гепарансульфата, в то время как активность лизосомального
фермента хитотриозидазы в плазме крови не изменяется.
3. Экскреция гликозаминогликанов с мочей при болезни Гоше менее
выражена, чем при мукополисахаридозах, но активность хитотриозидазы в
плазме крови возрастает в сотни раз, что может служить маркером при
дифференциальной диагностике болезни Гоше и мукополисахаридозов.
4. При сахарном диабете суммарная экскреция сульфатированных
гликозаминогликанов возрастает более чем в 2 раза. В зависимости от стадии диабетической нефропатии изменяется соотношение хондроитинсульфатов и гепарансульфатов в сторону возрастания доли гепарансульфатов.
5. Введение крысам сурамина вызывает изменения в экскреции
сульфатированных
гликозаминогликанов,
мукополисахаридозами,
что
позволяет
наблюдаемые
использовать
у
больных
сурамин
для
воспроизведения модели мукополисахаридозов у животных.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Пауль Г.А., Русова Т.А. Определение сульфатированных гликозаминогликанов в моче // Клиническая лабораторная диагностика. – 1995. - №2.,
- С. 13 – 14.
2.
Пауль Г.А., Китайник Г.П. Проблемы обследования больных при патологии соединительной ткани // Тезисы докладов 6-ой научнопрактической конференции врачей, Новосибирск, 24 – 26 апреля 1996 г. С.88 – 89.
20
3.
Василькова Н.Ю., Пауль Г.А., Китайник Г.П. Случай диагностики
мукополисахаридоза // Тезисы докладов 6-ой научно-практической конференции врачей, Новосибирск, 24 – 26 апреля 1996 г. - С.89 – 90.
4.
Пупышев А.Б., Шкурупий В.А., Короленко Т.А., Власенко Л.П., Пауль Г.А. Синдром лизосомного накопления: от исследования фармакоиндуцируемых форм к энзимодиагностике лизосомных болезней // Материалы научно-практической конференции, Томск, 9-10 июня 1998 г. - С. 85 87.
5.
Пауль Г.А. Новые подходы к энзимоанализу мукополисахаридозов //
Тезисы докладов 9-ой научно-практической конференции врачей , Новосибирск, 1999. – С. 364.
6.
Paul G.A., Rusova T.V., Zaidman A.M., Kitainik G.P. Peculiarities glycosaminoglycan and proteoglycan excretion in human with mucopolysaccharidoses // Book of Abstracts, 5th International Symposium on Mucopolysaccharidoses and Related Diseases, Vienna, March 18 – 21, 1999. - P. 136.
7.
Короленко Т.А., Жанаева С.Я., Фаламеева О.В., Каледин В.И., Филюшина Е.Е., Бузеева И.И., Пауль Г.А. Хитотриозидаза как маркер стимуляции макрофагов// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. –
2000. - №10. - С. 391-394.
8.
Пауль Г.А., Амбросова С.М., Бондарь И.А., Климонтов В.В., Короленко Т.А. Количественные и качественные изменения гликозаминогликанов мочи при различных заболеваниях // Тезисы докладов 11-ой научнопрактической конференции врачей, Новосибирск, 2001. – С. 397.
9.
Klimontov V., Bondar I., Paul G., Pupyshev A. Serum activity of lysosomal enzymes and urinary glycosaminoglycan excretion in diabetic nephropathy //
Diabetologia. – 2001. – V.44, suppl. 1. – P. A269.
10. Пауль Г.А., Пупышев А.Б., Китайник Г.П., Шорина А.Р., Куприянова
Л.Я., Власенко Л.П. Селективный скрининг лизосомных болезней накопления в условиях медико-генетического отдела областного диагностического
центра // Бюллетень СО РАМН, 2001. - №1. - С.20-22.
11.
Короленко Т.А., Фаламеева О.В., Жанаева С.Я., Каледин В.И., Пауль
Г.А., Куторгин Г.Д., Гаврилова Н.И. Хитотриозидаза – новый фермент макрофагов: биологическая роль и значение в диагностике лизосомных болезней накопления // Бюллетень СО РАМН. - 2001. - №1.- С.28-34.
12.
Korolenko T., Falameyeva O., Djanaeva S., Paul G., Wevers R., Sandula
J. Chitotriosidase activity in models of lysosomal storage and macrophage stimulation // Book of Abstracts, 13th ESGLD Workshop, The Netherlands, September
20 – 23, 2001. - P.108.
13.
Korolenko T., Filushina E., Levina O.,Falameyeva O., Djanaeva S.,
Dergunova M., Paul G., Plotnikova G.I., Petrova E.A. Overloaded macrophage
depletion by gadolinium chloride as a new approach for treatment of experimental lysosomal storage syndrome // Book of Abstracts, 13th ESGLD Workshop, The Netherlands, September 20 – 23, 2001. - P.110.
14.
Бондарь И.А., Климонтов В.В., Пупышев А.Б., Пауль Г.А., Амбросова С.М., Короленко Т.А. Экскреция сульфатированных гликозаминоглика21
нов с мочой у больных с диабетической нефропатией // Проблемы эндокринологии. - 2001. - т.47, №4. - С.35-38
15.
Бондарь И.А., Климонтов В.В., Пупышев А.Б., Пауль Г.А., Амбросова С.М. Обмен сульфатированных гликозаминогликанов и активность лизосомных ферментов у больных с диабетической нефропатией // Сахарный
диабет. - 2002. - №.1 - С.46-49.
16.
Paul G.A., Voznyi Y.V., Keulemans J.L.M., van Diggelen O.P., Kitaynik
G.P., Peskov S.A., Korolenko T.A. The Application of a new fluoremetric substrate assay for diagnosis of Hunter disease in diagnostic practice // Abstracts, 7th
International Symposium on MPS and Related Diseases, France, 20th – 23rd June
2002. – P. 48.
17.
Пауль Г.А., Китайник Г.П., Песков С.А., Шорина А.Р., Амбросова
С.М., Бравве Ю.И. Возможности использования искусственных субстратов
для энзимодиагностики лизосомных болезней накопления в областном клиническом диагностическом центре // Материалы областной научнопрактической конференции, Новосибирск, 2002. – С.141 – 142.
18. Климонтов В.В., Бондарь И.А., Пауль Г.А., Надев А.П. Ранние метаболические и гемодинамические маркеры диабетической нефропатии // Материалы Всероссийской конференции, Новосибирск, 2002. – С.143 – 144.
19.
Пауль Г.А., Шорина А.Р., Китайник Г.П., Амбросова С.М., Песков
С.А. Состояние и перспективы клинико-лабораторной диагностики мукополисахаридозов // Молекулярно-биологические технологии в медицинской
практике / Под ред. А.Б. Масленникова. – Вып. 4. - Новосибирск:Альфа Виста, 2003. – С.134 – 140.
20.
Пауль Г.А., Песков С.А., Масленников А.Б. Наследственные болезни
обмена веществ: общие принципы выявления нарушений обмена аминокислот, сахаров, гликозаминогликанов. Методическое пособие для врачей /
Под ред. А.Б. Масленникова. – Новосибирск: Альфа Виста, 2004. – 40 с.
21.
Песков С.А., Ефремов А.В., Таирова С.А., Пауль Г.А., Масленников
А.Б., Прыткина О.К., Потеряева Е.Л., Ерзин Д.А., Никифорова Н.Г. Ранние
метаболические, клинические и морфологические маркеры нефропатии от
воздействия промышленных аэрозолей. //Материалы Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные,
экологические и клинические аспекты», Новосибирск, 2004. – С.268 - 269.
22.
Пауль Г.А., Песков С.А., Китайник Г.П., Шорина А.Р., Ерзин Д.А.
Технологии биохимической диагностики болезней обмена веществ и лизосомных болезней накопления в клиническом диагностическом центре //
Екатеринбургский консультативно-диагностический центр - итоги 15летней деятельности в практическом здравоохранении: Сборник научных
трудов. – Екатеринбург: Издательство АБМ, 2004. – С.205 – 207.
23.
Пауль Г.А., Песков С.А., Масленников А.Б., Амбросова С.М., Кубраковская С.В., Таирова С.А., Шорина А.Р., Жанеева С.Я., Короленко Т.А.
Комплексное клинико-лабораторное обследование в дифференциальной диагностике болезни Гоше // Современные диагностические и лечебные технологии: Сборник статей. - Ростов–на-Дону, 2005. – С.107-108.
22
24.
Пауль Г.А., Песков С.А., Короленко Т.А. Роль изменений количественного и качественного состава гликозаминогликанов мочи при экспериментальном мукополисахаридозе //Бюллетень сибирской медицины,
2005. Приложение 1. – С.56.
25.
Песков С.А., Пауль Г.А., Русова Т.В., Короленко Т.А. Масленников
А.Б. Универсальная технология ранней диагностики нарушений метаболизма гликозаминогликанов с помощью электрофореза // Клиническая лабораторная диагностика, 2005. - № 10. – С.6 - 7.
26.
Песков С.А., Пауль Г.А., Масленников А.Б., Потеряева Е.Л., Бекенева Т.И. Современные возможности клинико-лабораторной диагностики
первичных и вторичных нейродегенеративных процессов // Молекулярнобиологические технологии в медицинской практике / Под ред. А.Б. Масленникова. – Вып. 8. - Новосибирск: Альфа Виста, 2005. – С.167 – 175.
27.
Шорина А.Р., Пауль Г.А., Максимова Ю.В., Песков С.А. Случай
комплексной клинико-биохимической диагностики болезни Гоше // Медицинская генетика, 2005. – Т.4, № 6. – С.291 - 292.
Сокращения:
ГАГ – гликозаминогликаны
ГС – гепарансульфат
ДС - дерматансульфат
МПС - мукополисахаридоз
СД – сахарный диабет
ХС – хондроитнисульфат
Соискатель
Пауль Г.А.
23
Подписано к печати 16 апреля 2007 г.
Тираж 100 экз. Заказ №1746
Отпечатано «Документ-Сервис», 630090,
Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00
24