ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МАТЕРИАЛА ИЗ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ

Проект
Стандартизованная
аналитическая
технология
ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МАТЕРИАЛА
ИЗ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ
1. Цель исследования
Материалом для диагностики поражений лимфатических узлов могут служить:
 препараты, полученные при пункции лимфатических узлов;
 отпечатки с удаленного лимфатического узла (биопсия, операционный
материал);
 соскобы со стенок свища;
 гнойное содержимое, полученное при пункции (бактериоскопическое
исследование и посев).
Исследование
материала,
полученного
при
аспирационной
диагностической пункции, биопсии или операции является одним из
основных методов, который позволяет оценить клеточные элементы при
различных патологических процессах в лимфатических узлах. Данное
исследование необходимо при диагностике реактивных лимфаденопатий
(острого, туберкулезного, вирусного лимфаденита, болезни «кошачьих
царапин», бруцеллеза, токсоплазмоза, саркоидоза, и т.д.), а также для
диагностики
опухолевых
поражений
(лимфогранулематоза,
неходжкинских злокачественных лимфом и лейкозов, метастазов рака в
лимфатические узлы).
Цель внедрения технологии «Цитологическое исследование материала
из лимфатических узлов» определяется необходимостью установления единых
правил: доставки материала в лабораторию, требований к качеству получения
и доставки материала, приготовления, фиксации и окрашивания мазков, а
также оценки результатов исследования.
Согласно ГОСТ Р ИСО15189 [1], стандартизация и соблюдение указанных
1
правил
позволит
получить
адекватную
информацию
о
результатах
исследования пунктата лимфатических узлов для ранней диагностики
различных поражений, оценки эффективности проводимого лечения.
2 Требования к обеспечению выполнения технологии
2.1 Требования к специалистам и вспомогательному персоналу
Перечень специалистов с высшим и средним образованием,
участвующих в выполнении технологии:
- врач клинической лабораторной диагностики;
- специалист со средним медицинским образованием.
Требования к образованию специалистов
Цитологическое исследование мазка пунктата и отпечатка с биоптата
лимфатических
узлов
имеют
право
проводить
врачи
клинической
лабораторной диагностики, прошедшие специализацию и повышение
квалификации
в
установленном
порядке
и
специалиста. Подготовительную работу выполняет
медицинским
образованием,
имеющий
имеющие
сертификат
специалист со средним
соответствующий
сертификат
(медицинского технолога, медицинского лабораторного техника (фельдшералаборанта или лаборанта).
Работа по выполнению указанной методики в лаборатории распределяется
следующим образом:
а) персонал со средним медицинским образованием проводит прием,
регистрацию
полученного
окрашивание
мазков
биологического
пунктата
материала;
лимфатических
узлов,
фиксацию
и
регистрацию
заключения, архивирование препаратов.
б) врачи клинической лабораторной диагностики проводят исследование
материала, полученного при пункции лимфатических узлов, описывают
клеточный состав, устанавливают цитологический диагноз.
Требования к знаниям и умениям специалистов, выполняющих технологию
должны соответствовать образовательным стандартам.
2.2 Требования к обеспечению безопасности труда медицинского
2
персонала
Требования по безопасности труда при выполнении технологии
соответствуют общим правилам безопасности при работе в клиникодиагностической лаборатории согласно ГОСТ Р ИСО 52095[2]. Должны
соблюдаться правила биологической безопасности, правила сбора и удаления
отходов, правила работы с электроприборами и реактивами, пожарной
безопасности.
Требования биологической безопасности
Все
образцы,
содержащие
биологический
материал
(пунктат
лимфатических узлов и мазки), являются источниками инфекции. Для
соблюдения биологической безопасности выполняют следующие правила [3]:
- регистрация и окраска присланного в лабораторию биологического
материала проводится
в
индивидуальных
средствах
защиты
(халаты,
резиновые перчатки);
- после
окончания
работы
проводят
дезинфекцию
расходных
материалов, рабочих мест и помещений лаборатории в резиновых перчатках,
для обеззараживания используются средства, обеспечивающие уничтожение
вирусной и бактериальной флоры, рекомендуемые для дезинфекции [4].
Потенциально
опасные
отходы,
загрязненные
остатками
биологического материала, образующиеся в процессе выполнения
технологии, дезинфицируют, затем собирают в герметическую
одноразовую упаковку и удаляют из лаборатории в контейнерах,
установленных в определенных местах на территории лечебного
учреждения [5].
Правила работы со специальным оборудованием и пожарной
безопасности.
Все сотрудники должны выполнять инструкции и правила техники
безопасности, изложенные в технических паспортах к электрическим
приборам. Все сотрудники лаборатории, работающие с реактивами, должны
быть обучены обращению с ними.
3
2.3.
Материальные ресурсы, необходимые для выполнения
технологии
■
Материальные ресурсы даны в расчете для проведения исследования
препаратов пунктатов лимфатических узлов от одного пациента.
Материальные ресурсы для выполнения цитологического исследования
пунктата лимфатических узлов
Приборы, изделия медицинской техники, оборудование:
1. Микроскоп
бинокулярный
с
иммерсионной
системой
и
встроенным осветителем
2. Аппарат для получения дистиллированной воды
3. Кюветы для фиксации и окраски мазков*
4. Штатив-контейнер для предметных стекол
5. Контейнер переносной для транспортировки
биологического
материала
6. Устройство для фиксации и окрашивания мазков на предметном
стекле (автоматическое)*
7. Таймер лабораторный
8. Рельсы для окрашивания мазков
9. Лотки
Стеклянные изделия:
10. Стекло предметное (с матовым полем для маркировки), размер 23 х 76 х
1,1 мм или 23 х 76 х 1,8 мм
11. Стекло предметное, шлифованный край, размер 21 х 76 х 1.1 мм
12. Стаканы химические низкие 40 мл, 400 мл
13. Стаканы без метки 200 мл
14. Цилиндры мерные высокие 100 мл. 500 мл
15. Пипетки объемом: 0,02мл, 0,4мл, 2 мл, 5 мл, 10 мл (или
автоматические дозаторы с изменяющимся объемом)
Реактивы:
16.Панхромные растворы:
фиксаторы-красители эозин метиленовый
синий по Май-Грюнвальду или Лейшману;
краситель азур-эозин по
Романовскому
17. Азур II
18. Эозин калия или натрия водорастворимый
19. Эфир диэтиловый во флаконах
20. Дигидрофосфат калия
21. Гидрофосфат натрия
22.Этанол 95°**
23. Уксусная кислота 3,5%
4
24. Иммерсионное масло
25. Хлорамин или другое дезинфицирующее средство
Расходуемый материал;
26. Перчатки хирургические, резиновые
27. Вода дистиллированная
Вата хирургическая
*Примечание. В списке приведены взаимозаменяемые варианты приспособлений для фиксации и окраски
мазков
** Примечание. На одно предметное стекло по норме расхода спирта полагается 2 мл этанола
3.
Характеристика
выполнения
цитологического
исследования
материала из лимфатических узлов
Технология исследования пунктата лимфатических узлов включает
следующие последовательные этапы:
- доставка, прием и регистрация полученного материала;
- фиксация и окрашивание мазков;
- микроскопия: исследование морфологии клеток пунктата;
- описание цитограммы;
- при
необходимости
–
иммуноцитохимическое,
цитогенетическое
исследование, гибридизация in situ, проточная цитометрия;
- установление цитологического диагноза;
- регистрация заключений и архивирование препаратов;
- оценка правильности исследования (внутрилабораторный и внешний
контроль
качества
цитологического
исследования
пунктата
лимфатических узлов).
5
3.1. Доставка, прием и регистрация биологического материала
Во время транспортировки не допускается контакт предметного стекла с
нативным материалом и бланка-направления, в соответствии с правилами
биологической безопасности. Высушенные мазки доставляют в лабораторию
в специальных контейнерах.
Сотрудник лаборатории, принимающий материал, должен проверить:
-
правильность
оформления
направления:
в
бланке-
направлении указываются данные обследуемого (ФИО, возраст, №
истории болезни или амбулаторной
карты,
отделение, диагноз, данные
анамнеза, сведения о проводимой терапии);
- маркировку мазков (на них должны быть нанесены код или фамилия
больного, идентичные коду и фамилии в бланке направления материала для
исследования).
Лаборант
должен
зарегистрировать
доставленный
материал
в лабораторном журнале, отметить количество мазков.
3.2 Фиксация и окрашивание материала из лимфатических
узлов
3.2.1
Общие
правила
фиксации
и
окрашивания
мазков
материала из лимфатических узлов:
- все доставленные в лабораторию мазки регистрируют, фиксируют,
окрашивают и исследуют;
- фиксация и окрашивание мазков материала из лимфатического
узла может выполняться
вручную
или
автоматически
с
помощью
специальных устройств, в которые загружаются нефиксированные мазки.
Последующее автоматическое дозирование фиксатора-красителя
и
буферных растворов обеспечивает стандартную и равномерную окраску;
- вручную
фиксация
и
окрашивание
мазков
материала
лимфатических узлов и отпечатков с биоптата проводится
фиксации
и
окрашиванию
из
аналогично
препаратов периферической крови;
- применение любой методики фиксации и окрашивания мазков
требует
точного
соблюдения
последовательности
процедур
при
6
приготовлении растворов и временных промежутков в течение процесса
фиксации и окрашивания.
Фиксация мазков выполняется либо как предварительный этап перед
окрашиванием, либо одновременно с окрашиванием, если по технологии
используются растворы готовых панхромных красителей.
Подготовительная работа для выполнения фиксации и окрашивания
мазков состоит: в приготовлении буферного раствора, основных и рабочих
растворов красителей, подготовке оборудования.
3.2.2
Методика
фиксации
и
окрашивания
мазков
пунктата
лимфатических узлов
Мазки можно окрашивать любым из красителей, используемых в
цитологической диагностике, однако наилучшие результаты получаются при
использовании
различных
модификаций
метода
Романовского
(по
Паппенгейму, Лейшману и др.)
Фиксация мазков
Реактивы:
-
фиксатор-краситель
Мая-Грюнвальда
(модификация
окраски
Романовского по Паппенгейму) или фиксатор-краситель Лейшмана.
П р и м е ч а н и е — Все фиксаторы содержат метанол, что требует соблюдения
соответствующих правил обращения с химическими реагентами, содержащими ядовитые
вещества.
Оборудование:
- кюветы для фиксации и окраски мазков со штативом-контейнером (или
лотки
со
специальными
«рельсами»
для
окраски
мазков)
либо
автоматические приборы для фиксации и окрашивания мазков.
- химические стаканы (низкие) для разведения красителей
Последовательность процедур:
- высушивают мазки на воздухе;
- сухие нефиксированные мазки помещают в штатив-контейнер для окраски
мазков или располагают горизонтально на специальные «рельсы»;
7
- штатив-контейнер опускают в кювету с раствором фиксатора-красителя
на 3-5 минут, или наливают по 3-4 мл фиксатора-красителя на каждый из
препаратов, находящихся на рельсах;
- вынимают контейнер из фиксирующего раствора, или стряхивают
фиксатор краситель со стекол, находящихся на «рельсах» в лоток;
- промывают контейнер с мазками или мазки, находящиеся на «рельсах»,
водопроводной водой;
- стряхивают избыток воды
- при необходимости выполнения молекулярных исследований материал
помещают в жидкую среду и готовят тонкослойные препараты с помощью
цитоцентрифуги и/или проводят иммунофенотипирование с помощью
проточной цитометрии.
Окрашивание мазков.
Оборудование:
- колбы и бутыли для приготовления и хранения основных растворов
красителей
- кювета для окраски мазков со штативом-контейнером (или лотки со
специальными «рельсами» для окраски мазков);
- химические стаканы низкие (для разведения красителей).
Реактивы:
Основной раствор красителя азур II:.
1.
1,0 г азура II растворяют в 1000 мл кипящей воды, охлаждают.
Основной раствор красителя водорастворимого эозина К
2.
или Na:
1,0 г эозина К или 2,0 г эозина Na растворяют в 1000 мл
кипящей воды, охлаждают.
Рабочий раствор азур-эозина готовят ex tempore, способ приготовления
зависит от методики окраски.
Схема
окрашивания
мазков
по
методу
8
Паппенгейма:
- докрашивают азур – эозином: штатив-контейнер опускают в кювету с
раствором азур – эозина на 20 минут, или наливают по 3-4 мл краски на
каждый из препаратов, находящихся на рельсах (рабочий раствор
красителя готовят перед работой (ex tempore): 2 части основного
раствора азура, 1 часть основного раствора водорастворимого эозина и
3 части дистиллированной воды рН 6,8-7,2.)
- вынимают контейнер из краски, или стряхивают краситель со стекол,
находящихся на «рельсах» в лоток;
- промывают контейнер с мазками или мазки находящиеся на «рельсах»
водопроводной водой;
- стряхивают избыток воды;
- окрашенные и промытые мазки высушивают на воздухе.
Схема окрашивания мазков по методу Лейшмана:
- докрашивают азур – эозином: штатив-контейнер опускают в кювету с
раствором азур – эозина на 20-40 минут, или наливают по 3-4 мл краски
на каждый из препаратов, находящихся на рельсах (смесь красителей
готовят перед работой (ex tempore): 40 мл основного раствора азура II,
30
мл
основного
раствора
водорастворимого
эозина,
70
мл
дистиллированной воды);
- вынимают контейнер из краски, или стряхивают краситель со стекол,
находящихся на «рельсах» в лоток;
- промывают контейнер с мазками или мазки находящиеся на «рельсах»
водопроводной водой;
- стряхивают избыток воды;
- окрашенные и промытые мазки высушивают на воздухе.
4. Описание цитограммы пунктата лимфатических узлов
Результатом
цитологического
исследования
материала
из
9
лимфатических узлов является обнаружение и характеристика клеточных
элементов в мазке (лимфоидных элементов разной степени зрелости,
макрофагов, клеток эндотелия синусов, лейкоцитов и/или элементов
злокачественного новообразования)
и формирование цитологического
диагноза:
- обязательно необходимо отметить качество полученного материала
(материал адекватный, неадекватный: элементы лимфатического узла не
обнаружены, клеточный состав скудный, много элементов крови и т.д.);
- по результатам исследования цитограммы необходимо сформировать
заключение, которое в зависимости от качества полученного материала
будет носить описательный, предположительный или окончательный
характер,
по
возможности
в
соответствии
с
действующей
классификацией ВОЗ;
- в трудных для диагностики случаях прибегают к консультации
специалиста-морфолога
профильного
лечебно-профилактического
учреждения.
4.1 Оценка правильности заключения (контроль качества
цитологического исследования пунктата лимфатических узлов)
Контроль
качества
цитологического
исследования
пунктата
лимфатических узлов выполняется путем участия в системе внешней
оценки
качества
заключения,
и
внутрилабораторной
которая
систематически.
В
должна
настоящем
оценки
осуществляться
стандарте
в
правильности
лаборатории
приводятся
несколько
способов контроля качества исследования.
а) Все
пунктаты
лимфатических узлов одновременно
исследуются
двумя врачами, результаты сравниваются, обсуждаются возникшие
расхождения оценки
цитологической
картины.
Такой
подход
уменьшает вероятность ошибок, связанных с субъективными факторами.
б) Принцип оценки правильности исследования состоит в следующем: в
цитологической лаборатории исследуются контрольные мазки (препараты) из
10
лимфатических узлов, приготовленные экспертами ФСВОК. Сравниваются
цитологические заключения сотрудников лаборатории и экспертов. При
ошибочных заключениях обсуждение контрольного мазка проводится за
микроскопом.
В
обсуждении
участвуют
отвечающий
за
качество
исследований сотрудник и врач, проводивший исследование.
При необходимости (сложный диагностический случай) мазки из
пунктата
лимфатических
узлов
консультируют
у
специалиста-
морфолога профильного лечебно-профилактического учреждения. В
обсуждении принимает участие заведующий лабораторией и все
сотрудники.
в)
Катамнестический
контроль
правильности
проводят
путем
сопоставления заключения цитологической лаборатории с диагнозами,
установленными пациентам при дальнейшем клиническом обследовании:
1) при гистологическом исследовании лимфатических узлов;
2) при анализе историй болезни за несколько лет - для выявления
расхождений окончательного клинического диагноза и цитологического
заключения.
4.2 Регистрация заключений и архивирование препаратов
Заключения регистрируют на бумажных и электронных носителях,
которые хранят в лаборатории в течение 20 лет. Бланки с результатами
цитологического исследования вклеивают в историю болезни, при
использовании информационно-вычислительных систем (компьютерной
техники) заключения вводят в «электронную» историю болезни.
Окрашенные мазки лимфатического узла архивируют и хранят вместе
с журналами регистрации в течение 20 лет. Выдают препараты из
архива только по письменному запросу лечащего врача или другого
ответственного сотрудника лечебно-профилактического учреждения.
5.
Особенности
пациента
для
добровольного
взятии
пунктата
информированного
лимфатического
согласия
узла
и
дополнительная информация для пациента и членов его семьи
11
Согласие пациента на проведение взятия и исследование
пунктата лимфатического узла (пример)
Я ........................................................................................................
подписывая данный документ, даю согласие на проведение мне пункции
лимфатического узла и прошу персонал.. …………о ее проведении:
- я информирован о методике проведения пункции лимфатического
узла, ее цели и ожидаемых результатах ее проведения;
- я информирован, что точно предсказать результат данной процедуры
невозможно;
-я
понимаю,
что
во
время
процедуры
могут
возникнуть
непредвиденные обстоятельства и осложнения, в таком случае ход
процедуры может быть изменен врачом по его усмотрению;
-я знаю, что обязан поставить врача в известность обо всех проблемах
со
здоровьем
и
аллергических
проявлениях
или
индивидуальной
непереносимости лекарств;
-я ознакомлен со всеми пунктами настоящего документа, о чем
свидетельствует моя подпись ниже:
Подпись......................................
Дата .......................................
6. Трудозатраты на выполнение цитологического исследования
пунктата лимфатических узлов
Таблица 1 - Трудозатраты на выполнение простой медицинской услуги
«Цитологическое исследование пунктата лимфатических узлов» приведены в
соответствии с расчетными нормами времени, утвержденными приказом
Минздрава РФ от 25.12.97 N 380.
Код
Вид
08.06.001 Прием,
Трудозатраты
Трудозатраты
(мин.)
(мин.)
Специалиста со Врача
средним
клинической
образованием
лабораторной
диагностики
регистрация, 20
12
фиксация и окрашивание
мазков
пунктата
лимфатических
узлов,
регистрация
заключения
архивирование препаратов
Описание
состава
препаратов,
35*
клеточного
цитологических
установление
цитологического диагноза
* исследование врачом каждого последующего препарата одного больного –
10 мин.
Библиография:
1. ГОСТ Р ИСО 15189 — 2006 Лаборатории медицинские. Частные
требования к качеству и компетентности
2. ГОСТ Р ИСО 52095 — 2007 (ИСО 15190:2003) Лаборатории
медицинские. Требования безопасности
3. "Правила
устройства, техники
безопасности и
производственной
санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в
лабораториях
(отделениях,
отделах)
санитарно-эпидемиологических
учреждений системы Министерства здравоохранения СССР", 1981 г.
4. Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке
и стерилизации изделий медицинского назначения, МЗ РФ №МУ-287-113 от
30.12.1998 г.;
5. Санитарные правила и нормы. 2.1.7.728-99. «Правила сбора,
хранения и удаления отходов в лечебно-профилактических учреждениях».
Литературные источники, использованные при подготовке документа:
1. Абрамов М.Г. Клиническая цитлогия. М. Медицина, 1974г.
2. Вылков И.Н. Патология лимфатических узлов. София, 1980г.
3. Карр Я., Хэнкок Б., Хенри Л., Уорд А. Лимфоретикулярные болезни М.,
Медицина, 1993г.
4. Морозова В.Т., Луговская С.А. Лимфатические узлы. Цитологическая
диагностика. Москва, 2008, 78 стр.
13
5. Николаева Г.М. Цитология туберкулеза и других грануломатозов
легких. Москва 2004г.
Проект стандартизованной технологии подготовили: Шабалова И.П.,
Морозова В.Т., Джангирова Т.В. (РМАПО).
14