На правах рукописи ФИЛИППОВА ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНА

На правах рукописи
ФИЛИППОВА ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНА
РОЛЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ИНВАЗИВНОСТИ И АПОПТОЗА ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРИ
НАРУЖНОМ ГЕНИТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ
14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2011
2
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства
имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения и социального
развития Российской Федерации
Научный руководитель:
доктор медицинских наук,
профессор
Сотникова Наталья Юрьевна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор
Козлов Иван Генрихович
доктор медицинских наук,
профессор
Гариб Фируз Юсуфович
Ведущая организация:
Федеральное государственное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства
здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится «17» октября 2011 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу:
117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1
Автореферат разослан «23» июня 2011 года
Ученый секретарь диссертационного Совета,
кандидат медицинских наук, доцент
Кузнецова Т. Е.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Наружный генитальный эндометриоз, одно из
наиболее распространенных гинекологических заболеваний, характеризуется
ростом эндометриальной ткани вне полости матки, преимущественно в перитонеальной полости, и является причиной развития у пациенток болевого
синдрома и бесплодия (Vinatier D., e.a, 2000; Nap A.., e.a., 2004; Rodgers P.A.,
е.а., 2009). Гипотеза о важной роли иммунных нарушений в развитии эндометриоидных гетеротопий получила в последние годы широкое распространение (Сотникова Н.Ю. с соавт., 2005; Анциферова Ю.С. с соавт., 2007;
Iwabe T., e.a., 2000; Lebovic D.I., e.a., 2001; Berkkanoglu M., Arici A., 2003;
Ulukus M, Arici A., 2005; Kyama C.M., e.a., 2009; Velasco I., e.a., 2010).
Развитие и рост эндометриоидных очагов происходит в перитонеальной полости. Известно, что в перитонеальной жидкости содержится большое
количество клеток иммунной системы, преимущественно макрофагов, и разнообразных биологически активных веществ, участвующих в регуляции процессов клеточного роста и пролиферации
(Vinatier D., e.a., 2001; Yang
W.C.V., e.a., 2004; Nap A.., e.a., 2004). У женщин с эндометриозом в перитонеальной жидкости повышена концентрация макрофагов, усилена их активация и продукция ими целого ряда цитокинов и факторов роста (Halme J.,
e.a., 1987; Gazvani R., Templeton A., 2002; Sidell N., e.a., 2002; Kyama C.M.,
e.a., 2003; Yang W.C.V., e.a., 2004). Однако до сих пор остается не решенным
вопрос о том, почему, несмотря на высокий уровень активации, перитонеальные макрофаги пациенток с эндометриозом не элиминируют из перитонеальной полости гетеротопический эндометрий. В основе этого явления могут
лежать нарушения экспрессии макрофагами функциональных рецепторов, а
также изменения продукции цитокинов, хотя прямых доказательств этой гипотезы до сих пор не получено.
Эндометриальные клетки у пациенток с эндометриозом обладают повышенной жизнеспособностью, пролиферацией и инвазивностью (Сотникова
Н.Ю. с соавт., 2007; Vinatier D., e.a., 2000; Brenner R.M., e.a., 2002). Особую
4
роль в обеспечении инвазивности эндометриальных клеток при эндометриозе
отводят повышенной продукции протеолитических ферментов из семейства
матриксных металлопротеиназ (MMPs) в ткани эндометриоидного очага
(Ueda M., e.a., 2002; Alviggi C., e.a., 2004; Chen Q.H., e.a., 2004; Li Y., Lang
J.H., 2006; Collette T., e.a., 2006). Однако до сих пор не установлены факторы,
которые могут влиять на усиление синтеза ММРs при эндометриозе. Считают, что выживанию эндометрия в перитонеальной полости способствует
угнетение апоптоза эндометриальных клеток (Dmowski W.P., e.a., 2004;
Nishida M., e.a., 2004; Harada Н., е.а., 2004, 2007; Taniguchi F., e.a., 2011). По
данным литературы, фагоциты играют важную роль в индукции апоптоза
(Mor G., Abrahams V.M., 2003). Однако участие перитонеальных макрофагов
в регуляции апоптоза клеток эндометрия при эндометриозе мало изучено.
Таким образом, выявление участия перитонеальных макрофагов и гуморальных факторов перитонеальной жидкости в обеспечении повышенной
жизнеспособности и инвазивности ткани эндометриоидных очагов является
актуальной задачей клинической иммунологии, так как позволит уточнить
иммунные аспекты формирования и роста гетеротопий.
Цель исследования: установить механизмы участия перитонеальных
факторов в регуляции апоптоза и инвазивности эндометриальных клеток при
наружном генитальном эндометриозе для выяснения новых патогенетических аспектов эндометриоза
Задачи исследования:
1. Установить особенности функционального состояния перитонеальных
макрофагов и содержания кальпротектина, IL-8, и MCP-1 в перитонеальной
жидкости женщин с наружным генитальным эндометриозом.
2. Определить особенности экспрессии факторов, регулирующих апоптоз и
инвазию (MT-1, XIAP, каспаза-3, ММР-2, ММР-9, TIMP-1, TIMP-2), в эутопическом и эктопическом эндометрии женщин с наружным эндометриозом.
3. В эксперименте in vitro оценить влияние перитонеальных факторов на
апоптоз стромальных клеток и на экспрессию факторов,
регулирующих
5
апоптоз (MT-1, XIAP, каспаза-3), в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом и здоровых женщин.
4. В эксперименте in vitro оценить влияние перитонеальных факторов на экспрессию генов, регулирующих инвазивность (ММР-2, ММР-9, TIMP-1,
TIMP-2), в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом.
5. Выявить влияние секреторных продуктов перитонеальных макрофагов и
перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом на инвазию эндометриальных клеток в матригеле.
Научная новизна исследования
Установлены новые иммунные механизмы, участвующие в развитии и
росте эктопического эндометрия в перитонеальной полости пациенток с
наружным генитальным эндометриозом.
Показано, что развитие и рост очагов эндометриоза в перитонеальной
полости происходят на фоне угнетения экспрессии перитонеальными макрофагами молекул, участвующих в межклеточном взаимодействии, презентации антигена и запуске апоптоза.
Выявлено, что распространенные формы наружного генитального эндометриоза ассоциируются с усилением внутриклеточной продукции провоспалительных цитокинов макрофагами, и повышением содержания в перитонеальной жидкости хемокинов и кальпротектина.
Показано, что развитие эндометриоза связано с нарушением регуляции
апоптоза в ткани эндометрия, проявляющимся в повышении синтеза антиапоптотическиого фактора XIAP в эутопическом эндометрии, усилении экспрессии мРНК каспазы-3 в ткани эндометриодного очага и резком снижении
уровня экспрессии мРНК МТ-1 как в эутопическом, так и в эктопическом эндометрии пациенток с эндометриозом.
Впервые установлено, что у здоровых фертильных женщин макрофаги
и растворимые факторы
перитонеальной жидкости in vitro
усиливают
апоптоз эндометриальных стромальных клеток, тогда как у пациенток с эндометриозом перитонеальная жидкость снижает апоптоз эндометриальных
6
стромальных клеток, а перитонеальные макрофаги угнетают экспрессию
мРНК регулирующих апоптоз факторов (MT-1, XIAP и каспазы-3) в ткани
эутопического эндометрия.
Выявлено усиление инвазивных свойств эндометриальных клеток при
эндометриозе за счет изменения баланса в системе ММРs/TIMPs в сторону
преобладания активности протеолитических ферментов.
Впервые показано, что факторы перитонеальной жидкости пациенток с
эндометриозом усиливают инвазивные свойства клеток эутопического эндометрия, при этом перитонеальная жидкость повышает синтез в ткани эндометрия протеолитического фермента ММР-2, а макрофаги – угнетают экспрессию мРНК антипротеолитических факторов TIMP-1 и TIMP-2.
Впервые выявлено, что у пациенток с наружным генитальным эндометриозом аутологичная перитонеальная жидкость и продуцируемые макрофагами растворимые факторы усиливают инвазию в матригеле клеток
эутопического эндометрия.
Практическая значимость результатов исследования
Выявлены новые патогенетические механизмы развития наружного генитального эндометриоза, заключающиеся в уточнении роли перитонеальных факторов в регуляции инвазивности и апоптоза эндометриальных клеток.
Предложены новые дополнительные диагностические критерии степени тяжести наружного генитального эндометриоза, основанные на определении относительного содержания в перитонеальной жидкости уровня IL-8+
перитонеальных макрофагов.
Предложены новые дополнительные диагностические критерии наружного генитального эндометриоза, основанные на определении уровня экспрессии в эндометрии мРНК XIAP.
Положения, выносимые на защиту
7
Высокий уровень синтеза XIAP в эутопическом эндометрии при
наружном генитальном эндометриозе обеспечивает повышение жизнеспособности эндометриальных клеток при их попадании в перитонеальную полость, тогда как усиление протеолитической активности ММР-2 и ММР-9 на
фоне высокого уровня синтеза каспазы-3 способствует росту эндометриоидного очага.
Снижение экспрессии функциональных молекул перитонеальными
макрофагами и усиление продукции провоспалительных цитокинов приводит
к нарушению локального иммунного ответа и изменению микроокружения в
перитонеальной полости, вызывая угнетение апоптоза клеток эутопического
эндометрия и усиление их инвазивных свойств, что обеспечивает рост гетеротопий.
Апробация работы
Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на: 12th International Symposium for Immunology of Reproduction (Varna, Bulgaria, 2009), XIII Всероссийском научном форуме с
международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (СанктПетербург, 2009); 90-й Юбилейной итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 80-летию академии «Неделя науки - 2010» (Иваново, 2010); VIII конференции иммунологов Урала
(Сыктывкар, 2010), 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» с элементами научной школы для молодежи (Пермь, 2010).
Внедрение результатов работы в практику
Результаты диссертационной работы внедрены в практику гинекологической клиники Федерального государственного учреждения «Ивановский
научно-исследовательский
институт
материнства
и
детства
имени
В.Н.Городкова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и используются в учебном процессе на кафедре патофизиологии и иммунологии ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицин-
8
ская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному
развитию.
Личное участие автора
Автором самостоятельно проводилось выполнение иммунологических
исследований. Была проведена систематизация, статистическая обработка,
анализ и описание полученных результатов.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 8 – в
журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и практические рекомендации.
Библиографический указатель включает 197 источников, в том числе 24 отечественных и 173 иностранных источников. Работа иллюстрирована таблицами и рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на базе ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н.Городкова» Минздравсоцразвития России, директор д.м.н.
А.И.Малышкина. Исследования проводились в гинекологической клинике,
эндоскопическом отделении - зав. к.м.н. В.Н. Романов, лаборатории клинической иммунологии - зав. д.м.н. профессор Н.Ю. Сотникова, лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии - зав. д.м.н. профессор Л.П. Перетятко.
Всего было обследовано 126 женщин, поступивших в гинекологическую
клинику ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н.Городкова»
Минздравсоцразвития России, объединенных в
следующие клинические
9
группы: 35 практически здоровых женщин фертильного возраста с реализованной
репродуктивной функцией (контрольная группа) и 91 женщина с
наружным генитальным эндометриозом, из которых у 62 женщин (68%) был
диагностирован эндометриоз I-II степени, а у 29 пациенток (32%) – эндометриоз III - IV степени.
Материалом для исследования служили: перитонеальная жидкость, биоптаты эндометрия из полости матки и ткань эндометриоидных очагов.
Иммунологические методы исследования:
- выделение популяции мононуклеарных клеток (МНК) перитонеальной
жидкости стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте
плотности фиколл-верографина (d=1,078) (Boyum A., 1968);
- выделение обогащенной популяции стромальных клеток из ткани эутопического и эктопического эндометрия женщин стандартным ферментативным
методом (Clover L.M., et. al., 2000);
- определение особенностей экспрессии функциональных молекул на поверхности макрофагов перитонеальной жидкости с помощью моноклональных антител (мАТ) методом проточной цитофлюориметрии на приборе
FACScan (Becton Dickinson, USA). Характеристика используемых мАТ представлена в Таблице 1. Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили
стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика.
Для оценки внутриклеточной продукции цитокинов проводили процедуру
пермеабилизации клеточной мембраны с использованием коммерческого набора
FIX & PERM cell permeabilization reagents (Invinrogen, Camarillo, CA, USA).
Для определения количества клеток, вступивших в апоптоз, использовали
коммерческий набор с Annexin V (CALTAG Laboratories, USA). Анализ результатов проводили в программе "CellQuest Pro" (Becton Dickonson, USA).
10
Таблица 1.
Панель мАТ, использованных в исследовании
№ мАТ
Клон
Фирма-производитель
п/п
1
CD11b
ООО «Сорбент», Москва
2
CD49e
IIA1
BD Boisceinces, USA
3
CD95
DX2
Caltag Laboratories, USA
4
CD 95L
Alf-2.1
InvitrogenTM, USA
5
CD 86
HA5.2B7
Beckman Coulte, Francer
6
HLA-DR
ООО «Сорбент», Москва
7
IL-1β
CRM56
eBioscience, USA
8
IL-8
R&D Systems, USA
9
TNFα
IPM2 (188) Beckman Coulter, France
10 IL-6
7IL6
BioErgonomics, France
11 IL-12
C8.6
InvitrogenTM, USA
12 CD45
HI30
Caltag Laboratories, USA
13 CD14
TuK4
Caltag Laboratories, USA
14 Vimentin
Vim 3B4
Mouse IgG2a
15
16
17
Recombinant
human
AnnexinV
Мышиные
IgG1
Мышиные
IgG2a
-
InvitrogenTM, USA
Флюорохромная
метка
FITC
PE
PE
PE
PE
PE
FITC
FITC
PE
PE
FITC
FITC
PE
DakoCytomation,
Denmark
FITC
-
BD Boisceinces, USA
FIFC
-
BD Boisceinces, USA
PE
- оценка содержания в перитонеальной
жидкости кальпротектина
(S100A8/A9), МСР-1 и IL-8 методом твердофазного иммуноферментного
анализа (ИФА) с использованием коммерческих тест-систем на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems, Finland). Характеристика тестсистем представлена в Таблице 2.
11
Таблица 2.
Характеристика тест-систем для определения цитокинов, использованных
при проведении исследования.
№
Цитокин
Фирма-производитель
Предел чувствип/п
тельности
Тест-системы
1.
Кальпротектин, Buhlmann Laboratories AG, Swit- 0,4 мкг/мл
S100A8/S100A9 zerland
2.
МСР-1
Bender MedSystems, Austria
2,3 пг/мл
3.
IL-8
Bender MedSystems, Austria
2,0 пг/мл
- количественное определение экспрессии мРНК в эутопическом и эктопическом эндометрия методом полимеразной цепной реакции (RT-PCR) в реальном времени на амплификаторе с оптической насадкой iCycler iQ (BIORAD, USA). В работе использовались следующие наборы праймеров и зондов: ОНКОСКРИН 12-Q для определения интенсивности экспрессии гена 2-микроглобулина человека (ген домашнего хозяйства), ИММУНОСКРИН 8Q для выявления интенсивности экспрессии гена человека ММР-2, ИММУНОСКРИН 10-Q для выявления интенсивности экспрессии гена человека
TIMP-2, ИММУНОСКРИН 13-Q для выявления интенсивной экспрессии гена человека XIAP, ИММУНОСКРИН 16-Q для выявления интенсивности
экспрессии гена человека МТ-1 (OOO «Генотехнология», Гематологический
научный центр РАМН, лаборатория генной инженерии, Москва, Россия);
наборы для количественного определения кДНК генов ММР-9, TIMP-1 и
каспазы-3 (CASP-3) (ООО «Фрактал Био», г.Санкт-Петербург, Россия);
- культивирование in vitro эксплантов эутопического эндометрия женщин основных клинических групп наблюдения с обогащенной популяцией аутологичных перитонеальных макрофагов, или в присутствии аутологичной перитонеальной жидкости при 37 0С и 5% СО2 в течение 24 часов, с последующим определением уровня экспрессии мРНК генов, регулирующих апоптоз и
инвазию в эндометриальных биоптатах;
- получение супернатантов 24- часовых культур перитонеальных макрофагов;
12
- оценка влияния перитонеальной жидкости и супернатантов 24-часовых культур
перитонеальных макрофагов женщин с наружным генитальным эндометриозом на
инвазию стромальных клеток эутопического эндометрия пациенток с эндометриозом в матригеле с использованием коммерческого набора BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber (BD Biosciences, USA)
Общее количество проведенных исследований составило 1540.
Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего
арифметического и ошибки среднего арифметического с использованием
программы Microsoft Excel из комплекта Microsoft Office 2003. Достоверность различий показателей в группах определялась по t-критерию Стьюдента.
Результаты работы и их обсуждение
Проведенные нами исследования выявили ряд особенностей синтеза
факторов, регулирующих апоптоз, в эутопическом и эктопическом эндометрии женщин с эндометриозом. Было установлено, что в эутопическом эндометрии при эндометриозе достоверно повышался синтез фактора XIAP (Хсцепленного ингибитора апоптоза) по сравнению с аналогичным показателем
в эндометрия здоровых женщин и в эктопическом эндометрии женщин с эндометриозом (22,51±9,62x103 копий пар/мкл – эутопический эндометрий
женщин с эндометриозом; 0,38±0,18 x103 копий пар/мкл – контрольная группа; 2,90±1,59x103 копий пар/мкл - эктопический эндометрий, p<0,05 в обоих
случаях). Отличительной характеристикой эктопического эндометрия являлся повышенный уровень экспрессии мРНК каспазы-3 (3,80±1,25x103 копий
пар/мкл - эктопический эндометрий женщин с эндометриозом; 0,72±0,33x103
копий пар/мкл - эндометрий здоровых женщин, p<0,05; 0,38±0,09103 - эутопический эндометрий женщин с эндометриозом, p<0,05, p<0,01 соответственно), Как в эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом, так и
в ткани эндометриоидного очага отмечалось снижение уровня экспрессии
мРНК
МТ-1
по
(361,89±124,74x103
сравнению
копий
с
пар/мкл-
таковым
в
эндометрий
контрольной
здоровых
группе
женщин;
13
46,56±23,76x103 копий пар/мкл - эутопический эндометрий женщин с эндометриозом; 42,364±17,42x103 копий пар/мкл - эктопический эндометрий
женщин с эндометриозом, p<0,05 в обоих случаях).
Известно, что МТ-1 регулирует процессы клеточной пролиферации и
роста и антиоксидантную защиту клеток (Theocharis S.E., 2004; Wichereck L.,
e.a., 2005). Низкий уровень синтеза МТ-1 может приводить к нарушению
процессов, контролирующих развитие апоптоза, в эутопическом, и эктопическом эндометрии при эндометриозе.
Выявленное нами повышение синтеза анти-апоптотического фактора
XIAP в эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом может обуславливать повышенную устойчивость к апоптозу эндометриальных клеток
при данном заболевании, что, по-видимому, облегчает их выживание при попадании в перитонеальную полость в результате менструального рефлюкса и
может способствовать формированию эндометриоидных очагов. Однако в
самом эндометриоидном очаге отсутствие значительных изменений синтеза
XIAP и повышенная экспрессия мРНК каспазы-3 свидетельствует о преобладании активности проапоптотических факторов, что, вероятно, определяет
доброкачественный характер роста эктопического эндометрия.
Важную роль в обеспечении процессов инвазии эндометриальных клеток в перитонеальной полости отводят тканевому протеолизу, осуществляемому ферментами из семейства матриксных металлопротеиназ (ММР) и их
тканевых ингибиторов (TIMP) (Lu X.E., e.a.,2006; Braunmeier A.G., e.a., 2006;
Hinsbergh V.W.M., 2006). Нами было выявлено, что в эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом был усилен по сравнению с показателями
эндометрия здоровых женщин синтез ММР-2 (0,89±0,27x103 копий пар/мкл –
контрольная группа, 2,40±0,63x103 копий пар/мкл – эндометриоз, p<0,05) и ее
специфического ингибитора TIMP-2 (4,09±0,74x103 копий пар/мкл – контрольная группа; 13,53±3,94x103 копий пар/мкл – эндометриоз, p<0,05), а
также ингибитора ММР-9 - TIMP-1 (2,72±1,33x105 копий пар/мкл – контроль,
24,44±9,02x105 копий пар/мкл - эндометриоз соответственно, p<0,05). При
14
этом синтез ингибиторов ММРs в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом существенно превышал уровень синтеза самих матриксных металлопротеиназ.
В очаге эндометриоза по нашим данным был значительно повышен по
сравнению с показателями эндометрия здоровых женщин уровень экспрессии
мРНК ММР-2 (0,89±0,27x103 копий пар/мкл – контрольная группа, 5,89±2,29
x103 копий пар/мкл – очаг эндометриоза, p<0,05); ММР-9 (0,27±0,16 x105 копий пар/мкл – контрольная группа, 13,78±5,04x105 копий пар/мкл - очаг эндометриоза, p<0,05) и TIMP-1 (2,72±1,33x105 копий пар/мкл – контрольная
группа, 87,73±31,19x105 копий пар/мкл очаг эндометриоза, p<0,05). Баланс
активности ферментов с про- и антипротеолитической активностью в эндометриоидном очаге изменялся по сравнению с эутопическом эндометрием
женщин с эндометриозом и характеризовался практически одинаковым
уровнем экспрессии мРНК как ММР-2, так и ее специфического ингибитора
TIMP-2.
Таким образом, формирование и рост эктопического эндометрия сопровождаются значительными изменениями в регуляции апоптоза и инвазии.
С другой стороны, особенности перитонеального микроокружения, в которое
попадают клетки эндометрия, также значительно меняются при наружном
генитальном эндометриозе.
По нашим данным, в перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом было значительно снижено относительное содержание макрофагов, экспрессирующих на своей поверхности CD11b (85,141,57% - контроль,
71,972,30% - эндометриоз, p<0,001), CD49e (87,912,19% - контроль,
80,162,34% - эндометриоз, p<0,05), HLA-DR (87,352,28% - контроль,
78,352,43% - эндометриоз, p<0,05) и CD95L молекулы (60,622,42% - контроль 46,372,65% - эндометриоз, p<0,001) по сравнению с группой контроля. При дифференцированном анализе данных, характеризующих экспрессию функциональных рецепторов перитонеальными макрофагами жен-
15
щин с наружным генитальным эндометриозом, в зависимости от степени
распространенности эндометриоидного процесса, было установлено, что выявленные нарушения отмечались как при 1-2 стадии эндометриоза (CD11b+ 71,582,91%, p<0,001; HLA-DR+ - 80,592,37, p<0,05; CD95L+ - 45,623,42%,
p<0,001), так и при 3-4 стадии заболевания (CD11b+ - 73,103,19%, p<0,01;
HLA-DR+ - 71,976,23%, p<0,05; CD95L+ - 48,503,41%, p<0,01). Таким образом, вне зависимости от стадии эндометриоза при данной патологии снижено количество перитонеальных макрофагов, экспрессирующих рецепторы, участвующие в регуляции процессов межклеточного взаимодействия,
презентации антигена и в индукции апоптоза.
Одновременно у женщин с наружным генитальным эндометриозом
нами отмечалось значительное нарушение внутриклеточной продукции провоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами. Было установлено, что при эндометриозе в перитонеальной жидкости достоверно повышалось по сравнению с показателями контрольной группы содержание макрофагов, продуцирующих внутриклеточно IL-1β (64,513,40% - контрольная
группа, 74,692,90% - эндометриоз, p<0,05), TNF (63,113,37% - контрольная группа, 74,771,95% - эндометриоз, p<0,01) и IL-8 (67,102,96% - контрольная группа, 75,132,03% - эндометриоз, p<0,05). При этом продукция
IL-1β, IL-6 и IL-8 коррелировала со стадией патологического процесса и максимально усиливалась при 3-4 стадии эндометриоза (IL-1β+ - 80,533,46%,
p<0,001; IL-6+ -66,252,70%, p<0,05 и IL-8+ - 78,171,70%, p<0,01).
Внутриклеточная продукция перитонеальными макрофагами женщин с
эндометриозом другого провоспалительного цитокина - TNFα, по нашим
данным, была повышена как при 1-2, так и при 3-4 стадии заболевания. Наши
результаты хорошо согласуются с имеющимися литературными данными о
высоком содержании этого цитокина в перитонеальной жидкости пациенток
с эндометриозом (Harada T. 2001, Berkkanoglu M. Arici A., 2003; Grund E.M.,
2008). Многие исследователи считают, что TNFα играет ключевую роль в
16
механизмах патогенеза эндометриоза, вызывая развитие воспалительных реакций в перитонеальной полости и оказывая непосредственное влияние на
рост эндометриоидных гетеротопий (Grund E.M., 2008). Выявленный нами
факт усиленной внутриклеточной продукции TNFα перитонеальными макрофагами женщин с эндометриозом вне зависимости от степени распространенности патологического процесса свидетельствует о важной роли этого
цитокина в механизмах формирования эндометриоидного очага.
В нашей работе мы также оценили содержание в перитонеальной
жидкости некоторых цитокинов, влияющих на апоптоз и инвазию. Нами было установлено, что у женщин с наружным генитальным эндометриозом в
перитонеальной
жидкости
повышена
концентрация
кальпротектина
(0,440,17 мкг/мл – контрольная группа, 1,280,38 мкг/мл – эндометриоз,
p<0,05), MCP-1 (308,1229,87 пг/мл – контрольная группа,
528,4051,45
пг/мл – эндометриоз, p<0,01) и IL-8 (6,193,41 пг/мл – контрольная группа,
19,095,00 пг/мл – эндометриоз, p<0,05). Дифференцированный анализ данных в зависимости от стадии эндометриоза показал, что повышение уровня
цитокинов в перитонеальной жидкости также зависело от степени распространенности патологического процесса. Максимальные значения концентрации цитокинов отмечались преимущественно у женщин с 3-4 стадией заболевания (кальпротектин - 1,860,65 мкг/мл, p<0,05; MCP-1 - 689,1874,79
пг/мл, p<0,001; IL-8 - 27,739,12 пг/мл, p<0,05).
Многочисленными исследованиями было показано, что провоспалительные цитокины непосредственно усиливают процессы пролиферации и
роста клеток (Bedaiwy M.A., 2007; Mier-Cabrera J., 2011, Herrmann Lavoie C.,
2007, Gazvani R., Templeton A., 2002). Поэтому выявленные нами изменения
в локальной продукции цитокинов могут создавать условия, благоприятные
для эктопического роста эндометриальной ткани.
Для проверки этого предположения нами была проведена серия экспериментов in vitro, в которых мы оценили влияние макрофагов и цитокинов
17
перитонеальной жидкости на апоптоз и инвазивный потенциал клеток эутопического эндометрия при эндометриозе. Мы культивировали экспланты
эутопического эндометрия в присутствии обогащенной популяции аутологичных перитонеальных макрофагов, либо в присутствии аутологичной перитонеальной жидкости в течение 24 часов. После окончания срока культивирования из эксплантов эндометрия выделяли эндометриальные стромальные клетки и оценивали уровень их апоптоза в аннексиновом тесте. Кроме
того, в ткани эндометрия определяли характер экспрессии мРНК генов, регулирующих апоптоз и инвазию. Контролем служили показатели эндометрия,
культивировавшегося только в присутствии среды RPMI 1640.
Нами было установлено, что у здоровых женщин воздействие макрофагов и перитонеальной жидкости на экспланты эутопического эндометрия
приводило к увеличению количества апоптирующих эндометриальных стромальных клеток, находящихся на поздних/необратимых стадиях апоптоза и
имеющих фенотип Annexin V+Pi+ (37,74±4,12% - контроль, 53,23±4,25% при инкубации с макрофагами, 54,35±2,25% - при воздействии перитонеальной жидкости, p<0,05, p<0,01, соответственно). Кроме того, в данной группе
перитонеальные макрофаги усиливали синтез каспазы-3 в ткани эндометрия
(15,69±5,91х103 копий пар/мкл - контроль; 39,51±9,64х103 копий пар/мкл при воздействии макрофагов, p<0,05).
Известно, что у здоровых женщин рефлюксный эндометрий элиминируется из перитонеальной полости за счет индукции апоптоза (Dmowski
P.W., e.a., 1998, Harada T., e.a. 2004, Taniguchi F., е.а., 2011). Полученные
нами данные подтверждают это мнение и свидетельствуют о важной роли
макрофагов и растворимых факторов перитонеальной жидкости в этом процессе.
В то же время и макрофаги, и перитонеальная жидкость здоровых
женщин усиливали экспрессию в эндометрии мРНК МТ-1 (21,51±2,59х103
копий пар/мкл – контроль, 54,19±13,90 х103 копий пар/мкл – при воздействии
макрофагов, 68,79±21,68х103 копий пар/мкл – при воздействии перитонеаль-
18
ной жидкости, p<0,05 в обоих случаях). Как известно, металлотионеины обладают ярко выраженными антиоксидантными свойствами и способны к
нейтрализации целого ряда свободных радикалов (Inoue K.-I., е.а., 2009)
.Учитывая то, что при индукции апоптоза формируется противовоспалительное микроокружение, усиление синтеза факторов, таких как МТ-1, подавляющих развитие воспалительных реакций, в апоптирующих клетках представляется вполне логичным.
Таким образом, выявленное нами in vitro усиление апоптоза в ткани
эндометрия после инкубации с аутологичной перитонеальной жидкостью
или макрофагами, по всей видимости, является физиологичным и отражает
необходимую реакцию перитонеального микроокружения на эктопически
перемещенный эндометрий.
При эндометриозе направленность воздействия перитонеальных макрофагов и перитонеальной жидкости на апоптоз клеток эутопического эндометрия была другой. После инкубации эндометрия с аутологичной перитонеальной жидкостью мы отмечали снижение апоптоза эндометриальных стромальных клеток преимущественно за счет клеток, находящихся на ранних/обратимых этапах апоптоза и имеющих фенотип Annexin V+Pi(24,59±1,88% - контроль, 17,38±2,46% - при воздействии перитонеальной
жидкости, p<0,05). Кроме того, при эндометриозе инкубация эндометрия с
аутологичными перитонеальными макрофагами приводила к резкому снижению экспрессии мРНК XIAP (18,52±8,20х103 копий пар/мкл -
контроль,
13,02±4,03х103 копий пар/мкл - при воздействии перитонеальной жидкости,
p<0,01), каспазы-3 (18,52±8,20х103 копий пар/мкл - контроль, 0,42±0,22х103
копий пар/мкл - при воздействии перитонеальной жидкости, p<0,05) и MT-1
(43,95±7,88х103 копий пар/мкл - контроль, 13,02±4,03 х103 копий пар/мкл при воздействии перитонеальной жидкости, p<0,001). Складывается впечатление, что выявленная нами низкая экспрессия функциональных рецепторов
и особенно CD95L-молекул, по всей видимости, приводит к угнетению
апоптоз-индуцирующей функции макрофагов, что, в свою очередь может
19
обуславливать нарушение своевременной элиминации жизнеспособных эндометриальных клеток при их попадании в брюшную полость.
Факторы перитонеальной жидкости также оказывали непосредственное
влияние и на инвазивный потенциал эутопического эндометрия при эндометриозе. Нами было установлено, что аутологичные перитонеальные макрофаги при воздействии на эутопический эндометрий пациенток с эндометриозом снижали синтез в ткани TIMP-2 (10,36±2,60х103 копий пар/мкл - контроль, 1,76±0,64х103 копий пар/мкл - при воздействии макрофагов, p<0,05) и
TIMP-1 (10,12±3,91х103 копий пар/мкл -
контроль, 0,52±0,25х103 копий
пар/мкл - при воздействии макрофагов, p<0,05), а перитонеальная жидкость
резко
усиливала
экспрессию
в
ткани
эндометрия
мРНК
ММР-2
(4,83±2,40х103 копий пар/мкл –контроль, 20,44±6,19х103 копий пар/мкл- при
воздействии перитонеальной жидкости, p<0,05).
Можно предположить, что основным фактором, определяющим инвазивные свойства клеток эндометрия при наружном эндометриозе, является
измененный цитокиновый профиль перитонеальной жидкости, в частности
за счет высокой продукции провоспалительных цитокинов макрофагами.
Так, есть данные, что TNFα может вызывать снижение экспрессии TIMPs
(Collette T., Maheux R., 2006). По-видимому, участие перитонеальных макрофагов в усилении инвазивных свойств эндометриальных клеток при эндометриозе проявляется в угнетающем действии макрофагов на синтез
теоилитических ферментов TIMP-1 и TIMP-2, что
антипро-
может опосредованно
усиливать инвазивный потенциал эндометриальных клеток.
Выявленное
нами прямое стимулирующее влияние перитонеальной жидкости при эндометриозе на синтез ферментов с протеолитическим действием согласуется с
имеющимися литературными данными. Так, в работе Cosin R. с соавторами
(2010) было установлено, что перитонеальная жидкость пациенток с эндометриозом индуцировала экспрессию в культуре эндометриальных клеток
мРНК урокиназного активатора плазминогена (uPA), обладающего как и
ММРs, протеолитическим действием. Характер
влияния перитонеальной
20
жидкости пациенток с эндометриозом может быть обусловлен выявленным
нами высоким содержанием в перитонеальной жидкости факторов, участвующих в регуляции клеточной инвазивности, таких как IL-8, МСР-1 и кальпротектин, поскольку по литературным данным, эти растворимые факторы
усиливают активность ММРs и инвазивный потенциал эндометриальных и
опухолевых клеток в культуре (Mulayim N., 2004, Yong H.Y., Moon A., 2007,
Lu Y., 2006).
Таким образом, как макрофаги, так и цитокины перитонеальной жидкости женщин с наружным генитальным эндометриозом могут повышать
инвазивный потенциал эндометриальных клеток, попадающих в перитонеальную полость, за счет усиления активности MMPs, тем самым, способствуя формированию и росту эндометриоидного очага.
Подтверждением нашего предположения об усилении инвазивного потенциала клеток эндометрия под действием растворимых факторов перитонеальной жидкости могут служить данные, полученные нами при изучении
инвазии эндометриальных клеток в матригеле. Культивирование стромальных клеток эутопического эндометрия пациенток с эндометриозом в присутствии либо супернатантов 24-часовых культур перитонеальных макрофагов
женщин с эндометриозом, либо аутологичной перитонеальной жидкости резко усиливало коэффициент миграции стромальных эндометриальных клеток
в матригеле (53,52±3,33% - спонтанная инвазия, 71,85±2,15% - инвазия в
присутствии супернатантов культур макрофагов, 76,07±1,43% - инвазия в
присутствии аутологичной перитонеальной жидкости, p<0,01 в обоих случаях).
Таким образом, при наружном генитальном эндометриозе как в эутопическом, так и в эктопическом эндометрии нарушена регуляция апоптоза и
инвазии, а в перитонеальной полости отмечаются значительные изменения
локального иммунного ответа, проявляющиеся в сниженной экспрессии
функциональных молекул перитонеальными макрофагами и повышении
концентрации провоспалительных цитокинов и хемокинов преимущественно
21
за счет усиления цитокин-продуцирующей активности макрофагов.
Пери-
тонеальные макрофаги и растворимые факторы перитонеальной жидкости
женщин с эндометриозом могут оказывать прямое стимулирующее действие
на инвазивный потенциал эндометриальных клеток, а также приводить к
снижению апоптоза в эндометрии, что по-видимому, лежит в основе фундаментальных патогенетических механизмов формирования и роста эндометриоидных очагов в перитонеальной полости.
ВЫВОДЫ.
1. Наружный генитальный эндометриоз вне зависимости от степени распространенности патологического процесса ассоциируется со снижением содержания перитонеальных CD11b+, HLA-DR+ и CD95L+ макрофагов и повышением уровня макрофагов, внутриклеточно продуцирующих TNFα. Для женщин с малыми формами эндометриоза характерно уменьшение пула CD49e+ макрофагов, с распространенными
формами эндометриоза – повышение уровня IL-1β+, IL-8+ и IL-6+ макрофагов в перитонеальной жидкости по сравнению с таковым у здоровых женщин.
2. Отличительной характеристикой женщин с распространенными формами наружного генитального эндометриоза является повышенное содержание в перитонеальной жидкости кальпротектина, IL-8 и MCP-1
по сравнению с нормативными значениями контрольной группы.
3. Наружный генитальный эндометриоз характеризуется нарушением регуляции апоптоза в эндометрии, что проявляется низким уровнем экспрессии мРНК MT-1 в эутопическом и эктопическом эндометрии, высоким уровнем экспрессии мРНК XIAP в эутопическом и каспазы-3 – в
эктопическом эндометрии по сравнению с аналогичными показателями
здоровых женщин.
4. У женщин с эндометриозом в эутопическом эндометрии отмечается
усиление синтеза протеолитического фактора MMP-2 и повышение
уровня экспрессии мРНК TIMP-1 и TIMP-2. В очаге наружного гени-
22
тального эндометриоза повышен уровень экспрессии мРНК MMP-2,
MMP-9 и TIMP-1 относительно показателей эндометрия здоровых фертильных женщин.
5. Перитонеальные макрофаги и перитонеальная жидкость здоровых
женщин in vitro повышают уровень вступивших в апоптоз и апоптирующих стромальных клеток в эутопическом эндометрии, а перитонеальные макрофаги усиливают экспрессию мРНК MT-1 и каспазы-3 в эксплантах аутологичного эндометрия. При наружном генитальном эндометриозе культивирование эксплантов эутопического эндометрия в
присутствии перитонеальной жидкости приводит к снижению количества апоптирующих эндометриальных стромальных клеток, находящихся на ранних/обратимых этапах апоптоза (Annexin V+Pi+), а в присутствии перитонеальных макрофагов - к угнетению экспрессии мРНК
MT-1, XIAP и каспазы-3.
6. При наружном генитальном эндометриозе перитонеальные факторы
усиливают инвазивные свойства клеток эутопического эндометрия:
растворимые факторы перитонеальной жидкости способствуют усилению экспрессии мРНК протеолитического фермента ММР-2 в эндометриальных эксплантах, а перитонеальные макрофаги снижают экспрессию мРНК специфических ингибиторов ММРs - TIMP-1 и TIMP-2
в ткани аутологичного эутопического эндометрия.
7. В системе матригель как перитонеальная жидкость, так и супернатанты
24-часовых культур перитонеальных макрофагов женщин с эндометриозом усиливают инвазию эндометриальных стромальных клеток.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Рекомендуется определять в биоптатах эутопического эндометрия пациенток с подозрением на наружный генитальный эндометриоз экспрессию мРНК XIAP в качестве дополнительного диагностического критерия.
23
У пациенток с наружным генитальным эндометриозом для уточнения степени распространенности патологического процесса рекомендуется определять относительное содержание перитонеальных макрофагов,
внутриклеточно продуцирующих IL-8, и при значениях показателей IL-8+
макрофагов более 73,2% диагностировать наружный генитальный эндометриоз 3-4 стадии.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
1. Филиппова Е.С., Сотникова Н.Ю., Посисеева Л.В., Кирсанов А.Н., Анциферова Ю.С. Роль перитонеальных макрофагов в регуляции апоптоза клеток эутопического эндометрия при наружном генитальном эндометриозе
// Вестник Военно-Медицинской академии.- 2009.-№1(25).- С.498.
2. Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Филиппова Е.С., Шишков Д.Н. Изменение экспрессии генов, регулирующих инвазивность и апоптоз, в
эутопическом и эктопическом эндометрии женщин с наружным генитальным эндометриозом // Аллергология и иммунология. -2009.- т.10, №2.С.252-253.
3. Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Посисеева Л.В., Елисеева М.А., Филиппова Е.С. Иммунные механизмы, определяющие нарушение взаимодействия перитонеальных макрофагов с эутопическим эндометрием у
женщин с наружным генитальным эндометриозом // Медицинская иммунология. - 2009.- т.11, №4-5.- С.400-401.
4. Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Посисеева Л.В., Кирсанов А.Н., Филиппова Е.С. Иммунный апоптоз на системном и локальном уровне у
женщин с бесплодием, ассоциированным с трубным фактором и наружным генитальным эндометриозом // Медицинская иммунология. - 2009.т.11, №4-5.- С.422-423.
5. Елисеева М.А., Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю., Филиппова Е.С., Анциферова Ю.С. Изменение фенотипа и цитокинового профиля перитонеальных макрофагов при их взаимодействии с клетками эутопического эндометрия при наружном генитальном эндометриозе // Проблемы репродукции.- 2009.- спец. выпуск.- С.179-180.
6. Antsiferova Yu.S., Sotnikova N.Yu., Posiseeva L.V., Filippova E.S., Eliseeva
M.A. Immune mechanisms of endometriosis lesions formation//Abstracts book
of 12th International Symposium for Immunology of Reproduction- Varna, Bulgaria, 2009.- P. 77-78.
7. Sotnikova N.Yu., Antsiferova Y. S., Posiseeva L.V., Shishkov D.N., D, Posiseev D.V., Filippova E.S. Mechanisms regulating invasiveness and growth of
24
endometriosis lesions in rat experimental model and in humans // Fertility and
Sterility -2010.-Vol.93.-N8.-P.2701-2705.
8. Филиппова Е.С., Елисеева М.А., Красильникова А.К./ Особенности регуляции инвазии и апоптоза клеток эутопического и эктопического эндометрия при эндометриозе// Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии.-2010.- № 2/1 (29). -С.214.
9. Филиппова Е.С., Анциферова Ю.С. Роль перитонеальных факторов в регуляции апоптоза и инвазии эндометриальных клеток у женщин с эндометриозом// Российский Иммунологический журнал, октябрь- декабрь
2010, Т.4(13), №4, -С.439.
10.Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Елисеева М.А., Филиппова Е.С. Особенности регуляции апоптоза в эутопическом и эктопическом эндометрии
у женщин с эндометриозом // Jurnali nazariy va klinik tibbiyot (Журнал теоретической и клинической медицины, Узбекистан).- 2010.- №5.- С. 71-74.
11.Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Филиппова Е.С., Красильникова А.К.
Роль цитокинов перитонеальной жидкости в регуляции инвазивных
свойств эндометриальных клеток при эндометриозе // Мать и Дитя в
Кузбассе. -2011. – спец. выпуск №1. – С.304-309.
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
CD – cluster of differentiation (кластер дифференцировки)
MMP – матриксная металлопротеиназа
FITC – флюоресцеин изотиоционат
РЕ – фикоэритрин
Pi- пропидиум иодид
RT-PCR – полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
TIMP – тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы
ИФА – иммуноферментный анализ
мАТ – моноклональные антитела
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота
Мф – макрофаги
ПЖ – перитонеальная жидкость
МТ-1 – металлотионеин-1
XIAP – X-сцепленный ингибирующий апоптоз белок