Сравнительная оценка степени фиксации различных

Сравнительная оценка степени фиксации различных стандартных культур клеток и
фибробластов кожи на полипропиленовых сетчатых эндопротезах, используемых в
хирургии грыж брюшной стенки
Чижов Д.В.1, Егиев В.Н.2, Сологуб В.К.3 Коромыслова И.А.3
1
12 ГКБ г. Москва
2
Кафедра хирургии и онкологии ФПКМР РУДН
3
МНИИМЭ г. Москва
Положительный эффект применения фибробластов у пациентов указывает на
высокий восстановительный потенциал использования аутогенных фибробластов в
герниологии. Проведенные исследования позволили установить, что степень фиксации
фибробластов
на
различных
типах
полипропиленовых
эндопротезов
достоверно
отличается. Причем в последующем применение различных полипропиленовых сеток с
фиксированными на них аутофибробластами у экспериментальных животных показало
различную тканевую реакцию на их имплантацию. Результаты эксперимента позволяют
предложить, что степень фиксации фибробластов на сетчатых полипропиленовых
эндопротезах является критерием биосовместимости полипропиленовых сеток. В тоже
время культура клеток мышиных фибробластов не является стандартной и предполагает
различные результаты фиксации клеток к сетчатым эндопротезам при использовании
культуры клеток фибробластов от различных экспериментальных животных. В связи с
этим обстоятельством возникла необходимость использования стандартной культуры
клеток для оценки степени фиксации клеток на различных полипропиленовых
эндопротезах.
Цели и задачи исследования: сравнительная оценка степени фиксации стандартных
культур клеток и фибробластов кожи на различных синтетических полипропиленовых
сетчатых эндопротезах, используемых для пластики дефектов передней брюшной стенки.
Материалы
и
методы:
в
исследовании
полипропиленовые сетчатые эндопротезы
использовались
следующие
для восстановительной хирургии: Surgipro
mesh (SPMM) Covidien, Prolene (Ethicon), Ultrapro (Ethicon), Эсфил стандартный
(Линтекс), Эсфил легкий (Линтекс), Эсфил усиленный (Линтекс).
Выбранные
культуры клеток
отличались по способности прикрепляться
к
субстрату: от практически не снимаемых макрофагов до снимаемых трипсином клеток
МДВК и фибробластов, и легко стряхиваемых со стекла версеном без трипсина, клеток
ВНК-21. Клетки культивировали
в среде RPMI-1640/ DMEM (Sigma) 1/1 c 10 %
фетальной сыворотки к.р.с. ( ПанЭко ) в СО2 инкубаторе при 37о С. Фибробласты кожи
мыши готовили трипсинизацией фрагментов кожи эмбрионов мыши и использовали после
5 – 10 пассажей, 1:4, каждые 5-7 дней. Перитонеальные макрофаги получали, промывая
средой брюшную полость мыши, и высевали в концентрации 100 тыс. клеток / мл.
Перевиваемая линия клеток почки сирийского хомячка - ВНК-21 получена из
Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС ССL 10) и перевивалась 1:10 после
снятия раствором версена каждые 3 дня. Перевиваемая линия клеток почки коровы МДВК получена из Американской Коллекции Типовых Культур ( АТСС ССL 22) ,
перевивалась один раз в 5 дней 1:5 после снятия клеток раствором версена с 0,5 %;
трипсина.
Для культивирования
полистироловые
клеток на сетках использовали 24 луночные
культуральные планшеты ( Nunk ).
Сетки нарезали на квадраты
размером на 1-2 мм больше чем диаметр лунок, так чтобы они фиксировались на дне
лунок. В лунки с сетками вносили по 2 мл питательной среды с 200 – 500 тыс. клеток.
Планшеты помещали в СО2 инкубатор и инкубировали 1 – 4 дня, оценивая прикрепление
и рост клеток в инвертированном микроскопе. После заполнения всего дна лунок
делящимися клетками
сетки извлекали и
оценивали фиксацию клеток на сетках
качественно и количественно. Для качественной оценки сетки с клетками фиксировали
формалином и метанолом и окрашивали раствором Гимза. Количественную оценку
фиксации клеток проводили, измеряя концентрацию белка в ультрафиолете при 280 нм в
лизате клеток спектрофотометром Genezis 10 UV (Thermo). Сетки с клетками промывали
раствором Хенкса и затем клетки лизировали
двух кратным
замораживанием -
оттаиванием ( -20оС - +25 о С ) в 2 мл раствора. Оптическая плотность полученного таким
образом лизата отмытых от среды 100 тыс. клеток была 0,130 , и для 10 тыс. клеток - 0.010
ед. Это показывает, что оптическая плотность при 280 нм может служить адекватным
критерием наличия клеток на сетках. Окрашивание препаратов фиксация -
7% р-р
формальдегида на PBS pH 7,2 в течение 1 часа, обезвоживание метанолом, окрашивание
по Гимза. Световая микроскопия в проходящем свете в инвертированном микроскопе
Nikon объективы10х/0,25 и 4х/0,25.
Результаты исследования приведены в таблице 1.
Таблица 1.
Сравнительная оценка концентрация белка в ультрафиолете при 280 нм в лизате
клеток, фиксированных на различных полипропиленовых носителях
Название сетки
Surgipro mesh (SPMM) Covidien
Prolene (Ethicon)
Ultrapro (Ethicon)
Эсфил стандартный (Линтекс)
Эсфил легкая (Линтекс)
Эсфил усиленный (Линтекс)
Оптическая плотность пробы
BHK-21
МДВК
Перитонеальные Фибробласты
макрофаги
кожи
0,0152 ± 0,0145± 0,00375±
0,014±
0,00356 0,00238 0,001518
0,00497
0,019±
0,03125± 0,008±
0,01375±
0,00821 0,01044 0,00294
0,00479
0,0358± 0,036±
0,008±
0,02475±
0,01681 0,01008 0,00374
0,0067
0,01325± 0,04117± 0,007±
0,01475±
0,00171 0,0083
0,00141
0,00222
0,022±
0,03183± 0,0075±
0,02425±
0,00689 0,00697 0,00404
0,0067
0,0386± 0,03267± 0,005±
0,0235±
0,01557 0,01282 0,00271
0,00597
Выводы:

Различные стандартные культуры клеток достоверно отличаются по степени их фиксации к
различным типам сетчатых полипропиленовых эндопротезов

Принципиально возможно использовать стандартные культуры клеток для оценки
биосовместимости различных полипропиленовых сетчатых эндопротезов

Наиболее близкими по способности фиксации в ряду различных эндопротезов к культуре
клеток фибробластов является культура клеток BHK-21