Диагностика аутоиммунного гепатита у детей с

Проект
Клинические рекомендации
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННОГО ГЕПАТИТА У ДЕТЕЙ
С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ИММУНОБЛОТИНГА
Москва 2015
1
Содержание
Стр.
Разработчики……………………………………………………………………..
3
1. Введение……………………………………………………………………….
4
2. Методология…………………………………………………………………..
6
3. Описание медицинской разработки.………………………………………..
8
3.1. Методика определения аутоиммунных антител…………..…………..
8
3.2. Характеристики теста…………..………….…………..………….……
9
3.3. Результаты научно-исследовательской работы………………………
10
3.4. Сведения о патентовании………………………………………………
15
3.5. Степень готовности медицинской технологии к внедрению……….
15
3.6. Область применения медицинской технологии…………………….
15
3.7. Реализация в практике………………………………………………..
16
4. Заключение……………………………………………………………………
16
Список литературы………………………………………………………..
17
2
Разработчики: д.м.н. Строкова Т.В,, д.м.н., проф. Т.Б. Сенцова, к.б.н. Сурков А.Г., к.м.н.
Багаева М.Э., к.м.н. Зубович А.И., к.м.н. Ворожко И.В., Черняк О.О.
В.н.с. отделения педиатрической
гастроэнтерологии, гепатологии и
диетологии, д.м.н.
_______________
Строкова Т.В..
Заведующая лабораторией клинической
биохимии, иммунологии и аллергологии,
д.м.н., профессор
_______________
Сенцова Т.Б.
С.н.с. отделения педиатрической
гастроэнтерологии, гепатологии и
диетологии, к.м.н.
_______________
Сурков А.Г.
С.н.с. отделения педиатрической
гастроэнтерологии, гепатологии и
диетологии, к.м.н.
_______________
Багаева М.Э.
С.н.с. лаборатории клинической
биохимии, иммунологии и аллергологии,
к.м.н.
_______________
Ворожко И.В.
Н.с. отделения педиатрической
гастроэнтерологии, гепатологии и
диетологии, к.м.н.
_______________
Зубович А.И.
Н.с. лаборатории клинической биохимии,
иммунологии и аллергологии, к.м.н.
_______________
Черняк О.О.
Организация-разработчик: Федеральное государственное бюджетное научное
учреждение «Научно-исследовательский институт питания»
3
1. Введение
Успехи современной гепатологии в диагностике и лечении хронических диффузных
заболеваний печени у взрослых и детей определяются во многом расшифровкой их
этиологии. В то же время остается группа нозологических форм с неясным
этиологическим фактором, патогенез которых представляет собой аутоиммунную агрессию, в том числе и против неизмененных компонентов ткани печени. В ряду
различных аспектов детской гепатологии аутоиммунные заболевания печени наименее
изучены. В качестве возможных причин следует выделить редкость данной патологии не
только у детей, но и у взрослых, а также сложность диагностики этих поражений печени
(клинической, лабораторной и инструментальной). В то же время аутоиммунный гепатит
(АИГ), первичный склерозирующий холангит (ПСХ), перекрестный аутоиммунный
синдром могут дебютировать в детском и подростковом возрасте, что требует от
педиатров четких диагностических и терапевтических позиций.
В соответствии с современными представлениями, АИГ - это хроническое воспалительное
заболевание печени неизвестной этиологии, характеризующееся пери-портальным
воспалением, значительной гипергаммаглобулинемией, появлением в сыворотке крови
широкого спектра печеночно-ассоциированных аутоантител и положительным ответом на
иммуносупрессивную терапию. Как следует из приведенного определения, причины
заболевания остаются невыясненными и, следовательно, понятие «аутоиммунный» в
большей степени характеризует не этиологию, а патогенез процесса. Следует учитывать,
что невозможность определения этиологического фактора хронического заболевания
печени не обязательно свидетельствует о диагнозе АИГ.
При АИГ первичной мишенью аутоиммунных реакций является гепатоцит, при
первичном билиарном циррозе (ПБЦ) и ПСХ вначале повреждаются клетки желчных
протоков и только потом - паренхима печени. Факторы, приводящие к развитию
подобных реакций, до конца не изучены. Обсуждается триггерная роль вирусов, токсинов,
бактерий, метаболитов лекарственных веществ и других патогенных факторов.
АИГ относится к редким заболеваниям, может возникать в любом возрасте, встречается в
основном у женщин в возрасте 10-30 лет и 50-70 лет. Соотношение заболевших женщин и
мужчин составляет, по разным данным, от 2,0 : 0,2 (Тайвань) и 4,7 : 1 (Южная Америка)
до 8 : 2 (Европа). У детей АИГ обычно диагностируют в возрасте 6-10 лет, соотношение
девочек и мальчиков составляет от 4 : 1 до 7 : 1. По данным нашего наблюдения, среди 58
детей с АИГ, госпитализированных в НЦЗД РАМН, соотношение девочек (43) и
мальчиков (15) равнялось 2,8 : 1.
4
Основным критерием диагноза АИГ считают выявление определенного спектра
аутоантител, что лежит в основе классификации АИГ. Следует отметить, что только при
повторных обнаружениях аутоантител в высоких концентрациях и с одновременным
повышением уровня аминотрансфераз можно думать об АИГ. В настоящее время, в
зависимости от спектра выявляемых аутоантител, выделяют АИГ 1-го, 2-го и 3-го типов.
АИГ 1-го типа встречается в любом возрасте, но обычно от 10 до 20 лет или от 45 до 70
лет. На этот «классический» вариант болезни приходится 80% всех случаев АИГ, он
характеризуется наличием в сыворотке антинуклеарных (antinuclear antibodies, АNA)
и/или антигладкомышечных (smooth muscle antibodies, SMA) аутоантител. У 65-93%
больных обнаруживаются также перинуклеарные ней-трофильные цитоплазматические
антитела (pANCA). При АИГ 2-го типа мишенью для иммунных клеток является антиген
микросом печени и почек 1-го типа, в сыворотке определяются антитела к микросомам печени и эпителиальных клеток клубочкового аппарата почек типа 1 (анти-LKM1). АИГ 2-го
типа редко диагностируется у взрослых, большую часть больных составляют дети от 2 до
14 лет. Некоторые авторы выделяют АИГ 3-го типа, который характеризуется наличием
антител к растворимому печеночному антигену (анти-SLA), но у 74% этих больных
выявляют также ANA и SMA, что ставит под сомнение существование данного типа АИГ
как отдельной нозологической формы.
Наличие аутоантител является одним из основных условий постановки диагноза АИГ. Тем
не менее, у приблизительно 15-20% детей с АИГ аутоантитела не выявляются.
АИГ характеризуется широким спектром клинических проявлений - от бессимптомного
до тяжелого, иногда фульминант-ного, гепатита, с наличием внепеченочных проявлений
или без них. У детей бессимптомное течение АИГ встречается редко.
Диагноз АИГ является показанием для проведения иммуносупрессивной терапии. АИГ в
детском возрасте без иммуносупрессивной терапии имеет чрезвычайно неблагоприятное
течение и плохой прогноз: 5-летняя выживаемость у таких больных составляет 50%, 10летняя - 10%. Применение современных схем иммуносупрессии позволяет достаточно
эффективно контролировать течение процесса при АИГ у детей. Монотерапия
преднизолоном или преднизолоном в комбинации с азатиоприном вызывает клиническую,
биохимическую и гистологическую ремиссию у 65% пациентов в течение 3 лет.
Таким образом, своевременная диагностика АИГ определяет качество и прогноз жизни
больных.
В
связи
с
этим
возрастает
необходимость
внедрения
новых
высокочувствительных и высокоспецифических методов диагностики аутоиммунного
поражения печени. Одним из таких являются методы лабораторной диагностики,
основанные на методе иммуноблотинга.
5
Терминология
Аутоиммунный гепатит – хроническое воспалительное заболевание печени неизвестной
этиологии,
характеризующееся
перипортальным
воспалением,
значительной
гипергаммаглобулинемией, появлением в сыворотке крови широкого спектра печеночноассоциированных аутоантител и положительным ответом на иммуносупрессивную
терапию.
Иммуноблотинг
(вестерн-блотинг)
–
современный
высокочувствительный
аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков с
помощью антител.
2. Методология
Методы, использованные для сбора/селекции доказательств:
 поиск в электронных базах данных (Pubmed, Embase).
Методы, использованные для оценки качества и силы доказательств:
 оценка значимости в соответствии с уровнями доказательности и классами
рекомендаций (табл.1, 2).
Таблица 1. Уровни доказательности
Уровень
1
2
3
4
Источник доказательств
Проспективные рандомизированные контролируемые исследования.
Достаточное количество исследований с достаточной мощностью, с участием
большого количества пациентов и получением большого количества данных.
Крупные мета-анализы.
Как минимум одно хорошо организованное рандомизированное
контролируемое исследование.
Репрезентативная выборка пациентов
Проспективные с рандомизацией или без исследования с ограниченным
количеством данных.
Несколько исследований с небольшим количеством пациентов.
Хорошо организованное проспективное исследование когорты.
Мета-анализы ограничены но проведены на хорошем уровне.
Результаты непрезентативны в отношении целевой популяции.
Хорошо организованные исследования «случай-контроль»
Нерандомизированные контролируемые исследования.
Исследования с недостаточным контролем.
Рандомизированные клинические исследования с как минимум 1 значительной
или как минимум 3 незначительными методологическими ошибками.
Ретроспективные или наблюдательные исследования.
Серия клинических наблюдений.
Противоречивые данные, не позволяющие сформировать окончательную
рекомендацию
Мнение эксперта/данные из отчета экспертной комиссии, экспериментально
подтвержденные и теоретически обоснованные
6
Таблица 2. Уровни рекомендаций.
Уровень
A
B
Описание
Рекомендация основана на высоком уровне
доказательности (как минимум 1 убедительная
публикация 1 уровня доказательности,
показывающая значительное превосходство
пользы над риском)
Рекомендация основана на среднем уровне
доказательности (как минимум 1 убедительная
публикация 2 уровня доказательности,
показывающая значительное превосходство
пользы над риском)
C
Рекомендация основана на слабом уровне
доказательности (но как минимум 1
убедительная публикация 3 уровня
доказательности, показывающая значительное
превосходство пользы над риском) или
нет убедительных данных ни о пользе, ни о
риске)
D
Отсутствие убедительных публикаций 1, 2 или 3
уровня доказательности, показывающих
значительное превосходство пользы над риском,
либо убедительные публикации 1, 2 или 3
уровня доказательности, показывающие
значительное превосходство риска над пользой
Расшифровка
Метод/терапия первой
линии;
либо в сочетании со
стандартной
методикой/терапией
Метод/терапия второй
линии;
либо при отказе,
противопоказании, или
неэффективности
стандартной
методики/терапии.
Рекомендуется
мониторирование побочных
явлений
Нет возражений против
данного метода/терапии
или нет возражений против
продолжения данного
метода/терапии.
Рекомендовано при отказе,
противопоказании или
неэффективности
стандартной
методики/терапии, при
условии отсутствия
побочных эффектов
Рекомендация основана на
мнении экспертов, нуждается
в проведении исследований
Методы, использованные для анализа доказательств:

Обзоры опубликованных мета-анализов;

Систематические обзоры с таблицами доказательств.
Описание методов, использованных для анализа доказательств:
При
отборе
публикаций,
как
потенциальных
источников
доказательств,
использованная в каждом исследовании методология изучается для того, чтобы убедиться
в ее валидности. Результат изучения влияет на уровень доказательств, присваиваемый
публикации, что в свою очередь влияет на силу вытекающих из нее рекомендаций. Для
минимизации субъективного фактора и возможных ошибок каждое исследование
7
оценивалось независимо, по меньшей мере, двумя членами рабочей группы. Какие-либо
различия в оценках обсуждались рабочей группой в полном составе.
Экономический анализ:
 Анализ стоимости не проводился и публикации по фармакоэкономике не
анализировались.
Основные рекомендации:
 Сила доказательности (1-4) приводятся при изложении текста технологии.
3. Описание медицинской разработки
3.1 Методика определения аутоиммунных антител
Метод иммуноблотинга основан на комбинации гель-электрофореза и иммунохимической
реакции «антиген-антитело». С помощью гель-электрофореза белки разделяются в
полиакриламидном
геле.
Далее
белки
переносят
на
нитроцеллюлозную
или PVDF мембрану. Затем их детектируют с использованием антител методом
«сэндвича»: сначала белки связываются с первичными (моно- или поликлональными)
антителами, которые в свою очередь связываются со вторичными антителами,
конъюгированными с ферментами (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой).
Визуализация исследуемого белка достигается путем проведения соответствующей
биохимической
реакции
колориметрическим,
с
образованием
хемилюминесцентным,
продукта,
который
флуоресцентным
определяется
методами
детекции.
Количество белка может быть оценено с помощью денситометрии. Высокая степень
разрешения
достигается
за
счет
электрофоретического
разделения
белков
и
специфичности моноклональных антител. В оптимально отработанных условиях Вестернблоттингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1нг.
Для выявления печеночных IgG-аутоантител к к 9 различным антигенам печени: AMA-M2
(пируват- дегидрогеназному комплексу), М2-3E (BPO, белку субъединиц Е2 дегидрогеназ
альфа-2-оксикислот внутренней мембраны митохондрий), Sp100 (белку ядерных гранул,
ядерных пятен), PML (белку промиелоцитарной лейкемии, ядерных пятен), gp210
(интегральному белку ядерной мембраны, комплекс ядерных пор), LKM-1 (микросомам
печени и почек; цитохрому Р450 II D6), LC-1 (цитозольному антигену печени 1 типа;
формиминотрансферазе-циклодеаминазе),
SLA/LP
(растворимому
печеночному
антигену/печеночно-панкреатическому антигену) и Ro-52 в сыворотке и плазме крови
были использованы наборы EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (EUROIMMUN
AG, Германия).
8
3.2. Характеристики теста
Набор содержит тестовые стрипы, на которые нанесены параллельные полосы очищенных
антигенов. Тестовые стрипы инкубируют на первой стадии реакции с образцом
разведенной
сыворотки или плазмы крови
пациента. В случае если
образец
положительный, специфические антитела класса IgG (а также классов IgA и IgM) будут
связываться с соответствующими антигенами. Для обнаружения связанных антител
проводится вторая инкубация с использованием ферментного конъюгата (антитела к IgG
человека, меченные щелочной фосфатазой), который способен вызывать развитие цветной
реакции.
Диапазон определения: метод EUROLINE является качественным, диапазон определения
не дается. Принято, что предельный титр антител устанавливается при разведении образца
1:101.
Антигены. Нативный антиген AMA-M2 получен очисткой из сердца быка; в качестве
главного компонента он содержит субъединицу Е2 (74 кДа) пируватдегидрогеназного
комплекса (PDH). Антиген М2-3E (BPO) – объединенный рекомбинантный белок,
продуцируемый E. coli и представляющий собой иммуногенные домены субъединиц Е2
дегидрогеназы
2-
пируватдегидрогеназы
оксикислот
(РDH)
и
с
2-
разветвленными
цепями
оксоглутаратдегидрогеназы
(BCOADH),
(OGDH),
вместе
называемые ВРО. Антигены Sp100 и PML являются компонентами ядерных телец
лейкемичных
промиелоцитов
(ядерные
тельца
PMLNB,
ядерные
гранулы).
Соответствующая кДНК человека была экспрессирована в E. coli. Антиген gp210 является
компонентом комплекса ядерных пор (NPC). Соответствующая кДНК человека была
экспрессирована в E. coli. Антиген LKM-1 локализован в микросомальной фракции
печени и почек. Путем клонирования и секвенирования он был идентифицирован как
цитохром Р450 II D6. Соответствующая кДНК человека была экспрессирована в E. coli.
Рекомбинантный
антиген
LC-1
(формиминотрансфераза-
циклодеаминаза)
был
экспрессирован путем клонирования соответствующей кДНК человека в клетках
насекомых с использованием системы бакуловируса. Рекомбинантный SLA/LP (белоксуппрессор UGA, ассоциированный с тРНК) получен клонированием соответствующей
кДНК человека в E. coli. Ro-52: Рекомбинантный белок Ro-52 (52 кДа). Соответствующая
кДНК человека была экспрессирована в клетках насекомых с использованием системы
бакуловируса.
Перекрестные реакции: перекрестных реакций с другими аутоантителами не обнаружено.
Интерференция: не отмечено изменения аналитических характеристик при исследовании
в данном наборе гемолизированных, липемических или желтушных образцов с
9
концентрациями гемоглобина вплоть до 5 мг/мл, триглицеридов – до 20 мг/мл и
билирубина – до 0,4 мг/мл.
Воспроизводимость:
воспроизводимость
результатов
между
опытами
оценивали
многократным повторным исследованием одних и тех же охарактеризованных образцов в
течение нескольких дней, воспроизводимость в пределах одного опыта – многократным
исследованием охарактеризованных образцов в течение одного дня. В каждом случае
интенсивность полос находилась в пределах установленного диапазона. Таким образом,
данный тест EUROLINE показывает очень высокую воспроизводимость в пределах одной
постановки и между постановками.
Результаты проведенных клинических исследований: Для верификации теста фирмойпроизводителем на наличие антител к AMA-M2, 3E (BPO), Sp100, PML и gp210 было
исследовано 49 сывороток взрослых пациентов с аутоиммунным гепатитом (АИГ), 200
сывороток пациентов с вирусными гепатитами С или В и 50 сывороток здоровых доноров
крови. При АИГ 94% сывороток содержали антитела хотя бы к одному из названных
антигенов. В другом исследовании, на наличие аутоантител к антигенам печени были
проверены сыворотки 24 взрослых пациентов, страдающих АИГ 2 типа, сыворотки 26
пациентов с первичным билиарным циррозом, сыворотки 109 человек контрольной
группы с прочими заболеваниями печени и сыворотки 57 здоровых доноров крови.
Специфичность анти-SLA/LP и анти-LC-1 к АИГ составляла 100%, тогда как анти-LKM-1
присутствовали как при АИГ, так и при вирусных гепатитах.
Доказательность медицинской технологии соответствует уровню 4 согласно прилагаемой
рейтинговой системе доказательности (Таблица 1).
3.3 Результаты научно-исследовательской работы
Обследовано 38 детей (мальчиков - 15, девочек - 23) в возрасте 10,1±0,7 лет (2г 3 мес – 17
лет). Обследование детей включало:
1. Общеклинические исследования (сбор анализа, клинический анализ крови, общий
анализ мочи).
2. Исследование маркеров вирусных гепатитов (анти-HAV, анти-HCV, HBsAg).
3. Биохимическое исследование крови (билирубин общий+прямой, АСТ, АЛТ, ЩФ,
ГГТ, креатинин, глюкоза, холестерин, общий белок + протеинограмма).
4. Исследование уровня иммуноглобулинов (Ig) классов G, A, и M.
5. Ультразвуковое исследование органов брюшной полости.
6. – Исследование аутоантител pANCA, ANA, ASMA, a-LKM1, AMA-M2, М2-3E
(BPO), Sp100, PML, gp210, LC-1, SLA/LP иммуноферментным методом и
10
исследование аутоантител a-LKM1, AMA-M2, М2-3E (BPO), Sp100, PML, gp210,
LC-1, SLA/LP методом иммуноблотинга.
7. ЭГДС и биопсия печени проводились по показаниям.
Анализируя результаты обследования указанной группы детей, было выявлено, что
дебют заболевания был в возрасте 8,9±0,7 (1,9 – 15,5) лет. У 23 детей зарегистрировано
острое
начало
заболевания,
связанное
с
появлением
желтухи,
гепато-
и/или
гепатоспленомегалии; у 15 – постепенное. В связи с отсутствием возможностей
проведения иммунологических исследований у большинства детей был установлен
диагноз хронического криптогенного гепатита. В связи с чем эти пациенты в течение
длительного времени не получали полноценной патогенетической терапии. У всех детей
была назначена лишь гепатопротективная терапия, у части из них – короткие курсы
лечения иммуносупресивными препаратами в низких дозах, что способствовало
прогрессированию заболевания. Возраст установления диагноза составлял 10,1±0,7 лет.
Таким образом, медиана периода между появлением первых симптомов заболевания и
установлением диагноза составила в 1 год 4 мес.
При проведении обследования у всех детей были исключены острые и хронические
вирусные гепатиты, наследственные болезни обмена.
В клиническом анализе крови средний уровень гемоглобина составил 123,6±2,4 г/л,
эритроцитов 4,2±0,09 х 1012/л. При этом анемия (Hb<100г/л) была зарегистрирована у
двоих детей (5,3%). Уровень лейкоцитов был 7,8±0,5 х 109/л, тромбоцитов 220,0±17,4 х
109/л. Вместе с тем, несмотря на нормальные средние показатели тромбоцитов,
тромбоцитопения (<150 х 109/л) наблюдалась у 9 (23,7%). Одним из маркеров воспаления
является уровень СОЭ, который значительно повышается при различных аутоиммунных
заболеваниях. Средний уровень СОЭ у обследованных детей составил 18,6±2,8 мм/час.
Следует отметить, что нормальный уровень данного показателя наблюдался у 21 ребенка
(55,3%), у остальных – он был повышен (рис 1).
Средние показатели биохимического анализа крови представлены в таблице 1.
11
7,9
2,6 2,6
55,3
31,6
N
до 2N
до 3N
до 4N
до 5N
Рисунок 1. Показатели СОЭ у детей с АИГ
Средние показатели общего билирубина превышали норму в 2 раза (40,6±4,6 мкмоль/л).
При этом нормальный уровень данного показателя был зарегистрирован лишь у 12
(32,4%) детей, у остальных он превышал норму в 1,5-5 раз.
Таблица 1. Показатели (M±m) биохимического анализа крови.
Показатели
Средний уровень
Референсные
значения
Билирубин общий
40,6±4,6
5-20
Билирубин прямой
18,5±2,8
<5
АСТ
643,2±105,9
5-40
АЛТ
607,3±91,9
5-40
ЩФ
284,8±30,5
<400
ГГТ
81,8±6,9
5-35
Общий белок
83,7±2,2
65-85
Альбумин
43,7±1,5
55,8-65,0
γ-глобулины
32,5±1,8
11,5-18,6
IgG
25,26±2,4
7,0-16,0
IgA
2,21±0,2
0,7-4,0
IgM
1,78±0,1
0,4-2,3
Единицы измерения
Мкмоль/л
Мкмоль/л
Ед/л
Ед/л
Ед/л
Ед/л
г/л
%
%
г/л
г/л
г/л
Как известно, аутоиммунные заболевания печени протекают с выраженным
синдромом цитолиза. В дебюте заболевания средний уровень АСТ был 727,7±111,1 Ед/л,
АЛТ – 733,0±115,5 Ед/л. На момент госпитализации в отделение педиатрической
гастроэнтерологии, гепатологии и диетологии данные показатели соответствовали
643,2±105,9 и 607,3±91,9 Ед/л соответственно (рис.2). Статистически значимых различий
между величинами АЛТ и АСТ в момент дебюта заболевания и на момент госпитализации
не выявлено (p>0.05), что свидетельствует о сохраняющийся высокой активности
заболевания в течение длительного времени.
12
800
600
400
200
0
АСТ
АЛТ
Дебют
Госпитализация
Рисунок 2. Показатели синдрома цитолиза у детей с АИГ (p>0.05)
13
В тоже время, величины АЛТ и АСТ имели достаточно большие диапазоны
колебаний, что было связано с проведением небольших курсов иммуносупрессивной
терапии накануне госпитализации в НИИ питания (рис.3, таблица 2).
Таблица 2. Величины АЛТ и АСТ в зависимости от уровня превышения верхней границы
нормального значения (N), Ед/л (M±SD).
<3 N
3-5N
6-10 N
>10N
АСТ
73,3±12,6
187,7±8,9
325,0±25,5
1066,2±150,1
АЛТ
77,9±13,5
153,5±7,8
308,4±21,7
995,9±122,8
100%
80%
50
50
21,1
10,5
18,4
21,1
АСТ
АЛТ
60%
40%
20%
0%
<3N
18,4
10,5
3-5N
6-10N
>10N
Рисунок 3. Выраженность синдрома цитолиза у детей с АИГ на момент госпитализации.
Следует отметить, что у подавляющего большинства детей (92,1%) отмечалось
повышение уровня ГГТ, что свидетельствовало о наличии холестаза. Средний уровень
ГГТ составил 81,8±6,9 ед/л. Повышение щелочной фосфатазы наблюдалось лишь в 21,1%
случаев.
Изменения в протеинограмме были зарегистрированы у всех детей. Анализ показателей
общего белка выявил, что нормальный его уровень был у 55,3% детей. Повышение белка,
свидетельствующее об активном воспалении, наблюдалось у 34,2%, снижение, связанное
с нарушением белково-синтетической функции печени – 10,5%. У 86,8% детей – выявлена
гапергаммаглобулинемия, свидетельствующая о наличии активного воспаления, а у 10,5%
- гипоальбуминемия, связанная с прогрессированием заболевания, глубоким поражением
печеночной ткани и нарушением белково-синтетической функции печени. Исследование
уровня IgG выявило ее повышение у 81,6% детей.
14
Наличие синдрома холестаза у подавляющего большинства детей, незначительного
(не более 3-х норм) синдрома цитолиза, отсутствие повышения уровня IgG у 18,4% детей,
накануне
госпитализации
получавших
иммуносупрессивную
терапию,
требуют
проведения исследования аутоантител.
Исследование аутоантител иммуноферментным методом выявило следующие
спектры аутоантител: pANCA – в 2,6%, ANA – в 26,3%, ASMA – в 13,2%, ANA+ASMA – в
31,6%, ANA+ASMA+AMA – в 7,9%, a-LKM1 – в 10,5%, AMA-M2 – в 0%, М2-3E (BPO) –
в 0%, Sp100– в 0%, PML– в 0%, gp210– в 0%, LKM-1– в 0%, LC-1– в 0%, SLA/LP – в 0% и
Ro-52– в 0%, отсутствие аутоантител наблюдалось в 7,9% случаев (рис. 4). По результатам
исследования аутоантител был подтвержден диагноз аутоиммунного гепатита 1-го типа у
30 (79%), 2-го типа – у 4 (10,5%) детей.
% 35
31,6
30
26,3
25
20
13,2
15
10
10,5
7,9
5
7,9
2,6
0
pANCA
ANA
ASMA
ANA+ASMA
ANA+ASMA+AMA
aLKM1
отсут.а/т
Рис.4. Спектр аутоантител, выявленных у пациентов с АИГ.
При применении метода иммуноблотинга у той же когорты пациентов была
получена 100% чувствительность и воспроизводимость этого метода: a-LKM1 –выявлены
в 10,5%, AMA-M2 – в 0%, М2-3E (BPO) – в 0%, Sp100– в 0%, PML– в 0%, gp210– в 0%,
LKM-1– в 0%, LC-1– в 0%, SLA/LP – в 0% и Ro-52– в 0% случаев. Полученные данные,
подтверждают результаты исследований, проведенных у взрослых.
3.4. Сведения о патентовании: нет.
3.5.
Степень
готовности
исследовательская
медицинской
разработка
может
технологии
быть
внедрена
к
в
внедрению:
научно-
практику
лечебно-
профилактических учреждений Российской Федерации для диагностики аутоиммунного
гепатита у детей.
3.6. Область применения медицинской технологии: - здравоохранение: педиатрия,
внутренние
болезни,
гастроэнтерология,
инфекционные
болезни,
иммунология,
15
ревматические болезни, обучение студентов высших медицинских учебных заведений,
курсантов циклов профессиональной переподготовки и повышения квалификации.
3.7. Реализация в практике: клиника ФГБНУ «НИИ питания», кафедра диетологии
ГБОУ
ДПО
«Российская
медицинская академия
последипломного
образования»
Минздрава России, кафедра диетологии и нутрициологии ГБОУ ВПО «Российский
национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова»
Минздрава России.
4. Заключение
Результаты проведенного исследования показывают, что АИГ в детском возрасте
плохо диагностируется (в среднем, через 1 г. 4 мес. после дебюта заболевания)
и
характеризуется высокой степенью активности воспалительного процесса в печени при
отсутствии адекватной патогенетической терапии. Это в значительной мере повышает
риск быстрого развития необратимых процессов поражения печеночной ткани –
фиброзирования и цирроза. В связи с чем своевременная диагностика АИГ приобретает
первостепенное значение. В проведенном нами сравнительном исследовании была
установлена высокая чувствительность и воспроизводимость определения аутоантител
методом
иммуноблотинга,
что
позволяет
рекомендовать
его
для
диагностики
аутоиммунного гепатита у детей.
16
Список литературы
1. Huguet S. и др. Identification by proteomic tool of atypical anti-liver/kidney microsome
autoantibodies targets in de novo autoimmune hepatitis after liver transplantation // Ann. N. Y.
Acad. Sci. 2007. Т. 1109. С. 345–357.
2. Eyraud V. и др. Significance of antibodies to soluble liver antigen/liver pancreas: a large
French study // Liver Int. 2009. Т. 29. № 6. С. 857–864.
3. Efe C. и др. Antibodies to soluble liver antigen in patients with various liver diseases: a
multicentre study // Liver Int. 2013. Т. 33. № 2. С. 190–196.
4. Liberal R. и др. Diagnostic criteria of autoimmune hepatitis // Autoimmun Rev. 2014. Т. 13.
№ 4-5. С. 435–440.
5. Баранов А.А., Каганов Б.С., Гундобина О.С. Аутоиммунный гепатит у детей // Детский
доктор. 2001. Т. 1. № 18. С. 34–40.
6. Ивашкин В.Т., Буеверов А.О. Аутоиммунные заболевания печени в практике
клинициста. Москва: ООО «Издательский дом »М-Вести", 2001. 201 с.
7. Детская гепатология / под ред. Б.С. Каганов. Москва: Династия, 2009. 576 с.
8. Антитела класса IgG к антигенам печени EUROLINE [Электронный ресурс]. URL:
http://www.analytica.ru/instructions/immunochemistry/immunoblot/kits/Euroimmun/euroimmun
_dl1300-1601-4g_liver_profile.pdf (дата обращения: 25.03.2015).
9.
Вестерн-блоттинг
(Western-blotting)
[Электронный
ресурс].
URL:
http://web-
local.rudn.ru/web-local/kaf/rj/index.php?id=8&p=3046 (дата обращения: 25.03.2015).
17