Иммунопатогенез осложнений у онкологических больных. Тугуз Аминат Рамазановна
advertisement
На правах рукописи Тугуз Аминат Рамазановна Иммунопатогенез ранних послеоперационных осложнений у онкологических больных. 14.00.14 – онкология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. Москва – 2002 г. 2 Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им. академика Н.Н.Блохина РАМН Научный консультант: д.м.н. профессор М.В.Киселевский, Официальные оппоненты: Член-корр. РАМН, д.м.н. профессор А.А.Ярилин, д.м.н. профессор К.П. Лактионов, д.б.н. профессор А.А. Михайлова. Ведущая организация: И.М.Сеченова. Московская медицинская академия им. Защита состоится “ ” 2002 г. в часов на заседании специализированного совета (Д.001.17.01) при Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Автореферат разослан “ Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук ” 2002 г. Ю.В.Шишкин 3 ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы. Современные тенденции хирургического лечения онкологических больных, характеризующиеся расширением объема и зон оперативных вмешательств [Стилиди И.С., 2002], сопровождаются высоким риском развития ранних послеоперационных осложнений. Рост частоты и тяжести гнойно-септических осложнений определяет актуальность проблемы. По данным РОНЦ РАМН, сепсис и полиорганная недостаточность (ПОН) развиваются соответственно у 5% и 8,5 % пациентов, перенесших расширенные оперативные вмешательства [Свиридова С.П., Горобец Е.С., 2001]. Послеоперационная пневмония, как самая частая причина летальных исходов, отмечается у 25-30 % больных, оперированных по поводу рака легкого и в 36 % случаев после операций по поводу рака пищевода [Стилиди И.С.,2002]. На фоне гнойно-септических осложнений у 80% пациентов развивается ПОН, из них 30% погибают, как считали ранее, от генерализованных инфекций [Белобородов Б.В., 2001]. Причинно-следственные связи послеоперационных гнойносептических осложнений, по данным В.В. Жеребовского [2000], определяются тремя факторами: 1) - госпитальными инфекциями [Stansby et al. 1994; Гельфанд Б.Р., 1997 и 2001; Белобородов В.Б., 2001]; 2) – особенностями хирургической патологии [Милонов О.Б., 1990]; 3) состоянием организма больного, его гомеостаза и иммунной реактивности [Bone et al., 1992; Кулибаба Д.М. с соавт., 1995]. В соответствии с господствующей в медицине бактериологической концепцией, в патогенезе ранних послеоперационных осложнений, включая синдром системной воспалительной реакции (ССВР), сепсис, септический шок, ПОН, и др., ведущая роль отводится микрофлоре (экзо- или эндогенного происхождения), что определяет стратегию профилактики и лечения этих осложнений – антибактериальную терапию и санацию инфекционного очага [Белобородов В.Б., 2001; Исаков Ю.Ф. и Белобородова Н.В, 2001; Гельфанд Б.Р., 2001; Ерюхин И.А., 2001; Сидоренко С.В., 2001; Шляпников С.А., 2001; Белобородова Н.В., 1995 и 2000; Виницкий Л.И. c cоавт., 1999; Осипов Г.А. с соавт., 1997]. Однако еще в 1956 году Давыдовским И.В. в развитии септического процесса на первый план была выдвинута роль макроорганизма и состояние его реактивности. Согласно его представлениям, клинические проявления системных патологических явлений определяются реакциями самого организма. Патологические процессы развиваются по общебиологическим закономерностям и обусловлены, прежде всего, собственными, присущими самому организму, эндогенными механизмами. Повреждающий фактор (операционная травма, микроорганизмы, эндотоксин и т.д.), играет роль причины и обязательного условия развития, но является лишь количественным регулятором эндогенеза системных патологических процессов [Крыжановский Г.Н., 2000 и 2001]. 4 Достижения современной медицины выдвинули концепцию сепсиса и критических состояний, основанную на патофизиологии генерализованных реакций защитных систем - иммуновоспалительной реакции организма, одной из важнейших триггерных систем, сложившейся в ходе эволюции [Bone R.C., et al., 1992; Serra F.B. et al.,1989]. При этом возможны варианты конститутивной гипо – и гипериммунореактивности, или последующие во времени фазы общей системной воспалительной реакции организма. Эндогенные биорегуляторы липидной и пептидной природы, необходимые для реализации воспалительных реакций и вовлеченные в патогенез таких системных нарушений, как ССВР, сепсис, септический шок и ПОН, представлены широким спектром биологически активных соединений: метаболиты арахидоновой кислоты, фактор активации тромбоцитов (PAF), гуморальные факторы, цитокины, рецепторы к цитокинам и др., причем каждый из них может выступать как причина, так и следствие каскада эндогенных реакций [Damas P. Et al, 1989 and 1992; Brockhaus M., 1997]. Большое значение в развитии послеоперационных осложнений отводится цитокинам и их рецепторам, которые ответственны за интеграцию основных звеньев иммунной системы и межклеточных взаимодействий [Damas P. et al., 1992; Van der Poll T., 1993; Cohen J. and Carlet J., 1996; Abraham E., et al., 1997; Brockhaus M., 1997]. Важная роль принадлежит интерлейкину-1 (IL-1) и фактору некроза опухоли (TNF), инициирующим продукцию других медиаторов воспаления [Cимбирцев А.С.,1998], но в избыточных количествах обладающих способностью повреждать органы и ткани. При экспериментальном введении TNF и IL-1 животным развиваются типичные проявления септического шока [Шичкин В.П., 1998; Кашкин Л.П.,1998]. Известно, что цитокины осуществляют регуляцию межклеточных взаимодействий, но в ряде случаев выходят за рамки чисто медиаторных функций и, приобретая системный характер, запускают каскад патологических реакций [Ковальчук Л.В. с соавт., 2001]. Однако представления о решающей роли каскадно-медиаторных процессах в генезе полиорганных повреждений и повышенной восприимчивости к инфекциям нуждаются в пересмотре с позиций общего дисбаланса между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами [Ertel W.,et al., 1995; Brivet F.G., et al., 1999; Atwell D.M. et al., 1999; Мухоедова Т.В., 2002]. Дефекты цитокиновой сети сказываются на эффективности противоинфекционного и противоопухолевого иммунитета. Нарушения продукции и секреции медиаторов ведут к дефектам Т- и В-лимфоцитов, фагоцитирующих клеток и NK [Фрейдлин И.С., 1998]. Среди возможных вариантов поломки цитокиновой регуляции выделяют основные: а) генетические, с отсутствием продукции и секреции цитокинов и их рецепторов, б) изменение соотношения клеток-продуцентов (Th1/Th2) с несбалансированной гиперпродукцией медиаторов [Bone R.C., et al., 1999; Мухоедова Т.В., 2002]. Показано, что нарушение регуляции продукции IL-2 5 и его рецептора (IL-2R) может обеспечивать постоянную аутокринную стимуляцию Т-лимфоцитов, т.е. лимфопролиферативный процесс [Han D. et al., 1996; Berezhnaya M.V., et al., 1994; De Vita F. et al., 1991; Heys S.D., 1994; Фрейдлин И.С., 1998]. Однако, несмотря на достижения современной медицины, до сих пор сложно прогнозировать вероятность развития ССВР, сепсиса, ПОН и др. тяжелых осложнений, тем более исход этих состояний [Белобородов В.Б.,2001], так как механизмы развития послеоперационных осложнений у онкохирургических больных мало изучены, исследования немногочисленны, в основном посвящены отдельным цитокинам и во многом противоречивы. Цель работы: исследование иммунологических механизмов и определение факторов прогноза развития ранних послеоперационных осложнений у онкологических больных. Задачи: 1. Определение цитокинового профиля онкологических больных в периоперационном периоде. 2. Мониторинг содержания растворимых рецепторов цитокинов у онкохирургических больных. 3. Исследование динамики метаболитов арахидоновой кислоты, компонентов системы комплемента и иммуноглобулинов в раннем послеоперационном периоде. 4. Оценка NK-активности, спонтанной и индуцированной продукции цитокинов и их растворимых рецепторов лейкоцитами онкологических больных. 5. Исследование динамики экспрессии mRNA цитокинов в периоперационном периоде. 6. Мониторинг уровня про- и противовоспалительных цитокинов у онкологических больных при проведении экстракорпоральных методов детоксикации. 7. Влияние адоптивной иммунотерапии на продукцию провоспалительных цитокинов у онкологических больных в послеоперационном периоде. 8. Обоснование выбора иммунологических критериев прогноза развития ранних послеоперационных осложнений. Научная новизна. Впервые у онкологических больных определены количественные (молярные) соотношения основных про- и противовоспалительных цитокинов и выявлен дисбаланс в системе IL-4/IL-2. Впервые прослежена динамика экспрессии mRNA цитокинов у онкологических больных в периоперационном периоде и показано блокирование экспрессии генов основных провоспалительных цитокинов 6 (IL-1, TNF-, IL-6, IL-12) в раннем послеоперационном периоде на фоне активации транскрипции противовоспалительного цитокина IL-10. Исследована периоперационная динамика широкого спектра эндогенных биорегуляторов, проведен почасовой интраоперационный и послеоперационный мониторинг сывороточных цитокинов у онкологических больных и показана необходимость пересмотра взглядов на прогностическую значимость медиаторов воспаления в развитии системных патологических реакций. Определены сывороточные уровни противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 в периоперационном периоде и показаны различия в динамике их содержания и прогностической значимости при развитии ранних послеоперационных осложнений у онкологических больных. Впервые исследовано содержание растворимых рецепторов цитокинов к фактору некроза опухоли (sTNF-RI и sTNF-RII), IL-4 (sIL-4R) в периоперационном периоде и показано их прогностическое значение в зависимости от сроков развития ранних послеоперационных осложнений. Исследована динамика рецепторного антагониста IL-1, метаболитов арахидоновой кислоты – лейкотриена (LTB4), тромбоксана (TXB2) при развитии ранних послеоперационных осложнений. Получены новые данные о прогностической значимости персистирования повышенных концентраций С3 компонента системы комплемента при развитии ранних послеоперационных осложнений у онкологических больных. Впервые проведено периоперационное тестирование цитокинов в контролируемых биоматериалах (сыворотке, отделяемом из дренажей, моче и фильтратах) у онкологических больных с расширенными оперативными вмешательствами; показана возможность существования недетектируемых форм цитокинов и их элиминации при проведении гемофильтрации. Получены новые данные о динамике спонтанной и стимулированной продукции цитокинов, их растворимых рецепторов мононуклеарными клетками периферической крови и нейтрофилами в периоперационном периоде; установлен эффект модуляции их продукции рекомбинантными цитокинами. Впервые исследовано структурно-функциональное состояние мембран мононуклеарных клеток крови онкологических больных с использованием ЭПР-зондов. Научная значимость. Исследовано соотношение про- и противовоспалительных цитокинов, их растворимых рецепторов и рецепторных антагонистов у онкологических больных; установлен дисбаланс в их соотношении по сравнению со здоровыми донорами. Охарактеризована динамика экспрессии генов цитокинов у онкологических больных в периоперационном периоде и показано, что 7 снижение продукции IL-1, TNF-, IL-6 и IL-4 обусловлено блокированием экспрессии mRNA. Установлено различие в периоперационной динамике IL-4 и IL-10 у онкологических больных с осложнениями и без таковых. Исследована динамика содержания растворимых рецепторов sTNF-RI sTNF-RII, sIL-4R в зависимости от сроков развития системных патологических процессов. У больных с осложнениями методом ЭПР-зондов установлены структурно-функциональные изменения мембран МНК, которые могут приводить к повышению концентрации их растворимых рецепторов к цитокинам (sTNF-RI sTNF-RII, sIL-4R). Изучена роль метаболитов арахидоновой кислоты и гуморальных факторов иммунитета в развитии ранних послеоперационных осложнений. Выявлены изменения концентрации IgM, С3 компонентов комплемента, стимулированной продукции IFN- МНК и НФ, связанные с течением послеоперационного периода у онкологических больных после расширенных оперативных вмешательств. Показана элиминация цитокинов с мочой и посредством экстракорпоральных методов детоксикации при их недетектируемых уровнях в крови, что свидетельствует о наличии нековалентно связанных форм цитокинов, способных к диссоциации. Практическая значимость. На основании полученных результатов установлено, что повышение содержания в крови IL-10, длительное персистирование повышенных концентраций С3 компонента системы комплемента, снижение уровня IgM и стимулированной продукции IFN-α может быть использовано в качестве критериев прогноза развития ранних послеоперационных осложнений. Установлено прогностическое значение высоких концентраций IL-8 при развитии гнойно-воспалительных процессов. Уровни растворимых рецепторов к цитокинам sTNF-RI sTNF-RII, sIL4R могут рассматриваться в качестве прогностических иммунологических критериев послеоперационных осложнений. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Иммунопатогенез послеоперационных осложнений обусловлен нарушением соотношения цитокинов и их растворимых рецепторов, вовлечением гуморального иммунного ответа; снижением продукции регуляторных пептидов и метаболитов арахидоновой кислоты. 2. Низкие уровни сывороточных цитокинов не отражают истинных концентраций этих медиаторов в крови и могут быть следствием как гипо и/или ареактивности онкологических больных, так и результатом специфического связывания повышенными концентрациями растворимых рецепторов. 8 3. Снижение продукции цитокинов и функциональной активности МНК обусловлено блокированием экспрессии mRNA основных регуляторных пептидов. 4. Выявляемые при экстракорпоральных методах детоксикации в фильтратах и ультрафильтратах высокие концентрации цитокинов свидетельствуют о существовании нековалентно связанных комплексов этих медиаторов, способных к диссоциации при прохождении через гемофильтры и биологические мембраны. Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 работ, в том числе 9 статей в центральной печати, 13 тезисов в материалах международных конференций и съездов. Апробация диссертации. Диссертация апробирована 21.06.2002 г. на совместной научной конференции лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории нетоксичных иммуномодуляторов НИИ ЭДиТО, хирургического отделения торако-абдоминальной онкологии, отделения реанимации и детоксикации, отделения интенсивной терапии и реанимации, отделения изучения новых противоопухолевых лекарств НИИ КО, экспресс-лаборатории НИИ ДО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Основные положения диссертации представлены на первом объединенном конгрессе “Актуальные проблемы экстракорпорального очищения крови, нефрологии и гемафареза”, проводимого в г.Москве 29-31 мая 2002г; 18-th UICC International Cancer Congress, 30June-5July 2002 ОslоNorway; The 2nd International Conference on Tumor Microenvironment: Progression? Therapy and Prevantion. Baden, Austria, June 25-29, 2002. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, материалов и методов исследования, двенадцати глав экспериментальных исследований, заключения, выводов и указателя литературы; иллюстрирована 66 таблицами и 46 рисунками. Объем диссертации - 210 страниц машинописного текста. Материалы и методы исследования. В проспективное исследование включены 205 больных, лечение которых проведено в период с 1999 по 2002 гг. в РОНЦ РАМН (183 пациента) и ЦКБ (22). 178 больных прооперированы по поводу злокачественных (159) доброкачественных новообразований (10) и неонкологической патологии (9). Органная локализация солидных новообразований: легкое (37), желудок (53), пищевод (36), почки (11), мочевой пузырь (4), ободочная, слепая и прямая кишка (6), матка (3), яичники (3) и другие локализации (7). Оперативные вмешательства были выполнены в объеме одномоментной субтотальной резекции пищевода с пластикой желудком комбинированным лапаратомным и правосторонним торакотомным доступом – операции типа Льюиса (32), резекции нижнегрудного отдела пищевода и проксимального отдела желудка косым лапароторакотомным 9 доступом по Осава-Гарлоку – операции типа Гарлока (6), обходного пищеводного шунтирования (2), гастрэктомии (26), резекции желудка (20), пневмонэктомии (21), лобэктомии (10), нефрэктомии (10), гемиколэктомии (8), эксплоративных лапаротомий (7) и др.(17). Течение послеоперационного периода осложнилось у 93 пациентов ССВР (16), сепсисом (8), пневмонией (24), ПОН (21), ОПН (13), респираторным дистресс-синдромом (6), шоком (5). В зависимости от сроков развития послеоперационных осложнений, больные распределены на две группы: 1 гр. – с ранними, развившимися на 1-3 сут. послеоперационными осложнениями (52); 2 гр. – с присоединившимися на 4-7 сут. гнойносептическими осложнениями (41). В работе использованы методы: проточной цитофлюорометрии, конкурентного и сэндвич-ИФА (ELISA) с использованием коммерческих тест-систем (“Quantikine”, RD systems; “Diaclone”, France; “Neogen Corporetion”, USA; “ProCon”, Санкт-Петербург; ООО «Цитокин», СанктПетербург), определения NK-активности в цитотоксическом тесте (ЦТ), пролиферативной активности лимфоцитов, хемолюминесценции (ХЛ), радиальной иммунодиффузии по Манчини (РИД), RT-PCR, ЭПР-зондов. Для выявления наиболее ранних и общих иммунологических маркеров послеоперационных осложнений у онкохирургических больных тестированы уровни cывороточных медиаторов IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, TNF-, IFN-, растворимых рецепторов sTNF-RI, sTNF-RII, sIL-4R, sIL-6R), рецепторного антагониста IL-1Ra, метаболитов арахидоновой кислоты (LTB4 и TXB2) в динамике послеоперационного периода, проведено одновременное определение IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, TNF-a в крови, моче, отделяемом из дренажей, ультрафильтратах у осложненных больных с ЭКМД. Исследованы спонтанная и стимулированная (in vitro) продукция цитокинов и их растворимых рецепторов лейкоцитами, NK активность МНК, цитотоксичность НФ, пролиферативная активность лимфоцитов, ХЛ НФ онкологических больных в периоперационном периоде. Определена экспрессия mRNA генов основных цитокинов IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18, TNF-, IFN -, IFN- методом RT-PCR (совместно с НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи РАМН). Функциональное состояние липидного слоя мембран эритроцитов исследовано с помощью ЭПР-зондов (совместно с ГОСНИИОХТ). Статистическая обработка результатов произведена с использованием пакета прикладных программ “Statistica for Windows 5.0” (Боровиков В.П., 1998). Результаты исследований и их обсуждение. Цитокиновый профиль онкологических больных. Для проведения мониторинга содержания прои противовоспалительных цитокинов при развитии ранних послеоперационных осложнений, исследован медиаторный профиль 65 10 первичных онкологических больных с гистологически верифицированными злокачественными новообразованиями легких (n=16), желудка (n=23), пищевода (n=18), почек (n=8) в сравнении со здоровыми донорами (n=72). Органная локализация Легкое Пищевод Желудок Почки Всего I стадия T1N0M0 4 2 1 7 Распределение по стадиям II стадия III стадия IV стадия T1-2N0M0 T3-4N0-1M0 T2-4N1M1 2 9 1 6 6 4 5 6 11 1 3 4 14 24 20 Всего 16 18 23 8 65 У большинства обследованных больных исходные концентрации IL1, TNF-, IL-6, IL-4, определенные до оперативных вмешательств, варьируют в относительно узком диапазоне концентраций от 0 до 100 pg/ml. Уровни IL-10, IL-12, IL-13 не превышают 20 pg/ml. Исключение из исследованных цитокинов составляет IL-2, содержание которого в 77,3 % наблюдений превышает 200 pg/ml (табл.1). Таблица 1 Концентрации цитокинов в крови доноров и онкологических больных. Цитокины Концентрация сывороточных цитокинов в pg/ml (10-9 М/ml). Доноры (n=72) Онкологические больные (n=65) pg/ml 10-9 М/ml pg/ml 10-9 М/ml 0,93 1,56 IL-1 15,96,3 26,67,9 2,02 2,67 TNF- 34,312,0 45,511,3 IL-6 0,22 0,88 4,70,8 18,53,1 IL-4 3,13 1,14 56,58,7 246,5 IL-2 15,05 19,5 256,513,1 328,914,5 IL-10 0,48 0,59 8,32,9 10,12,3 IL-12 0,16 0 0 11,52,1 IL-13 0,89 0,04 10,73,2 0,50,1 Примечание: М – масса цитокинов, выраженная в молях. Р > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 Цитокиновые профили онкологических больных отличаются от здоровых доноров по содержанию IL-6, IL-4, IL-2, IL-12 и IL-13, однако, несмотря на достоверность различий, концентрации этих биорегуляторов находятся в пределах физиологических значений и не зависят от гистотипа и степени распространенности заболевания. Конкурентное взаимодействие цитокинов за общие субъединицы гетеродимерных (тримерных) рецепторных комплексов (-цепь является компонентом рецепторов для IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 и IL-15 [Giri J., et al., 1994; Kondo M., et al., 1993]), не образующих при этом пространственно- 11 детерминированных кластеров на мембране, определяет зависимость биологических эффектов цитокинов от их молярных соотношений (таб. 2). Таблица 2 Молярные соотношения цитокинов у доноров и онкологических больных. Молярные соотношения сывороточных цитокинов Обследованные группы IL-1 TNF- IL-6 IL-4 IL-2 IL-10 IL-12 IL-13 Доноры (n=72) 1 2 0,2 3 15 0,5 0,2 1 Онкологические 1,6 2,7 0,9 1 19 0,6 0 0,04 больные (n=65) По сравнению с донорами, в крови онкологических больных отмечается дисбаланс в соотношениях 5 исследованных цитокинов IL-6, IL4, IL-2, IL-12 и IL-13, однако наиболее существенные различия выявлены в соотношении IL-4 и IL-2. В сыворотке здоровых доноров молярные соотношения IL-4 и IL-2 составляют 1:5. У онкологических больных в системе IL-4:IL-2 наблюдается почти 4-х кратное превышение IL-2 (1:19), которое возможно имеет значение для развития неоплазий, так как по имеющимся данным, у одного из наиболее мощных пролиферативных цитокинов IL-2, все клеточные сигнальные пути активируют протоонкогены [Бережная Н.М. с соавт. 2000; Симбирцев А.С., 1998; Ярилин А.А., 1999], а IL-4, кроме участия в противовоспалительных реакциях, способен к регуляции экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости и таким образом к повышению цитотоксичности Т-киллеров [Hillman G. et al.,1994; Hoon D.S. et al., 1993]. Сочетанный с выявленным дисбалансом IL-4/IL-2 дефицит IL-12, основного цитокина, опосредующего NK-активность [Iwazawa T.et al, 2001; Smyth M.J. et al.,2001; Jyothi M.D., 2000; Wiltrout R.H., 2000; Takeda K. et al.,2000; Di Cardo E. et al., 2000], вероятно является условием, способствующим развитию неоплазий. Фактором, определяющим локализацию и гистотип опухоли, по литературным данным, может быть местное повышение экспрессии рецепторов к IL-2 и в дальнейшем аутокринная регуляция опухолевого роста [Бережная Н.М. с соавт.,1994 и 2000; Zamorano J.,1998; Lin W. et al, 1995; Sogn J., 1998; Heys S.D., 1994; Han D. Et al., 1996]. Для подтверждения выявленного дисбаланса исследованных медиаторов и оценки способности МНК продуцировать цитокины, у 10 здоровых доноров и 10 онкологических больных II-III ст. со злокачественными новообразованиями легких (6) и пищевода (4) методом RT-PCR исследована экспрессия mRNA IL-1, TNF-, IL-6, IL-8, IL-4, IL-10, IL-2, IL-12, IL-18, IFN- и IFN- (табл.3.). Качественный анализ экспрессии mRNA цитокинов свидетельствует о том, что у доноров в основном активированы mRNA IL-1 и TNF-. Возможно, это обеспечивает наличие некоторых количеств этих цитокинов в преформированном состоянии, что является необходимым условием для 12 поддержания и реализации иммунного ответа и соответствует представлениям об основной роли IL-1, действующего синергично с TNF- [Ковальчук Л.В. с соавт., 2001]. Таблица 3 Экспрессия mRNA основных цитокинов МНК доноров. IL-1 TNF- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Р(+) Р(-) Sp + + + + + + + + + + 1 0 0 0 + + + + + + + + + + 1 0 0 0 IL-6 IL-4 IL-2 + + + + + + 0,6 0,4 0,49 0,155 + 0,1 0,9 0,30 0,095 0 1 0 0 IL-8 IL-10 + + + + + + 0,6 0,4 0,49 0,155 IL-12 + + + + + + + + + + + + + + 0,6 0,8 0,4 0,2 0,49 0,4 0,155 0,127 IL-18 IFN- IFN- + + + + 0,4 0,6 0,49 0,155 + + 0,2 0,8 0,4 0,127 0 1 0 0 Примечание: «+» наличие или «-» отсутствие полосы идентифицированной mRNA; P – доля (+) и (-), - стандартное отклонение, Sp – стандартная ошибка доли. Экспрессия у 80 % доноров mRNA IL-12, ключевого цитокина, усиливающего цитотоксичность NK-клеток и T-киллеров, [Oleksowicz L., 1994; Coutelier J.P., 1995; Vitolo D., 2000] обуславливает функционирование клеточного иммунитета. В интактных МНК доноров не обнаружены mRNA IFN-, IFN-, IL-2, IL-4, поэтому тестируемые в крови IL-4 и IL-2, возможно, продуцируются другими клетками организма. Спектр экспрессированных mRNA генов цитокинов МНК онкологических больных до оперативных вмешательств (табл. 4), отличается от здоровых доноров инверсией активации mRNA IL-2 и IL-12. Блокирование экспрессии mRNA IL-12, обладающего прямым противоопухолевым действием [Nastala C.L.,1994; Eto M., 2000; Smyth M.J.,2000], и как отмечено выше, инициирующего клеточный тип иммунного ответа с усилением цитотоксичности NK-клеток и T-киллеров [Stern A.S., 1990; Oleksowicz L., 1994] подтверждается снижением спонтанной киллерной активности этих эффекторов у онкологических больных. 13 Таблица 4 Экспрессия mRNA основных цитокинов МНК онкологических больных. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Р(+) Р(-) Sp IL-1 TNF- + + + + + + + + + + 1 0 0 0 + + + + + + + + + + 1 0 0 0 IL-6 IL-4 + + + + + + + + + + + + + + + 0,9 0,6 0,1 0,4 0,3 0,49 0,095 0,155 IL-2 IL-8 + + + + + + + + + + 1 0 0 0 + + + + + 0,5 0,5 0,5 0,158 IL-10 IL-12 IL-18 IFN- IFN- + + + + + + + + + + 1 0 0 0 0 1 0 0 + + + + + + + + 0,8 0,2 0,4 0,127 + + 0,1 0,1 0,9 0,9 0,30 0,3 0,095 0,095 Примечание: «+» наличие или «-» отсутствие полосы идентифицированной mRNA; P – доля (+) и (-), - стандартное отклонение, Sp – стандартная ошибка доли. Интра- и послеоперационный анализ динамики концентраций сывороточных цитокинов. Периоперационный посуточный мониторинг сывороточных цитокинов проведен с целью определения роли про- и противовоспалительных цитокинов в развитии ранних послеоперационных осложнений. Из 118 онкологических больных с расширенными оперативными вмешательствами у 73 пациентов развились осложнения: ССВР (10), сепсис (8), ПОН (20), пневмония (20), ОПН (12), шок (5). У 45 пациентов ранний послеоперационный период протекал без осложнений, со стабилизацией состояния на 6-7 сутки. Анализ динамики основных провоспалительных медиаторов IL-1, TNF- и IL-6 свидетельствует о том, что достверных различий в содержании свободных цитокинов у больных с осложнениями и без таковых не выявлено (таб. 5-7). Независимо от течения послеоперационного периода и исхода развившихся осложнений, у основной части больных детектированы низкие или физиологические концентрации медиаторов. В ряде случаев тестированы высокие уровни IL-1, которые не были связаны с клиническим течением послеоперационного периода и обнаруживались в обследованных группах с осложнениями и без таковых. Более того, у неосложненных больных в отдельных наблюдениях обнаружены пиковые концентрации IL1, достигающие 1500 pg/ml. 14 Таблица 5 Динамика IL-1 в раннем послеоперационном периоде. Сроки исслед (сут.). Д/о 1 сут. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Концентрация IL-1 в сыворотке в pg/ml больные без осложнений (n=45) больные с осложнениями (n=73) % проб с % проб с М m M m недетектир. недетект. Уровнем Уровнем. 32,610,7 80,811,4 90,520,3 61,617,5 63,524,2 47,514,5 62,914,9 59,423,2 63 62 77 78 50 67 75 65 170,4 53,8 87,1 32,2 170,9 62,2 64,2 21,0 133,5 42,4 113,5 39,7 73,3 53,1 176,2 62,3 207,5 67,9 176,4 46,1 189,7 31,2 66 57 53 67 55 47 50 67 52 50 64 Р >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 Примечание: М-среднее значение; m-ошибка среднего значения. У больных с сепсисом, содержание IL-1, как правило, не превышает физиологических значений. Аналогичные результаты получены Тимоховым В.С. с соавт. [1997] на неонкологических больных. Уровни свободного TNF- в обследованных группах с осложнениями и без таковых, также достоверно не различаются и не повышаются при системных патологических процессах (табл.6). Таблица 6 Динамика TNF- в раннем послеоперационном периоде. Сроки Концентрация TNF- в сыворотке (pg/ml) исследо Больные без осложнений(n=45) больные с осложнениями (n=73) вания Md % проб с Md % проб с Мm Mm (сут.). недетект. недетектир. уровнем. Уровнем. Д/о 1 сут. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 51,28,7 71,611,9 76,520,3 67,330,7 59,521,9 49,724,9 59,427,3 39,110,7 48,6 57,4 54,3 67,3 15,5 8,0 29,2 25,8 13 19 15 13 12 16 14 10 112,2 26,4 94,2 19,5 84,4 27,8 73,5 20,5 162,4 44,2 96,9 33,1 155,2 40,3 178,5 87 151,2 105 161,4 105 165,7 91 52,8 52,5 50,6 50,3 49,8 48,2 53,2 58,4 48,2 51,6 49,8 12 7 25 22 13 23 22 11 33 16 25 Р > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Примечание: М-среднее значение; m-ошибка среднего значения; Md – медиана. 15 Несмотря на многочисленные публикации о высокой прогностической значимости TNF- при сепсисе, септическом шоке и др., у онкологических больных с системными патологическими процессами не выявлено достоверной связи уровня TNF- с течением и исходом послеоперационных осложнений, что подтверждается исследованиями Calandra T., et al. [1989]. Прогностический вклад TNF- при сепсисе составляет 1% (с 83% при использовании традиционных критериев до 84% с учетом уровня TNF-). Случаи гипер- и гипоцитокинемии по TNF- в группах умерших и выживших пациентов с сепсисом показаны Шано В.П. с соавт. [1999]. Независимо от клинических последствий и исхода развившихся осложнений, для IL-6 были характерны низкие/недетектируемые посттравматические концентрации (табл. 7), хотя в ряде работ [Tilman S., Rosenbloom A.J., Meduri G.U. and Kragsbjerg P., 1995; Дроздов В.Н., 1999; Мухоедова Т.В., 2002] приводятся данные о прогностически неблагоприятной роли высоких концентраций этого провоспалительного цитокина, который рассматривается не только как информативный критерий тканевого повреждения, но и параметр тяжести сепсиса, септического шока, ПОН. Более того, по мнению В.Н.Дроздова, уровень IL-6 “тесно” коррелирует с гнойными осложнениями в послеоперационном периоде. Эти выводы, сформулированы на основании противоречивых данных и немногочисленных исследований (6 больных, из них 4 умерших). Таблица 7 Динамика IL-6 в раннем послеоперационном периоде у онкологических больных. Сроки исслед (сут.). Д/о 1 сут. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Концентрация IL-6 в сыворотке в pg/ml Больные без осложнений больные с осложнениями (n=73) (n=45) % проб с % проб с недетект. недетектируем. М m M m уровнем. уровнем. 8,52,5 4,33,6 3,11,2 6,12,3 69,49,8 29,713,6 16,48,4 7,55,1 69 78 79 65 68 71 63 67 15,6 8,6 13,8 6,9 16,2 9,5 24,2 9,1 31,8 14,2 50,5 14,8 8,1 4,3 37,6 11,5 4,8 2,7 5,3 1,1 0 6 2,5 78 69 78 60 67 72 70 65 62 67 72 Примечание: М-среднее значение; m-ошибка среднего значения. Р > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 16 Достоверных различий в содержании IL-8 в раннем послеоперационном периоде у больных без осложнений (n=25) и с таковыми (n=32) в целом не выявлено, однако у некоторых пациентов были тестированы пиковые концентрации IL-8, достигающие 7000 pg/ml. При анализе течения послеоперационного периода у этих пациентов выявлено развитие гнойно-воспалительных процессов (поддиафрагмальный или межкишечный абсцесс, перитонит и т.д.). Примерно за сутки до клинических проявлений гнойно-воспалительных осложнений концентрация IL-8 повышалась, однако после адекватной санации гнойного очага и антибиотикотерапии уровень IL-8 снижался до физиологических значений. Эти результаты свидетельствуют о том, что IL-8 может рассматриваться как маркер гнойно-воспалительных процессов. При анализе данных с помошью компьютерной программы «Статистика 5.5» методом X2 – квадрата в зависимости от характера и тяжести послеоперационных осложнений не выявлено достоверных различий в группах больных с ПОН, сепсисом, септическим шоком, ОПН, пневмонией. Установлено, что повышение уровней свободных цитокинов информативно для определения вероятности и степени выраженности осложнений только в концентрациях, превышающих 1000 pg/ml для TNF-α и IL-1β. Таким образом, результаты тестирования основных провоспалительных цитокинов не выявили достоверных различий у онкологических больных в зависимости от течения послеоперационного периода, что согласуется с данными мультицентровых исследований о статистически недостоверной эффективности лечения больных с сепсисом и септическим шоком (n=4000) моноклональными антителами к таким цитокинам как IL-1 и TNF- [Abraham E.,1998]. Более того, блокирование IL-1 сопровождалось повышением летальности больных [Abraham E.,1998]. Результаты посуточного мониторинга свободных цитокинов у онкологических больных в сравнении с приведенными данными требуют пересмотра устоявшихся представлений о неконтролируемых каскадномедиаторных процессах в генезе тяжелых послеоперационных осложнений – сепсиса, ПОН. Отсутствие достоверных различий в медиаторном профиле по основным исследованным провоспалительным цитокинам у онкологических больных в зависимости от последовательности клинических событий, характера и тяжести состояний, свидетельствует о том, что уровни свободных провоспалительных цитокинов недостаточно информативны в плане прогноза развития ранних послеоперационных осложнений. С целью определения роли противовоспалительных цитокинов в развитии ранних послеоперационных осложнений, у этих же больных параллельно тестированы IL-4 и IL-10 (табл.8 и рис.1). Согласно полученным данным, достоверные различия в содержании IL-4 в обследованных группах больных с осложнениями и без таковых не выявлены (табл. 8.). 17 Таблица 8 Динамика IL-4 в раннем послеоперационном периоде у онкологических больных. Концентрация IL-4 в крови (pg/ml) Сроки Больные без осложнений больные с осложнениями (n=73) Р исслед (n=45) (сут.). Md % проб с Md % проб с М m Mm недетект. недетект. уровнем. уровнем Д/о 40 0 50 > 0,05 18,54,6 8,8 41,8 21,3 1 сут. 16,75,8 4,3 38 46 > 0,05 33,4 10,1 5,2 2 39 29 > 0,05 19,910,3 6,3 82,5 45,7 25,2 3 25 35 > 0,05 33,410,2 9,5 29,6 7,6 18,0 4 40 22 > 0,05 41,419,7 3,2 78,6 26,3 47,4 5 36 29 > 0,05 15,66,3 10,1 59,1 23,7 24,0 6 25 25 > 0,05 9,45,2 15,4 27,8 13,9 13,9 7 33 0 30 > 0,05 39,112,7 30,5 30,2 16,3 8 25 62,9 20,8 45,4 9 28 51,9 7,5 55,8 10 40 34,9 16,4 29,7 Примечание: М-среднее значение; m-ошибка среднего значения; Md – медиана. По данным Мухоедовой Т.В. [2002] «высокая амплитуда провоспалительного компонента, независимо от его состава, является детерминантой ПОН, но при условии двукратного или четырехкратного (в среднем) превышения уровня IL-4». Обратные пропорции с 3-8 кратным преобладанием IL-4, якобы, обеспечивают протективное действие. Максимальная степень дисбаланса, выявленная при септическом шоке, составляет 64:1 [Мухоедовой Т.В., 2002]. В отличие от IL-4, содержание IL-10 достоверно повышается у осложненных больных и является более информативным параметром (рис.1). 70 * 60 50 осложненные * * * * pg/ml 40 без осложнений * * * 30 20 10 0 д/о 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 сутки Т Рис.1. Динамика IL-10 в группе больных с благоприятным и осложненным течением послеоперационного периода; * - достоверные (p<0,05) различия; Т-терминальные состояния. 18 160 140 120 100 80 60 40 20 0 pg/ml Содержание IL-10 в крови осложненных больных стабильно нарастает, достоверно отличаясь от динамики изменения концентрации этого цитокина у пациентов с благоприятным течением послеоперационного периода и не коррелирует с уровнем IL-4. Амплитуда и темпы нарастания концентрации IL-10 у больных с осложнениями в 1-3 сут. были значительно выше, чем при развившихся в более поздние сроки гнойно-септических осложнениях (рис.2). осложненния в 1-3 сут. осложнения на 5-7 сут. сепсис * * * * 6 7 * д/о 1 2 3 4 5 8 9 10 15 сутки т Рис.2. Динамика IL-10 в группе больных с неблагоприятным течением послеоперационного периода в зависимости от сроков развития осложнений. * - достоверные (p<0,05) различия; Т-терминальные состояния. Таким образом, несмотря на многочисленные публикации о прогностической роли исследованных медиаторов, ежедневный мониторинг провоспалительных цитокинов у онкологических больных с тяжелыми послеоперационными осложнениями не выявил достоверных различий по сравнению с больными без осложнений. Полученные в результате исследований низкие и, для некоторых цитокинов, недетектируемые концентрации в крови онкологических больных при тяжелых послеоперационных осложнениях могут быть следствием как истинной медиаторной гипо-/ареактивности, так и быстрым специфическим и/или неспецифическим связыванием и исчезновением из системного кровотока свободных форм этих биологически активных соединений. Поэтому даже при ежедневном мониторинге с однократным отбором образцов крови в течение суток, вероятность выявления свободных цитокинов настолько мала, что обсуждаемые в подавляющем большинстве работ результаты “динамических” (1; 3; 5; 7 и т.д. сут.) наблюдений малоубедительны, тем более, что время циркуляции свободных цитокинов в системном кровотоке колеблется от десятков минут до нескольких часов [Фрейдлин И.С., Симбирцев А.С., 1998]. Почасовой периоперационный мониторинг IL-1, TNF- и IL-6 в первые операционные сутки. Проведение более детального, почасового мониторинга этих медиаторов в первые операционные сутки, включая интраоперационный период, обусловлено тем, что в преформированном состоянии цитокины 19 обнаруживаются в небольшом количестве и как индуцебельные белки, синтезируются в ответ на разные сигналы, включая операционную травму. mRNA некоторых цитокинов обнаруживаются через 15 мин., а максимум синтеза у разных провоспалительных медиаторов наблюдается только через несколько часов: IL-1 в первые 12-24 часа, TNF- начиная с 12 до 48 часов, а IL-6 через 24-48 часов. Почасовой периоперационный мониторинг IL-1, TNF- и IL-6, проведенный в первые сутки у 46 онкологических больных с расширенными оперативными вмешательствами по поводу рака пищевода (13), желудка (13), легкого (7), почек (7) и др. локализаций (6) оказался более информативным в плане последующего прогноза клинического течения послеоперационного периода. Однако у большей части обследованных пациентов в двух сравниваемых группах с осложнениями (n=25) и без таковых (n=21) на протяжении 20-ти часов наблюдений сохранялись “нулевые” или недетектируемые концентрации цитокинов. Тем не менее, динамика исследованных цитокинов характеризовалась рядом особенностей, потребовавшей их индивидуального описания. IL-1. В интраоперационном периоде практически у всех больных, независимо от длительности оперативных вмешательств (от 3 часов при нефрэктомии до 6-8 час. при операциях типа Льюиса) и течения послеоперационного периода не выявлено эпизодов системного повышения основного провоспалительного цитокина IL-1. Однако, уже в первые часы после завершения оперативных вмешательств у 38% пациентов отмечено системное повышение IL-1 (в среднем до 258,1 15,2 pg/ml по сравнению с исходными 38,212,4 pg/ml, p<0,05), при этом в 27 % случаев тестированы умеренно повышенные (>100 pg/ml), а в 7% - чрезвычайно высокие концентрации IL-1 (от 944 до 1999 pg/ml). У 62 % пациентов после оперативных вмешательств IL-1 не обнаружен в крови. В группе больных с развившимися впоследствии осложнениями, в первые часы после операции “нулевые” концентрации отмечены в 75% случаев, а у неосложненных – только в 53%. В последующие 20 часов наблюдений у 50% больных с осложнениями зарегистрированы эпизоды (3-5 час.) подъема уровня IL-1 от 300 до 500 pg/ml. Повышение IL-1 предшествовало дыхательной недостаточности, стойкой артериальной гипотензии и острой почечной недостаточности (ОПН). Временной промежуток между подъемом и манифестацией осложнений не превышал 5-7 часов, но на высоте клинических проявлений осложнений IL-1 в крови уже не определяется. В то же время, у 50 % больных тяжелые послеоперационные осложнения развиваются на фоне недетектируемых значений IL-1. Динамика уровня TNF- во время операции у неосложненных больных характеризуется стабильным повышением его содержания с 58,314 (исходные значения) до 120,523 pg/ml к концу операции. У больных с 20 развившимися впоследствии осложнениями, в интраоперационном периоде содержание TNF- варьирует в узком диапазоне концентраций от 62,517 pg/ml до 8019 pg/ml. На протяжении двадцати часов непрерывных наблюдений (первые операционные сутки) в зависимости от характера, сроков развития и исхода осложнений не выявлено достоверных различий в содержании TNF- в обследованных группах больных. IL-6 в интраоперационном периоде обнаружен только у 20% пациентов в диапазоне концентраций от 15 до 91,5 pg/ml. Частота выявления IL-6 несколько выше у осложненных больных (22%), чем в группе без осложнений (14 %). После операции IL-6 обнаруживается уже в 60 % наблюдений, при этом индивидуальные колебания концентраций находятся в пределах от 15 до 2230 pg/ml. Средние значения IL-6 в зависимости от клинических событий различаются и соответственно для осложненных и неосложненных больных составляют 124,3pg/ml (частота встречаемости 40%, от 9 до 37pg/ml) и 32 17,2pg/ml (67%, 15-208 pg/ml). Таким образом, после завершения оперативных вмешательств, в группе онкологических больных без осложнений по сравнению с осложнеными чаще определяются IL-1 (47% против 25%), а концентрации TNF- и IL-6 выше. Это свидетельствует о том, что у больных без осложнений развивается более адекватная реакция на травму, которая проявляется в синтезе провоспалительных медиаторов. Результаты, полученные при мониторинге цитокинов свидетельствуют о том, что независимо от течения послеоперационного периода выделяются две группы больных с разным медиаторным профилем. Механизм медиаторной ареактивности в раннем послеоперационном периоде у онкологических больных подтвержден молекулярно-биологическими (RTPCR) и иммунологическими методами (спонтанной и стимулированной продукцией цитокинов МНК). В первые часы после оперативных вмешательств у большей части больных с развившимися впоследствии осложнениями не экспрессируются mRNA IL-1, TNF-, но активируются гены противовоспалительных цитокинов (таб.9). mRNA противовоспалительного IL-10 после оперативных вмешательств экспресирована практически у всех больных. Приблизительно через 4-6 часа после оперативных вмешательств, МНК онкологических больных в 70 % наблюдений не экспрессируют mRNA IL-1, а в 50 % - TNF-. Кинетика накопления mRNA [Auron P.E., et al, 1985 и Lindberg K., et al., 1994] провоспалительных цитокинов и в частности IL-1, с максимумом экспрессии через 3-4 часа после стимуляции, подтверждает длительную, сохраняющуюся и в последующие сутки, послеоперационную гипои/или ареактивность по основным провоспалительным медиаторам у части обследованных больных (табл.10). 21 Таблица 9 Экспрессия mRNA основных цитокинов МНК онкологических больных после операции. IL-1 TNF- IL-6 IL-4 IL-2 IL-8 IL-10 IL-12 IL-18 IFN- IFN- 1 + + + + + 2 + + + 3 + + + + + 4 + + + + 5 + + + + + + + + 6 + + + + + 7 + + + + 8 + + 9 + + + + 10 + + + + + Р(+) 0,3 0,5 0,4 0,3 0,6 0,2 1 0,2 0,8 0 0,2 Р(-) 0,7 0,5 0,6 0,7 0,4 0,8 0 0,8 0,2 1 0,8 0,46 0,5 0,49 0,46 0,49 0,4 0 0,4 0,4 0 0,4 Sp 0,145 0,158 0,155 0,145 0,155 0,127 0 0,127 0,127 0 0,127 Примечание: «+» наличие или «-» отсутствие полосы идентифицированной mRNA; P – доля (+) и (-), - стандартное отклонение, Sp – стандартная ошибка доли. В первые сутки после операций экспрессия mRNA IL-1 в МНК восстанавливается в основном только у неосложненных больных (№ 5,8,10), что подтверждает данные, полученные в ИФА. Активация mRNA TNF- без соответствующей экспрессии mRNA IL-1 и IL-6 наблюдается у больных с ранними послеоперационными осложнениями. Очевидно, для развития адекватного и полноценного иммуновоспалительного ответа на хирургическую травму, необходимо синхронное и согласованное действие ряда провоспалительных цитокинов, что подтверждается неразрывностью их действия в очаге воспаления и схожестью распределения соответствующих рецепторов на клетках-мишенях [Ковальчук Л.В. с соавт., 2001]. Таблица 10 Экспрессия mRNA цитокинов МНК онкологических больных на 1сут. после операции. IL-1 TNF- IL-6 IL-4 IL-2 IL-8 IL-10 IL-12 IL-18 IFN- IFN- 1 + + + + + 2 + + + + + 3 + + + 4 + + + 5 + + + + + + + + + + 6 + + + + + + 7 + + + + 8 + + + + + + 9 + + + + + 10 + + + + + + Р(+) 0,4 0,8 0,4 0,3 0,4 0,1 1 0,9 0,5 0,2 0,3 Р(-) 0,6 0,2 0,6 0,7 0,6 0,9 0 0,1 0,5 0,8 0,7 0,49 0,40 0,49 0,46 0,49 0,30 0 0,30 0,50 0,40 0,46 Sp 0,155 0,127 0,155 0,145 0,155 0,095 0 0,095 0,158 0,127 0,145 Примечание: «+» наличие или «-» отсутствие полосы идентифицированной mRNA; P – доля (+) и (-), - стандартное отклонение, Sp – стандартная ошибка доли. 22 На 3-6 сут. после операции цитокиновый профиль практически у обследованных пациентов не восстанавливается, однако у больных без осложнений сохраняется экспрессия mRNA основного провоспалительного цитокина IL-1 и mRNA IL-12. МНК больных с осложнениями не экспрессируют mRNA не только IL-1, но практически всех остальных цитокинов (табл.11). Таблица 11 Экспрессия mRNA цитокинов МНК онкологических больных на 3-6 сутки после операции. IFN- IFN- IL-1 IL-2 IL-4 IL-6 IL-8 IL-10 IL-12 IL-18 TNF- 1 + 2 + 3 + + 4 + 5 + + + + + + + + 6 + + + + + + + 7 + + + + + + 8 + + + + + + + + 9 + + + 10 + + + Р(+) 0,2 0,2 0,3 0,3 0,4 0,4 0,1 0,5 0,3 0,8 0,5 Р(-) 0,8 0,8 0,7 0,7 0,6 0,6 0,9 0,5 0,7 0,2 0,5 0,4 0,4 0,46 0,46 0,49 0,49 0,30 0,50 0,46 0,40 0,50 Sp 0,127 0,127 0,145 0,145 0,155 0,155 0,095 0,158 0,145 0,127 0,158 Примечание: «+» наличие или «-» отсутствие полосы идентифицированной mRNA; P – доля (+) и (-), - стандартное отклонение, Sp – стандартная ошибка доли. Таким образом, после оперативных вмешательств и на протяжении последующих 3-6 сут. отмечены динамические изменения в экспрессии mRNA почти всех цитокинов, что во многом определяется течением послеоперационного периода. Наиболее характерные изменения отмечены в экспрессии mRNA основного провоспалительного цитокина IL-1, которая ингибирована у всех осложненных больных и не восстанавливается в раннем послеоперационном периоде именно у этих пациентов. Методом RT-PCR подтверждены эффекты, наблюдаемые в ИФА: экспрессия mRNA и продукция цитокинов в динамике послеоперационного периода у части онкологических больных в основном совпадают, но в ряде случаев при выявлении mRNA цитокина в RT-PCR, в супернатантах МНК он не обнаруживается. Поскольку процессы транскрипции и трансляции регулируются независимо друг от друга, то они могут быть и не связаны между собой. Явления диссоциации транскрипции и трансляции, в зависимости от стимулирующего агента или прикрепления моноцитов к пластику, описаны для IL-1 цитокинов [Schindler R., et al.,1990]. Некоторые индукторы синтеза IL-1, например С5-компонент комплемента, вызывают прохождение только этапа транскрипции с накоплением mRNA, которая 23 быстро подвергается деградации без последующей трансляции [Schindler R., et al.,1990, Симбирцев А.С., 1998]. Периоперационный мониторинг цитокинов в биоматериалах (дренажах, моче и сыворотке) у осложненных онкологических больных проведен у больных с шоком (2), ПОН (4), ОПН (3) в фазе олиго- и анурии, развившейся после расширенных оперативных вмешательств на пищеводе, желудке и после нефрэктомии. Периоперационный мониторинг цитокинов в биоматериалах (дренажах, моче и сыворотке) у осложненных больных с “нулевыми” сывороточными уровнями, позволяет выявить повышенные (до 5000 pg/ml) концентрации цитокинов в отделяемом из дренажей и моче, что в свою очередь косвенно свидетельствует о присутствии в крови онкологических больных значительных количеств медиаторов в “скрытых”, возможно мембранно-связанных формах или иных комплексах, недетектируемых ИФА. В качестве подтверждения приведены результаты периоперационного мониторинга основных провоспалительных цитокинов у больных с осложнениями. На пике клинических проявлений геморрагического шока с выраженной артериальной гипотензией (АД 50/0) и в последующие часы в сыворотке детектируются низкие концентрации IL-1 (63 pg/ml). При восстановлении артериального давления усиливается экскреция IL-1 с мочой, который вероятнее всего содержится в сыворотке в избыточном количестве, но не детектируется (рис.3). сыворотка pg/ml 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 * дренаж плевральный дренаж брюшной моча * * д/о 15:20 18:00 20:00 22:00 Рис.3. Периоперационный мониторинг IL-1 (10-22 час.) у больного с шоком, развившемся после операции; *-достоверные (р<0,05) различия. Повышение IL-6 в отделяемом из дренажей с 1209 до 3266 pg/ml (рис.4) очевидно связано с местной продукцией, не сопровождается увеличением его содержания в крови и адекватной экскрецией с мочой. 24 сыворотка дренаж плевральный дренаж брюшной моча pg/ml 3300 3000 2700 2400 2100 1800 1500 1200 900 600 300 0 * * * д/о 15:20 * * 18:00 20:00 22:00 Рис.4. Мониторинг IL-6 в биоматериалах в периоперационном периоде у больного с шоком, развившемся после операции (18 час.);* - достоверные (р<0,05) различия. Наличие в сыворотке связанного IL-1β подтверждается выявлением высоких уровней этого цитокина в отделяемом из дренажей и почти синхронной его экскрецией с мочой (рис.5). 600 дренаж pg/ml 500 * сыворотка * моча 400 300 * * 20:00 22:00 * 200 100 0 д/о 16:00 18:00 1сут. 2сут. Рис.5.Мониторинг IL-1 в периоперационном периоде. *- достоверные (р<0,05) различия. На фоне высокой (1178,8 pg/ml) продукции в послеоперационной ране, в сыворотке IL-6 не обнаруживается, а экскреция его с мочой минимальна. Снижение концентрации IL-6 в отделяемом из дренажей до 624,9 pg/ml сопровождается повышением его элиминации с мочей (рис.6). 25 сыворотка 1400 дренаж pg/ml 1200 * * * моча 1000 800 * 600 400 * * 200 0 д/о 16:00 18:00 20:00 22:00 1сут. 2сут. Рис.6 Мониторинг IL-6 в периоперационном периоде; *- достоверные различия (р<0,05). В связанном состоянии цитокины, очевидно, не инактивированы и сохраняют способность диссоциировать из комплексов, что подтверждено при анализе биоматериалов 18 больных с ЭКМД (ОПН с олиго-и анурией). Несмотря на индивидуальные особенности течения послеоперационного периода, разные показания к проведению ЭКМД, длительность процедур и объемы замещающего раствора и др., общим для данной категории больных были низкие или неопределяемые концентрации сывороточных цитокинов на фоне ОПН. Вместе с тем, уже в начальных порциях фильтратов (до 10 литров) были обнаружены чрезвычайно высокие концентрации медиаторов (до 700 pg/ml TNF-), содержание которых снижается к концу процедуры (в последних 10 л концентрация TNF- составляет около 200 pg/ml.). Аналогичные результаты – наличие значительных количеств TNF- и IL-1 в ультрафильтрате без существенного изменения плазменного уровня получены Bellomo R., et al.[1991]. И.И.Яковлевой с соавт. [1999] представлены данные об отсутствии достоверных различий в содержании TNF-, IL-1 в плазме и ультрафильтрате и интенсивной элиминации провоспалительных цитокинов при постоянной ГФ. Приблизительное содержание TNF- в 60 л замещающего раствора (обычно применяемый объем) в среднем составляет около 21000000 pg. При этом концентрация TNF- в крови с учетом общего объема циркулирующей крови (в среднем 5л), должна была бы достигать 4200 pg/ml. Это примерно в 42 раза превышает верхние пределы физиологических концентраций этого медиатора, что подтверждает гипотезу Schetz M. с соавт. [1995], об удалении медиаторов воспаления при гемофильтрации и ее эффективности вследствие элиминации провоспалительных цитокинов [Тимохов В.С. с соавт., 1997; Яковлева И.И. с соавт., 1999]. В качестве примера приведены результаты почасового мониторинга содержания цитокинов в сыворотке и фильтрате у больного с ОПН (табл.12). Уровни сывороточных цитокинов IL-1, TNF-, IL-6 и IL-4 при почасовом периоперационном мониторинге накануне острой сосудистой 26 недостаточности, шока и ОПН не превышали физиологических значений (0100 pg/ml). Обнаружение в фильтрате высоких концентраций медиаторов, на порядок превышающих уровни сывороточных, подтверждает не только их наличие в системном кровотоке, но является доказательством их способности к диссоциации из сывороточных комплексов не только при прохождении через искусственные гемофильтры, но и биологические мембраны почки и, возможно, в других органах. Таблица 12 Мониторинг цитокинов в сыворотке крови и фильтрате при ГФ. Время проведения Сеанс ГФ 1 Д/о 1050 1440 1635 1 сут. 1800 2000 2200 2400 600 800 2 сут. Шоковая почка 1000 1400 1600 3 сут. 4 сут. 5 сут. 6 сут. 7 сут. Концентрация цитокинов pg/ml IL-6 IL-1 TNF- сыв. фильт. сыв. фильт. сыв. фильт. 0 53,7±8 0 0 45,8±5 0 0 50,3±7 0 0 46,9±7 0 0 60,5±8 0 0 58,2±4 0 0 49,2±5 0 0 49,2±3 0 0 46,9±6 0 0 50,7 0 IL-4 сыв. Фильт. 31,9±3 5,9±1 14,8±3 0 1,9±0,2 8,4±2 7,7±2 9,1±1 6,6±2 10,5±3 0 52,6±5 0 9,1±1 0 0 75,3±8 119±10 0 0 14,1±2 11,9±4 1900 0 2230 0 2400 600 1000 0 0 0 0 0 0 0 523±21 673±23 50,3±6 * * 104±19 174±12 52,6±9 * * 54,8±3 49,2±4 52,6±4 45,8±6 55,9±3 51,3±5 49,2±4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 235±18 * 107±20 60,2*±7 15,2±2 * 22,7±3 42,9±5 21,9±4 4,1±1 4,8±2 4,0±1 0 27,4±3 25,2±6 Примечание:*-достоверные различия (p<0,05) по сравнению с сывороточными уровнями. Нековалентный характер специфического связывания с рецепторными лигандами способствует диссоциации цитокинов [Ковальчук Л.В. с соавт., 2001]. Локальное высвобождение значительных количеств цитокинов, обладающих вазоконстрикторными свойствами, в так называемых “шоковых” органах – почках, легких и т.д., может обуславливать развитие ОПН, интерстициальных отеков легких и таких системных патологических процессов как шок, ПОН; т.е. цитокины сами по себе способны 27 инициировать практически весь спектр наблюдаемых в послеоперационном периоде осложнений. Эти выводы согласуются с многочисленными исследованиями патофизиологической роли цитокинов в избыточной продукции метаболитов арахидоновой кислоты, нарушении микроциркуляции, снижении артериального давления, внутрисосудистого свертывания крови – характерными клиническими проявлениями септического шока [Standiford T., et al., 1992; Casey L.C., 1993]. Существование недетектируемых, но не инактивированных форм медиаторов, подтверждает факт их возможно более длительного персистирования в системном кровотоке, вопреки устоявшиеся представлениям о местной продукции и метаболизме цитокинов [Фрейдлин И.С., 1999; Симбирцев А.С.,1998]. Таким образом, детектируемые в ИФА уровни сывороточных медиаторов не отражают истинных концентраций и требуют дополнительного исследования содержания связанных цитокинов. Однако применение современных коммерческих тест-систем для количественного определения связанных цитокинов ограничивается во–первых, используемыми для этих целей менее точными непрямыми разновидностями ИФА (конкурентным и ингибиторным); во-вторых, интегральной оценкой свободных и связанных цитокинов. Учитывая это, представляется наиболее целесообразным исследование не самих цитокинов, а факторов, обуславливающих их специфическое связывание в сыворотке – растворимых рецепторов к цитокинам. Исследование растворимых рецепторов основных цитокинов. Исходно низкие/недетектируемые уровни провоспалительных цитокинов, и в первую очередь TNF, у онкологических больных могут быть обусловлены лиганд-рецепторным дисбалансом, высоким содержанием рецепторных антагонистов и растворимых рецепторов к этим цитокинам. С целью изучения механизма послеоперационной медиаторной гипои/или ареактивности у онкологических больных (n=42) исследован исходный рецепторный профиль в сравнении со здоровыми донорами (n=20) (табл.13). Таблица 13 Уровни IL-1ra, sTNF-RI, sTNF-RII, sIL-4R и sIL-6R в сыворотке больных и здоровых доноров. Обследованные Концентрация в pg/ml группы IL-1ra sTNF-RI sTNF-RII sIL-4R sIL-6R Доноры (n=20) 406,3 72 965 25 2135,1 53 987,5 78 12279 262 Больные (n=42) 285,5 196 2433,5 43 2950,4 80 910,2 111 11180 395 P >0,05 <0,05 <0,05 >0,05 > 0,05 В отличие от доноров, у онкологических больных в сыворотке достоверно повышено содержание двух типов растворимых рецепторов к одному из основных провоспалительных цитокинов – фактору некрозу опухоли sTNF-RI (CD120a, p55) и sTNF-RII (CD120b, p75). Этот факт в определенном смысле объясняет гипореактивность онкологических больных 28 по данному медиатору, но не исключает и неспецифического связывания TNF с другими фракциями крови [van Riemsdijk I.C. et al.,2000]. Для определения основных продуцентов растворимых рецепторов к фактору некрозу опухоли и механизма повышения концентрации этих рецепторов, in vitro исследованы спонтанная и стимулированная продукция растворимых рецепторов к основным цитокинам (табл.14,15). Таблица 14 Спонтанная продукция in vitro IL-1ra, sTNF-RI, sTNF-RII, sIL-4R и sIL-6R МНК доноров и онкологических больных. МНК Концентрация в супернатантах (pg/ml). IL-1ra sTNF-RI sTNF-RII sIL-4R sIL-6R Доноров (n=20) 6123 48 130 28 1923,2 75 381,8 39 792 55 Больных (n=21) 4317 75 105 31 2703,7 59 435,7 81 806,3 93 P <0,05 >0,05 < 0,05 >0,05 > 0,05 Таблица 15 Стимулированная in vitro ФГА продукция IL-1ra, sTNF-RI, sTNF-RII, sIL-4R и sIL-6R МНК доноров и онкологических больных. МНК Концентрация в супернатантах (pg/ml). IL-1ra sTNF-RI sTNF-RII sIL-4R sIL-6R Доноров (n=20) 602159 56,822 189083 387,378 668,769 Больных (n=21) 605127 80,331 5432,9117 483,665 711,645 P >0,05 >0,05 <0,05 >0,05 > 0,05 Интактные и стимулированные МНК и доноров и больных в основном продуцируют sTNF-RII, в достоверно (р<0,05) меньших количествах sIL-4R, sIL-6R, и практически не секретируют sTNF-RI (CD120a, p55) – так называемый «домен гибели», участвующий в трансдукции сигнала [Ярилин А.А.,1999]. sTNF-RII (CD120b, p75), очевидно, не участвует в трансдукции сигнала, а по аналогии с sIL-1RII [Sims J.E. et al., 1994; Ковальчук Л.В. с соавт., 2001], возможно, служит ловушкой для TNF. Так как МНК онкологических больных продуцируют sTNF-RII в достоверно больших количествах, чем МНК доноров, можно предположить, что механизм медиаторной гипореактивности по TNF обусловлен оверэкспрессией рецепторов-ловушек. Уровни значимости различий при спонтанной и стимулированной продукции sTNF-RI и sTNF-RII МНК здоровых доноров и онкологических больных предполагают существование разных продуцентов и механизмов повышения их концентрации в крови. Первое предположение о разных клеточных источниках подтверждается исследованиями распределения рецепторов двух типов sIL-1RI и sIL-1RII к IL-I на разных клеточных популяциях [Sims J.E. et al., 1994], но не исключает иные механизмы регуляции их экспрессии и повышения концентрации в крови. 29 Одним из наиболее вероятных механизмов повышения уровня sTNFRII в крови, который продуцируется в значительных количествах интактными и стимулированными МНК, может быть экспрессия альтернативно сплайсированных mRNA или повышенный шеддинг мембраносвязанных форм. В случае с sTNF-RI, исходно низкая продукция которого МНК не стимулируется ФГА, наиболее вероятный механизм повышения в крови - шеддинг мембраносвязанных форм. Результаты исследования микровязкости клеточных мембран форменных элементов крови онкологических больных (табл.16) с помошью зондов 5-д.с.к. (16-д.с.к.) – доксильных производных стеариновой кислоты, определяют один из наиболее вероятных механизмов их повышения – усиление шеддинга рецепторов при повреждении мембран. Эти воздействия сопровождаются структурно-функциональными перестройками липидного бислоя, которые характеризуются снижением показателя текучести мембран, упорядоченности (S), проницаемости и микровязкости (), изменением состава. У онкологических больных по сравнению с донорами возрастает разупорядоченность липидного слоя мембран, о чем свидетельствует снижение ее микровязкости [Курочкин В.К., 2000; Айрапетова К.Г., 2002]. Таблица 16 Структурное состояние мембран МНК онкологических больных и здоровых доноров Обследованные группы До оперативных вмешательств 16-д.с.к. 5-д.с.к. S S Здоровые доноры 0,1400 0,008 14,5 1,2 0,4200 0,001 Онкологические больные 0,0900 0,015 10,3 0,9 0,3100 0,003 P< 0,05 P< 0,05 P <0,05 В соответствии с результатами, представленными в таблице 16, у онкологических больных достоверно (р<0,05) снижены показатели упорядоченности (S) на разных уровнях липидного бислоя мембран. Вероятно, нарушение жидкокристаллических свойств мембран клеток обусловлено шеддингом интегральных гликопротеидных цепей стабилизирующих белков, в том числе рецепторов цитокинов. Таким образом, из двух наиболее вероятных механизмов, обуславливающих высокие концентрации sTNF-RII в крови обследованных групп – синтез de novo альтернативно сплайсированных mRNA и шеддинг, очевидно превалирует последний. Исследование динамики сывороточных концентраций растворимых рецепторов цитокинов sTNF-RI, sTNF-RII, sIL-4R, sIL-6R в зависимости от течения послеоперационного периода. Растворимые рецепторы цитокинов, являются мощными регуляторами уровня и активности цитокинов, связывая их так же прочно как и мембранносвязанные рецепторы [Rose-John S. and Heinrich P.,1994; Heaney 30 M.L. and Golde W.,1998; Renz H., 1999]. Возможно они не столько блокируют функции цитокинов, выступая их антагонистами, сколько служат молекулами-переносчиками, защищающими таким образом медиаторы от расщепления протеазами крови [Fernandez-Botran R. et al.,1996]. Согласно данным Rose-John S. and Heinrich P., [1994]; Fernandez-Botran R. et al., [1996]; Heaney M.L. and Golde W., [1998]; Renz H., [1999], повышение концентрации растворимых рецепторов является следствием двух не взаимоисключающих процессов: усиленного шеддинга мембранносвязанных форм и синтеза de novo с альтернативно сплайсированных mRNA. Для выяснения причинно-следственных связей в формировании медиаторной гипо- и/или арективности у онкологических больных с послеоперационными осложнениями исследован рецепторный профиль в зависимости от течения раннего послеоперационного периода и исхода развившихся осложнений Мониторинг уровня растворимых рецепторов цитокинов проведен в периоперационном периоде у 20 неосложненных и 32 больных с осложнениями (ССВР-12, сепсисом-6, ПОН-14), которые распределены на 2 группы в зависимости от сроков развития осложнений: 1гр.(14 больных) – в 1-3 сут.; 2гр. (16 пациентов) – с присоединившимися гнойно-септическими в более позднее сроки (4 и более сут.) после оперативных вмешательств. sTNF-RI. В группе неосложненных больных в раннем послеоперационном периоде, начиная с 6-8 часов после операции отмечается умеренное повышение sTNF-RI с 3007,2251 pg/ml до 4024,5103 рg/ml на 3 сут. и снижение к 4 сут. У больных с осложнениями в динамике послеоперационного периода, начиная со 2 сут., наблюдается более резкий подъем сывороточного уровня sTNF-RI, с достоверно более высокими амплитудами значений (рис.7). 10000 с осложнениями без осложнений pg/ml 12000 8000 * * 6000 * * * * 18 19 * * 4000 2000 0 д/о 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 13 14 15 17 Т Рис.7. Динамика содержания sTNF-RI у онкологических больных с осложнениями и без осложнений. Обозначения по оси абсцисс: д/о – до операции, 1-19 сут. после операции (п/о);Т - терминальные состояния; *достоверные (p<0,05) различия между группами. При мониторинге уровней сывороточного sTNF-RI в зависимости от сроков развития осложнений были выявлены закономерности, имеющие прогностическое значение (рис.8). 31 12000 осложнения с 1-3 сут. п/о pg/ml 14000 осложнения с 4-7сут. п/о * 10000 * 8000 * * * 6000 4000 2000 0 д/о 1 2 3 4 5 7 сутки Т Рис. 8. Динамика послеоперационного уровня sTNF-RI у больных с осложнениями, развившимися в 1-3 сут. (1) и с присоединившимися гнойносептическими процессами на 4-7 сут. (2). Обозначения по оси ординат: концентрация sTNF-RI в pg/ml; по оси абсцисс: 1-7 сут.п/о; Т – терминальные состояния; *-достоверные (р<0,05) различия. Изменения концентрации sTNF-RI в сыворотке крови определяются сроками развития осложнений, а также исходом этих осложнений. Так, у пациентов с тяжелых осложнениями, развившимися на 1-3 сут. после операций, уровень sTNF-RI возрастает до 6160,7 pg/ml уже к концу 2-х сут. Высокие концентрации sTNF-RI сохраняются на протяжении всего периода обследования, а в терминальных состояниях составляют 10650 pg/ml. У больных, с присоединившимися гнойно-септическими осложнениями на 4 сут. и в более поздние сроки после операций, отмечено умеренное повышение сывороточного уровня sTNF-RI в те же сроки (рис.8). Полученные результаты согласуются с биологической ролью sTNF-RI (CD120A, p55) “домена смерти”, который способен активировать апоптоз и таким образом, может участвовать в патогенезе ранних послеоперационных осложнений. Вместе с тем известно, что mTNF-RI (р55; CD120A) связывая TNF- и передавая сигнал для активации генов TNF- через МАР киназы (JNK/p38), принимает участие в аутокринной регуляции продукции TNF-, необходимого для развития воспалительного ответа [Goh K.C. et al. 1999]. В таком случае, патофизиологический механизм развития осложнений, в значительной степени может быть обусловлен избыточной продукцией sTNF-RI и блокированием аутокринной регуляции продукции TNF- и, как следствие, развитием медиаторной гипо-/ареактивности по одному из наиболее важных провоспалительных цитокинов. STNF-RII. Периоперационный мониторинг sTNF-RII, ассоциированного с эндотоксинемией, позволяет выявить прогностически значимые изменения концентраций у осложненных онкологических больных. Динамика периоперационных концентраций sTNF-RII у больных с благоприятным и осложненным течением послеоперационного периода различается (рис.9). 32 pg/ml 14000 12000 * 10000 8000 * * * * 6000 * * * 4000 2000 0 д/о 1 2 3 4 5 с осложнениями 6 7 8 9 10 13 14 без осложнений 15 17 Т сутки п/о Рис. 9. Динамика содержания sTNF-RII у онкологических больных с осложнениями и без осложнений. Обозначения по оси ординат: концентрация в pg/ml; по оси абсцисс: д/о – до операции, 1- 17 сут. п/о; Т – терминальные состояния; *-достоверные (р < 0,05) различия. В группе осложненных больных концентрации sTNF-RII нарастают значительно быстрее с достоверно более высокой амплитудой значений, регистрируются на протяжении более длительного периода (7-17 сут.), чем у больных с благоприятным течением послеоперационного периода. В терминальных состояниях у умерших от ПОН и др., содержание sTNF RII в крови составляет в среднем 11640,6 pg/ml (рис.9). У больных с ранними (1-3 сут.) послеоперационными осложнениями (ССВР, ПОН, септический шок) исходный уровень sTNF-RII в крови достигает 4466,3 pg/ml. Уже с 1-2 сут. после оперативных вмешательств отмечается его резкий подъем с 9185,6 pg/ml до 10087,6 pg/ml. В последующие дни содержание sTNF RII повышается до 11314,0 pg/ml, а в терминальных состояниях у умерших больных -12216,3 pg/ml (рис.9). Гнойно-септические осложнения, развившиеся в более поздние сроки после операций (5 и 7 сут.), сопровождаются умеренными подъемами уровня sTNF RII от 6515,6 до 6992,5 pg/ml на протяжении всего периода наблюдения. При неблагоприятном исходе осложнений концентрация sTNF RII достигают 11558,3 pg/ml (рис.10). осложнения на 1-3 сут. pg/ml 15000 * * 10000 * * * * * осложнения на 5-7 сут. * сепсис * * 5000 0 д/о 1 2 3 4 5 6 7 8 10 14 Т Рис. 10. Динамика содержания sTNF RII у онкологических больных с сепсисом и осложнениями, развившимися в раннем (1-3сут.) и более позднем (5-7сут.) послеоперационном периоде. Обозначения по оси ординат: концентрация в pg/ml; по оси абсцисс: д/о–до операции, 1-14 сут. п/о., Т– терминальные состояния; * - достоверные (р<0,05) различия. 33 При бактериологически подтвержденном сепсисе максимальное содержание sTNF RII в крови составляет 13044,0 pg/ml. Наиболее высокие концентрации sTNF RII выявлены у больных с интраоперационным шоком (12784,0 pg/ml), ПОН с преобладанием почечнопеченочной недостаточности (17880,6 pg/ml). Таким образом, динамика концентрации sTNF RII соответствует течению раннего послеоперационного периода и потому может быть использована как фактор прогноза ранних послеоперационных осложнений, в том числе и гнойно-септических. 3000 pg/ml В периоперационной динамике sIL-4R у неосложненных онкологических больных прослежены закономерности, выявленные для раннее исследованных рецепторов с умеренным подьемом в 1 сут. и нормализацией на 4 сут. (рис.11). В группе больных с осложнениями уровень sIL-4 R повышается в первые сут. после операций до 2667,8 pg/ml и достигает исходных значений в более поздние сроки. В терминальных состояниях концентрация sIL-4 R составляет 1948,2 pg/ml. с осложнениями * без осложнений 2500 * * 2000 1500 1000 500 0 д/о 1 2 4 5 6 7 8 9 10 13 14 сутки Т Рис. 11. Динамика содержания sIL-4R у осложненных и неосложненных больных. Обозначения по оси ординат: концентрация в pg/ml; по оси абсцисс: д/о – до операции, 1- 14 сут. п/о; Т - терминальные состояния; *достоверные (p<0,05) различия. На фоне ранних (1-3 сут.) осложнений, начиная с 1-2 сут. отмечается быстрое нарастание sIL-4R. В группе больных с присоединившимися гнойно-септическими осложнениями в более поздние (5-7 сут.) сроки, изменения в содержание sIL-4R имеют более умеренный характер. При сепсисе в крови обследованных пациентов выявляются более низкие концентрации sIL-4 R (рис.12). pg/ml 34 3500 3000 2500 * * 2 3 * * * 5 6 с осложнениями 1-3 сут. с осложнениями на 5-7 сут. сепсис * * 2000 1500 1000 500 0 д/о 1 4 7 8 9 10 14 сутки Т 16000 14000 pg/ml Рис.12. Динамика содержания sIL-4 R у онкологических больных с сепсисом и осложнениями, развившимися в раннем (1-3 сут.) и более позднем (5-7 сут.) послеоперационном периоде. По оси абсцисс: до операции, 1-14 сут. п/о, Т - терминальные состояния; *-достоверные (p<0,05) различия. Наиболее высокие (до 3306,5 pg/ml) уровни sIL-4R тестированы у больных с ПОН, развившейся в 1-3 сут. после операции. Динамика концентрации sIL-4R в раннем послеоперационном периоде соответствует срокам развития осложнений и может быть использована в качестве фактора прогноза. sIL-6R. Периоперационные изменения концентраций сывороточного sIL-6R в группах обследованных больных не информативны (рис.13). с осложнениями без осложнений 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 д/о 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 сутки Т Рис.13. Динамика содержания sIL-6 R у онкологических больных с осложнениями и без осложнений. Обозначения по оси ординат: концентрация в pg/ml; по оси абсцисс: д/о – до операции, 1- 10 сут. п/о. Т – терминальные состояния. В раннем послеоперационном периоде у больных с осложнениями и без таковых динамика sIL-6R характеризуется незначительными, по сравнению с иходными, колебаниями концентраций. Исследование содержания IL-1ra (рецепторного антагониста), лиганд-антагониста IL-1R, блокирующего биологическую реакцию клеток по конкурентному механизму, в пробах сыворотки 42 онкологических больных до операции и в раннем послеоперационном периоде свидетельствует об изменении концентрации IL-1ra при системных патологических процессах, развивающихся после расширенных оперативных вмешательств. 35 Мониторинг содержания IL-1ra в сыворотке крови больных без осложнений (1 группа, n=18) выявил значительное его повышение (до 1155,7 pg/ml) непосредственно после операции. Максимальные концентрации (8542,3 pg/ml) тестированы через 6-8 часов после операции, которые к концу 1 сут. снижаются (6986,0 pg/ml) и достигают исходных значений на 2 сут. У осложненных больных (2 гр., n=24) по сравнению с 1 гр. отмечена тенденция к длительному повышению послеоперационных концентраций IL1ra: так уровень с 1162,1 pg/ml в 1 сут. возрастает до 2435,9 pg/ml на 2 сут. Более высокие концентрации IL-1ra, которые сохраняются на протяжении 13 сут., зарегистрированы на фоне клинических проявлений осложнений, При неблагоприятном течении послеоперационного периода и исходе осложнений, развившихся в разные сроки после расширенных оперативных вмешательств, отмечается повышение содержания IL-1ra в крови. Наиболее высокие уровни IL-1ra зарегистрированы при шоке (8342,9 pg/ml). В терминальных состояниях у умерших больных концентрация IL-1ra в крови достигает максимальных значений - 8842,6 pg/ml (рис.14). 9000 * * pg/ml 8000 7000 6000 5000 * 4000 * 3000 2000 1000 0 1 2 3 4 5 6 Рис. 14. Содержание IL-1ra в крови онкологических больных с осложнениями. Обозначения: по оси абсцисс: 1 - до операции; 2 – при сепсисе; 3 – пневмонии; 4 - ОПН; 5 – шоке; 6 – при терминальных состояниях; *- достоверные (p<0,05) различия. Полученные данные позволяют утверждать, что уровень IL-1ra у онкохирургических больных повышается при травмах, ранних послеоперационных осложнениях (шоке, ОПН, пневмонии), в терминальных состояниях и имеет прогностическое значение. Транзиторный подъем сывороточного IL-1ra после оперативных вмешательств связан с послеоперационной динамикой IL-1 и не сопровождается развитием осложнений, в то время как стойкое его персистирование в крови отмечено при неблагоприятном течении раннего послеоперационного периода. Посттравматическая гиперпродукция IL-1ra, очевидно, обеспечивает не только блокирование избыточных количеств IL-1, и таким образом негативные последствия системного действия IL-1 (индукции протеаз в мышечной и костной ткани с резобцией кости, хряща и миомаляцией), но и тонкую регуляцию межклеточных взаимодействий [Ковальчук Л.В. и др.,2001]. 36 Метаболиты арахидоновой кислоты (TXB2, LTB4). Исследование роли продуктов циклооксигеназного и липоксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты в развитии ранних послеоперационных осложнений у онкологических больных основано на тестировании содержания наиболее стабильных метаболитов ТХВ2 (тромбоксана В2) и LTB4 (лейкотриена В4), известных своей центральной физиологической ролью в развитии воспалительных реакций и патогенезе системных состояний, включая шок различной этиологии. Уровни ТХВ2 и LTB4 исследованы в сыворотке крови здоровых доноров (n=16) и онкологических больных (n=29) до и после оперативных вмешательств, на фоне благоприятного течения (n=13) и клинических проявлений развивающихся осложнений (n=16) в раннем послеоперационном периоде, терминальных состояниях у умерших больных (n=8); в супернатантах МНК и НФ доноров (n=16) и больных (n=29). ТХВ2. Для исследования роли продуктов циклооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты в патогенезе ранних послеоперационных осложнений использована количественная оценка образования тромбоксанов. С этой целью в биоматериалах тестировано содержание ТХВ2, наиболее устойчивого окисленного продукта ТХА2, который в свою очередь образуется из PGH2 (простагландина Н2). Достоверных различий в исходной концентрации ТХВ2 у онкологических больных и здоровых доноров не отмечено. Уровни спонтанной и стимулированной Са-ионофором продукция ТХВ2 МНК и НФ здоровых доноров и обследованных онкологических больных существенно не различаются (таб.17). У прооперированных больных без осложнений на 1-2 сут. после операции уровень ТХВ2 в крови снижается. Содержание ТХВ2 у пациентов с ранними послеоперационными осложнениями варьирует в широких пределах от 5 до 3300 ng/ml и определяется характером развивающихся осложнений: максимальная концентрация ТХВ2 отмечена при ССВР (3300 ng/ml), ДН и ОПН (соответственно 3000 ng/ml и 1953 ng/ml). У больных с присоединившимися гнойно-септическими осложнениями регистрируются низкие уровни ТХВ2. При микробиологически подтвержденном сепсисе (синегнойная палочка), концентрация ТХВ2 составляет 5 ng/ml. В терминальных состояниях, у больных, умерших от ПОН, уровень ТХВ2 в крови не превышает 35 ng/ml. Полученные данные свидетельствуют о том, что гнойно-септические осложнения у онкологических больных развиваются на фоне стабильного снижения уровня ТХВ2, который может быть маркером гипореактивности. Следовательно, TXB2 является субстратом регуляции иммунной системы, снижение которого ассоциируется с неблагоприятным течением и исходом послеоперационного периода. 37 Таблица 17 Уровни ТХВ2 в исследованных образцах сыворотки и супернатантах МНК здоровых доноров и онкологических больных. Обследованные доноры и онкологические больные Концентрация ТХВ2 (ng/ml) Продукция МНК и НФ. Спонтанная Стим. Са-ионф. МНК НФ МНК НФ 341067 3100208 3620199 354098 Кровь Доноры (n=16 ) 263071 Больные без осложнений 286785 до операции (n= 13) Больные без осложнений 1650122* на 1-2 сут. п/о (n=13) Больные с осложнениями 237289** до операции (n=16 ) 3615109 3520193 3580201 3490125 3350118 3095123 2000165* 2670174* 3255173 3060101 3620125 2350116 Примечание: * - достоверные отличия от доноров (р<0,05), **-достоверные отличия от неосложненных больных (р<0,05). Учитывая прогностически неблагоприятное значение снижения концентрации ТХВ2 у больных с осложнениями, определенный интерес представляет исследование возможной элиминации субстанций, необходимых для развития адекватных воспалительных реакций [Journois D., 2001]. Анализ биоматериалов при продолженной гемофильтрации (ГФ) не подтверждает существенной элиминации ТХВ2: у больных с ОПН содержание ТХВ2 в сыворотке крови снижается в среднем с 2750 ng/ml до 1520 ng/ml, но при этом концентрация его в фильтрате и моче соответственно составляет 20 ng/ml и 370 ng/ml. Лейкотриен В4 (LTB4). Для оценки патогенетической роли лейкотриенов в развитии послеоперационных осложнений у онкологических больных исследовано содержание LTB4 в биологических жидкостях, полученных от больных при клинических проявлениях органных и полиорганных расстройств в разные сроки после расширенных оперативных вмешательств (табл.18). Таблица 18 Уровень LТВ4 в исследованых образцах сыворотки и супернатантах МНК здоровых доноров и онкологических больных. Обследованные доноры и онкологические больные. Сыворотка крови Концентрация LТВ4 (рg/ml) Продукция МНК и НФ. Спонтанная стим. Са-ионф. МНК НФ МНК НФ 489 11019 417 35439 8715 9920 7013 16023* Доноры (n= 16) 12522 Больные без осложнений, 253033* до операции (n=13) Больные без осложнений, 31121* 9021 13537 8017 21427* после операции (n=13) Больные с осложнениями 221839** 5512 8625 6711 24930** до операции (n=16) Примечание: *-достоверные отличия от доноров (р<0,05), **-достоверные отличия от больных без осложнений (р<0,05). 3000 2500 pg/ml 38 Выявленные у онкологических больных по сравнению со здоровыми донорами достоверно (р<0,01) более высокие концентрации LTB4 согласуется с данными об участии 5-ЦО (циклооксигеназы) и продуктов циклооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты в канцерогенезе [Lipulescu, 1996; Reddy et al.,1996; Sheng et al., 1997; Ghosh, 1997; Hussey, 1997]. Механизмы влияния 5-ЦО на клеточный рост и промотирование опухоли связывают с активацией некоторых протоонкогенов [Rioux and Castonguay, 1998]. Значительное (p<0,01) снижение уровня LTB4 после удаление опухоли не исключает способность злокачественных клеток к продукции LTB4. В зависимости от течения послеоперационного периода выявлены достоверные различия исходных уровней LTB4 у больных с развившимися впоследствии осложнениями и без таковых. В раннем послеоперационном периоде у больных с осложнениями уровень LTB4 в сыворотке крови резко снижается, но при этом в разные сроки отмечается его кратковременное повышение (рис.15). * 2000 онкологические больные 1500 доноры 1000 * 500 0 0 1 2 3 4 5 14 18 сутки Т Рис.15. Динамика уровня LTB4 в раннем послеоперационном периоде у онкологических больных с осложнениями. Обозначения по оси абсцисс: 0 до операции, 1;2;3;4;5 – 1-5 сут. п/о; 7 -14 сут; 8 – 18 сут. п/о; Т – терминальные состояния; *-достоверные (р<0,05) различия. Повышение LTB4 на 4 и 14 сут. после операции было связано с ОПН в стадии олиго- или анурии в структуре ПОН. ДН сопровождается незначительным повышением LTB4 до 300 pg/ml, при гнойно-септических осложнениях и сепсисе уровень его составляет соответственно 203 и 210 pg/ml, а в критические дни не превышает 90 pg/ml. Тестирование сыворотки крови, мочи и ультрафильтрата при продолженной ГФ у больных с ОПН после гастрэктомий по поводу злокачественных и доброкачественных новообразований желудка, выявляет существенные различия в соотношении содержания LTB4 в исследованных биоматериалах. При раке желудка в сыворотке крови детектируемый уровень LTB4 не в среднем не превышает 100 pg/ml, но после прохождения через фильтр (HF-80), в крови его концентрация повышается до 600 pg/ml, что в 6 раз превышает исходный уровень. Содержание LTB4 в порциях мочи 39 и фильтрата, отобранных одновременно с кровью, составляет соответственно 235 и 2720 pg/ml. У больных с ОПН, развившейся после операций по поводу доброкачественных новообразований, до ЭКМД содержание LTB4 в сыворотке крови достигает 3559 рg/ml, после процедуры ГФ (HF-80) снижается до 2538 pg/ml. В ультрафильтрате обнаруживаются незначительные (до 80 pg/ml) по сравнению с сывороточными концентрациями LTB4, но при динамическом наблюдении и отборе проб мочи через каждые 3 часа в процессе проведения курса ГФ отмечена повышенная его экскреция с мочой (с 1620 до 1780 pg/ml). Полученные данные свидетельствуют о том, что LTB4 участвует в патогенезе послеоперационных осложнений, но эту его роль трудно оценить, так как конститутивно у онкологических больных регистрируются чрезвычайно высокие уровни LTB4. Наибольший интерес представляет динамика LTB4 в процессе ЭКМД. Возможно, что при развитии таких органных дисфункций как ОПН LTB4 нековалентно связывается с некоторыми фракциями крови, маскируется в связанных комплексах и детектируемый уровень LTB4 в сыворотке больных с тяжелыми послеоперационными осложнениями не отражает его истинного содержания. Доминирующая роль продуктов липоксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты-лейкотриенов в патогенезе многих заболеваний как сильнейших провоспалительных агентов липидной природы, обуславливает наиболее выраженные проявления воспалительных реакций при тяжелых заболеваниях, однако периоперационный мониторинг уровня лейкотриенов свидетельствует о парадоксальной гипореактивности на фоне развития тяжелых осложнений у онкологических больных. Динамика IgA, IgG, IgM в раннем послеоперационном периоде у больных с осложнениями (n-32) и без таковых (n=25) различается по всем основным классам (рис.16 и 17), но наиболее значимые изменения отмечены в отношении IgM, который секретируется раннее других и с которым связана значительная часть антител первичного иммунного ответа. Эти антитела экстренной иммунной защиты с относительно низким сродством к антигену, но с высокой способностью связывать комплемент, агглютинировать и лизировать клетки-мишени, предохраняют организм от бактериемии [Ярилин А.А.,1999]. У неосложненных больных достоверных различий в содержании исследованных сывороточных иммуноглобулинов в сравнении со здоровыми донорами не обнаружено (рис.16). Группа больных с исходно низкими уровнями IgM характеризуется неблагоприятным течением и исходом осложнений в раннем послеоперационном периоде (рис.17). В терминальных состояниях IgM практически не детектируется в крови. Полученные результаты согласуются с открытием иммунорегуляторных функций иммуноглобулинов [Климович В.Б.,1998]. Свойства иммуноглобулинов не ограничиваются связыванием, сегрегацией и деградацией антигенных субстанций. Показано, что связанные МЕ/л 40 с антигеном иммуноглобулины выполняют ряд регуляторных функций. Так, обнаружено антигенспецифическое, зависимое от активированных Тлимфоцитов и комплемента 50-100 кратное усиление иммунного ответа корпускулярными или растворимыми комплексами антигенов с IgMантителами [Heyman В.,1999]. В случае с IgM, феномен регуляторных свойств опосредован взаимодействием с рецепторами комплемента, которое ведет к модуляции продукции цитокинов и сдвигам в соотношении позитивных и негативных влияний на иммунные реакции. Лечебное действие иммуноглобулинов сопряжено с изменением баланса активности популяций Тх1 и Тх2 [Климович В.Б.,1998]. 300 250 200 150 100 50 0 IgA IgG IgM доноры больные д/о больные п/о 250 200 МЕ/л Рис.16. Содержание IgA, IgG, IgM в сыворотке доноров и неосложненных онкохирургических больных. Обозначения: д/о - до и на 5-7 сут. после операции (п/о). IgA 150 IgG 100 * 50 * * * * * * IgM 0 доноры больные д/о больные п/о терминальные состояния Рис.17. Мониторинг IgA, IgG, IgM в сыворотке доноров и осложненных онкологических больных в динамике послеоперационного периода. Обозначения: д/о-до и на 5-7 сут. после операции (п/о), * - статистически достоверные (р <0.05) различия в сравнении с донорами; ** - статистически достоверные (р <0.05) различия в сравнении с дооперационными. Мониторинг С3 и С4 компонентов системы комплемента, у онкологических больных с осложненным (n=32) и благоприятным течением послеоперационного периода (n=25) в сравнении с донорами (n=20) выявил достоверные изменения в системе С3 компонентов комплемента (рис.18). 41 мг/л 25000 20000 * С3 15000 С4 10000 5000 0 доноры больные д/о 1 сут. п/о 2-3 сут. п/о 140000 120000 мг/л Рис. 18. Содержание С3 и С4 компонентов комплемента в динамике послеоперационного периода у неосложненных онкологических больных в сравнении с донорами. (* - достоверные изменения). У онкологических больных с благоприятным течением послеоперационного периода в первые сутки отмечено транзиторное повышение уровня С3 компонента, которое нормализуются уже на 2-3 сут. ** * 100000 С3 ** 80000 * С4 60000 40000 * 20000 * 0 доноры больные д/о больные, п/о, 1 сут. 2-3 сут. 5-7 сут. Т. Рис. 19. Мониторинг С3 и С4 компонентов комплемента у онкохирургических больных с послеоперационными осложнениями. Обозначения: д/о, п/о – до и после операции, Т-терминальные состояния. *статистически достоверные отличия от доноров (р<0,05), **- статистически достоверные различия в динамике послеоперационного периода (р<0,05). При осложненном течении послеоперационного периода повышенные уровни С3 компонента комплемента сохраняются на протяжении 1-7 сут. и в значительных количествах детектируются в терминальных состояниях. Наиболее высокие концентрации С3 компонента комплемента отмечены при шоке (131250 мкг/л), интерстициальном отеке легкого (72500 мкг/л), ОПН (15500 мкг/л), ДН (4300 мкг/л) и грибковом сепсисе (3000 мкг/л). В то же время, у больных с ПОН, развившейся на 2-3 сут. после операции, на фоне клинических проявлений осложнений зарегистрированы низкие уровни С3 –56 мкг/л. Элиминации даже высоких (до 120000 мкг/л) концентраций С3 при проведении ЭКМД (ПФ и ГФ) не отмечено. 42 Содержание С4 в крови обследованных больных варьирует в узком диапазоне концентраций от 49 до 220 мкг/л, не коррелируют с течением послеоперационного периода, исходом развившихся осложнений и уровнем С3; в отличие от С3 компонента системы комплемента является малоинформативным параметром. Динамика стимулированной in vitro вирусом болезни Ньюкасла (NDV) продукции IFN- МНК и НФ онкологических больных. Интактные МНК и НФ онкологических больных не продуцируют IFN-. Анализ динамики стимулированной in vitro NDV продукции IFN- МНК и НФ онкологических больных в периоперационном периоде соответствует развитию ранних послеоперационных осложнений. Мониторинг стимулированной продукции IFN- на самых ранних этапах хирургического лечения позволяет прогнозировать вероятность осложнений после расширенных оперативных вмешательств. Стабильное снижение стимулированной продукции IFN- у осложненных больных отмечено на всех этапах исследования, начиная с дооперационного периода (рис.20). без осложнений pg/ml 600 * 500 400 * с осложнениями * 300 200 100 0 до операции 1-3 сут. 5-7сут. П/о Рис. 20. Динамика стимулированной in vitro NDV продукции IFN- до операции и в раннем послеоперационном периоде МНК онкологических больных без осложнений и с неблагоприятным исходом ранних послеоперационных осложнений; * - достоверные различия. В супернатантах стимулированных НФ у выживших больных уровень продукции IFN- значительно повышается в течении всего периода исследования, проявляя синергизм с МНК, в то время как в группе умерших от сепсиса и ПОН динамика стимулированной продукции IFN- характеризуется обратной тенденцией. Исходно более низкие дооперационные уровни IFN-, как правило, отмечаются у больных с осложнениями. После операции и на последующих этапах исследования IFN- практически не детектируются в супернатантах активированных NDV МНК у больных в терминальных состояниях (рис.21). 43 700 * 600 pg/ml 500 400 I гр. без осложнений II гр. с осложнениями * 300 * 200 100 0 до операции 1-3 сут. п/о 5-7 сут. п/о Рис.21. Динамика стимулированной in vitro NDV продукции IFN- НФ онкологических больных до операции и в раннем послеоперационном периоде. (I группа с благоприятным течением послеоперационного периода, II – умершие от гнойно-септических осложнений). * - достоверные различия. 600 500 pg/ml МНК, выделенные из селезенок онкологических больных после оперативных вмешательств со спленэктомией, подобно МНК и НФ периферической крови, спонтанно не продуцируют IFN-, но сохраняют способность к стимулированной in vitro NDV продукции IFN-. У больных с низким конститутивным уровнем стимулированной продукции IFN- МНК селезенки в раннем послеоперационном периоде чаще развиваются осложнения с неблагоприятным исходом (рис.22). * 400 300 200 100 0 I гр.выжившие II гр.умершие Рис. 22. Уровень стимулированной in vitro NDV продукции IFN- мононуклеарными клетками, выделенными из селезенки после спленэктомии у онкологических больных; * - достоверные (р<0,05) различия. Полученные данные позволяют уже с первых суток прогнозировать вероятность развития послеоперационных осложнений с неблагоприятным исходом у больных с расширенными оперативными вмешательствами. и применять адоптивную иммунотерапию с целью профилактики. Благоприятное течение послеоперационного периода характеризуется сохранением лейкоцитами способности к стимулированной продукции IFN, в то время как у умерших от сепсиса и ПОН отмечается тотальное снижение продукции этого триггерного цитокина. Наши результаты подтверждаются исследованиями последних лет о “стержневой” роли IFN- в регуляции иммунных реакций организма 44 [Herberman R.B.,1997; Stark G.R., 1998; Yang Y.F. et al.,2001; Belardelli F., et al., 2002] и участии в противоопухолевом иммунитете [Gresser I. and Thyrell L.et al., 2002]. Механизм триггерного действия IFN- опосредован стимуляцией синтеза IL-1 для совместного представления антигена Тлимфоцитам и развития специфического иммунитета [Skurkovich S., 1987]. Транскрипция генов IFN- не требует предшествующего синтеза белков и относится к наиболее ранним событиям на инфекционный или другой антиген [Marie I., 1998]. Плейотропный эффект интерферонов отражает его контрольно-регуляторную роль в сохранении гомеостаза [Ершов Ф.И.,1998]. Влияние адоптивной иммунотерапии рекомбинантным G-CSF (нейпогеном) на уровень сывороточных цитокинов. Мониторинг основных провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF-, проведенный у 10 больных, получавших нейпоген в дозе 300 мг/подкожно (за сутки до операции и на 1,3 сут. после операции), свидетельствует о повышении уровня IL-1 до 902 – 3554 pg/ml на протяжении 1-6 сут. наблюдений у выживших пациентов с осложнениями и без таковых. У больных с неблагоприятным исходом ПОН в крови детектированы низкие концентрации IL-1 как до операции, так и в последующие 1-3 сутки. Динамика TNF-, подобно IL-1, но с меньшей амплитудой значений, также определяется течением раннего послеоперационного периода и исходом развившихся осложнений. Адоптивная иммунотерапия G-CSF способствует преимущественной стимуляции продукции IL-1, обеспечивая высокий уровень основного провоспалительного цитокина для реализации иммунного ответа на операционную травму. Концепция патогенеза сепсиса и критических состояний, основанная на патофизиологии генерализованных реакций защитных систем, неконтролируемых каскадно-медиаторных процессах в генезе полиорганных повреждений, нуждается в пересмотре с позиции баланса эндогенных биорегуляторов, к которым относятся не только цитокины, но и их растворимые рецепторы, метаболиты арахидоновой кислоты, иммуноглобулины, компоненты системы комплемента и др. – субстраты иммунной системы. При системных патологических процессах наблюдаются общие иммунологические сдвиги, которые различаются в зависимости от сроков развития осложнений: нарушение балланса про- и противовоспалительных медиаторов; структурно-функциональные изменения мембран и усиление шеддинга рецепторов цитокинов с последующим нарастанием их концентрации в сыворотке; стойкое повышение С3 компонента комплемента с одновременным снижением уровня IgM; снижение индуцированной продукции IFN-. 45 Выводы: 1. У онкологических больных по сравнению со здоровыми донорами достоверно повышены уровни растворимых рецепторов к фактору некроза опухоли (sTNF-RI и sTNF-RII). 2. Дисбаланс сывороточных цитокинов у онкологических больных обусловлен изменением соотношения IL-2/IL-4. Снижение продукции IL-12 у онкологических больных опосредовано блокированием экспрессии его mRNA и сопровождается низкой функциональной активностью NK. 3. Мониторинг свободных провоспалительных цитокинов в раннем послеоперационном периоде не выявил достоверных различий в группах онкологических больных с осложнениями и без таковых. 4. Развитие послеоперационных осложнений сопровождается достоверным повышением концентрации противовоспалительного IL10, растворимых рецепторов к фактору некроза опухоли (sTNF-RI, sTNF-RII) и IL-4 (sIL-4R); длительным персистированием С3 компонента системы комплемента на фоне снижения концентрации IgM. 5. Снижение уровня тромбоксана В2 в динамике послеоперационного периода сопровождается развитием осложнений. 6. У больных с низкой стимулированной продукцией IFN- в периоперационном периоде достоверно повышается вероятность развития послеоперационных осложнений. 7. Снижение спонтанной, индуцированной продукции цитокинов, функциональной активности мононуклеарных клеток периферической крови обусловлено ингибированием экспрессии mRNA медиаторов воспаления (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-12) и активацией противовоспалительного IL-10. 8. IL-8 является маркером гнойно-септических осложнений. Повышение его концентрации в крови опережает клинические проявления воспалительных процессов; адекватная санация гнойного очага сопровождается нормализацией уровня IL-8. 9. Повышенная экскреция цитокинов с мочой у больных с низкими сывороточными уровнями медиаторов воспаления свидетельствует о недетектируемой гиперцитокинемии. Цитокины могут диссоциировать из нековалентно связанных комплексов при прохождении через биологические мембраны. 10. Гемофильтрация позволяет эффективно элиминировать избыточные количества связаных провоспалительных цитокинов IL-1β и TNF-α. IL-6, С3 компонент системы комплемента, лейкотриен B4 (LTB4) и тромбоксаны (TXB2) не элиминируются при проведении гемофильтрации. 46 Практические рекомендации. В качестве дополнительных факторов прогноза развития ранних послеоперационных осложнений у онкологических больных могут быть использованы уровни растворимых рецепторов к цитокинам (sTNF-RI, sTNFRII, sIL-4R), С3 компонента системы комплемента, IgM, продукции IFN-α. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Список опубликованных работ по теме диссертации. Динамика содержания TNF-, IL-1, IL-6, IL-4 и IL-8 в раннем послеоперационном периоде у больных раком желудка. А.Р.Тугуз, С.П.Свиридова, Е.Г.Громова, М.В.Киселевский, Б.М.Исмаилова, Ю.В.Буйденок, К.С.Титов. // Иммунология. – 2002. –Том 23. - № 1. – С.59-61. Динамика содержания TNF-, IL-1, IL-6, IL-4 и IL-2 при гемодиализе у больных с хронической почечной недостаточностью. Е.Г.Громова, А.Р.Тугуз, А.Ю.Денисов, Е.А.Решетников, М.В.Киселевский. // Иммунология. – 2002. –Том 23. - № 1. – С. 61-63. Динамика цитокинов (TNF-, IL-1, IL-6, IL-4 и IL-8) у онкологических больных при применении экстракорпоральных методов детоксикации в раннем послеоперационном периоде. А.Р.Тугуз, Е.Г.Громова, Н.В.Малахова, А.А.Мурашкин, М.В.Киселевский. // Иммунология. – 2001. - № 5. – С. 56-58. Спонтанная и стимулированная интерлейкином-2 и гранулоцитарномакрофагальным колониестимулирующим фактором продукция цитокинов нейтрофильными гранулоцитами здоровых доноров. Тугуз А.Р., Данилина Д.В., Громова Е.Г., Блиндарь В.Н., Киселевский М.В. // Иммунология. –2002. –Том 23. -№ 3. – С.156-158. Патобиохимические и патоиммуно-логические механизмы послеоперационных осложнений у онкологических больных. М.В.Киселевский, А.Р.Тугуз. // Новое в онкологии: Сб.научных трудов. Выпуск 5.–2001.- С. 553-569. Адаптивная иммунотерапия опухолевых плевритов. М.И.Давыдов, К.Р.Оразгельдыев, С.М.Волков, Г.В.Казанова, А.Р.Тугуз. // Новое в онкологии: Сб. научных трудов. Выпуск 5.–2001.- С. 72-88. Динамика цитокинов с хронической почечной недостаточностью. Рыбакова О.Б., Денисов А.Ю., Громова Е.Г., Тугуз А.Р. // «Актуальные проблемы экстракорпорального очищения крови, нефрологии и гемафареза.»: Сб. материалов. 29-31 мая 2002. Москва. – С. 51-52. Элиминация TNF-, IL-1, IL-6 и IL-8 в процессе вено-венозной гемофильтрации в раннем послеоперационном периоде у онкологических больных. Громова Е.Г., Тугуз А.Р., Киселевский М.В., Малахова Н.В. // «Актуальные проблемы экстракорпорального очищения крови, нефрологии и гемафареза»: Сб. материалов. 29-31 мая 2002. Москва. –С. 195-196. 47 Почасовой мониторинг TNF-, IL-1, IL-6, IL-6 и IL-4 в сыворотке крови и фильтрате при проведении артериовенозной гемофильтрации у онкологических больных. Громова Е.Г., Тугуз А.Р., Киселевский М.В. // «Актуальные проблемы экстракорпорального очищения крови, нефрологии и гемафареза.»: Сб. материалов. 29-31 мая 2002. Москва. – С. 51-52. 10. Значение соотношения основных провоспалительных цитокинов в крови, моче, отделяемом из дренажей и фильтрате в процессе артериовенозной гемофильтрации (ГФ) у оперированных онкологических больных с синдромом полиорганной недостаточности (СПОН). Тугуз А.Р., Громова Е.Г., Киселевский М.В., Кузнецова Л.С. // «Актуальные проблемы экстракорпорального очищения крови, нефрологии и гемафареза.»: Сб. материалов. 29-31 мая 2002. Москва. – С. 51-52 11. Кинетика цитокинов в сыворотке крови, моче и отделяемом из дренажей в периоперационном периоде у больных раком почки. Громова Е.Г., Тугуз А.Р., Киселевский М.В., Матвеев В.Б. // Иммунология.–2002. – Том 23. - № 4. – С. 232-235. 12. Клинико-иммунологическая характеристика детей, серонегативных к инфекциям, управляемым средствами специфической вакцинации. А.Х.Агиров, М.В.Киселевский, А.Р.Тугуз, Л.А.Долева. // Иммунология. – 2001. - № 3. – С. 47-51. 13. Опыт организации иммунологической лаборатории в Республике Адыгея. А.Х.Агиров, А.Р.Тугуз, М.В.Киселевский. // Иммунология. – 2001. - № 4. – С. 59-63. 14. Прогностическое значение уровня сывороточных цитокинов в развитии послеоперационных осложнений у онкологических больных. М.В.Киселевский, А.Р.Тугуз, Е.Г.Громова, И.В.Нехаев, Н.В. Малахова, С.П.Свиридова, У.С.Горобец, Ю.В.Буйденок, Д.В.Данилина. // Современные подходы к диагностике и лечению злокачественных новообразований. Тезисы докладов научно-практической конференции 7 декабря 2000. Москва. ГВКГ. Им. Н.Н. Бурденко.- С. 54-55. 15. Cytokines dynamics in the blood, urine and drainage liquid in the earlier postoperative period of kidney cancer patients. M.V.Kiselevsky, A.R.Tuguz, E.G.Gromova, V.B.Matveev. M.V.Kiselevsky, A.R.Tuguz, E.G.Gromova, V.B.Matveev. // 18th UICC International Cancer Congress 30 June-5July, 2002. Oslo, Norway. P 876. 16. IFN-a-production by blood and spleen mononuclear cells and granulocytes in earlier postoperative period cancer patients. A.R. Tuguz, E.G.Gromova, M.V.Kiselevsky. // 18th UICC International Cancer Congress. 30 June - 5 July. 2002. Oslo Norway. P 989. 17. TNF-a; IL-1B and IL-8 elimination during hemofiltration procedure in earlier postoperative period cancer. E.G.Gromova, A.R. Tuguz, M.V.Kiselevsky, L.S.Kuznetsova. // 18th UICC International Cancer Congress, 30 June-5 July 2002, Oslo Norway. P 988. 9. 48 18. Prognostic role of the main proinflammatory cytokiness ratio in the blood, urine, drainage liquid and filtrates in the process of hemofiltration in caner patients with multiple organ failure. A.R. Tuguz, E.G.Gromova, M.V.Kiselevsky, L.S.Kuznetsova. // 18th UICC International Cancer Congress, 30 June-5 July 2002, Oslo, Norway. P 990. 19. The prognostic role of blood cytokines level during the postoperative period in cancer patients. A.R. Tuguz, E.G.Gromova, M.V.Kiselevsky, K.S.Titov. // 18th UICC International Cancer Congress, 30 June-5 July 2002, Oslo, Norway. P 991. 20. Correction of immunosupression in gastric patients after total gasterectomy with splenectomy. A.R. Tuguz, Y.V. Buydenok, M.V. Kiselevsky, I.O. Chikileva, K.S. Titov. // 18th UICC International Cancer Congress, 30 June-5 July 2002, Oslo, Norway. P 339. 21. Influence of IL-42-IL-4 form derived by alternative splicing, on cytotoxity of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) and granulocytes towards NKsensitive K-562 cell line. A.R. Tuguz, V.M.Abramov, R.N.Vasilenko, I.O.Chikileva, Y.V.Buydenok, M.V.Kiselevsky, L.V.Ptisin, A.M. Vasiliev. // 8th UICC International Cancer Congress, 30 June-5 July 2002, Oslo, Norway. P 992. 22. Generation of dendritic cells using mononuclear cells from several sources. A.R. Tuguz, Chikileva I.O., Abramov V.M., Vasilenko R.N., Buydenok Y.V., Kiselevsky M.V. // 18th UICC International Cancer Congress, 30 June-5 July 2002, Oslo, Norway. P 1013.