Камышев И.А. , Малов А.Н., Неупокоева А.В. Анализ планарных

АНАЛИЗ ПЛАНАРНЫХ КРИСТАЛЛОГРАММ ЛАЗЕРНО
ОБЛУЧЕННЫХ РАСТВОРОВ БИОЖИДКОСТЕЙ
И.А. Камышев, А.Н. Малов, А.В. Неупокоева
МБОУ Лицей №1
664043, г. Иркутск, ул. Воронежская, 2
e-mail: garik_x@inbox.ru
АННОТАЦИЯ
Исследованы
кристаллограммы
биологических
жидкостей
физиологического раствора и раствора глицина до и после воздействия
излучения
He-Ne
лазера
(λ=633нм).
Уменьшение
кластеров
биоорганических молекул под действием лазерного излучения
подтверждается экспериментами in vitro на растворах методом
кристаллографического анализа сухих пленок этих жидкостей.
1. ВВЕДЕНИЕ
В инновационной деятельности особое место занимает нанотехнология.
Согласно Р. Фейнману [1], «биологические организмы производят
функционирующие наноустройства, начиная с самого возникновения
жизни, и мы можем почерпнуть из биологии много новых идей об их
создании». Одной из таких идей с полуторавековой историей является
использование в науке и технике полимеров биологического
происхождения – биополимеров и, в частности, желатина. Одновременно
исследования по анализу структуры коллоидных водных растворов
позволяют интерпретировать и многие аспекты взаимодействия лазерного
излучения с биологическими тканями.
Относительно недавно с использованием спекл-оптических методов
было установлено [2], что в воде и водных растворах имеются
супранадмолекулярные комплексы размерами от 10 до 100 мкм,
образующие динамические структуры, чувствительные к внешним
воздействиям. С другой стороны, существует множество работ по
исследованию кристаллограмм биологических жидкостей, создаются банки
данных по описанию типовых структур твердой фазы различных
исследуемых объектов, с помощью которых можно провести сравнение и
1
сделать вывод о присутствующих патологиях. В частности, структуры,
наблюдаемые при высыхании биологических жидкостей (сыворотка крови,
урина, слюна и т.д.), являются диагностическим признаком ряда
заболеваний.
В [3] была экспериментально исследована возможность регистрации
лазерно-индуцированных изменений в биологических жидкостях методом
дегидратации биоорганической жидкости [4], что позволило «проявить» и
установить сам факт изменений, происходящих в биологической жидкости
под действием лазерного излучения.
Цель работы: апробировать методику регистрации структурных
изменений в растворах биоорганических веществ (на примере глицина),
отработать способы анализа микроизображений для получения численных
оценок структурных изменений кристаллограмм.
2. ФОРМИРОВАНИЕ ПЛЕНОК
Первыми к подложке «прилипают» молекулы, имеющие минимальную
скорость. Когда образуется «островок» из нескольких молекул, то он
становится зародышем кристалла и другие молекулы из раствора
осаждаются на этот зародыш, обуславливая его рост. Причиной осаждения
и роста кристалла (выпадения из раствора) является испарение растворителя
(воды).
Биологические молекулы (белки, ДНК, РНК и др.) имеют, как правило,
морлекулярную массу от десятков до сотен тысяч атомных единиц массы и
представляют собой длинные нити (цепи). Маловероятно, что вся
макромолекула «ляжет ничком» на подложку при испарении раствора,
обычно к подложке «прилипает» одно или несколько звеньев на конце нити
макромолекулы. Затем, в результате кристаллизации макромолекул
происходит складывание их цепей. Анализ первичного и вторичного
зародышеобразования
кристаллов
и
молекулярной
конденсации
макромолекул показывает, что обычно критические размеры всех этих
зародышей таковы, что их объем значительно меньше объема одной
молекулы, а их ширина значительно больше диаметра молекулы.
Образование зародышей происходит до тех пор, пока свободная энергия
остающихся незакристаллизованных частей частично закристаллизованных
молекул достаточно велика. После этого каждая молекула должна
складываться так, чтобы размеры зародыша были больше толщины
молекулы. [5]
2
3.
ПОСТАНОВКА
ЗАДАЧИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ УСТАНОВКИ
И
ОПИСАНИЕ
Схема экспериментальной установки представлена на рис.1
Рис. 1 Схема экспериментальной установки
1)
He-Ne лазер ЛГ-75
2)
Кювета с объектом исследования
3)
Покровное стекло для кристаллограммы
4)
Компьютерный микроскоп
5)
Компьютер
Описание используемого оборудования:
 Гелий-неоновый лазер ЛГ-75, создающий излучение с длиной волны
633 нм, мощностью 25мВт;
 Компьютерный микроскоп IntelPlay QX3 и программное обеспечение
к нему.
4. ОБЪЕКТ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве исследуемых было взято две жидкости:
1)
Физиологический раствор (0,9% водный раствор хлорида
натрия)
Физиологический раствор в кварцевой плоско-параллельной кювете
5х10х20 мм облучался 20 минут. Каплю образца раствора брали трижды:
первый раз до облучения, второй после 10 минут, третий после 20 минут
облучения.
Капля жидкости наносилась на покровное стекло, пленка
образовывалась за счет свободного растекания жидкости на подложке.
Пленка сушилась при комнатной температуре 20оС и относительной
влажности менее 80% в течение 16 часов. После высыхания раствора
полученная кристаллограмма регистрировалась с помощью компьютерного
микроскопа.
3
2)
Однопроцентный раствор глицина
Одна стандартная таблетка глицина была помещена в 10 мл
дистиллированной воды и для полного растворения выдерживалась в
течение 15 минут при температуре 45°C на водяной бане.
Раствор в кювете облучали лазерным излучением в течение 20 минут.
Образец жидкости для кристаллограммы брали 3 раза: первый – до
облучения, второй – после 10 минут облучения, третий – после 20 минут.
Капля жидкости наносилась на покровное стекло, пленка
образовывалась за счет свободного растекания жидкости на подложке.
Пленка сушилась при комнатной температуре 20оС и относительной
влажности менее 80% в течение 23 часов. После высыхания раствора
полученная кристаллограмма регистрировалась с помощью компьютерного
микроскопа.
Следут заметить, что глицин является нейромедиатором- участвует в
процессах передачи нервного импульса в организме человека.
Общее число исследованных образцов: физиологический раствор – 3,
раствор глицина – 1.
5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ АГРЕГАТА
Размер агрегата определялся с помощью линейки в программе
Microsoft Office Paint 2010. Зная масштаб (то есть, сколько пикселей в
одном миллиметре), мы пересчитали размеры агрегатов на изображении в
реальные размеры.
6. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТА
По фотографиям физиологического раствора (рис. 2 и рис. 3) было
определено, что в необлученных образцах средний размер кристалла
составлял 150 мкм, в образцах, облученных 10 минут – 100 мкм, в образцах,
облученных 20 минут – 90 мкм (рис. 6)
По фотографиям однопроцентного раствора глицина (рис. 4 и рис. 5)
было определено, что в необлученных образцах средний размер агрегата
составлял 150 мкм, в образцах, облученных 10 минут – 90 мкм, в образцах,
облученных 20 минут – 80 мкм.
4
Рис 2 Участок кристаллограммы
не облученного физраствора, 200Х
Рис 3 Участок кристаллограммы
физраствора, облученного в течение
20 минут физраствор, 200Х
Рис 4 Участок кристаллограммы
Рис 5 Участок кристаллограммы
не облученного раствора глицина,
раствора глицина, облученного в
200Х
течение 20 минут, 200Х
Рис 6
Рис 7
5
7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Полученные результаты показывают, что при облучении происходит
уменьшение среднего размера кластеров макромолекул, что приводит к
уменьшению размеров зародышей при кристаллизации вещества за счет
высыхания раствора. Это позволяет предположить, что подобные изменения
происходят под действием лазерного излучения и в живых организмах.
Известно, что изменение структуры кластеров и конформаций биомолекул
существенно влияет на ее функционирование. Поэтому метод планарных
кристаллограмм, опробованный в данной работе, можно рекомендовать для
мониторинга структурных изменений, происходящих в биологических
жидкостях под действием лазерного излучения.
8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенного исследования можно сделать следующие
выводы.
1.
Показано, что формирование, регистрация и обработка
кристаллограмм позволяет регистрировать структурные изменения в
растворах биоорганических веществ (на примере физраствора и раствора
глицина).
2.
Отработан способ получения численных параметров размера
агрегата по цифровой фотографии кристаллограмм.
3.
Выявлено, что под действием лазерного излучения происходит
уменьшение размеров кристаллов в высохшей пленке биоорганической
жидкости.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Пул Ч., Оуэнс Ф. Нанотехнологии. - М.: Техносфера, 2005. - 134
с.
2.
Смирнов А.Н., Сыроешкин А.В. Супранадмолекулярные
комплексы воды // «Русский химический журнал (Журнал химического
общества им. Д.И. Менделеева)» )», 2004, т. XLVIII, № 2, с. 125- 136.
3.
Malov A.N., Musatova E.S., Seteikin A.U., Zinoviev S. V. Laser
nanoclasterization processes simulation // In «Modern Problems of
Nanopharmacology», The 8th Russia and China Pharmaceutical Forum, 14- 17
September 2011, Blagoveshchensk. – pp. 66 – 67.
6
4.
Патент ПМР № 180F1, приоритет от 17.04.2001. –удостоверение
№ 342, 4 с. Способ определения состояния биологического объекта/ Малов
А.Н., Выговский Ю.Н., Пидгурский С.Н., Писларюк Л.Д., Сенокосов Э.А.,
Фещенко В.С., Фещенко Л.В.; Тирасполь- опубл. «Бюлл. эконом. и
правовой информации», 2001.- № 9.
5.
Малов А.Н., Мусатова Е.С., Сетейкин А.Ю. Исследование
особенностей зародышеобразования при планарной кристаллизации
биоорганических растворов на твердой подложке // Вестник Амурского
государственного университета, 2012, выпуск 57, с. 39 – 44.
7