загрузить - ПЦР лабораторное оборудование, ПЦР тест

Разработка и апробация тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для
дифференциации видов уреаплазм и определения их концентрации в
образцах из урогентального тракта
Автор: Шипулина О.Ю., Гущин А.Е., Рыжих П.Г., Цеслюк М.М., Шипулин Г.А.
Организация: ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора РФ, Москва
Бактерии рода Ureaplasma в настоящее время относят к условно-патогенным микроорганизмам, а медицинский
термин "уреаплазмоз" официально не применяется. Под уреаплазмозом понимают воспалительный процесс в
мочеполовых органах, когда при лабораторном обследовании обнаружена Ureaplasma и не выявлены безусловнопатогенные микроорганизмы, способные вызвать данное воспаление. Зависимость между инфицированием
уреаплазмой и развитием острого воспалительного процесса остается недоказанной. Также пока обсуждается, но
не доказана возможность проникновения уреаплазм через плодные оболочки, с последующим инфицированием
плода, а также то, что уреаплазмы могут являться этиологической причиной преждевременных родов или
рождения детей с дыхательной недостаточностью.
Распространенность уреаплазменной инфекции среди женщин детородного возраста чрезвычайно высока и в
подавляющем большинстве случаев эта инфекция протекает в бессимптомной форме. Считается, что при
бессимптомном течении, обсемененность слизистых оболочек уреаплазмой (концентрация в мл образца) низкая –
103 КОЕ/мл, а концентрация 104 КОЕ/мл считается клинически значимой. При этом в литературе отсутствуют
публикации о каких-либо серьезных исследованиях, подтверждающих обоснованность этого утверждения.
Для определения титра живых уреаплазм в клиническом материале используют бактериологический метод –
микрокультуральный тест, основанный на 10-кратных последовательных разведениях клинического материала с
последующим посевом и определением титра колониеобразующих единиц (КОЕ) или цветообразующих единиц
(ЦОЕ). Длительность проведения исследования, возможность ошибки при разведении образца, тенденция
уреаплазм к агрегации, влияние сопутствующей микрофлоры или принимаемых препаратов на рост уреаплазм
ограничивают точность метода и влияют на правильность оценки клинической значимости этого лабораторного
маркера.
Важным недостатком культурального метода является невозможность дифференцировать виды Ureaplasma
(U.parvum и U.urealyticum), т.к. в последнее время накоплено большое количество данных, свидетельствующих о
разной степени патогенности этих двух видов. Так, доказано, что U.urealyticum может вызывать воспалительные
заболевания, уретриты и цервициты, а U.parvum с высокой частотой обнаруживается в урогенитальном тракте
здоровых женщин без жалоб и патологий. Частота обнаружения уреаплазм в группе здоровых беременных
женщин возрастает до 70-80%, причем в большинстве случаев выявляется U.parvum в высоком титре.
Цель.
Целью нашей работы явилась разработка тест-системы для одновременной дифференциации двух видов
уреаплазм – U.parvum и U.urealyticum и определения их концентрации в клинических образцах на основе ПЦР с
детекцией продуктов в режиме реального времени, а также апробация ее на контрольных образцах и
клиническом материале в сравнении с микрокультуральным тестом «Уреаплазма Микротест», который успешно
прошел испытания и получил разрешение для использования в медицинской практике в России.
Материалы и методы.
На основе мультипраймерной полимеразной цепной реакции в реальном времени нами была разработана тестсистема «АмплиСенс U.parvum/U.urealyticum–титр-FRT» для дифференциации и количественного определения
ДНК двух видов уреаплазм - Ureaplasma parvum и Ureaplasma urealyticum. В качестве мишени для амплификации
в геноме микроорганизма был выбран однокопийный ген уреазы, на который были выбраны три праймера для
амплификации, один из них общий, узнающий ДНК обоих видов уреаплазм, два другие – дифференцирующие.
Также были выбраны два флуоресцентно меченных зонда, один, меченный флуоресцентным красителем Fam,
специфичный для U.parvum, другой, меченный красителем R6G, специфичный для U.urealyticum. В тесте также
используется внутренний стандарт – количественно охарактеризованный неконкурентный внутренний контроль,
который предназначен для стандартизации и учета эффективности всех этапов ПЦР-анализа и используется для
расчета точной концентрации микроорганизма в объеме клинического образца. Для амплификации и выявления
ВК выбраны праймеры и зонд, меченный флуорофором Rox.
Для расчета концентрации ДНК U.parvum и ДНК U.urealyticum в стандартном объеме клинического образца, в
который помещен стандартный объем клинического материала, необходимо знать количество копий ДНК
U.parvum, U.urealyticum и ВК в реакционной пробирке, а также количество копий ДНК ВК, добавленное в каждый
исследуемый образец на этапе пробоподготовки. Первые три значения мы получаем из данных прибора,
измеряющего количество единиц флуоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации и сравнивая их со
значениями флуоресцентных сигналов в контролях-калибраторах, образцах, в которых находится ДНК U.parvum,
U.urealyticum и ВК в известной нам концентрации. А концентрацию ДНК ВК в образце мы получаем из вкладыша в
инструкцию к тест-системе, в котором вписаны результаты измерений данной серии контрольных образцов.
Пользуясь формулой расчета концентрации и электронными таблицами Excel можно автоматически получить
искомые значения для большого массива исследуемых образцов за несколько минут, всего лишь скопировав
данные с прибора и вставив их в нужные колонки электронной таблицы. Принципиальным отличием от
культурального исследования, результаты которого учитываются визуально, а поэтому высок риск ошибок,
которые может допускать лаборант, в количественном ПЦР-тесте исходные данные и результаты исследования
хранятся в лабораторной базе и всегда доступны.
Разработанная тест-система была апробирована на разведениях стандартных культур U.parvum (контрольный
штамм 468-1) и U.urealyticum (контрольный штамм 2T-2), концентрация живых микроорганизмов в которых
измерялась стандартным методом лимитирующих разведений. Аналитическая чувствительность теста составила
500 копий ДНК/мл для обоих штаммов. Диапазон линейного измерения составил – от 103 до 107 копий в мл.
Результаты определения средней по 10 измерениям концентрации целевых микроорганизмов в контрольных
штаммах представлены в таблице 1.
Таблица 1. Результаты измерения ДНК уреаплазм в контрольных образцах культуральным методом и с помощью
ПЦР в реальном времени.
Штамм (вид)
Концентрация ДНК
Ureaplasma(копий/мл)
468-1 (U.parvum)
2T-2 (U.urealyticum)
7.9*105
2.0*106
Титр U.p./U.u.
(ЦОЕ/мл)
2.0*105
3.2*105
Концентрация уреаплазм в культуральной жидкости U.parvum и U.urealyticum по данным культурального теста
ниже концентрации по уреаплазм по данным ПЦР-теста в 4 и 6 раз ниже, соответственно. Это связано с тем, что
в культуральном тесте, в отличие от ПЦР, выявляются только жизнеспособные микроорганизмы. А в любом
микробиологическом сообществе, в данном случае, чистой культуре микроорганизмов, находящейся в конце
логарифмической фазы роста, одновременно существуют как жизнеспособные, так и нежизнеспособные
микроорганизмы, которые не выявляются бактериологическими методами. Таким образом, по нашим данным, в
исследуемой культуре U.parvum доля жизнеспособных клеток составляет 25% от всей массы уреаплазм, а в
культуре U.urealyticum она составляет 16%.
Воспроизводимость результатов количественных измерений изучали на образцах вагинального отделяемого при
тестировании нескольких аликвот из одного и того же образца (на семи образцах, содержащих U.parvum в
концентрации от 8*104 до 5*106 копий/мл). А также нескольких последовательных получений вагинального
отделяемого из разных зон задненижнего свода влагалища от одной и той же пациентки (материал забранный от
двух пациенток содержал U.parvum в концентрации 1.3*106 и 7.6*105 копий/мл). В первом случае коэффициент
вариации (CV) находился в пределах от 4,2% до 13,1%, что свидетельствует о высокой точности метода
измерения. Во втором случае он составил 14.3 и 34.1%, соответственно, разница логарифмов концентраций не
была более 0.4, и это означает, что степень обсемененности уреаплазмами вагинального эпителия одинакова,
независимо от зоны.
Для апробации новой тест-системы на клиническом материале в сравнении с культуральным тестом были
собраны образцы цервикального канала и отделяемого влагалища от женщин, обратившихся к гинекологу по
поводу заболеваний шейки матки или беременных женщин, проходящих плановый осмотр. Образцы собирали в
стерильную транспортную среду для культурального теста и затем тестировали на наличие уреаплазм
культуральным тестом и с помощью ПЦР-теста «АмплиСенс U.parvum/U.urealyticum–титр-FRT». Всего было
протестировано 81 образцов. Результаты выявления уреаплазм обоими методами представлены в таблице 2. В
таблице 3 представлены значения концентраций ДНК уреаплазм в образцах, давших отрицательный результат в
культуральном тесте. Данные по распределению видов уреаплазм в группе ПЦР-положительных образцов
представлены в таблице 4. Данные по соотношению значений концентраций уреаплазм, полученных в
культуральном тесте и с помощью количественного ПЦР-теста представлены в таблице 5.
Таблица 2. Результаты выявления U.parvum и U.urealyticum в клинических образцах.
«АмплиСенс U.p./U.u.–титр-FRT»
положительный
«Уреаплазма Микротест»
положительный
43
«Уреаплазма Микротест»
отрицательный
8
«АмплиСенс U.p./U.u.-титр-FRT»
0
30
отрицательный
Таблица 3. Результаты определения концентрации U.parvum и U.urealyticum в клинических образцах, давших
отрицательный результат в культуральном тесте.
образец
18
19
20
73
76
104
106
116
Вид Ureaplasma
U.parvum
U.parvum
U.urealyticum
U.parvum
U.parvum
U.parvum
U.urealyticum
U.parvum
Копий ДНК/мл
8.2*104
9.1*105
7.6*102
9.2*105
1.8*104
2.0*103
4.4*104
8.2*102
lg копий ДНК/мл
4.9
5.0
2.9
6.0
4.3
3.3
4.6
2.9
Таблица 4. Распределение видов уреаплазм в группе ПЦР-положительных образцов.
Вид Ureaplasma
U.parvum
U.urealyticum
U.parvum+ U.urealyticum
Количество
образцов
37
12
2
% от общего числа
положительных
72,5
23,5
3,9
Средняя концентрация (lg
копий/мл)
5.4 (2.3 – 6.7)
5.3 (2.9 – 7.0)
5.8, 5,9
Таблица 5. Значения концентраций уреаплазм, полученные в культуральном тесте и с помощью количественного
ПЦР-теста.
Титр уреаплазм по данным
культурального теста
106
105
104
103
Образцов в группе
16
11
4
12
Среднее и разброс значений
концентрации ДНК уреаплазм в ПЦРтесте (lg копий ДНК/мл)
6.1 (4.6 – 6.0)
5.3 (3.5 – 6.4)
6.2 (6.1 – 6.2)
5.1 (3.8 – 6.0)
Как видно из данных, представленных в таблицах 2 и 3, чувствительность ПЦР-теста в выявлении уреаплазм
выше чувствительности культурального теста, причем, в культуральном тесте не выявлялись положительные
образцы, концентрация уреаплазм в которых была достаточно высокой, более104 уреаплазм в мл клинического
образца.
Как видно из таблицы 4, образцы, содержащие U.urealyticum составляют примерно четверть от всех
положительных образцов, причем концентрация уреаплазм в образце не зависит от ее вида.
Из данных, представленных в таблице 5 следует, что точность определения титра уреаплазм основанного на
десятикратных разведениях образца и определения положительного результата с помощью культурального
метода значительно уступает точности определения концентрации уреаплазм с помощью количественного ПЦРтеста. Коэффициент корреляции между двумя методами составил 0,43.
Заключение.
Таким образом, тест-система «АмплиСенс U.parvum/U.urealyticum–титр-FRT», разработанная для
дифференциации видов уреаплазм и определения концентрации ДНК уреаплазм в образцах из урогенитального
тракта, показала лучшие аналитические характеристики в сравнении с культуральным тестом «Уреаплазма
Микротест» и может быть рекомендована для использования в рутинной лабораторной практике.