На правах рукописи ЕГОРОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА НАНОЧАСТИЦЫ МЕТАЛЛОВ В РАСТВОРАХ:
advertisement
На правах рукописи ЕГОРОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА НАНОЧАСТИЦЫ МЕТАЛЛОВ В РАСТВОРАХ: БИОХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Москва – 2011 Работа выполнялась в Институте электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН, в НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН и в МИТХТ им. М.В.Ломоносова. Научный консультант: академик РАМН доктор химических наук, профессор Швец Виталий Иванович Официальные оппоненты: чл.-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Северин Евгений Сергеевич доктор биологических наук, профессор Бурлакова Елена Борисовна доктор химических наук, профессор Варламов Валерий Петрович Ведущая организация: Институт биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН Защита диссертации состоится «25» апреля 2011 г. в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр.Вернадского, д.86. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.Ломоносова. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК РФ: http//vak.ed.gov.ru Автореферат разослан «____» марта 2011 г. Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук старший научный сотрудник Лютик А.И. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В развитии современных нанотехнологий значительную роль играют исследования наночастиц металлов. Это обусловлено, прежде всего, широким спектром возможностей их практического применения, в которых используются специфические свойства как самих наночастиц, так и модифицированных ими материалов. Наиболее разработаны, на сегодняшний день, возможности использования наночастиц металлов при создании новых катализаторов для различных промышленных процессов. Хорошие перспективы открываются и для применения наночастиц металлов в других областях техники, а также в биологии и медицине. Возможности применения наночастиц для диагностики и лечения различных (в том числе онкологических) заболеваний, а также в иммунохимических методах исследования уже активно изучаются в новом направлении экспериментальной медицины, получившем название «Наномедицина». Показано, в частности, что наночастицы серебра могут использоваться для получения различных материалов с бактерицидными свойствами, а наночастицы золота - для повышения эффективности и уменьшения побочных эффектов в радиотермальной терапии опухолей. В то же время, за последнее десятилетие установлено, что наночастицы различных видов, особенно наночастицы металлов, попадая в организм человека, могут стать причиной серьезных заболеваний (нанопатологий). Известно, что наночастицы металлов могут проникать в организм человека различными путями: через слизистые оболочки дыхательных путей и пищеварительного тракта, трансдермально (например, при использовании косметических средств), через кровоток в составе вакцин и сывороток и т.д. Опасность распространения нанопатологий, хотя еще и не вполне осознана, но несомненно велика уже сегодня, и, очевидно, будет нарастать в будущем. Выяснение причин патологического действия наночастиц и разработка способов борьбы с заболеваниями, вызванными проникновением в организм наночастиц, становятся сейчас предметом нового направления в экспериментальной медицине. Таким образом, можно утверждать, что определение путей и способов воздействия наночастиц металлов на живой организм – это чрезвычайно важная и актуальная работа, необходимая, во-первых, для улучшения имеющихся и создания новых лекарственных средств или способов лечения, то есть для наномедицины, во-вторых, для выяснения причин нанопатологий и, в третьих, для установления научно обоснованных допустимых диапазонов концентраций и размеров наночастиц в воде, воздухе или в составе различных материалов, с которыми контактирует человек. 3 Возможности исследования свойств наночастиц металлов, разработки вариантов их практического применения, а также выяснения механизмов их биологического действия в значительной степени зависят от способа получения, который во многих случаях определяет их структуру, размеры, физические и химические свойства и, главное, стабильность – время жизни в наноразмерном состоянии. Среди способов получения наночастиц большую группу образуют методы химического синтеза, основанные на восстановлении ионов металла до атомов в растворах, в условиях, благоприятствующих последующей агрегации атомов и ионов с образованием наночастиц. К моменту начала нашего исследования важной задачей в области химического синтеза было создание методов, пригодных для практического применения – позволяющих получать наночастицы металлов малого размера, в значительных количествах, стабильные на воздухе, - и при этом приемлемых с экономической точки зрения (не требующих больших затрат энергии, дорогостоящего оборудования, дополнительных синтезов и т.п.). Одним из таких методов явился предложенный нами метод биохимического синтеза, на основе которого возникло новое направление в области синтеза, исследований свойств и разработки вариантов применения наночастиц металлов. Можно сказать, что необходимость создания такого направления вытекала из потребностей развития исследований в нанохимии, наномедицине и нанопатологии, ориентированных прежде всего на решение прикладных задач с использованием достижений нанотехнологий. Цель и задачи работы Цель работы состояла в создании нового направления в области синтеза наночастиц металлов в растворах, которое позволяло бы получать наночастицы металлов в больших (практически значимых) количествах, стабильные на воздухе в течение длительного времени, что давало бы возможность проводить систематические исследования их свойств и разработки вариантов применения. При выполнении работы были поставлены следующие основные задачи: 1. Определение условий синтеза наночастиц различных металлов в обратных мицеллах, которые позволяли бы реализовать преимущества, даваемые сочетанием системы обратных мицелл и биологических восстановителей (природных пигментов из группы флавоноидов), в соответствии с целью работы; 2. Исследование механизма взаимодействия используемых флавоноидов с ионами металлов в обратных мицеллах, что представлялось важным как для совершенствования процедуры синтеза, так и для исследований взаимодействия флавоноидов с ионами металлов в биологических системах; 4 3.Разработка процедур получения водных растворов наночастиц металлов из их обратномицеллярных растворов, для исследований свойств и выяснения возможностей применения наночастиц в водных средах; 4.Разработка процедур получения различных жидкофазных и твердых материалов, модифицированных наночастицами металлов; 5.Исследование каталитических свойств и биологических эффектов наночастиц металлов в растворах и модифицированных ими материалов, для разработки вариантов применения в химической промышленности, экспериментальной биологии и медицине. Научная новизна. 1. Предложен оригинальный метод синтеза наночастиц металлов - биохимический синтез в обратных мицеллах с использованием в качестве восстановителей природных биологически активных веществ из группы флавоноидов. Впервые экспериментально доказано, что природные флавоноиды (кверцетин, рутин, морин) способны эффективно восстанавливать ионы металлов в водном ядре обратной мицеллы с образованием металлических наночастиц. 2. Определено влияние различных факторов (концентраций соли металла и восстановителя, состава соли металла, степени гидратации) на скорость формирования, оптические свойства, размеры и стабильность наночастиц металлов в обратных мицеллах. 3. Исследован механизм взаимодействия флавоноидов с ионами серебра, золота, меди и цинка; показано, что первой стадией взаимодействия является образование комплекса, затем комплекс распадается с образованием наночастиц и флавоноида в окисленной форме. 4. Найдены коэффициенты экстинкции кверцетина и рутина, комплексов кверцетина с ионами металлов и наночастиц серебра в обратных мицеллах из аэрозоля– ОТ (АОТ). 5. Разработаны процедуры получения водных дисперсий наночастиц металлов из их мицеллярных растворов. 6. Изучено влияние различных факторов (концентраций компонентов раствора, свойств поверхности адсорбента) на адсорбцию наночастиц серебра и меди из мицеллярных растворов и наночастиц серебра из водных дисперсий на различных материалах (активированном угле, силикагеле, порошках оксидов металлов, тканях, полимерных мембранах и др.). 7. Исследованы антимикробные и каталитические свойства наночастиц серебра и меди в растворах, а также модифицированных этими наночастицами жидкофазных и твердых материалов. Установлено, что, как растворы наночастиц, так и 5 модифицированные ими материалы обладают высокой механизмов возникновения бактерицидной или каталитической активностью. 8. Для выяснения патологий, обусловленных проникновением наночастиц металлов в организм человека, проведены исследования, позволяющие продвинуться в понимании основных закономерностей взаимодействия наночастиц металлов с клетками (in vitro) и живыми организмами. Эксперименты проводились с водными дисперсиями наночастиц серебра на биологических объектах разного уровня организации (одноклеточных микроводорослях, плесневом грибе, семенах растений, грызунах, культурированных клетках человека). Определено влияние концентрации наночастиц серебра на жизнеспособность и функциональную активность биологических объектов. Установлено отличие биологического действия наночастиц и ионов серебра. Научно- практическая значимость работы Известно, что свойства внутренней среды обратных мицелл при малых степенях гидратации близки к свойствам внутренней среды клеточных органелл и компартментов живой клетки. Таким образом, установленный в работе факт формирования наночастиц металлов при взаимодействии флавоноидов с ионами металлов в обратных мицеллах демонстрирует принципиальную возможность образования кластеров и наночастиц в результате взаимодействия флавоноидов с ионами металлов в живых организмах. Отсюда следует, что система обратных мицелл может служить адекватной моделью для изучения механизмов биологической активности флавоноидов, включающей их взаимодействия с ионами металлов. В частности, полученные в работе данные о коэффициентах экстинкции и структуре комплексов флавоноидов с ионами металлов в обратных мицеллах могут быть полезны для углубления понимания процессов, лежащих в основе антиоксидантного действия флавоноидов в биологических системах. Установлено, что, как растворы наночастиц, так и модифицированные ими материалы представляют несомненный интерес для практического применения. Показано, в частности, что водные дисперсии наночастиц серебра могут использоваться для создания жидкого дезинфицирующего средства нового типа, обладающего существенными преимуществами по сравнению с рядом известных дезинфектантов. Обнаружена значительная каталитическая активность для наночастиц меди в реакции изомеризации дихлорбутенов (одной из стадий получения синтетического каучука), а также для наночастиц серебра, меди и других металлов в реакциях органического синтеза, используемых при получении различных красителей, отбеливателей, добавок к топливам 6 и другой продукции одного из отечественных предприятий (завод «Пигмент», г.Тамбов). Было зафиксировано существенное увеличение скорости процесса, выхода и качества продуктов по ряду показателей. Полученные в работе результаты по биологическим эффектам наночастиц серебра на объектах разного уровня организации могут быть использованы, во-первых, для выработки рекомендаций по выбору действующих концентраций наночастиц серебра с целью применения их в медицине (для диагностики или в виде лекарственных препаратов) и, во-вторых, для разработки санитарных норм при определении допустимых концентраций наночастиц металлов в окружающей среде и в материалах, с которыми контактирует человек. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Создан оригинальный метод синтеза наночастиц металлов в растворах, позволяющий получать наночастицы малого размера (не более 25 нм), стабильные на воздухе в течение длительного времени, что позволяет проводить систематические исследования их свойств и разрабатывать варианты их практического применения. 2. Исследован механизм взаимодействия восстановителей (флавоноидов) с ионами металлов в обратных мицеллах. Показано, что синтез наночастиц идет через стадию образования комплекса флавоноида с ионами металла в водном ядре обратной мицеллы. 3. Разработана технология получения водных растворов наночастиц металлов из их мицеллярных растворов. 4. Разработана технология нанесения наночастиц металлов из мицеллярных и водных растворов на различные твердые материалы. 5. Предложены различные варианты применения растворов наночастиц серебра и модифицированных ими жидкофазных и твердых материалов. Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах работ по синтезу наночастиц, получению их водных растворов, исследованию механизма взаимодействия флавоноидов с ионами металлов и адсорбционных свойств наночастиц металлов в растворах – от постановки задачи, планирования и проведения экспериментов, до анализа, обсуждения и оформления полученных результатов. В исследованиях биологических эффектов и каталитических свойств наночастиц в большинстве случаев автору принадлежит ведущая роль в постановке задачи, планировании экспериментов, а также в анализе, обсуждении и оформлении полученных результатов. В некоторых случаях планирование и оформление и во всех случаях проведение экспериментов в этих исследованиях осуществлялось специалистами соответствующих учреждений и предприятий. 7 Апробация работы. Результаты работы докладывались на VII Всероссийской конференции «Органические реагенты в аналитической химии» симпозиуме «Физика и химия полиметиновых (Саратов, 1999), VII красителей» (Москва, 1999), Международной конференции по наукоемким технологиям (Москва, 1999), International Conference «Colloids 2000» (Hungary, Szegel, 2000), II Всероссийском совещании «Высокоорганизованные каталитические системы" (Москва, 2000), XII Симпозиуме по современным проблемам химической физики (Туапсе, 2000), VII Международном Фрумкинском симпозиуме (Москва, 2000), X International Symposium on Relation between Homogeneous and Heterogeneous Catalysis. (Lyon, France, 2001), VII Международном симпозиуме «:Metal Ions in Biology and Medicine» (Санкт-Петербург, 2002), VI Всероссийской (международной) конференции «Физикохимия ультрадисперсных (нано-) систем (Томск, 2002), I и V Международных Конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002 и 2009), Научных сессиях МИФИ (Москва, 2003, 2004), I и II Всероссийских (международных) научно-практических конференциях «Нанотехнологии - производству» (Фрязино, 2004, 2005), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), V международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, 2008), Международном симпозиуме «Biological Motility: achievements and perspectives» (Пущино, 2008), I Международной летучей школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Красновидово, 2009), 4-th International Conference «Environmental effects of nanoparticles and nanomaterials» (Vienna, Austria, 2009), II и III Международных форумах по нанотехнологиям «Rusnanoforum 2009, 2010» (Москва, 2009, 2010), Международном семинаре «Дни Horiba в России» (Санкт-Петербург, 2010). Результаты прикладных разработок представлялись также на нескольких международных выставках: Экватек-2002, Интерлакокраска-2003, 2004, 2009. Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 224-х страницах основного текста, содержит 76 рисунков, 18 таблиц и состоит из введения, литературного обзора, описания предпосылок и основ биохимического синтеза, включая материалы и методы исследования и примеры синтеза наночастиц (1 глава), изложения и обсуждения результатов исследований процесса формирования и свойств наночастиц (7 глав), описания возможностей применения наночастиц (1 глава), выводов и списка литературы (256 наименований). Публикации По материалам работы имеется 53 публикации, из них 2 обзора, 19 статей, 4 патента и 28 тезисов докладов. 8 Работа выполнена при участии МГУ им. М.В.Ломоносова (кафедра химической кинетики и катализа химического факультета), Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино), НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН (Москва), НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов ГНЦ (Москва), Тамбовского государственного технического университета (кафедра химической технологии органических веществ), Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН (Москва). Работа проводилась при поддержке РФФИ (грант 01-03-32783), комплексной программы РАН «Наноматериалы и супрамолекулярные системы» на 2003 г., ФЦП на 2009-2013 годы по лоту «Проведение научных исследований коллективами научнообразовательных центров в области биомедицинских и ветеринарных технологий жизнеобеспечения и защиты человека и животных», по теме «Инновационные технологии получения новых биологически активных субстанций с повышенной эффективностью терапевтического и диагностического действия и наноразмерных лекарственных форм созданных субстанций и известных медицинских препаратов», а также нескольких частных компаний, заинтересованных во внедрении наночастиц металлов. Основное содержание работы 1. Биохимический синтез в обратных мицеллах. 1.1. Предпосылки метода. Сравнение с другими химическими методами. Биохимический синтез относится к группе химических методов получения наночастиц металлов в растворах, основанных на восстановлении ионов металла до атомов в условиях, благоприятствующих формированию наночастиц. В этой группе синтез наночастиц проводится в молекулярных (водных или неводных) растворах или в обратных мицеллах – в тройной системе: водный раствор соли металла/ПАВ/неполярный растворитель. В последнем случае реакция восстановления и формирование наночастиц протекают в водном ядре мицеллы, образованной молекулами ПАВ (поверхностноактивного вещества). Восстановителями наиболее часто служат (1) неорганические (гидразин, борогидрид натрия) или органические (формальдегид, глюкоза, цитраты и др.) вещества, традиционно используемые в этом качестве в химии, (2) сольватированный электрон, генерируемый ионизирующим излучением, (3) фотоэлектроны, возникающие под действием УФ или лазерного излучения и (4) электроны, генерируемые на катоде в ходе электролиза растворов, содержащих соли соответствующих металлов. Во всех случаях используются стабилизаторы, которые обеспечивают устойчивость системы, предотвращая агрегацию наночастиц. Стабилизаторами обычно служат природные (желатин, крахмал, агар-агар и др.) или синтетические полимеры и ПАВ; в некоторых случаях роль стабилизатора может играть восстановитель. 9 Сравнительный анализ разных вариантов химического синтеза показывает, что система обратных мицелл имеет ряд преимуществ перед молекулярным раствором. Вопервых, агрегация наночастиц здесь происходит, как правило, значительно медленнее, то есть, время жизни наночастиц в обратно-мицеллярном (далее мицеллярном) растворе существенно увеличивается по сравнению с молекулярным раствором. Во-вторых, варьируя параметры мицеллярного раствора (в частности, задавая диаметр водного ядра мицеллы), оказывается возможным достаточно надежно контролировать размеры, получаемых наночастиц. Таким образом, синтез в обратных мицеллах позволяет получать дисперсии наночастиц со сравнительно узким распределением по размерам, что весьма существенно для исследования их свойств, в том числе «размерных эффектов». Другой важный вывод вытекает из результатов применения не традиционных химических, а природных биологических восстановителей, содержащихся, главным образом, в водных экстрактах из растений или супернатантах культур бактерий. Было показано, в частности, что водные экстракты из семян люцерны, чечевицы, листьев хны и герани, почек и цветков гвоздики, из некоторых грибов, супернатанты культур кишечной палочки и золотистого стафилококка способны эффективно восстанавливать ионы благородных металлов (золота и серебра) в водном растворе с образованием наночастиц, стабилизированных либо самим восстановителем, либо другими веществами (белками, полисахаридами), присутствующими в том же растворе. Как неоднократно отмечалось в литературе, такой способ имеет ряд преимуществ перед традиционными методами, главными из которых являются мягкие условия синтеза и отсутствие в растворе, содержащем наночастицы, более или менее ядовитых побочных продуктов или примесей в самих наночастицах, которые неизбежно появляются при использовании основных химических восстановителей. Поэтому такое «биологическое» восстановление как основа для получения металлических наночастиц имеет хорошие перспективы применения в биологии, медицине и других областях, где важно обеспечить минимальную токсичность растворов наночастиц металлов для живых организмов. В биохимическом синтезе сочетаются преимущества системы обратных мицелл и биологических восстановителей. В основе метода лежит восстановление ионов металлов в обратных мицеллах природными биологически активными веществами – растительными пигментами из группы флавоноидов. Используются три представителя этой группыкверцетин, рутин и морин; первые два хорошо известны как вещества, обладающие выраженной антиоксидантной и радиопротекторной активностью и применяемые в медицине в качестве лекарственных средств и пищевых добавок. Изучение механизмов биологического действия флавоноидов (главным образом, путем изучения их реакций в водных растворах) позволило установить, что во многих случаях наблюдаемые эффекты обусловлены способностью этих веществ образовывать прочные комплексы с ионами металлов (главным образом, меди и железа), играющих важную роль в процессах перекисного окисления липидов. Наша идея состояла в том, что можно использовать эту 10 способность флавоноидов для синтеза наночастиц металлов, если взаимодействие флавоноидов с ионами металлов будет происходить в водном ядре обратной мицеллы, то есть в среде, существенно отличающейся по свойствам от молекулярного раствора и, как известно из литературы, благоприятствующей образованию наночастиц в других вариантах химического синтеза. И действительно, реализация этой идеи позволила получить наночастицы золота, серебра, меди и других металлов. Название «биохимический синтез» не вполне корректно, поскольку оно рождает аналогию с процессами биосинтеза, протекающими в живой клетке и являющимися одним из направлений исследований в биохимии, тогда как по существу речь идет о химической реакции восстановления ионов металла до атомов биологическими молекулами, которая запускает процесс агрегации атомов и ионов, то есть собственно синтез наночастиц. Аналогичная трудность возникает при формальном рассмотрении названий методов, использующих биологические восстановители («биовосстановление», «зеленый синтез», тот же «биохимический синтез»), о которых говорилось выше. В нашем случае из различных вариантов названия, обсуждавшихся на начальном этапе развития метода, со временем прочно утвердился лишь один - «биохимический синтез в обратных мицеллах» поскольку в нем отражается основное отличие, с одной стороны, от химических методов, использующих небиологические восстановители в обратных мицеллах, и, с другой стороны, от химических методов, использующих биологические восстановители в водных растворах. В публикациях и докладах используется обычно сокращенный вариант – «биохимический синтез», с соответствующими пояснениями о сущности метода, если это оказывается необходимым. По сравнению с другими химическими методами, биохимический синтез обладает рядом преимуществ, важных для практического применения металлических наночастиц. Сравнение с методами, использующими традиционные химические восстановители, выявляет следующие преимущества. Во-первых, при биохимическом синтезе образование наночастиц идет в растворе на воздухе, тогда как во многих других известных вариантах для получения наночастиц необходимо создавать вакуум или атмосферу инертного газа. Это обстоятельство, а также другие особенности процедуры синтеза позволяют избежать усложнений, необходимых в других методах (дополнительных синтезов, применения дорогостоящего или энергоемкого оборудования и др.), что значительно удешевляет конечный продукт. Во-вторых, оказывается возможным получать наночастицы, стабильные в растворе на воздухе в течение длительного времени (до нескольких лет), что весьма существенно как для исследования их свойств, так и для прикладных разработок. В то же время, известно, что в других случаях время жизни наночастиц часто не превышает нескольких дней. В-третьих, для некоторых металлов удается повысить степень превращения ионов металла в наночастицы по сравнению с достигаемой другими методами и уменьшить расход восстановителя, что важно, опять-таки, с экономической 11 точки зрения. В-четвертых, применение природных восстановителей делает метод более экологически безопасным. При биологическом восстановлении в водном растворе синтез также идет на воздухе, технологически не сложен, наночастицы в большинстве случаев стабильны в растворе на воздухе, раствор не содержит ядовитых примесей, так что здесь присутствуют почти все преимущества биохимического синтеза по сравнению с традиционными химическими методами, перечисленные выше. Однако имеются и проблемы, в силу которых этот способ получения наночастиц оказывается менее пригодным для практических целей, чем биохимический синтез. Во-первых, в большинстве случаев водный раствор, в котором образуются наночастицы, имеет сложный состав и неизвестно, какое вещество является восстановителем и в какой концентрации оно присутствует в растворе. Кроме того, состав раствора обычно плохо воспроизводим, поскольку он зависит от свойств биообъекта, которые, в свою очередь, могут существенно зависеть от его предыстории (например, для листьев растения – от условий (почвы, климата и т.д.), в которых оно выращено, фазы его развития, времени года). Во-вторых, для таких частиц характерно очень широкое распределение по размерам, что затрудняет исследования влияния размера частиц на их биологическую активность. В-третьих, скорость формирования и выход наночастиц часто бывают невелики, так что сложно быстро получить раствор с высокой концентрацией наночастиц, что требуется во многих вариантах применения. В биохимическом синтезе эти недостатки отсутствуют, но это не означает, что метод является универсальным и может применяться без каких-либо ограничений. Например, наночастицы в обратных мицеллах (в мицеллярных растворах) взвешены в органическом растворителе, что делает невозможным применение их в водных средах. Но эта проблема была решена путем разработки технологии приготовления водных растворов наночастиц из их мицеллярных растворов (см. раздел 5). Таким образом, удалось сохранить преимущества биохимического синтеза в обратных мицеллах и в то же время расширить поле исследований свойств наночастиц и спектр возможных применений. 1.2. Общая схема синтеза Синтез проводится в обратных мицеллах из АОТ – анионного ПАВ, которое наиболее часто применяется для создания обратно-мицеллярных систем, поскольку оно хорошо растворимо во многих неполярных растворителях и позволяет получать стабильные обратные мицеллы в широком диапазоне концентраций ПАВ и степеней гидратации w = [H2O]/[ПАВ]. Строение обратной мицеллы в системе Н2О/АОТ/н-алкан в общем виде показано на рис.1. Для обычно используемой нами системы Н2О/АОТ/изооктан во всем диапазоне степеней гидратации (0.5 <w ≤ 10) диаметр водного ядра, 2Rw ≤ 2 нм; при наиболее часто применяемых значениях (w < 4) 2Rw ≤ 1 нм. 12 Рис.1. Строение обратной мицеллы. Rh и Rw соответственно, гидродинамический радиус и радиус водного ядра. «Связанная» вода – жестко структурированная вода в пограничном слое, где сказывается организующее влияние полярных головок ПАВ. При малых степенях гидратации (w<4), наиболее часто используемых в биохимическом синтезе, вся вода в ядре мицеллы является связанной. Восстановление ионов металла в ядре мицеллы показано на примере иона Ag+. Общая схема биохимического синтеза показана на рис.2. Возможны два основных пути процесса: смешение предварительно отдельно приготовленных мицеллярных растворов флавоноида и соли металла (I) и введение водного раствора соли металла непосредственно в мицеллярный раствор флавоноида (II). В первом случае для приготовления мицеллярного раствора флавоноида используется его концентрированный раствор в этаноле солюбилизируется АОТ/жидкий или пропаноле. в Во втором случае порошок флавоноида растворе углеводород. В обоих случаях конечными продуктами являются наночастицы в водном ядре мицеллы и флавоноид в окисленной форме. Рис.2. Общая схема биохимического синтеза. Fl и Fl+ - флавоноид в молекулярной и окисленной форме, соответственно. NP – наночастица. Для каждого металла требовалась специальная работа по подбору условий (концентраций реагентов, концентрации АОТ, степени гидратации, состава соли металла), которые обеспечивали высокую скорость образования и стабильность наночастиц, а также достаточно высокую степень превращения ионов металла в наночастицы. По наблюдениям, сделанным на начальном этапе работ по биохимическому синтезу, при использовании варианта I скорость реакции и выход наночастиц, как правило, оказывались меньше, чем при выборе варианта II, поэтому в дальнейшем наночастицы получали почти исключительно по этому последнему варианту. Вследствие особенностей оптических свойств комплексов флавоноидов с ионами металлов и металлических наночастиц, процесс формирования наночастиц сопровождается характерными изменениями окраски раствора, что часто позволяет визуально фиксировать момент начала синтеза и приблизительно оценивать скорость процесса. 13 1.3. Основные материалы и методы исследования Для получения наночастиц использовали кверцетин (Qr), рутин (Ru) и морин (Mo) производства фирм Merck, Sigma-Aldrich или Acros, соли металлов (нитраты или сульфаты) марки х.ч. и золотохлористоводородную кислоту (ЗХВК), все отечественного производства, водный раствор аммиака, нормальные углеводороды (С6 – С8, чаще всего изооктан эталонный, Химмед), АОТ (бис-(2-этилгексил)сульфосукцинат натрия) производства фирм Acros или Aldrich. Растворы солей металлов и ЗХВК готовили на деионизованной воде, полученной с помощью прибора «Водолей» (НПО “Химприбор”, Москва). Для приготовления водных дисперсий наночастиц дистиллированную воду. Контроль рН и ионного состава воды использовали проводили методом потенциометрии на приборе «Экотест-2000» («Эконикс», Москва). Растворы аммиачных солей металлов готовили путем введения водного раствора аммиака в водный раствор соли металла до полного растворения выпадающего осадка гидроокиси металла и образования комплексных аммиак-содержащих катионов серебра ([Ag(NH3)2]+), и других металлов ([Cu(NH3)4]2+, получали растворы [Zn(NH3)4]2+ , [Cо(NH3)4]2+ ,[Ni(NH3)4]2+ ) Соответственно, диамминнитрата серебра и тетраамминнитратов или тетраамминсульфатов двухвалентных металлов, которые затем вводили в мицеллярный раствор флавоноида до заданной степени гидратации. Мицеллярные растворы флавоноидов готовили по разработанной нами стандартной методике. Вначале готовили раствор АОТ в углеводороде, затем в нем солюбилизировали флавоноид, взятый в виде порошка. При необходимости АОТ и флавоноиды предварительно подвергали сушке для уменьшения содержания гидратационной воды. Концентрацию флавоноидов в растворе определяли методом спектрофотометрии; для этого предварительно находили их коэффициенты экстинкции в мицеллярном растворе. Контроль формирования и стабильности, а также исследования оптических и адсорбционных свойств наночастиц осуществляли путем измерения спектров оптического поглощения с использованием спектрофотометров Specord M40 (Carl Zeiss, Германия) и Helios-α (Thermo Electronics, Великобритания). Размеры частиц в растворе определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии (ФКС) на приборах Coulter N4 MD (Coulter Electronics, США) и Horiba LB 550 (Horiba, Япония). Микрофотографии наночастиц получали методом просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ). Для этого использовали электронный микроскоп LEO912 AB OMEGA с ускоряющим напряжением 120 кВ (Carl Zeiss, Германия), доступный в центре коллективного пользования биологического факультета МГУ. 1.4. Примеры синтеза наночастиц металлов Растительные пигменты группы флавоноидов, в том числе используемые нами кверцетин, рутин и морин – это низкомолекулярные полифенольные соединения, основой которых является трехкольцевая структура: два ароматических кольца (А и В), соединенных между собой гетероциклом (С), содержащим кислород (рис.3). 14 Мицеллярные растворы этих флавоноидов, как и их водно-спиртовые или водные растворы, имеют две основные полосы поглощения в УФ области спектра (рис.4): полосу I и полосу II в интервале, соответственно, 360-380 нм и 240-270 нм. Полосы поглощения обусловлены π – π* переходами системах: в полоса двух хромофорных I – в кольце В, сопряженном с трехуглеродным фрагментом кольца С, полоса II – в кольце А, сопряженном с кольцом С. Рис.3 (слева). Структура молекул флавоноидов, используемых в биохимическом синтезе. 1 – кверцетин, 2 - рутин, 3 – морин. Sug – дисахарид, состоящий из остатков глюкозы и рамнозы. Рис.4 (сверху). Спектры оптического поглощения флавоноидов – кверцетина (Qr), рутина (Ru) и морина (Mo) в мицеллярных растворах. I и II - две основные полосы поглощения. Введение водных растворов солей металлов в мицеллярные растворы флавоноидов с последующим встряхиванием в течение нескольких минут приводит к более или менее быстрым изменениям окраски и спектра поглощения растворов, отражающим различные стадии взаимодействия флавоноидов с ионами металлов, завершающиеся образованием наночастиц. Синтез наночастиц осуществлялся главным образом на растворах кверцетина; проводились также эксперименты с рутином и морином для выяснения влияния различий в структуре флавоноидов на процесс формирования наночастиц. Ниже приведено несколько примеров синтеза наночастиц. Наночастицы серебра Введение водного раствора соли серебра в мицеллярный раствор Qr, после встряхивания в течение 1-3-х мин приводит к резкому изменению окраски раствора – от бесцветной или бледно-желтой до красно-коричневой разной интенсивности или почти черной, в зависимости от концентрации образующихся наночастиц. В спектре поглощения исчезают обе полосы Qr и появляется новая полоса в видимой области с максимумом в интервале 420-440 нм, характерным для наночастиц серебра в обратных мицеллах. Эта новая полоса постепенно растет и через 1-4 суток оптическая плотность в максимуме полосы (Dmax) достигает наибольшей величины (Dоmax). В последующие несколько недель оптическая плотность отклоняется от Dоmax не более чем на 10%, так что значение Dоmax считается соответствующим завершению процесса формирования наночастиц 15 (стационарная стадия). Типичное изменение спектра поглощения мицеллярного раствора Qr после введения раствора соли серебра показано на рис.5. Интенсивная окраска раствора позволяет визуально контролировать стабильность наночастиц и приблизительно оценивать изменения их концентрации. Рис.5. Характерный вид изменения спектра мицеллярного раствора кверцетина после введения водного раствора соли серебра. C(Qr) = 0.236 mM, C(Ag) = 3 mM (концентрация введенной соли металла), С(АОТ) = 0.15 М, w = 3.7. Для сравнения приведен спектр исходного раствора кверцетина. Здесь и на последующих рисунках приведены спектры, снятые при длине оптического пути 1 мм. Концентрация наночастиц в растворе измеряется в единицах либо молярной концентрации (эквивалентной концентрации соли металла), либо весовой концентрации (весовое содержание наночастиц); металла последнюю в находят виде путем пересчета из молярной концентрации с использованием атомного веса металла. Для определения молярной концентрации из спектра поглощения необходим коэффициент экстинкции наночастиц, который для большинства металлов неизвестен, поскольку, как правило, сложно определить, какая часть введенных в раствор ионов металла превратилась в наночастицы. Для нескольких металлов (Ag, Au, Cu) коэффициенты экстинкции можно найти в литературе, однако они могут зависеть от метода получения наночастиц и поэтому для надежного определения концентрации желательно иметь коэффициенты экстинкции, найденные для своей экспериментальной системы. Такая работа была проделана нами для наночастиц Ag (см. раздел 4). Для прикладных исследований была разработана стандартная процедура, позволяющая получать растворы с концентрациями наночастиц порядка нескольких миллимолей (нескольких сотен мг/л) и средними размерами в интервале 8-10 нм. На рис. 6 показан пример электронной микрофотографии и соответствующего распределения по размерам в стандартном мицеллярном растворе. Рис.6. Электронная микрофотография и гистограмма распределения по размерам в стандартном мицеллярном растворе наночастиц серебра. w=3.7. 16 Частицы сферические, средний размер 9 нм, разброс по размерам ± 2 нм. Анализ электронных дифрактограмм показывает, что наночастицы имеют кристаллическую структуру с параметрами решетки, близкими к таковым для кристаллов золота. На рис.7 приведена типичная гистограмма для стандартного раствора, полученная методом ФКС. Рис.7. Типичная гистограмма распределения частиц по размерам в стандартном мицеллярном растворе наночастиц серебра, полученная методом ФКС. Средний размер частиц – 14.1 нм. Средний размер частиц здесь, как правило, оказывается несколько больше, чем дает электронная микроскопия. Такое увеличение среднего диаметра (или гидродинамического радиуса) по сравнению с данными электронной микроскопии наблюдалось для частиц разной природы – латексов, липосом, наночастиц металлов и оксидов. Связывалось это, главным образом, с тем, что метод ФКС чрезвычайно чувствителен к присутствию частиц большего размера, поскольку они наиболее сильно рассеивают свет и потому даже их относительно небольшой численный вклад в общее количество частиц может приводить к заметному увеличению измеряемого среднего размера. Для различных специальных целей можно получать наночастицы других средних размеров (в интервале 5 – 25 нм), а также других форм; в последнем случае имеются в виду смеси наночастиц разной формы (сферы, треугольники, шестигранники и др.). Наночастицы в мицеллярном растворе сохраняются в течение длительного времени (до нескольких лет). При этом возможны небольшие изменения концентрации, а также среднего размера и формы наночастиц; последние отражают, вероятно, медленно текущие процессы кристаллообразования, агрегации наночастиц и диссоциации этих агрегатов. Наночастицы золота Введение водного раствора HAuCl4 в мицеллярный раствор Qr приводит к изменению наночастиц. цвета раствора Скорость и формированию процесса, размеры и полосы форма наночастиц зависят от параметров системы (концентраций реагентов и АОТ, степени гидратации). При w ≥ 2 в течение 1-2-х мин раствор приобретает красно-фиолетовую окраску; Рис.8. Спектры поглощения мицеллярных растворов наночастиц золота разного цвета: 1-красного, 2- красно-фиолетового. 17 в течение последующих 10-15-ти мин интенсивностьокраски усиливается, затем изменения цвета прекращаются и этот красно-фиолетовый раствор сохраняется в течение нескольких лет. При меньших степенях гидратации изменения цвета происходят медленнее; вначале появляется ярко-красная (рубиновая) окраска, которая видна первые 5-10 мин. Затем постепенно проявляется фиолетовый оттенок, через 40-60 мин раствор приобретает устойчивый красно-фиолетовый цвет. Пример спектров красного (w=0.75) и красно-фиолетового (w=2) растворов показан на рис.8. Максимумы поглощения в обоих случаях лежат в области характерного максимума наночастиц золота: для красного раствора – при 523-526 нм, для красно-фиолетового – при 537-538 нм. Известно, что цвет золей золота зависит от размера частиц; частицы красного золя меньше, чем синего или фиолетового. Это наблюдение соответствует результатам наших определений размеров частиц методом ТЕМ. На рис.9 и 10 показаны микрофотографии наночастиц, соответственно, красного и красно- фиолетового золя. В первом случае частицы сферические, имеют размеры в интервале 3-5 нм, то есть представляют собой практически монодисперсный образец. Во втором случае частицы явно Рис.9. Электронная микрофотография наночастиц золота в красном мицеллярном растворе. большего размера, с заметным разбросом; анализ гистограммы в Гауссовом приближении дает 16 ± 8 нм. 25 Доля частиц, % 20 15 10 5 0 5 10 15 20 25 30 35 Размер частиц, нм Рис.10. Электронная микрофотография и гистограмма распределения частиц по размерам в краснофиолетовом мицеллярном растворе наночастиц золота. Кроме того, здесь образуются частицы разных форм – помимо сферических, имеются также треугольные, пятиугольные, шестиугольные и цилиндрические частицы; пример частиц разной формы крупным планом показан на рис.11. На многих фотографиях выявляется также кристаллическая структура наночастиц, что подтверждается 18 Рис.11. Электронная микрофотография наночастиц золота разной формы, присутствующих в красно-фиолетовом растворе. соответствующими дифрактограммами. Исследование красно-фиолетовых растворов наночастиц золота методом ФКС дает завышенные значения размеров частиц, причем расхождение с данными ТЕМ здесь, как правило, больше, чем для наночастиц серебра. Это может быть следствием более значительного вклада крупных частиц, либо влияния отклонений формы частиц от сферической, которая предполагается в методе ФКС при расчете гидродинамического радиуса по уравнению Стокса-Эйнштейна. Наночастицы меди и цинка Введение водных растворов аммиачных солей меди и цинка (тетраамминсульфатов или тетраамминнитратов) в мицеллярный раствор Qr приводит к резким изменениям окраски, свидетельствующим об образовании вначале комплекса кверцетина с ионами металла, а затем наночастиц. В случае меди раствор наночастиц медно-красный; максимум полосы поглощения лежит при 550±5 нм, в области, характерной для поглощения этих наночастиц (550-570) нм. Типичный спектр поглощения показан на рис.12. Рис.12.. Спектр поглощения наночастиц меди, полученных биохимическим синтезом (CuQr) на стационарной стадии, w = 3.7. Для сравнения показан спектр наночастиц меди, полученных в обратных мицеллах восстановлением гидразином (CuH) при w = 4 [Lisiecki I., Pileni M.-P., 1995]. 0,30 Оптическая плотность 0,25 0,20 CuH Сравнение со спектром наночастиц меди, 0,15 полученных 0,10 CuQr обратных 0,05 0,00 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 восстановлением мицеллах при гидразином близкой в степени гидратации показывает, что положение максимума практически одинаково, но в нашем случае полоса Длина волны, нм наночастиц выражена более четко, возможно вследствие более высокой степени превращения ионов меди и соответственно, более низкой оптической плотности в УФ области спектра засчет уменьшения концентрации не восстановленных ионов металла. Поглощение при 800 нм (характеризующее концентрацию оксида меди в растворе) в обоих случаях незначительно; это показывает, что при биохимическом синтезе достигается столь же малая степень окисления наночастиц кислородом воздуха, как и при использовании традиционного химического восстановителя. Электронная микрофотография наночастиц меди показана на рис.13. Рис.13. Электронная микрофотография наночастиц Cu в мицеллярном растворе. Наночастицы приблизительно сферические. Средний размер не превышает 15 нм. 19 Раствор наночастиц цинка темно-бурый, полоса поглощения в интервале 260-280 нм, характерном для наночастиц этого металла. На рис.14 показаны микрофотография и гистограмма распределения частиц по размерам для мицеллярного раствора. 30 Доля частиц, % 25 20 15 10 5 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Диаметр частиц, нм Рис.14. Электронная микрофотография и гистограмма распределения частиц по размерам в мицеллярном растворе наночастиц цинка. Средний размер (сферических) частиц 5.05 ± 3.94 нм. Видно, что частицы в основном сферические, малого размера; более 80% частиц имеют диаметр 2-7 нм. Обработка гистограммы в приближении распределения Гаусса дает средний размер 5.05 ±3.94 нм. Имеются также стержнеобразные частицы толщиной около 5-ти нм и длиной 30-50 нм. 2. Основные направления исследований На рис.15 основные представлены направления, в которых проводились работы по Механизм взаимодействия флавоноидов с ионами металлов Влияние различных факторов на , . d, Адсорбционные свойства синтезу и исследованию свойств наночастиц металлов. Нашими основными объектами являлись (1) Адсорбционные свойства Мицеллярные растворы Технология переноса в водную фазу Водные растворы наночастиц (2) водные наночастиц Биологические эффекты Антимикробные свойства серебра, растворы золота, меди, цинка, кобальта и никеля и Каталитические свойства мицеллярные серебра, растворы золота, меди и цинка, получаемые из их Токсичность для живых организмов мицеллярных растворов по разработанной нами технологии. Рис.15. Основные направления исследований процесса формирования и свойств наночастиц металлов, получаемых методом биохимического синтеза. На мицеллярных растворах проводились исследования влияния различных факторов на скорость формирования, выход, размеры и стабильность наночастиц, а также механизма взаимодействия флавоноидов с ионами металлов в обратных мицеллах, лежащего в основе синтеза наночастиц. 20 Результаты этих работ использовались при получении водных растворов и в исследованиях различных свойств наночастиц. На мицеллярных растворах исследовались каталитические свойства наночастиц серебра, меди, кобальта и никеля, адсорбционные и антимикробные свойства наночастиц серебра и меди. На водных растворах исследовались адсорбционные свойства и биологическое действие наночастиц серебра; последнее включало как антимикробную активность, так и токсические эффекты на других живых организмах. На основе изучения адсорбционных свойств были получены различные твердые материалы с нанесенными наночастицами, которые также использовались для исследований антимикробной или каталитической активности наночастиц. Прежде чем дать здесь краткое описание содержания работ в каждом из направлений, необходимо определить главную линию или общий принцип, которому были подчинены наши исследования. Как должно быть ясно из цели нашей работы, создание нового направления в области синтеза наночастиц металлов было ориентировано прежде всего на получение практических результатов. Поэтому следует иметь в виду, что большинство вопросов, которые ставились и решались в ходе наших работ, были более или менее непосредственно подчинены требованиям, обусловленным прикладной задачей или запросами потребителей (частных конкретной компаний или государственных предприятий), заинтересованных в применении растворов наночастиц для модификации своей продукции или разработки новых образцов. 3. Влияние различных факторов на скорость формирования, выход, размеры и стабильность наночастиц Скорость формирования, выход, размеры и стабильность наночастиц зависят от концентраций соли металла и флавоноида, концентрации АОТ, степени гидратации, состава соли металла. Так, скорость формирования и выход наночастиц увеличиваются с увеличением концентрации соли металла; при этом увеличиваются средний размер частиц и ширина распределения. Два последних параметра увеличиваются также с увеличением степени гидратации; при w превышающей некоторое пороговое значение уменьшается стабильность системы. Изменение концентрации АОТ мало влияет на скорость формирования и выход наночастиц; однако чрезмерное уменьшение его концентрации приводит к уменьшению стабильности системы. Влияние концентрации АОТ на размеры частиц зависит от концентрации ионов металла: так, для наночастиц Ag при большой концентрации ионов серебра оно не проявляется, при малой их концентрации увеличение концентрации АОТ приводит к уменьшению среднего размера частиц. Существенным параметром является также состав соли металла. Заметное увеличение скорости формирования и выхода наночастиц наблюдается при переходе от простой соли серебра (нитрата) к комплексной (диамминнитрату). Для других металлов – меди, цинка, кобальта и никеля – наночастицы образуются лишь при взаимодействии флавоноидов с тетраамминнитратами этих металлов, но не с простыми солями, независимо от природы аниона (сульфаты или нитраты). 21 Здесь мы приводим два примера, иллюстрирующие (1) влияние состава соли серебра на скорость формирования и выход наночастиц и (2) влияние степени гидратации на размеры и ширину распределения наночастиц серебра в мицеллярном растворе. На рис.16 показаны зависимости степени превращения от времени для разных солей серебра при одинаковой начальной концентрации соли в мицеллярном растворе. Видно, что скорость роста концентрации и выход наночастиц Рис.16. Изменение значений Dmax в течение первых 6-ти часов формирования наночастиц из нитрата (о) и диамминнитрата () серебра при одинаковой концентрации этих солей в мицеллярном растворе (3мМ) и одинаковых значениях других параметров системы. Штриховыми линиями показаны значения Dmax, достигаемые на стационарной стадии (D0max) с нитратом (NO) и диамминнитратом (NH). 3,5 NH 3,0 2,5 2,0 NO 1,5 (отношения концентраций наночастиц на 1,0 стационарной стадии к концентрации соли металла, 0,5 0 1 2 3 4 5 6 пропорциональные значениям D0max) существенно Время (час) больше в случае аммиачной соли, [Ag(NH3)2]NO3, чем в случае простого нитрата, AgNO3. Выяснение природы такого различия показало (рис.17), что наиболее вероятной причиной ускорения формирования наночастиц при использовании аммиачной соли серебра (при концентрациях соли серебра в исходном водном растворе, не превышающих 0.3M) можно считать увеличение эффективной концентрации вводимых ионов металла вследствие различия в коэффициентах активности двух исследованных солей. 0,90 A activity coefficient 0,85 0,80 0,75 0,70 0,65 0,60 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 Ionic strength (M) Dmax (th) B 3,0 2,5 Optical density Оптическая плотность 4,0 D 2,0 c max (th) Рис.17. Проявление неидеальности водного раствора нитрата серебра. А – зависимость коэффициента активности () от концентрации раствора AgNO3 , рассчитанная по теории ДебаяГюккеля в интервале 0.01-0.1 М и по уравнению Гиббса-Дюгема в интервале 0.1-0.3 М. В – Сравнение теоретических (линии) и экспериментальных (точки) зависимостей значений Dmax на стационарной стадии от концентрации соли серебра в исходном водном растворе. Сплошная линия – идеальный раствор ( = 1). Штриховая линия – раствор, в котором изменяется как на рис.17А.о – нитрат, - диамминнитрат 1,5 1,0 На 0,5 рис.18 приведены гистограммы 0,0 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 Ionic strength (M) 0,25 0,30 распределения по размерам для наночастиц серебра, полученных при одинаковых концентрациях кверцетина, соли металла, АОТ и степенях гидратации w =3.7 (a) и 10 (б). Видно, что в первом случае средний размер и ширина распределения (4.6 ± 1.8 нм) существенно меньше, чем во втором (10.35 ± 2.5 нм). Такое различие имеет значение, например, для исследований влияния размера наночастиц на их биологическую активность. 22 Рис. 18. Влияние степени гидратации на средний размер и ширину распределения в мицеллярном растворе наночастиц серебра. Наночастицы получены при одинаковых концентрациях кверцетина, АОТ и ионов серебра и при w = 3.7 (a) и 10 (б) Определение влияния названных выше факторов позволяет находить их сочетания, обеспечивающие возможность получения стабильных растворов наночастиц определенного размера (c узким распределением) и заданной концентрации. 4. Механизм взаимодействия флавоноидов с ионами металлов Исследование механизма взаимодействия флавоноидов с ионами металлов при биохимическом синтезе представляет интерес как для совершенствования процедуры получения и определения концентрации наночастиц в растворе, так и для углубления понимания процессов, лежащих в основе превращений ионов металлов в живом организме, в том числе процессов агрегации – дезагрегации (переходов ионов металлов в кластеры и наночастицы и обратно). Восстановление ионов металла в результате взаимодействия с флавоноидами в обратных мицеллах есть первая стадия процесса формирования наночастиц; как известно, выяснение механизма восстановления ионов металла является одной из основных задач в исследовании механизма формирования наночастиц металлов при химическом восстановлении в жидких средах. В литературе рассматриваются два основных механизма восстановления ионов металла в растворе при формировании наночастиц – (1) перенос электронов от молекул восстановителя к иону металла с образованием промежуточного комплекса, причем перенос электрона в комплексе катализируется поверхностью растущей металлической частицы и (2) перенос электронов от молекул (или ионов) восстановителя непосредственно к ионам металла, который осуществляется также при участии поверхности растущей частицы. В последнем случае растущая частица играет роль микроэлектрода, на котором происходит как окисление восстановителя, так и восстановление ионов металла; при достаточно больших размерах частицы оба процесса могут быть пространственно разделены (электрохимический механизм, см. [Смирнов В.В. и др. Химическое осаждение металлов в водных растворах. Минск: Изд-во «Университетское», 1987]). Учитывая известную способность флавоноидов образовывать комплексы с ионами металлов в водных растворах, естественно было предположить, что при биохимическом синтезе реализуется первый механизм. Однако это предположение требовало проверки, поскольку хорошо известно также, что одна и та же реакция в водном растворе и в обратных мицеллах может протекать по разным механизмам, вследствие чего различными 23 оказываются скорость, образующиеся продукты и другие характеристики реакции. Такие факты установлены в исследованиях в области мицеллярного катализа и действия ферментов в обратных мицеллах (мицеллярной энзимологии) для различных (в том числе окислительно-восстановительных) реакций. В нашем случае требовалось выяснить, прежде всего, идет ли формирование наночастиц в обратных мицеллах через стадию образования комплекса флавоноида с ионами металла. С практической точки зрения решение этого вопроса давало возможность определить коэффициент экстинкции наночастиц и, следовательно, их концентрацию в мицеллярном растворе. Как мы уже упоминали выше, определение коэффициента экстинкции в случае наночастиц осложняется тем, что, как правило, неизвестно, какая часть изначально введенных ионов металла перешла в наночастицы. В случае образования комплекса он, как промежуточный продукт, может присутствовать в мицеллярном растворе наночастиц; поэтому для определения концентрации наночастиц важно было определить стехиометрию и концентрацию комплекса. Для этого, в свою очередь, необходимо было найти коэффициент экстинкции комплекса. Ниже дано краткое изложение полученных нами результатов. 4.1. Наночастицы серебра При стандартной процедуре биохимического синтеза наблюдается быстрое формирование и рост полосы наночастиц, так что выявить промежуточные стадии оказывается невозможным. Выделение стадии образования комплекса можно было осуществить в условиях, когда взаимодействие Qr с ионами Ag+ протекает достаточно медленно, так чтобы можно было наблюдать формирование полосы комплекса без одновременного появления полосы наночастиц. В серии экспериментов на мицеллярных растворах с малыми концентрациями реагентов было показано, что образованию комплекса отвечает появление полосы 295 нм. Выделение этой полосы удалось осуществить при проведении реакции с мицеллярным раствором Qr, приготовленным не на предварительно дегидратированном (как при получении стандартных растворов), а на слабо гидратированном АОТ. При введении ионов Ag+ в полученный таким образом мицеллярный раствор Qr, происходит постепенное уменьшение интенсивности поглощения обеих полос кверцетина и одновременно усиление полосы 295 нм. Процесс завершается образованием хорошо оформленной полосы 295 нм и небольшого плеча в области 370-380 нм, обусловленного присутствием остатка кверцетина. Характерный вид спектра мицеллярного раствора, содержащего преимущественно комплекс [Ag…Qr] показан на рис.19. Спектры типа показанного на рис.19 использовали для определения коэффициента экстинкции комплекса по формуле, вытекающей из известного закона Бугера-Ламберта-Бера: * = Dmax(295)/(C0Qr -CtQr) * l (1) где C0Qr - начальная концентрация кверцетина, CtQr - его конечная концентрация в растворе, l – длина оптического пути. Величину CtQr можно определить графически по 24 разности оптических плотностей () при длине волны, равной max полосы I кверцетина (I max), используя найденный ранее коэффициент экстинкции для этой полосы 1 при соответствующей степени гидратации: CtQr = Δ/I l. По данным пяти определений при разных концентрациях серебра и кверцетина * = (1.98 ± 0.05) * 104 л/моль см. 0 C (Qr) Оптическая плотность 0,3 1 0,2 0,1 2 t C (Qr) 0,0 200 300 400 500 600 Длина волны, нм Рис.19. Определение коэффициента экстинкции комплекса Ag-Qr в мицеллярном растворе. 1 – спектр исходного раствора Qr, 2 – конечная стадия образования комплекса. C0(Qr) и Ct(Qr) – концентрация кверцетина, соответственно, в исходном растворе и на конечной стадии образования комплекса. - разность оптических плотностей при I max между спектром 2 и продолжением полосы комплекса в области 350-400 нм. Для определения стехиометрии комплекса рассчитывали максимальное (равновесное) количество кверцетина, перешедшее в комплекс при введении равного или меньшего количества ионов Ag+. Для этого использовали спектры, полученные при малых концентрациях реагентов через несколько суток после введения ионов серебра, когда изменения полос поглощения полностью прекращались. Во всех исследованных случаях количество Qr, перешедшее в комплекс, оказалось близким к начальной концентрации ионов Ag+. Отсюда вытекает, что ионы серебра и кверцетин в комплексе находятся в соотношении 1:1. Используя известные коэффициент экстинкции и стехиометрию комплекса, определяли коэффициент экстинкции наночастиц Ag. Для этого эксперимент проводили в условиях, когда в результате взаимодействия с ионами Ag+ кверцетин полностью переходит в комплекс, а ионы серебра либо связаны в комплекс, либо присутствуют в виде наночастиц. Коэффициент экстинкции наночастиц находили из соотношения: NP = Dmax(λNP max) /C ( AgNO3 (s)) * l где Dmax(λNP max) (2) – оптическая плотность в максимуме полосы поглощения наночастиц, C ( AgNO3 (s)) – концентрация ионов Ag+, присутствующих в растворе в виде наночастиц. По результатам нескольких экспериментов с разными соотношениями концентраций кверцетина и ионов Ag+ для наночастиц серебра получен коэффициент экстинкции NP = (1.03 ± 0.08) * 104 л/моль* см. По литературным данным, несколько Нами было показано, что для Qr существуют два коэффициента экстинкции: по полосе II ( II = 1.8 *104 л/моль*см), не зависящий от типа раствора (водный или мицеллярный) и степени гидратации, и по полосе I, в мицеллярном растворе зависящий от степени гидратации. При w=3-5 I = 2.26 * 104 л/моль*см. 1 25 меньшие значения NP (7-8 * 103 л/моль*см) были определены для мицеллярного и водного растворов наночастиц серебра, синтезированных с другими восстановителями. Найденный нами коэффициент экстинкции был подтвержден также путем сравнения экспериментальных спектров наночастиц серебра и рассчитанных по теории Ми при размерах частиц, измеренных на стационарной стадии методом ФКС. Определение коэффициентов экстинкции комплекса и наночастиц серебра позволяет находить их концентрации в мицеллярном растворе, полученном при различных параметрах системы (концентрациях исходных реагентов, АОТ, степени гидратации), а также изменения концентрации наночастиц при адсорбции их из раствора на твердых материалах. Опираясь на полученные данные, можно предложить следующую вероятную последовательность реакций, протекающих при взаимодействии кверцетина с ионами серебра в мицеллярном растворе: Ag+ + Qr [Ag+(-) … Qr(+)] (I) [Ag+(-) … Qr(+)] Ag0 + Qr+ (II) Ag0 + Ag+ Ag2+ + Ag0 + … Agkl+ (III) Вначале образуется комплекс кверцетина с катионом серебра (I), затем этот комплекс распадается с образованием атома серебра и окисленного кверцетина (II), затем атомы и ионы серебра ассоциируют с образованием наночастиц (III). Жирным шрифтом выделены компоненты, которые удается обнаружить по их характерным полосам поглощения в мицеллярном растворе. Индексы (-) и (+) указывают на смещение электронной плотности в комплексе от кверцетина к иону металла. Рис.20. Возможные виды комплексов кверцетина с ионами металлов (по данным А.Д.Рошаль и Т.В Сахно, 2001). Анализ полученных результатов позволяет также высказать предположения о структуре комплекса. Можно заключить, что он образуется не через 3’ катехиновой группы и 4’ кислороды (в кольце В, рис.3), поскольку, как известно из литературы, при этом наблюдается изменение спектра поглощения (батохромный сдвиг полосы I), которое в нашем случае отсутствует. Об этом же свидетельствует тот факт, что замена кверцетина на морин приводит к быстрому формированию наночастиц серебра; при этом изменение спектров поглощения 26 аналогично регистрируемому для кверцетина. Поскольку отличие структуры морина от кверцетина заключается в удалении друг от друга ОН групп в кольце В, в силу чего образование комплекса с кислородами при С3’ и C4’ оказывается невозможным (рис.3), можно предположить, что с обоими флавоноидами комплекс образуется через кислороды при С3 и С4, или С4 и С5. Эта версия подтверждается результатами теоретического анализа вероятности образования комплексов с ионами металлов 5- гидроксифлавонов, в том числе кверцетина. Показано (Рошаль и Сахно, 2001), что для кверцетина возможно образование 4-х видов комплексов (рис.20) – двух видов хелатов с участием карбонильной группы при С4 и гидроксильных групп у С3 (MQr3) либо С5 (MQr5) и двух видов хелатов с участием гидроксильных групп у С3’ и С4’ (MQr3’ и MQr4’). На основании результатов расчетов энтальпий образования комплексов кверцетина с ионами разных металлов и геометрических соображений (оценок размеров полостей между кислородами в положениях С4 и С5 или С4 и С3) авторами сделан вывод о том, что, вопервых, образование комплексов типа MQr3’ и MQr4’ маловероятно, и во-вторых, что тип образующегося здесь комплекса (MQr3 или MQr5) определяется размерами и электронным строением иона металла, причем для ионов большого размера предпочтительно образование комплекса MQr3. Из этих данных вытекает, что в нашем случае более вероятно образование комплекса типа MQr3. Однако из этого не следует, что комплекс ионов Ag+ через кислороды при С3’ и С4’ в принципе невозможен. Как вытекает из аналогичных экспериментов с рутином, в этом случае на промежуточной стадии наблюдается батохромный сдвиг полосы I, характерный для образования комплекса именно с катехиновой группой в кольце В. 4.2. Наночастицы золота Анализ изменений спектров поглощения в процессе синтеза наночастиц золота позволяет заключить, что здесь реализуется та же последовательность событий, что и описанная выше для синтеза наночастиц серебра. Вначале образуется комплекс [Au3+(δ-) …Qr (δ+) ] также через атомы кислорода в положениях С3 и С4 или С4 и С5. В комплексе (вероятно, через ряд промежуточных стадий) происходит восстановление ионов золота до атомов, затем ассоциация атомов и ионов с образованием наночастиц. Учитывая, что с рутином, для которого невозможно образование комплекса типа MQr3, синтез наночастиц золота реализовать не удается, можно предположить, что для иона золота более вероятно связывание с молекулой Qr через атомы кислорода в положениях С3 и С4. 4.3. Наночастицы меди и цинка Спектрофотометрическое исследование взаимодействия ионов меди и цинка с кверцетином в мицеллярных растворах показало, что при введении водных растворов простых солей (сульфатов или нитратов) наблюдается батохромный сдвиг полосы I, 27 свидетельствующий об образовании комплекса типа MQr3’ или MQr4’ , однако далее процесс не идет и образования наночастиц не происходит. Мы предположили, что причиной этого является нестабильность однозарядных ионов Cu+ и Zn+ (которые образуются на первой стадии восстановления соответствующих двухзарядных ионов), вследствие чего они не могут образовать комплекс с кверцетином, в котором идет восстановление до атома. Как было известно из литературы, такую проблему можно решить путем введения агента, образующего прочные комплексы с однозарядными ионами; в качестве такого агента мы использовали аммиак, заменив для этого простые ионы металлов на комплексные аммиак-содержащие ионы. И действительно, при введении в мицеллярный раствор Qr аммиачных солей меди или цинка (тетрааминсульфатов тетрааминнитратов) или наблюдается вначале образование комплекса, а затем наночастиц. Эти события отражаются в соответствующих изменениях спектров мицеллярного раствора поглощения Qr. 1,0 Оптическая плотность Рис. 21. Формирование наночастиц Cu. Изменение спектра мицеллярного раствора Qr через 2 мин (1) и 30 мин (2) после введения аммиачной соли меди до концентрации 4 мМ, w = 3.7. Qr 0,8 0,6 0,4 1 0,2 2 0,0 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Длина волны, нм Типичная картина для меди показана на рис.21. Вначале наблюдается батохромный сдвиг обеих полос кверцетина, свидетельствующий об образовании комплекса, затем полоса I исчезает и появляется полоса наночастиц (545-555 нм). Комплекс распадается с образованием двух продуктов – окисленного кверцетина (полоса 320-330 нм) и наночастиц. При стандартных условиях синтез идет достаточно быстро, так что уже через 2 мин не видна полоса I исходного кверцетина и появляется слабое поглощение в области полосы наночастиц. Для выявления стадий, предшествующих образованию наночастиц, как и в случае серебра, требуется замедлить процесс, например, уменьшая концентрации реагентов. 2,0 1,8 Рис.22. Пример кинетики формирования наночастиц цинка.Показаны изменения спектра мицеллярного раствора Qr через 5 мин (1), 30 мин (2), 70 мин (3) и 100 мин (4) после введения аммиачной соли цинка, w = 3.7. Qr Оптическая плотность 1,6 1,4 1 1,2 Подобная же картина наблюдается и 1,0 2 при введении в мицеллярный раствор 0,8 3 кверцетина раствора соли цинка (рис.22). 4 Здесь процесс синтез протекает медленнее, 0,6 0,4 0,2 чем в случае меди, так что для выявления 0,0 200 300 400 500 600 700 Длина волны, нм 28 промежуточных стадий специального замедления не требуется. Предположительно это обусловлено меньшей степенью связывания кверцетина с ионами цинка; такое различие отмечалось в исследованиях взаимодействии с этими ионами кверцетина, иммобилизованного в полимерных пленках (Sakaguchi T., Nakajima A., 1987). На рисунке отчетливо видна изобестическая точка (378 нм), отражающая прямую связь между распадом комплекса и образованием продукта окисления кверцетина (появление выраженного плеча при 330 нм). Полоса наночастиц Zn лежит в области 270-280 нм; ее можно выделить путем вычитания спектров комплекса и оставшегося кверцетина из конечного спектра, полученного после завершения реакции. Таким образом, в обоих случаях формирование наночастиц идет через образование комплекса. Нами были определены коэффициенты экстинкции комплексов Qr с простыми и комплексными аммиак-содержащими катионами металлов путем вычитания спектра оставшегося Qr из спектра мицеллярного раствора после введения соли металла в условиях, когда в нем отсутствуют наночастицы и содержатся только комплекс Qr с ионами металла и не прореагировавший кверцетин. Процедура вычитания проиллюстрирована на примере мицеллярного раствора Qr с ионами [Cu(NH3)4]2+ (рис.23) Здесь же показан характерный вид спектра комплекса. Во всех случаях, кроме сульфата меди, в спектре комплексов присутствуют две полосы, сдвинутые в красную сторону относительно соответствующих полос Qr; для сульфата меди удается выделить лишь одну длинноволновую полосу. Рис.23. Выделение спектра комплекса кверцетина с ионами [Cu(NH3)4]2+ из суммарного спектра системы Qr(0) + Cu(NH3)4 SO4. Спектр комплекса (на вставке) получен путем вычитания спектра не * Qr(0) прореагировавшего кверцетина (Qr ) 0,8 из спектра, снятого через 2 мин после введения соли металла (Qr(0) + Cu(N)). 0,6 2+ [Cu(NH3)4 0,7 - Qr] II 0,6 I 0,5 Оптическая плотность 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 200 300 400 500 600 700 800 0,4 экстинкции Qr(0)+Cu(N) рутина, 0,2 300 кверцетина, и комплексов кверцетина с металлами по * Qr 0,0 200 Коэффициенты 400 500 600 Длина волны, нм 700 800 полосе I приведены в таблице 1. Сравнение с доступными литературными данными по оптическим свойствам комплексов переходных металлов с флавоноидами в водных растворах показывает, что полученные нами значения коэффициентов экстинкции близки к найденным для комплексов меди в водном растворе с рутином (1-2*104 л/моль [Мельникова Н.Б., Иоффе И.Д., Царева Л.А. 2002]) и кверцетином (2 104 л/моль [Mira L., Fernandez M.T. et al 2002.]). Изменения спектров при взаимодействии ионов меди с 29 рутином и морином свидетельствуют о том, что здесь возможно образование комплексов двух типов – с кислородами при С3’ и С4’ в кольце В (Ru), или с кислородами при С3 и С4 в кольце С (Mo). Таблица 1. Положения полос поглощения и коэффициенты экстинкции рутина, кверцетина и его комплексов с ионами меди и цинка в мицеллярных растворах. Приведены данные для сульфатов (S) и тетраамминсульфатов (N) __________________________________________________________ Наименование maxI maxII I 10-4, л/моль см __________________________________________________________ Рутин 364 258 2,32 Кверцетин 372 258 2,8 [Cu2+…Qr]S 422 - 3,73 [Cu2+…Qr]N 450 278 2,84 [Zn2+…Qr]S 416 265 3,06 [Zn2+…Qr]N 432 279 2,65 ________________________________________________________ Обобщая приведенные выше сведения о механизме взаимодействия флавоноидов с ионами металлов в мицеллярном растворе можно заключить, что здесь выделяются две основные стадии: (1) образование комплекса и (2) распад комплекса в конечном счете на атомы металла (с последующим образованием наночастиц) и флавоноид в окисленной форме. При этом возможно образование комплексов с разной структурой (рис.20), различающейся фрагментами молекулы флавоноида, образующими связи с ионами металлов – либо через атомы кислорода при С3 и С4 в кольце С (наночастицы Ag и Au с Qr и наночастицы Cu с Mo), либо через атомы кислорода при С3’ и С4’ в кольце В (наночастицы Cu и Zn с Qr и Ru). 5. Водные растворы наночастиц металлов При разработке различных вариантов применения наночастиц оказалось важным получать их стабильные дисперсии не только в органическом растворителе (в нашем случае, в углеводородах), но и в полярных средах, прежде всего в воде. Есть все основания полагать, что стабильные наночастицы металлов в водных растворах найдут полезные применения в медицине и биотехнологии. Большое значение для разработки медицинских приложений наночастиц, а также для определения степени токсичности различных наноматериалов для человека и других живых организмов имеют исследования механизмов биологического действия наночастиц металлов, которые могут проводиться только на водных дисперсиях. Для расширения круга возможных применений наночастиц, полученных методом биохимического синтеза, была разработана методика получения водных дисперсий 30 наночастиц из их мицеллярных растворов. Нами описаны две процедуры приготовления таких дисперсий: (1) центрифугирование двухфазной системы мицеллярный раствор/вода и (2) смешение мицеллярного раствора с водой и последующее отстаивание. В первом случае удается получить водную дисперсию наночастиц с малым содержанием АОТ, но здесь оказывается малой и концентрация наночастиц; кроме того, технически сложно получать достаточно большие количества раствора наночастиц, приемлемые для прикладных исследований. Поэтому изучение свойств и разработка различных вариантов применения водных дисперсий наночастиц проводилась с использованием второй из упомянутых процедур. Таким путем получены водные дисперсии наночастиц серебра, золота, меди и цинка. Типичный спектр поглощения водного раствора наночастиц серебра показан на рис.24. Максимум полосы поглощения наночастиц лежит в интервале 400 – 420 нм, в согласии 2,0 1,8 положениями Dmax = 1,6 1,6 Оптическая плотность с известными из литературы максимума для наночастиц серебра в водных растворах. 1,4 1,2 Рис.24. Характерный вид спектра поглощения водной дисперсии наночастиц серебра. 1,0 0,8 0,6 0,4 Пример электронной микрофотографии и 0,2 0,0 200 300 400 500 600 700 800 гистограмма распределения по размерам показаны на рис.25. Средний размер частиц по данным ТЕМ практически совпадает с найденным для соответствующих мицеллярных растворов, но разброс по размерам часто оказывается больше. При измерениях методом ФКС, как и в случае мицеллярных растворов, размеры оказываются обычно больше Рис.25. Электронная микрофотография и распределение по размерам в водном растворе наночастиц серебра. найденных по электронным микрофотографиям. Возможно, что увеличение среднего размера в этом случае обусловлено присутствием агрегатов АОТ, который в избытке переходит в водную дисперсию из мицеллярного раствора. Помимо концентрации и 31 размеров наночастиц, концентрация АОТ в водной дисперсии является важным параметром при разработке некоторых вариантов применения этих растворов (например, в качестве добавок к косметическим средствам) а также для исследований биологических эффектов наночастиц, поскольку этот ПАВ может быть токсичным для биологических объектов. Для контроля этого параметра нами была поставлена методика определения концентрации анионных ПАВ в воде (ГОСТ Р 51211-98) и разработаны процедуры, позволяющие существенно уменьшить концентрацию АОТ в водной дисперсии наночастиц серебра, что давало возможность устранить побочные эффекты действия этого ПАВ (см. раздел 7). 6. Адсорбционные свойства наночастиц Нанесение наночастиц на твердые поверхности производилось путем адсорбции их из раствора с целью получения различных модифицированных материалов со специальными свойствами, для применения в технике и медицине. Для каждого вида материала подбирались условия, обеспечивающие достаточно высокие скорость адсорбции и плотность покрытия наночастицами, а также его достаточную устойчивость при предполагаемых условиях эксплуатации. Тип раствора, из которого наносятся наночастицы, зависит от свойств поверхности адсорбента. При этом в основном выполняются общие закономерности, известные из теории адсорбции – из неполярной среды с полярными примесями адсорбция этих примесей активно идет на гидрофильных поверхностях, а из полярной среды с неполярными примесями – на гидрофобных. Мицеллярный раствор с этой точки зрения является неполярной средой, в которой наночастицы в обратных мицеллах можно рассматривать как полярный компонент; такой раствор использовали для нанесения на стекло, металлы, ткани, порошки оксидов металлов, силикагель и другие материалы с полярными группами на поверхности. Водный раствор – полярная среда, в которой наночастицы в мицеллах из АОТ представляют неполярный компонент; из таких растворов наночастицы хорошо адсорбировались на активированном угле, углеродных тканях, а также на других материалах, поверхности которых обладают преимущественно гидрофобными свойствами. Контроль скорости адсорбции производили методом спектрофотометрии – по изменению интенсивности характерной полосы поглощения наночастиц в растворе, из которого они наносятся на данный материал. Количество наночастиц, адсорбированных на материале, оценивали в количестве нанесенного металла на единицу веса материала (обычно в мг/г) или (если известна удельная поверхность образца) – в количестве металла на единицу площади поверхности (мг/см2). При нанесении из монодисперсных растворов определялась также плотность покрытия (число наночастиц на единицу площади поверхности образца). Для определения оптимальных условий, позволяющих получить заданные скорость адсорбции и плотность покрытия, а также обеспечить высокую степень извлечения наночастиц из раствора, изучали влияние на эти параметры различных факторов – 32 концентраций наночастиц и АОТ в мицеллярном или водном растворе, специфики поверхности адсорбента, его происхождения (например, для активированного угля – источника его получения) и др. В отдельных случаях удавалось определить удельную поверхность адсорбента по результатам измерений адсорбции АОТ из мицеллярного раствора. Практическое значение таких исследований можно проиллюстрировать на примере получения силикагеля с нанесенными наночастицами серебра (рис. 26). Рис. 26. Изменение концентрации наночастиц серебра в мицеллярном растворе при адсорбции на силикагеле из стандартного раствора на неподготовленной поверхности (А) и из раствора оптимизированного состава на предварительно подготовленной поверхности (Б). Здесь показаны изменения концентрации наночастиц при адсорбции из стандартного мицеллярного раствора на неподготовленной поверхности и из раствора с оптимизированными концентрациями наночастиц и АОТ на предварительно подготовленной (увлажненной) поверхности силикагеля. В первом случае за 2 недели удается осадить менее 50% наночастиц, тогда как во втором случае всего за 6 часов можно добиться практически полного извлечения наночастиц из раствора. Работы по модификации твердых материалов проводились с наночастицами серебра, меди и цинка. На сегодняшний день наиболее востребованными оказались материалы, модифицированные наночастицами серебра. Нами получены различные ткани и изделия из тканей, порошки оксидов, образцы металлов, активированный уголь, силикагель, полимерные мембраны и другие материалы с различными плотностями покрытия наночастицами. Примеры таких материалов показаны на рис.27 и 28. Нанесение наночастиц серебра приводит к появлению характерной красно-коричневой или желтой окраски, интенсивность которой зависит от плотности покрытия. Лабораторные исследования позволили установить высокую антимикробную активность таких материалов; некоторые примеры результатов испытаний приведены в следующем разделе. 33 Рис.27. Фото образцов ткани (хлопок) с нанесенными наночастицами серебра. Рис.28. Фото образцов силикагеля с нанесенными наночастицами серебра. Плотность покрытия увеличивается слева направо. Помимо антимикробных свойств, наночастицы серебра могут проявлять также каталитическую активность. Данные по каталитической активности наночастиц серебра, меди и других металлов приведены в разделе 8. 7. Биологические эффекты наночастиц Известно, что наночастицы металлов, прежде всего серебра, являются популярным объектом перспективных прикладных разработок в различных областях химии, техники и медицины и в то же время, уже находят применение в практике – в производстве различных товаров (косметики, одежды, бытовой техники, игрушек и др.). Поэтому в исследованиях биологического действия наночастиц металлов на организмы растений, животных и человека весьма актуальным становится определение степени токсичности наночастиц как в виде растворов, так и в составе различных материалов. Помимо данных, необходимых для определения стандартов, обеспечивающих безопасность использования наночастиц и модифицированных ими материалов, определение токсичности может дать полезные сведения как о механизмах действия наночастиц на живые организмы, лежащих в основе их лечебных и патологических эффектов, так и для разработки различных вариантов их применения в биологии, биотехнологии и медицине. В исследованиях, проводившихся нами в этом направлении с наночастицами серебра, получены данные, отражающие их антимикробные свойства и токсические эффекты по отношению к другим биологическим объектам разных уровней организации. 7.1. Антимикробные свойства наночастиц серебра Испытания антимикробной активности наночастиц серебра проводились в ряде компетентных учреждений – в Институте им. Гамалеи РАМН, в Институте им.А.Н. Сысина РАМН, в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, в НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов Государственного научного центра (ГНЦ), в Московском городском центре дезинфекции (МГЦД). Для экспериментов использовались как растворы наночастиц, так и модифицированные наночастицами материалы. 34 Мицеллярные растворы наночастиц вводили в качестве малых добавок к лакокрасочным материалам (ЛКМ) разного состава на основе органических растворителей. Полученные модифицированные краски наносили на образцы дерева или других материалов; после высыхания на их поверхность наносили взвеси бактерий и через разные промежутки времени делали смывы, в которых определяли число жизнеспособных бактерий. Было показано, что ЛКМ с наночастицами серебра обладают выраженным бактерицидным действием по отношению к ряду патогенных бактерий, распространенных в бытовых условиях, тогда как контрольные краски без наночастиц такого эффекта не обнаруживают. Пример результатов испытаний в Институте им. Гамалеи приведен в таблице 2. Аналогичный результат был получен в натурных испытаниях, проводившихся в камерах СИЗО «Матросская Тишина». Было показано также, что введение наночастиц в краску возможно путем нанесения их на порошковые материалы, входящие в состав ЛКМ, например, на оксид алюминия. Таблица 2. Динамика бактерицидного действия наночастиц серебра, внесенных в краску, на штаммы бактерий: E.coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium TMLR 66, Salmonella typhi Ty 2, Shigella flexneri 516, Staphilococcus aureus Wood-46, Enterococcus faecalis CG 110, Listeria monocyntogenes EGD, Pseudomonas aeruginosa 508. *) Водные растворы наночастиц испытывали как в виде добавок к ЛКМ на водной основе, так и путем введения в водные растворы, содержащие взвеси штаммов болезнетворных бактерий в разных концентрациях. В последнем случае эффект наночастиц оценивался путем отбора проб через разные промежутки времени и сравнения числа КОЕ с таковым для контрольных растворов с бактериями без наночастиц. Во всех случаях было обнаружено, что растворы наночастиц обладают значительной антибактериальной или антивирусной активностью. 35 В качестве примера на рис.29 приведены данные, полученные в НИИ генетики ГНЦ на бактериях E.coli в водной среде. Видно, что при значительной начальной концентрации бактерий (3* 108 кл/мл), при небольшом времени экспозиции обеспечивается высокий уровень инактивации (90-100%) в широком диапазоне разведений исходного водного раствора наночастиц (до 75 раз). Рис.29. Бактерицидное действие водной дисперсии наночастиц серебра. Зависимость уровня инактивации бактерий E.coli от концентрации наночастиц серебра в водной среде. Данные НИИ генетики ГНЦ. 100 % Инактивации 80 60 8 Начальная концентрация клеток - 3*10 КОЕ/мл Время инкубации - 30 мин 40 В подобных же экспериментах в Институте им. Сысина действие наночастиц на бактерии E.coli сравнивалось с действием 20 ионов Ag+ (вводившихся в виде нитрата 0 0 5 10 15 -5 20 + СNP х 10 , г-ион Ag /л 25 30 серебра) в соответствующих концентрациях. Было показано, что динамика инактивации бактерий более интенсивна под действием наночастиц, чем ионов серебра; такой же результат был получен в опытах на колифагах MS-2 (вирусах бактерий). Высокий уровень бактерицидной активности наночастиц при введении в водную среду был продемонстрирован также в МГЦД на E.coli и S. Aureus. Для двух последних видов была определена нижняя граница концентрации наночастиц в водной среде (3-5 мкг/мл), при которой достигается 100% гибель бактерий. Упомянутые выше и другие данные испытаний водных растворов наночастиц Ag позволяют заключить, что такие растворы обладают сильно выраженным антимикробным действием и могут рассматриваться как основа для создания дезинфицирующих средств нового типа, более эффективных и более безопасных для человека, чем широко используемые дезинфектанты на основе хлора и его производных или четвертичных аммониевых соединений. Твердые материалы и полимерные пленки с наночастицами серебра. Испытания на антибактериальную активность проводились на тканях, активированном угле, металлических пластинах, полиамидных мембранах и полимерных пленках на основе производного хитина, содержащих наночастицы Ag . Ткани (шерсть, хлопок, лен и др.) вносили в водную среду с бактериями E.coli или помещали в чашки Петри на поверхность питательной среды с этими же бактериями. Антимикробное действие ткани оценивали по степени угнетения роста бактерий через разное время инкубации по сравнению с контрольными образцами той же ткани без наночастиц. Было показано, что в обоих случаях ткани с наночастицами Ag оказывают сильное угнетающее действие на рост бактерий (данные НИИ генетики ГНЦ). Были определены также условия стирки таких тканей, при которых практически полностью сохраняется первоначальная плотность покрытия наночастицами. Дальнейшая работа в 36 этом направлении может позволить получать ткани и изделия из них для применения в медицине (например, для пошива халатов или специальной одежды с биоцидными свойствами) или для широкого потребления при изготовлении товаров, для которых могут быть востребованы биоцидные свойства. Активированный уголь с нанесенными наночастицами серебра испытывали в Институте им. Сысина на колонках, через которые в течение недели непрерывно пропускали водопроводную воду с внесенными в нее бактериями E.coli или колифагами (MS-2) до концентраций, заметно превышающих предельно допустимые нормы. На выходе отбирали пробы воды, высевали на питательную среду и определяли величины КОЕ. Параллельно такую же работу проводили с углем без наночастиц. Было найдено, что для угля с наночастицами имеет место значительное снижение числа жизнеспособных микроорганизмов по сравнению с контролем, причем снижение было стабильным в течение всего времени эксперимента. Это означает, что наночастицы не вымываются с такого угля током воды, в отличие от углей, пропитанных солями серебра, для которых было обнаружено быстрое вымывание ионов серебра. Металлические пластины с нанесенными наночастицами Институте им. Гамалеи на антимикробную Ag испытывали в активность против штамма Legionella pneumophila Philadelphia. Это бактерия, вызывающая легионеллез - серьезное заболевание, часто возникающее в результате вдыхания кондиционированного воздуха. Пластины были изготовлены из нержавеющей стали, поскольку из этого материала изготавливают емкости для чистой воды, которые используют в кондиционерах, и в которых преимущественно и накапливается большая концентрация этих бактерий. Было установлено, что на поверхности пластин с наночастицами уже через час инкубации наступает полная гибель бактерий, тогда как в контроле их исходная концентрация (10 7 кл/мл) не уменьшается и через сутки. Таким образом, можно полагать, что обработка таких емкостей в кондиционерах позволит существенно уменьшить риск заболеваний легионеллезом. Полиамидные мембраны с наночастицами Ag были получены нами путем нанесения из предоставленных водного раствора. Работа проводилась с образцами мембран, предприятием «Технофильтр» (г. Владимир) и используемых в фильтрующих устройствах для очистки воды. Антимикробная активность мембран оценивалась в ОАО НИИ «Медполимер» по числу колоний и типов микроорганизмов, выросших на мембране через разное время после фильтрации водопроводной воды. Пример результатов испытаний мембран, модифицированных наночастицами Ag, приведен в таблице 3. Для сравнения показаны данные, полученные в тех же условиях на стандартных полимерных мембранах фирмы «Миллипор». 37 Таблица 3. Результаты микробиологических испытаний полиамидных мембран (ММПА+ - 0,2), покрытых наночастицами серебра. Данные ОАО «НИИ медполимер» (г. Москва) № обр-ца 1 2 3 4 Наименование образца Серебросодержащие с плотностью покрытия 0,16 мг/г Серебросодержащие с плотностью покрытия 0,33 мг/г Серебросодержащие с плотностью покрытия 2,22 мг/г GS (Миллипор 0,22 мкм) 1 сут Рост бактерий во времени 2-4 сут 4-6 сут 7-8 сут 9-10 сут Рост под испытуемой мембраной нет нет нет 3 новых нет чисто нет нет нет 7 новых нет чисто нет нет нет 2 новых нет чисто 34 40 49 Рост продолж ается Рост прекратил ся 2 Как видно из таблицы, на мембранах, модифицированных наночастицами серебра, при разных плотностях покрытия наночастицами в течение первых шести суток после фильтрации наблюдается отсутствие роста колоний. Такой результат свидетельствует о существенно более высокой антимикробной активности полученных нами полимерных мембран по сравнению с мембранами фирмы «Миллипор». Предполагается продолжить работы в этом направлении с целью создания новых фильтрующих устройств для получения обеззараженной воды. Полимерные пленки с наночастицами Ag были получены путем введения малых добавок водного раствора наночастиц в водный раствор биодеградируемого полимера (производного хитина). Испытания таких пленок на антимикробную активность проводились в НИИ им. Гамалеи на бактериях Staphillococcus aureus и typhimurium. Результат показан в таблице 4. Salmonella Таблица 4. Динамика взаимодействия штаммов сальмонеллы и стафилококка, взятых в различных концентрациях, с пленками, содержащими наночастицы серебра или без них. Тестируемый штамм, доза Обозначение пленок с различным содержанием серебра Salmonella typhimurium TMLR66 106 KOE Исходная культура ХИТ-10.А, 0 % Ag ХИТ-10.В, 0.03 % Ag ХИТ-10.С, 0.06 % Ag Исходная культура ХИТ-10.А, 0 % Ag ХИТ-10.В, 0.03 % Ag ХИТ-10.С, 0.06 % Ag Исходная культура ХИТ-10.А, 0 % Ag ХИТ-10.В, 0.03 % Ag ХИТ-10.С, 0.06 % Ag Исходная культура ХИТ-10.А, 0 % Ag ХИТ-10.В, 0.03 % Ag ХИТ-10.С, 0.06 % Ag Staphilococcus aureus Wood 46 106 КОЕ Salmonella typhimurium TMLR66 104 KOE Staphilococcus aureus Wood 46 104 КОЕ Lg числа живых бактерий в исследуемых пленках в промежутки времени (ч) 1 3,0 6,0 24,0 6,1 6,1 6,1 6,1 6,1 5,7 5,2 2,8 5,0 4,0 2,7 0 0 0 0 0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 5,8 4,9 3,2 5,0 4,1 3,0 0 0 0 0 0 4.0 4.0 4.0 4.0 4,0 3,7 3,4 1,5 2,8 1,8 0 0 0 0 0 0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 3,8 3,3 1,6 2,9 1,9 0 0 0 0 0 0 38 Видно, что пленки, содержащие малые добавки наночастиц серебра, обладают значительной антимикробной активностью в отношении исследуемых бактерий, при больших концентрациях бактериальных клеток во взвеси, контактирующей с пленкой (10 4 и 106 КОЕ/мл), причем эта активность существенно выше, чем отмеченная для контрольных пленок из того же полимера без наночастиц. Это позволяет предположить, что созданный нами полимерный материал может найти применение в медицине (например, при лечении повреждений кожи). 7.2 Токсические эффекты наночастиц серебра Изучение влияния наночастиц металлов на функции живых систем разных уровней организации, в том числе токсических эффектов, представляет сегодня новое научное направление, в котором имеются как достижения, так и проблемы, связанные прежде всего с особенностями наночастиц как объекта исследования и вытекающими из них трудностями методического характера. Одним из важнейших условий успешного решения поставленных здесь задач является наличие металлических наночастиц с воспроизводимыми характеристиками, стабильных в водном растворе, содержащем минимальные концентрации других биологически активных компонентов, что позволяет проводить эксперименты с корректно поставленными контрольными опытами и минимально возможными побочными эффектами. Метод биохимического синтеза имеет в этом отношении хорошие перспективы, поскольку он обеспечивает возможность получения стабильных водных растворов наночастиц заданного среднего размера с узким распределением и с известной, достаточно малой концентрацией стабилизатора (АОТ), биологический эффект которого можно независимо определять в контрольных опытах. К настоящему времени получены результаты исследований на нескольких биологических одноклеточных объектах – водорослях плазмодии Chlorella низшего vulgaris, гриба семенах Physarum polycephalum, растений, организме млекопитающих и культурированных клетках человека. Действие водных растворов наночастиц сравнивалось с действием растворов АОТ в тех же концентрациях, в которых этот ПАВ присутствует в растворе наночастиц, а также с действием ионов Ag+ , вводившихся в виде водных растворов нитрата серебра. Таким образом, оказывалось возможным (1) выделить биологический эффект наночастиц серебра в совокупном действии наночастиц и АОТ и (2) выяснить, является ли эффект наночастиц следствием действия ионов серебра, что важно для выяснения механизма действия наночастиц. Ниже приведено несколько примеров полученных результатов. Плазмодий слизевого гриба Physarum Polycephalum Исследования проводились совместно с Институтом теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Плазмодий Physarum polycephalum является удобным тест-объектом для изучения явлений хемотаксиса – двигательной реакции клеток на неблагоприятные химические воздействия из окружающей среды. Он представляет собой многоядерную протоплазму, окруженную общей мембраной и 39 обладающую способностью к неограниченному росту и амебоидному движению. В экспериментах определялось действие наночастиц на двигательную активность и рост плазмодия. Сравнивалось угнетающее действие (характеризующее степень токсичности) водных растворов наночастиц Ag, АОТ и ионов Ag+; эксперименты проводились в водных растворах (уровень двигательной активности тяжа плазмодия), а также на чашках Петри и на пластинках с питательной средой (рост плазмодия). В нескольких сериях экспериментов с наночастицами диаметром 8-10 (± 4-6) нм на чашках Петри было показано, что, во-первых, наночастицы Ag в концентрациях ≥ 10-4 M (10.8 мкг/мл) вызывают быструю гибель плазмодия и, во-вторых, при концентрациях, не вызывающих гибели плазмодия (≤ 10-5 M или 1.08 мкг/мл) наночастицы более токсичны, чем AOT, ионы Ag+ или смесь AOT + Ag+ в концентрациях, равных тем, которые вводятся с водным раствором наночастиц. Пример показан на рис.30. Рис. 30. Распространение плазмодия на агаровой подложке в контроле и в присутствии НЧС, AgNO3 и АОТ. Верхний ряд: AgNO3 – 10-5 М, АОТ – 2.5 * 10-3 %, НЧС – 10-5 М. Нижний ряд: AgNO3 – 10-4 М, АОТ – 2.5 * 10-2 %, НЧС – 10-4 М. Время – 6 час после помещения на подложку стандартных образцов плазмодия. Масштабный отрезок – 1 см. Видно, что при концентрации наночастиц C(НЧС) = 10-4 M во всех случаях рост плазмодия не происходит, а при C(НЧС) = 10-5 M наблюдается заметное различие в росте плазмодия на среде, содержащей наночастицы, и на трех средах, содержащих нитрат серебра, АОТ и их смесь в соответствующих концентрациях. Ясно также, что «чистый» контроль без всяких добавок неотличим от варианта с AgNO3, и лишь незначительно отличается от двух других случаев, содержащих АОТ. Этот результат подтверждает вывод, сделанный нами ранее в исследованиях на бактериях кишечной палочки, о большей эффективности наночастиц по сравнению с ионами Ag+ в тех же концентрациях. Такой же вывод был сделан другими авторами в исследованиях на бактериях, животных клетках и эмбрионах рыб. Данные, полученные в исследованиях уровня двигательной активности плазмодия в водном растворе и роста на питательной среде позволили построить следующий ряд сравнительной эффективности: AgNO3 << AOT< AgNO3 +AOT << наночастицы Ag. Таким образом, исследование хемотаксиса на плазмодии показало, что в случае наночастиц токсическое действие серебра многократно усилено, причем эффект усиления не сводится к дестабилизирующему действию на клеточную мембрану поверхностно-активного вещества (АОТ), образующего оболочку мицеллы. Кроме того, более высокая эффективность наночастиц по сравнению с ионами серебра позволяет предположить, что биологическое действие наночастиц не сводится к действию ионов серебра, но может включать иной механизм, в котором важную роль играют сами наночастицы металла. 40 Проводились также эксперименты с водными растворами наночастиц разного размера с узким распределением: 5.5±2.0 нм и 9.2±2.7 нм. Было обнаружено, что, при одинаковой общей концентрации наночастиц серебра в питательной среде, отрицательная реакция плазмодия более сильно выражена для наночастиц меньшего размера. Результат иллюстрируется рис.31. Зародыш плазмодия помещали на границе между двумя полосками агара (разделенными промежутком 1 мм), содержащими наночастицы разного размера. Рис.31. Реакция плазмодия на присутствие наночастиц серебра разного размера Видно, что рост плазмодия происходит почти исключительно в сторону среды с наночастицами большего размера (SNP5), то есть наблюдается явное «избегание» наночастиц меньшего размера (SNP4). Это подтверждает имеющиеся в литературе данные о большей токсичности наночастиц серебра малого размера. Возможно, влияние размера связано с различием в числе наночастиц на единицу объема среды. В нашем случае это число различается примерно на порядок: SNP4 - 1.48 x 1014; SNP5- 3.16 x 1013 (частиц/мл). В целом полученные здесь результаты позволяют заключить, что хемотаксис является чрезвычайно чувствительным тестом в исследованиях токсичности наночастиц. Данные, полученные на плазмодии Physarum polycephalum, позволяют рекомендовать подобные тесты для выявления следовых количеств вредных веществ на любых про- или эукариотических клетках, способных к хемотаксису. Одноклеточная водоросль Chlorella vulgaris Токсичность наночастиц Ag исследовалась на живых клетках культуры микроводоросли методом микроэлектрофореза на приборном комплексе «Цито-эксперт», в сотрудничестве с Инженерно-техническим центром (лабораторией биотестирования, г.Ижевск). Токсичность наночастиц оценивалась по изменению амплитуды колебаний клеток в переменном электрическом поле, обусловленному уменьшением их поверхностного заряда, который является показателем жизнеспособности клеток. Клетки водоросли в дистиллированной воде инкубировали с наночастицами при различных 41 концентрациях в интервале 10-8 – 10-4 M (0.00108 – 10.8 мкгAg/мл) заданное время, затем определяли индекс токсичности T = (Ac – Acell)/Ac , где Ac and Acell – средние амплитуды колебаний, найденные для контрольной (клетки без наночастиц) и экспериментальной суспензии, соответственно. Независимо определялась токсичность ионов Ag+ и смеси Ag+ +АОТ в соответствующих концентрациях, аналогично тому, как описано выше в экспериментах с плазмодием. Результат показан на рис. 32. ChlAgNP AGNO AgNOAOT 0,7 0,6 T (токсичность) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 10(-8) 10(-7) 10(-6) 10(-5) 10(-4) Концентрация (M) Рис.32. Токсичность наночастиц (AgNP), AgNO3 и смеси AOT + AgNO3 для клеток водоросли Chlorella vulgaris. Токсичность наночастиц вначале возрастает с увеличением их концентрации, затем остается постоянной в интервале 0.108 мкг/мл (10-6 M) - 10.8 мкг/мл; достигнутый уровень токсичности равен примерно ½ максимального (Т=1). Почти при всех исследованных концентрациях (кроме 10-4 M) наночастицы Ag более токсичны, чем ионы Ag+ или Ag+ + AOT при тех же концентрациях, что и введенные с наночастицами, в согласии с данными, полученными на плазмодии. Таким образом, и в этом случае действие наночастиц не сводится к действию ионов серебра. Одинаковая токсичность всех трех агентов при наибольшей концентрации (10-4 М) объясняется, скорее всего, тем, что клетки уже нежизнеспособны, подобно тому, что наблюдалось при этой концентрации на плазмодии. Семена растений Исследовалось действие наночастиц Ag на всхожесть семян арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) и сои (Glycine max); данные получены в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН. Оба растения являются известными тест-объектами для изучения влияния различных факторов на генетические характеристики растительных организмов. Сравнивалось влияние водного раствора наночастиц размером 9±6 нм и растворов АОТ в соответствующих концентрациях. Концентрация наночастиц и АОТ в исходном растворе составляла 5*10-3 М и 15*10-3 М, соответственно. Семена предварительно замачивали в дистиллированной воде в течение 24-х часов, затем заливали растворами наночастиц или АОТ и инкубировали еще 24 часа, затем отмывали дистиллятом и ставили на проращивание в стандартных условиях. Оказалось, что присутствие АОТ практически не 42 влияло на всхожесть семян, то есть цитолитический эффект отсутствовал. В случае наночастиц снижение всхожести наблюдалось при концентрациях выше 1*10-3 М (108 мкг/мл), а при более низких концентрациях эффект отсутствовал. Результат эксперимента с семенами арабидопсиса показан на рис.32. Arabidopsis (Landsberg) 100 Рис. 32. Всхожесть семян Arabidopsis thaliana при действии наночастиц серебра (НЧС) и АОТ. Всхожесть, % 80 НЧС 60 АОТ 40 Из 20 вытекает, полученных что высоких 0 0 2 4 5 10 20 200 1000 10000 Контроль при данных наиболее концентрациях в исследованном диапазоне водная Разведения дисперсия наночастиц серебра более токсична, чем раствор АОТ, что согласуется с рядом токсичности, найденным для плазмодия. Другое следствие состоит в том, что для исследованных семян в широком диапазоне концентраций (5*10-7 - 1*10-3 М) водный раствор наночастиц серебра не токсичен, что указывает на возможность его использования для обработки семян с целью защиты их от поражения патогенными бактериями. В отличие от результатов, полученных на бактериях E.coli, плазмодии и клетках хлореллы, для семян обнаружено сильное цитотоксическое действие ионов Ag+, причины которого пока не выяснены. Организм млекопитающих Исследовалось действие водных растворов наночастиц Ag на длительность жизни мышей линии Н.И.Вавилова BALB в возрасте 3-4 мес. (данные Института общей генетики им. РАН). В задачу исследования входило:1) определение процента выживаемости мышей в зависимости от концентрации введенного раствора наночастиц серебра (НЧС) и 2) установление дозы раствора, вызывающей 50% гибели животных в течение 30 дней после введения (ЛД50/30). Работа проводилась с тем же раствором наночастиц, что и в опытах на семенах растений. Раствор наночастиц (0.2 мл) вводился однократно внутрибрюшинно в различных разведениях; минимальная концентрация наночастиц Действие составляла наночастиц 0,05*10-3 сравнивалось М. с действием растворов АОТ и нитрата серебра в эквивалентных концентрациях. Определение выживаемости проводилось по стандартной методике в течение 30-ти дней после введения растворов. Результаты показаны на рис.33. Рис. 33. Смертность мышей при инъекции препарата НЧС и раствора АОТ в зависимости концентрации. 43 Из анализа полученных данных вытекает, что процент гибели был выше в группе с введением наночастиц серебра, чем при введении АОТ. На основании регрессионного анализа данных по выживаемости была определена доза раствора, вызывающая 50% гибели животных. Величина ЛД50/30 составила для наночастиц Ag (2, 75 ±0,66)10-3 М, а для АОТ – (32,6±17,1) *10-3 М. Полученные результаты указывают на достаточно сильный и зависимый от концентрации наночастиц летальный эффект при инъекции у мышей, независимо от пола животных. Существенное различие в величинах ЛД50/30 для наночастиц и АОТ свидетельствует также о меньшей токсичности ПАВ по сравнению с раствором наночастиц, в согласии с выводами, сделанными в ходе исследований плазмодия и семян растений. Введение раствора нитрата серебра не вызывало гибели мышей при всех исследованных концентрациях, что указывает на существенно меньшую токсичность ионов, чем наночастиц серебра, а также на то, что токсическое действие наночастиц не сводится к действию ионов серебра. Культуры клеток человека Исследовали действие водных растворов наночастиц Ag на культуры клеток опухолей человека (линии HeLa и U937). Работа проводилась в НИИОПП РАМН с целью получения сведений о механизме действия наночастиц металлов на клетки человека, а также для выяснения возможности использования наночастиц серебра в качестве лекарственного средства в терапии онкологических заболеваний. Клетки снимали с матрасов в логарифмической фазе роста стандартным образом и переносили в 96 луночные планшеты. Через сутки к клеткам добавляли водный раствор наночастиц в разных концентрациях или контрольные растворы (Ag+ , АОТ или смеси Ag+ + АОТ), инкубировали в стандартных условиях роста культур заданное время, после чего клетки отмывали и определяли цитотоксичность исследуемых агентов двумя способами – по уровню функциональной активности митохондрий (МТТ-тест) и внутриклеточных ферментов (ФДА/ПИ –тест). Определялась также возможность переноса наночастиц через клеточную мембрану путем эндоцитоза посредством блокирования активного транспорта (инкубация клеток при 4оС). Было обнаружено, что для обоих типов клеток токсичность наночастиц выше, чем соответствующих концентраций АОТ, ионов Ag+ и смеси Ag+ + АОТ, что может говорить о наличии специфической составляющей в действии наночастиц, в согласии с выводами, сделанными на других исследованных объектах. Методом лазерной конфокальной микроскопии после инкубации с наночастицами было зафиксировано проникновение агрегатов наночастиц внутрь клетки. Возможно, что оно происходит путем эндоцитоза, поскольку блокирование активного транспорта приводит к частичному снижению цитотоксичности; однако это не исключает другие способы проникновения наночастиц. 8. Каталитические свойства наночастиц Каталитические свойства наночастиц меди изучались на кафедре химической кинетики и катализа химического факультета МГУ. Определялась каталитическая 44 активность наночастиц в реакции изомеризации дихлорбутенов: CH2Cl-CHCl-CH=CH2 (3,4-ДХБ) CH2Cl-СН2-CH=CH2Cl (1,4-ДХБ) (3) Эта реакция является одной из промежуточных стадий получения синтетического каучука (хлоропрена). В промышленном производстве каучука в качестве катализатора для этой стадии применяется нафтенат меди, однако он имеет неудовлетворительные экономические и экологические показатели. Поскольку известно, что изомеризация дихлорбутенов катализируется не только солями, но и соответствующими металлами, представляло интерес исследовать каталитическую активность наночастиц меди, поскольку можно было предположить, что существенное увеличение удельной поверхности при переходе к наночастицам может привести к заметному повышению эффективности медного катализатора по сравнению с таковой, определяемой для кристаллической меди. Исследовались наночастицы меди как в мицеллярном растворе, так и на твердых носителях (оксиде алюминия и силикагеле). Результаты одной из серий экспериментов приведены в таблице 5. Таблица 5. Активность металлсодержащих катализаторов в изомеризации дихлорбутенов (промежуточная стадия синтеза хлоропрена). Катализатор to C Активность, моль прод./моль мет. час Наночастицы Cu (МР) На воздухе Без кислорода 100 110 230 340 Наночастицы Cu/SiO2 (0.03%) На воздухе Без кислорода 100 100 760 1500 Наночастицы Cu/Al2O3 (0.1%) На воздухе 100 700 Нафтенат меди (промышленный катализатор) 120 30 УДЧ меди; традиционные методы нанесения (восстановление из соли или термическое разложение на носителе). Кислород не влияет. Cu/SiO2 (5%) 100 130 Cu/Al2O3 (0.05%) 100 150 Кластеры Fe во фторопласте, 16.6% Без кислорода 90 300 Кластеры Fe в полиэтилене, 10% Без кислорода 150 Кластеры железа в полимерах 100 Оказалось, что наночастицы меди, получаемые методом биохимического синтеза, проявляют существенно более высокую активность, чем промышленный катализатор, 45 содержащий соль меди, или ультрадисперсные частицы, получаемые традиционным способом – пропиткой носителя раствором соли с последующим терморазложением или восстановлением водородом. Было обнаружено также, что активность катализатора с наночастицами меди сохраняется при многократном использовании. Важной особенностью наночастиц меди явилось не только сохранение, но даже усиление каталитической активности при нанесении на неорганический носитель. Каталитические свойства наночастиц меди исследовали также на реакции CCl4 c предельными углеводородами (изооктаном и октаном). Как и в случае дихлорбутенов, активность наночастиц меди на твердом носителе оказалась выше, чем в мицеллярном растворе. Наибольшую эффективность продемонстрировали наночастицы, нанесенные на силикагель, при взаимодействии CCl4 с октаном. При сравнительно низкой для таких процессов температуре (130о С ) конверсия CCl4 уже через 2 часа составляла 50%. Такой результат свидетельствовал о более высокой эффективности полученных нами наночастиц по сравнению с иммобилизованными на кремнеземе ионными комплексами меди или нанокомпозитами меди в полимерах. Каталитические свойства наночастиц серебра испытывались в реакции получения формальдегида из метанола с целью создания нового катализатора для промышленного получения формальдегида, который применяется в производстве фенол-формальдегидных смол, красителей, клеев, лаков и другой продукции. Работы проводились на двух типах носителей (корундо-муллите, традиционно используемым в производстве, и силикагеле) на опытной установке завода «Карболит» (ОАО «Карболит», г. Орехово-Зуево). Предварительные результаты показали, что использование наночастиц серебра может позволить снизить энергозатраты и увеличить выход конечного продукта; таким образом, есть основания полагать, что наночастицы Ag могут оказаться более эффективным катализатором, чем используемые для этой цели в настоящее время соли серебра. Исследования каталитических свойств наночастиц кобальта, никеля, серебра и других металлов в мицеллярных растворах проводились по инициативе Тамбовского государственного технического университета (кафедра химической технологии органических веществ) на тамбовском заводе «Пигмент» в реакциях синтеза различных красителей, отбеливателей и другой продукции этого завода. При этом зарегистрировано существенное увеличение скорости процесса, выхода и качества продуктов по ряду показателей. Примером может служить реакция получения органического красителя – пигмента оранжевого «Ж». Процесс включает две основные стадии: 1) диазотирования 3,3’-дихлорбензидина и 2) сочетания полученного диазосоединения с натриевой солью 1фенил-3-метилпиразолона-5. На первой стадии образуется промежуточный продукт (диазосоединение), на второй стадии (азосочетания) образуется сам пигмент. Оказалось, что введение наноструктурированного катализатора на стадиях синтеза позволяет, вопервых, ускорить процесс диазотирования и увеличить концентрацию промежуточного продукта, и, во вторых, существенно ускорить процесс азосочетания, что приводит к 46 уменьшению длительности процесса на 40% и, соответственно, к существенной экономии времени и энергетических затрат. Кроме того, получаемый в итоге пигмент имеет более высокие качественные показатели, чем получаемый по традиционной технологии. 9. Возможности применения наночастиц металлов, полученных методом биохимического синтеза Варианты применения наночастиц металлов вытекают как из результатов проведенных нами исследований, так и из других данных об их свойствах, сообщаемых в литературе. Ниже мы приводим краткий перечень возможностей практического использования получаемых нами наночастиц, начиная с наночастиц серебра, о которых к настоящему времени имеется наибольшее количество сведений. Из результатов исследования антимикробных свойств наночастиц серебра ясно, что они обладают высокой антимикробной активностью, как в растворах, так и при введении их в качестве добавки в жидкофазные материалы или при нанесении на различные поверхности. Отсюда вытекает большое разнообразие способов их применения для создания различных материалов с бактерицидными свойствами для широкого использования - жидких дезинфицирующих средств, косметических средств с антимикробным действием, лакокрасочных материалов, тканей и готовых изделий из тканей, полимерных материалов и изделий из них; фильтрующих материалов для очистки воды от бактериальных загрязнений, различных материалов и изделий медицинского назначения и др. Разумеется, в каждом случае требуется специальная работа для определения допустимых концентраций наночастиц и условий использования материала или изделия, обеспечивающих безопасность для потребителя. Исследования токсических эффектов и механизма биологического действия наночастиц серебра могут послужить основой для выяснения причин возникновения нанопатологий и создания новых лекарственных средств. Помимо биологического действия, наночастицы серебра проявляют также каталитическую активность в различных промышленно значимых реакциях, что открывает перспективы их использования в химической технологии для создания новых эффективных катализаторов. Развитие исследований других свойств наночастиц серебра может открыть новые способы их применения. Так, можно предположить, что изучение электрических свойств этих наночастиц и модифицированных ими материалов позволит разработать варианты получения проводящих клеев, лаков и других материалов для применения в электронике. Наночастицы меди, по нашим данным, имеют наиболее определенные перспективы применения в качестве катализатора в промышленном производстве каучука. Помимо описанных выше каталитических свойств, проведенные нами исследования их антимикробного действия показали, что они могут применяться также (отдельно или в сочетании с наночастицами серебра) для расширения спектра бактерицидной активности модифицированных наночастицами лакокрасочных и других материалов. Можно 47 предположить также, что здесь, как и в случае наночастиц серебра, исследования электрических свойств модифицированных материалов позволят предложить проводящие пасты, клеи для применения в электронике и покрытия с особыми свойствами для применения в летательных аппаратах и военной технике. Наночастицы цинка могут использоваться в качестве добавок к ЛКМ, сообщающих им антикоррозионные свойства. Как показали результаты предварительных экспериментов (на основании которых производителю ЛКМ был выдан патент РФ), добавки мицеллярного раствора наночастиц цинка, получаемых методом биохимического синтеза, позволяют заметно усилить антикоррозионную активность протекторной грунтовки и одновременно уменьшить содержание цинка в таком покрытии, что может дать существенный экономический эффект. Наночастицы кобальта и никеля, по данным предварительных испытаний на тамбовском заводе «Пигмент», проявили себя как эффективные катализаторы в процессах синтеза некоторых красителей и других продуктов. Учитывая известные каталитические свойства этих металлов, можно думать, что исследования эффективности этих наночастиц в качестве катализаторов даст положительные результаты и для других промышленно значимых процессов – например, для гидрогенизации жиров, где традиционно используются никелевые катализаторы. Исследования магнитных свойств этих наночастиц могут послужить основой для полезных разработок в различных областях техники и медицины, например, для использования их в качестве магнитоуправляемых носителей. Наночастицы кобальта имеют также перспективы применения в качестве сиккатива для получения быстровысыхающих красок и покрытий. Полезные результаты могут быть получены при использовании добавок этих наночастиц к сталям и сплавам, поскольку модификация наночастицами может сообщить этой продукции новые полезные качества, которые невозможно получить, используя традиционные добавки соответствующих металлов в обычном, не наноразмерном состоянии. Наночастицы золота, получаемые с помощью биохимического синтеза, пока не являлись предметом прикладных исследований. Однако такие исследования безусловно имеют большие перспективы практического применения, прежде всего в биологии и медицине. Наночастицы золота и их конъюгаты с биополимерами (ДНК, антителами, ферментами и др.) уже активно исследуются в экспериментальной биологии и медицине с целью создания новых эффективных иммунохимических методов диагностики и лечения генетических заболеваний. Имеются также реальные перспективы применения наночастиц золота для диагностики и лечения онкологических заболеваний. Помимо способности этих наночастиц образовывать конъюгаты с биологическими молекулами, специфически адсорбирующимися на клетках опухоли, здесь используется также их способность эффективно поглощать электромагнитное излучение, что дает возможность увеличивать эффективность радиотерапии и снижать дозу облучения, и таким образом уменьшает негативные эффекты этого метода лечения. 48 Развитие исследований свойств наночастиц может существенно расширить возможности их применения. При этом, поскольку металлы в наноразмерном состоянии обнаруживают необычные свойства, не характерные для массивного металла, могут появиться и такие новые варианты их применения, которые сегодня невозможно себе представить. Таков удивительный мир наночастиц, который мы только начинаем открывать, познавать и ценить. Выводы. 1. Предложен оригинальный метод синтеза наночастиц металлов - биохимический синтез в обратных мицеллах с использованием в качестве восстановителей природных биологически активных веществ из группы флавоноидов. Впервые экспериментально доказано, что природные флавоноиды (кверцетин, рутин, морин) способны эффективно восстанавливать ионы металлов в водном ядре обратной мицеллы с образованием металлических наночастиц. 2. На основе биохимического синтеза получены наночастицы различных металлов (серебра, золота, меди, цинка и др.) в обратных мицеллах из анионного ПАВ (аэрозоля-ОТ или АОТ), размером не более 25 нм, стабильные в растворе на воздухе в течение длительного времени (до нескольких лет). 3. Определено влияние различных факторов (концентраций соли металла и восстановителя, концентрации ПАВ, состава соли металла, степени гидратации) на скорость формирования, выход, размеры и стабильность наночастиц металлов в обратных мицеллах. 4. Исследован механизм взаимодействия флавоноидов с ионами серебра, золота, меди и цинка в обратных мицеллах; показано, что первой стадией взаимодействия является образование комплекса, затем комплекс распадается с образованием наночастиц и флавоноида в окисленной форме. На основе анализа спектров поглощения высказаны предположения о структуре комплексов кверцетина, рутина и морина с ионами металлов в мицеллярном растворе. 5. Впервые определены коэффициенты экстинкции в мицеллярном растворе кверцетина и рутина, а также комплексов кверцетина с ионами серебра, меди и цинка. Найден коэффициент экстинкции наночастиц серебра. 6. Впервые разработаны процедуры получения водных дисперсий наночастиц металлов из их мицеллярных растворов. Получены водные дисперсии наночастиц серебра с малой концентрацией стабилизатора (АОТ), что существенно для исследований биологических эффектов наночастиц в водных средах. 7. Изучена адсорбция (1) наночастиц серебра и меди из мицеллярных растворов и (2) наночастиц серебра из водных растворов на различных материалах (активированный уголь, силикагель, оксид алюминия, ткани, полиамидные мембраны и др.). Получены материалы с нанесенными наночастицами серебра и меди. 49 8. Исследованы антимикробные и каталитические свойства наночастиц серебра и меди в растворах, а также модифицированных этими наночастицами жидкофазных и твердых материалов. модифицированные Установлено, ими что, материалы как обладают растворы высокой наночастиц, так бактерицидной и или каталитической активностью. 9. На основе результатов исследований антимикробных и каталитических свойств наночастиц серебра и меди, а также каталитических свойств наночастиц кобальта и никеля предложены модифицированных различные ими варианты жидкофазных применения и твердых растворов материалов. наночастиц Некоторые и из предложенных вариантов находятся на стадии внедрения в производство. 10. Показано, что водные растворы наночастиц Ag являются сильным токсическим агентом, который может вызывать угнетение жизненных функций и гибель живых систем разного уровня организации, включая организм млекопитающих. Определены зависимости токсического эффекта от концентрации наночастиц. 11. Сравнение токсического эффекта наночастиц Ag с подобным же эффектом ионов Ag+ показывает, что в большинстве исследованных случаев действие наночастиц серебра превышает эффект ионов Ag+ в эквивалентных концентрациях. Отсюда следует, что действие наночастиц серебра осуществляется по иному механизму, нежели действие ионов серебра. Публикации по теме диссертации Обзоры 1. Егорова Е.М. Наночастицы металлов в растворах: биохимический синтез и применение. //Нанотехника. 2004. №1. С.15-26. 2. Egorova E.M. Biological effects of silver nanoparticles. In: “Silver nanoparticles: properties, characterization and applications”. (Ed. by Audrey E. Welles). Nova Science Publishers, New York, 2010, p.221-258. Статьи 3.Ревина А.А., Егорова Е.М., Каратаева А.Д. Взаимодействие природного пигмента кверцетина с наночастицами серебра в обратных мицеллах. // Журнал Физической Химии. 1999. Т.73. №10. С.1897-1904. 4.Egorova E.M., Revina A.A. Synthesis of metallic nanoparticles in reverse micelles in the presence of quercetin. //Colloids and Surfaces ser.A. 2000. V.168. №1. P.87-96. 5.Егорова Е.М., Ревина А.А., Ростовщикова Т.Н., Киселева О.И. Бактерицидные и каталитические свойства стабильных металлических наночастиц в обратных мицеллах. //Вестник МГУ. Сер.2. Химия. 2001. Т.42. №5. С.332-338. 6.Каратаева А.Д. Ревина А.А., Егорова Е.М., Шапиро Б.И. Взаимодействие карбоцианиновых красителей с нанокластерами серебра в обратных мицеллах. //Журнал научной и прикладной фотографии. 2001. Т.42. №6. С.553-562. 7.Донкпеган С.К., Цветков В.В., Ягодовский В.Д., Егорова Е.М., Ревина А.А. Влияние способа приготовления серебряного золя на состояние его частиц. //Журнал Физической Химии. 2001. Т.75. №1. С.149-152. 8.Кудрявцев Б.Б., Егорова Е.М, Ревина А.А. Возможности применения нанотехнологий в производстве лакокрасочных материалов и покрытий. //Химическая промышленность. 2001. №4. С.28-32. 50 9.Кудрявцев Б.Б., Недачин А.Е., Данилов А.Н., Оводенко Н.И., Ревина А.А., Егорова Е.М. Новое поколение биологически активных алкидных и водоэмульсионных красок. //Лакокрасочные материалы и их применение. 2001. №2-3. С.3-7. 10.Егорова Е.М., Ревина А.А. Оптические свойства и размеры наночастиц серебра в мицеллярных растворах. //Коллоидный журн. 2002. Т.64. №3. С.334-345. 11.Егорова Е.М., Ревина А.А.,Румянцев Б.В.,Смирнов О.К., Тоидзе З.Г., Шишков Д.И. Стабильные наночастицы серебра в водных дисперсиях, полученных из мицеллярных растворов. //Журнал прикладной химии. 2002. Т.75. №10. С.1620-1625. 12.Kudryavtzev B., Figovsky O., Revina A., Egorova E., Buslov F., Beilin D. The use of nanotechnology in production of bioactive paints and coatings. //The Journal “Scientific Israel – Technological Advantages”. 2003. V.5. P.209-215. 13.Егорова Е.М., Ревина А.А. О механизме взаимодействия кверцетина с ионами серебра в обратных мицеллах. //Журнал Физической Химии. 2003. Т.77. №9. С.1683-1692. 14.Егорова Е.М., Ревина А.А., Румянцев Б.В. Получение и антимикробные свойства водных дисперсий наночастиц серебра. // Сборник научных трудов VI Всероссийской (международной) конференции «Физикохимия ультрадисперсных (нано-) систем». Москва, 2003. С.149-152. 15.Матвеева Н.Б., Егорова Е.М., Бейлина С.И., Леднев В.В. Хемотаксис как способ тестирования биологических эффектов наноразмерных частиц серебра. //Биофизика. 2006. Т.51. №5. С.859-865. 16.Широкова Л.Н., Александрова В.А., Егорова Е.М., Вихорева Г.А. Макромолекулярные системы и бактерицидные пленки на основе производного хитина и наночастиц серебра. //Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т.45. №3. С.422426. 17.Орджоникидзе К.Г., Рамайя Л.К., Егорова Е.М. Рубанович А.В. Генотоксические свойства наночастиц серебра при воздействии на млекопитающих in vivo. //Acta Naturae. 2009. №3. С.109-112. 18.Егорова Е.М. Биохимический синтез наночастиц золота и цинка в обратных мицеллах. //Журнал физической химии. 2010. Т.84. №4. С.713-720. 19.Egorova E.M., Beylina S.I., Matveeva N.B., Sosenkova L.S. Chemotaxis-based assay for the biological action of silver nanoparticles. In: “Chemotaxis: Types, Clinical Significance and Mathematical Models”. (Ed. by Timothy C.Williams). Nova Science Publishers, New York, 2011 (in press). 20.Сосенкова Л.С., Егорова Е.М. Наночастицы серебра малого размера для исследований биологических эффектов. //Журнал физической химии. 2011. Т.85. №2. С.1-10. 21.Egorova E.M. Interaction of silver nanoparticles with biological objects: antimicrobial properties and toxicity for the other living organisms. // Journal of Physics: Conference Series. 2011. V. 247 (in press). Патенты 22.Егорова Е.М., Ревина А.А., Кондратьева В.С. Способ получения наноструктурных металлических частиц. Патент РФ № 2147487. Приоритет от 01.07.1999. 23.Егорова Е.М., Ревина А.А., Румянцев Б.В., Захаров А.Е.,Шишков Д.И.,Смирнов О.К.,Тоидзе З.Г. Способ получения модифицированного наночастицами серебра углеродного материала с биоцидными свойствами. Патент РФ №2202400. Приоритет от 05.07.2002. 24.Ревина А.А., Егорова Е.М., Наумов Ю.В. Способ модифицирования поверхности. Патент РФ №№2182934. Приоритет от 28.12.2002. 25.Кудрявцев Б.Б., Гурова Н.Б., Ревина А.А., Егорова Е.М., Седищев И.П. Лакокрасочный материал с биоцидными свойствами. Патент РФ № 2195473. Приоритет от 07.03.2003. 51 Тезисы докладов 26.Смирнов В.В., Ростовщикова Т.Н., Загорская О.В., Губин С.П., Ревина А.А., Егорова Е.М. Металлокластерные катализаторы для изомеризации дихлорбутенов. //Сб. докладов Международной конференции по наукоемким технологиям. М., 1999. 27. Revina A.A., Egorova E.M., Rostovshchikova T..N., Gusev V.Yu. Nanosized copper particles in reverse micelles: synthesis, properties and catalytic activity. // In: Abstracts of International Conference “Colloids 2000”. Szegel, Hungary, 2000. 28.Ростовщикова Т.Н., Киселева О.И., Гусев В.Ю., Ревина А.А., Егорова Е.М Иммобилизованные на неорганических носителях наночастицы в катализе превращений хлоролефинов. .//Тезисы II Всероссийского совещания «Высокоорганизованные каталитические системы". Москва, МГУ, 2000, С.78. 29.Ревина А.А., Егорова Е.М., Ростовщикова Т.Н., Киселева О.И. Агрегаты меди в обратных мицеллах в катализе превращений галогенуглеводородов. //Тезисы XII Симпозиума по современным проблемам химической физики. Туапсе, 2000, С.182. 30.Егорова Е.М., Ревина А.А., Хайлова Е.Б. Адсорбционные свойства металлических наночастиц, синтезированных в обратных мицеллах. //Тезисы VII Международного Фрумкинского симпозиума. Москва, 2000, ч.I, с.40. 31.Егорова Е.М., Ревина А.А. Новый метод химического синтеза металлических. наночастиц. // Тезисы VII Международного Фрумкинского симпозиума. Москва, 2000, ч.II, С.650. 32.Rostovshchikova T..N., Revina A.A., Egorova E.M., Kiseleva O.I., Chernavsky P.A. Nanosized copper and iron-containing particles in catalysis of alkylation and isomerization. //Abstract Book of the 10th international symposium on Relation between Homogeneous and Heterogeneous Catalysis. 2001. Lyon, France. P.162. 33. Егорова Е.М., Ревина А.А., Румянцев Б.В. Баранова Е.К., Жабкина Т.Н. Бактерицидные свойства наночастиц серебра в водных дисперсиях. //Материалы VI Всероссийской (международной) конференции «Физикохимия ультрадисперсных (нано)систем. Томск, 19-23. 08. 2002. Москва, 2002. С.82-83. 34.Егорова Е.М. Биохимический синтез наночастиц металлов (прикладные аспекты). //В сб.: «Научная сессия МИФИ-2003». Москва, 2003, Т.8. С.279-280. 35.Егорова Е.М. Синтез наночастиц меди в обратных мицеллах. //Сборник научных трудов Научной сессии МИФИ-2004. Москва, 2004. Т.9. С.247-248. 36. Егорова Е.М. Биохимический синтез наночастиц металлов. // Сборник трудов I Всероссийской (международной) научно-практической конференции «Нанотехнологии производству», Фрязино –2004. Москва, 2004. С.54-62. 37.Егорова Е.М. Растворы наночастиц металлов и модифицированные ими материалы: свойства и применение. //Труды Международной Научно-практической конференции «Нанотехнологии-производству 2005», Фрязино, 2005. Москва, 2006. С.26-32. 38.Егорова Е.М., Носик Д.Н., Носик Н.Н., Калнина Н.Б. Бактерицидные и вирулицидные свойства наночастиц серебра. //Тезисы докладов конференции «Нанотехнологии – производству 2005». Фрязино, 2005. С.46-47. 39.Матвеева Н.Б., Бейлина С.И., Леднев В.В., Егорова Е.М. Способ тестирования биологических эффектов наноразмерных частиц серебра. // Тезисы докладов конференции «Нанотехнологии – производству 2005». Фрязино, 2005. С.48-49. 40.Егорова Е.М., Широкова Л.Н., Вихорева Г.А.,Александрова В.А. Полимерные пленки на основе производного хитина и наночастиц серебра. // Тезисы докладов конференции «Нанотехнологии – производству 2005». Фрязино, 2005. С.50. 41.Егорова Е.М. Биохимический синтез наночастиц металлов. //Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Москва, 2007. Т.2. С.236. 42.Брянкин К.В., Егорова Е.М., Дегтярев А.А., Ковальчук Д.С. Наноструктурированные материалы как энергоинформационные структуры гранулообразования на стадии синтеза динатриевой соли 4,4-бис(2-анилино-4-морфолино-1,3,5 триазин-6-иламино)52 стильбен-2,2. // Сборник трудов пятой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности». СПб., Изд-во Политехнического унмверситета, 2008. С. 158-160. 43.Леонтьева А.И., Петрик В.И., Егорова Е.М., Дьячкова Т.П. Исследование кинетики процессов диазотирования и азосочетания на наноструктурированных катализаторах в производстве пигментов. // Сборник трудов пятой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности». СПб., Изд-во Политехнического унмверситета, 2008. С. 235-237. 44. Matveeva N.B., Egorova E,M., Beylina S.I. Chemotactic assay is capable to reveal the difference in efficiency of nanosized silver particles. // Biological motility: achievements and perspectives (Eds.Z.A. Podlubnaya and S.L. Malyshev). Pushchino, 2008, vol.2, p.240-242. 45.Сосенкова Л.С. Егорова Е.М. Наночастицы серебра малого размера для исследований взаимодействия с биологическими объектами. //Материалы V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2009. Часть I, с.487. 46.Филиппов А.Г., Егорова Е.М. Наночастицы серебра в обратных мицеллах из смеси АОТ/фосфатидилхолин. //Материалы V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2009. Часть I, с.471. 47.Орджоникидзе К.Г., Рамайя Л.К., Егорова Е.М. Рубанович А.В. Генотоксические эффекты наночастиц серебра в половых и соматических клетках млекопитающих. // 1-я Международная летучая школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Красновидово, 2009. Электронная версия, с.306. 48.Сосенкова Л.С. Егорова Е.М. Влияние концентрации ионов металла на средний размер и степень полидисперсности наночастиц серебра. //1-я Международная летучая школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Красновидово, 2009. Электронная версия, с.338. 49.Филиппов А.Г., Егорова Е.М. Наночастицы серебра в водных растворах – модифицированный вариант биохимического синтеза. //1-я Международная летучая школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Красновидово, 2009. Электронная версия, с.364. 50.Ordchonikidze, C.G., Ramayya L.K., Egorova E.M., Rubanovich A.V. Toxical and genotoxical effects of silver nanoparticles on mice in vivo. //Abstracts of the 4-th International Conference Environmental effects of nanoparticles and nanomaterials. Vienna, 6-9th September, 2009. 51.Егорова Е.М. Биохимический синтез наночастиц металлов. //Сборник тезисов докладов участников Второго Международного форума по нанотехнологиям «Rusnanotech-09». Москва, 6-8 октября 2009, с. 271. 52.Егорова Е.М. Лакокрасочные материалы с наночастицами металлов. //Нанотехнологии в строительстве: научный интернет-журнал. 2009. №4. С.81-83. 53.Линьков П.А., Егорова Е.М. Ткани, модифицированные наночастицами серебра. // В сб: «Нанотехнологии в текстильной и легкой промышленности – от разработки до внедрения». М., 2010. С.51-52. 53
