Шаг в будущее -2013 г. - Администрации Тюменского

ОБЛАСТНАЯ НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ МОЛОДЫХ ИССЛЕДОВАТЕЛЕЙ
«ШАГ В БУДУЩЕЕ»
Daphnia magna как объект биотестирования водной среды
Автор: Дементьева Светлана Владимировна,
Тюменская область, Тюменский район,
село Горьковка,
муниципальное общеобразовательное учреждение
Горьковская средняя общеобразовательная школа,
11 класс
Научный руководитель:
Колцанова Галина Николаевна,
учитель биологии и химии,
муниципальное общеобразовательное учреждение
Горьковская средняя общеобразовательная школа
Тюменский муниципальный район, 2013 г.
Daphnia magna как объект биотестирования водной среды
Дементьева Светлана Владимировна
Россия, Тюменская область, Тюменский район, село Горьковка, муниципальное
образовательное учреждение Горьковская средняя общеобразовательная школа, 11 класс
Краткая аннотация
В настоящее время в связи с ростом крупных предприятий и увеличением
антропогенной нагрузки на окружающую среду все большее внимание начали уделять
экологии и в особенности состоянию водных объектов.
Существует множество способов определения степени загрязнения водных объектов:
химический анализ, биоиндикация и биотестирование. Каждый из методов имеет свои
преимущества. Особую роль в оценке состояния окружающей среды играют
биологические тесты. Наше внимание привлекла дафния – маленький пресноводный
ветвистоусый рачок (Daphnia pulex). Расшифровка её генетического кода показала, что у
них больше генов, чем у всех других животных, причем эти рачки оказались генетически
ближе к человеку. Популяции дафний, населяющие пруды и озера, чувствительны к
современным токсическим веществам и окружающей среде, и, следовательно, могут быть
использованы для оценки экологического ущерба от изменений в окружающей среде, как
тест-объекты.
Daphnia magna как объект биотестирования водной среды
Дементьева Светлана Владимировна
Россия, Тюменская область, Тюменский район, село Горьковка, муниципальное
образовательное учреждение Горьковская средняя общеобразовательная школа, 11 класс
Аннотация
Актуальность темы. Загрязнение водной среды является одной из наиболее актуальных
экологических проблем. Для оценки степени техногенного воздействия на водные
экосистемы наряду с методами химического анализа используют биотестирование как
интегральный показатель токсического загрязнения среды (Зайцева и др., 1994;
Моисеенко, 2005; Филенко, 2007).
Среди этих методов важное место занимает определение токсичности среды с
использованием низших ракообразных. Эти методы широко применяются для целей
экологического контроля, как в России, так и за рубежом (Брагинский, 2000; Жмур, 2001;
ISO, 1996, 2001; US EPA, 2002). В качестве тест-реакции в анализе на острую токсичность
используют смертность рачков, а при установлении хронического токсического действия
проводят наблюдения за двигательной активностью дафний, а также изменением её
плодовитости. Несмотря на то, что хронический метод способен дать более глубокую
оценку токсичности, острые опыты в значительной степени способствуют сокращению
объема работ, позволяя в существенно более короткие сроки получать информацию о
качестве вод.
Использование быстрых ответов гидробионтов на загрязнение может значительно
снизить трудозатраты и время на проведение экологического контроля воды. Кроме того,
длительные экспозиции приводят к изменению исходных физико-химических свойств и
состава исследуемых проб, вследствие чего оценка качества среды может быть не всегда
корректной (Лесников, 1983; Брагинский, 1989; Сазонова и др., 1997; Vosyliene, 2007
Объект нашего исследования - Daphnia magna Strauss (дафния магна)
Предмет исследования – изменение биологически значимых показателей исследуемого
тест-объекта при токсическом действии неблагоприятных факторов среды.
Цель работы: анализ действия токсичных веществ и загрязненных водных сред на
жизнедеятельность организмов на примере Daphnia magna в зависимости от условий
проведения эксперимента.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести контроль чувствительности дафний, выращенных в домашних условиях, к
"эталонному" токсиканту бихромату калия (K2Cr2O7). Определение пригодности
биообъекта для тестирования .
2. Изучить действие на тест–объект водной экосистемы – Daphnia magna различных
токсикантов в условиях лабораторного культивирования.
3. Выявить изменение биологических параметров: двигательной активности,
выживаемости и плодовитости Daphnia magna при воздействии на неё загрязняющих
веществ, содержащихся в пробах снега.
4. Оценить степень загрязнения снежного покрова на разных участках территории села
методом биотестирования.
Daphnia magna как объект биотестирования водной среды.
Дементьева Светлана Владимировна
Россия, Тюменская область, Тюменский район, село Горьковка, муниципальное
образовательное учреждение Горьковская средняя общеобразовательная школа, 11 класс
Научная статья
Загрязнение водной среды является одной из наиболее актуальных экологических
проблем. Для оценки степени техногенного воздействия на водные экосистемы наряду с
методами химического анализа используют биотестирование как интегральный
показатель токсического загрязнения среды (Зайцева и др., 1994; Моисеенко, 2005;
Филенко, 2007).
Биотестирование - использование в контролируемых условиях биологических объектов
(тест-объектов) для выявления и оценки действия факторов (в том числе и токсических)
окружающей среды на организм, его отдельную функцию или систему организмов.
Биотестирование наряду с биоиндикацией является обязательным элементом
современной системы контроля качества вод. Подробную современную формулировку
биотестирования дают А. А. Зенин и Н. Б. Белоусова: «Биотестирование – один из
приемов определения степени токсического действия неблагоприятных факторов среды,
потенциально опасных для живых организмов экосистем, в контролируемых
экспериментальных лабораторных или натурных условиях путем регистрации изменений
биологически значимых показателей исследуемых водных объектов с последующей
оценкой их состояния в соответствии с выбранным критерием токсичности» [8].
Основной принцип гидробиологического биотестирования заключается в
испытании действия проб воды на водный организм, его часть или сообщество
организмов с известными и поддающимися учету характеристиками.
Тест-объект выступает в роли прибора, выявляющего интегральный
биологический эффект комплекса неблагоприятных экологических факторов, в том числе
и химической природы. В качестве тест-объектов рекомендован широкий круг
организмов, охватывающий все группы биологического сообщества.
Биологические тест-объекты и показатели,
используемые при установлении эколого-токсикологических нормативов[12].
Тест-параметр
Вспомогательный
Тест-объект
Основной
Численность клеток.
Организмы- Бактериальная Дыхание (по БПК). Концентрации
редуценты
микрофлора
кислорода, аммиака,
нитритов, нитратов
Общая численность клеток, рН
среды, концентрация кислорода,
Водоросли
соотношение живых и мертвых
Организмыклеток
продуценты
Выживаемость, рост стебля,
Макрофиты
отростков, корней
Инфузории
Выживаемость, размножение
Выживаемость, плодовитость,
Зоопланктон
Ракообразные численность и возрастной состав
модельных популяций
Зообентос
Моллюски
Выживаемость, плодовитость,
питание, масса
Биомасса. Содержание
пигментов.
Интенсивность
фотосинтеза
Интенсивность
фотосинтеза
Поведение
Морфологические
изменения
Поведение.
Морфологические
изменения.
Потребление кислорода
Рыбы
Хирономиды
Выживаемость на различных
стадиях
и сроки их прохождения.
Морфологические аномалии.
Плодовитость
Поведение, вес и общее
состояние личинок и
имаго
Эмбриогенез
Выживаемость эмбрионов.
Выклев и состояние предличинок
Аномалии развития.
Биохимические
отклонения
Выживаемость, масса тела,
анатомические и клинические
Поведение.
Взрослые
изменения, питание, частота
Биохимические
дыхания, органолептика мяса,
изменения
кумуляция
Биотестирование может применяться для решения следующих задач:
• определение токсичности отдельных веществ, вынужденно или преднамеренно
вносимых в окружающую среду, для представителей водных сообществ в целях
скрининга и нормирования;
• выявление присутствия в объектах окружающей среды потенциальных токсикантов
неизвестного состава, что могло бы служить основанием для последующего химического
исследования этой среды;
• установление источников токсического загрязнения экосистем и оценка их
интенсивности;
• определение необходимой степени разведения сточных вод до биологически и
экологически безвредных уровней. [7].
Во второй половине XX столетия в связи с необходимостью оценки токсичности
природных и сточных вод, а также некоторых химических веществ во многих странах
мира стали использовать биотестирование на Daphnia magna Straus. Впервые D. magna как
индикатор токсичности воды была предложена в 1929г. [9]. В СССР начало подобных
исследований связано с работами Н.С.Строганова и его школы, Е.А.Веселова и
Л.А.Лесникова [10]. Дафнию в качестве тест–объекта при изучении загрязнений
водоёма также предложил использовать Науманн в 1934г. Доступность тест – объектов
также необходимо принимать во внимание при выборе соответствующих методов для
целей биотестирования. Наиболее просто культивирование дафний. D. magna и D. pulex
(De Geеr, 1778) были введены в руководства по биотестированию во многих странах
мира. В настоящее время в США тест на выживаемость дафний в 48 часовом опыте взят за
эталон токсичности водной среды. В некоторых странах (Франция, Германия, Венгрия)
дафния принята как стандартный тест–организм для тестирования токсичности водных
растворов химических соединений, применяемых в исследовании загрязнений водной
среды[15]. Дафнии используются в качестве модельных организмов во многих
экологических, токсикологических и генетических исследованиях. В последнее время
дафний рекомендовано использовать и для биотестирования питьевых вод [5]. Поэтому
необходимо как можно более полное знание биологии вида, выбранного в качестве тестобъекта, в условиях его использования в виде лабораторной культуры.
Характеристика животного тест–объекта Daphnia magna Straus. [15].
Планктонные ракообразные, относящиеся к роду дафний, активные фильтраторы.
Пропуская через свой организм большие объёмы воды, они способны накапливать
значительные количества токсических веществ, способствуя тем самым естественному
самоочищению воды. Скорость аккумуляции загрязняющих веществ у этой группы
организмов очень велика. Дафнии чувствительны даже к небольшим концентрациям
некоторых солей, например, добавление солей меди в концентрации 0,01 мг/л вызывает
замедление движений рачков, они либо опускаются на дно, либо замирают у
поверхностной плёнки воды[16].
Укажем место изучаемых ракообразных в систематике:
Тип: Членистоногие
Arthropoda
Класс: Ракообразные
Crustacea
Отряд: Листоногие
Phyllopoda
Подотряд: Ветвистоусые
Cladocera
Род: Дафнии
Daphnia
Биология
Дафнии — мелкие рачки (размеры тела взрослых особей от 0,6 до 6 мм). Они населяют
все типы стоячих континентальных водоемов, встречаются также во многих реках с
медленным течением. В лужах, прудах и озерах часто имеют высокую численность и
биомассу. Дафнии — типичные планктонные рачки, большую часть времени проводящие
в толще воды. Различные виды населяют мелкие временные водоемы, литораль и
пелагиаль озер. Довольно многие виды, особенно населяющие засушливые районы —
галофилы, обитающие в солоноватых, соленых и гипергалинных континентальных
водоемах. Их значение в жизни наших водоемов очень велико. Бесчисленное множество
микроскопических ракообразных служит пищей для многих видов рыб, их личинок и
мальков. При этом сами они в свою очередь также поедают множество различных
микроорганизмов. Многие мелкие ракообразные питаются фильтрационным способом,
процеживают пищевую взвесь. Благодаря их пищевой деятельности осветляется
природная вода и улучшается ее качество.
К таким видам относятся, например, D. magna, D. atkinsoni, D.mediterranea и др.
Дафния магна (D. magna), самка — до 6 мм, самец — до 2 мм, новорожденные — 0,7 мм.
Созревают в течение 10—14 суток. Пометы через 12—14 суток. В кладке до 80 яиц
(обычно 20—30). Продолжительность жизни — до 3-х месяцев.
Дафния пулекс (D. pulex), самка — до 3—4 мм, самец — 1—2 мм. Пометы через 3—5
суток. В кладке до 25 яиц (обычно 10—12). Живут 26—47 суток.
Морфология. Тело дафний овальной формы, сжато с боков, заключено в прозрачный
панцирь. Тело нечетко сегментировано на головной, грудной и брюшной отделы (рисунок
Г.1). Голова покрыта щитом, передний край которого вытянут, образуя рострум. Под
рострумом расположены две пары конечностей: антеннулы и антенны, последние сильно
развиты, служат для скачкообразного перемещения в толще воды. Пять пар грудных
конечностей сильно расчленены, снабжены щетинками, служат для фильтрации воды,
питания, дыхания. Расположение внутренних органов представлено на рисунке Г.1. В
головном отделе, не покрытом раковиной, расположена пара глаз: большой - сложный,
маленький - простой. Под панцирем дафний легко различимы сердце, кишечник,
выводковая камера, которая находится в спинной части туловища. В выводковой камере
протекает эмбриональное развитие дафний.
Движение. Длинные раздвоенные усики дафний покрыты опушенными щетинками и
играют роль парашюта, замедляющего падение. Следовательно, дафния взмахнув всеми
четырьмя парами грудных ножек подскакивает вверх и возвращается в исходное
положение с помощью усиков-антенн. Регулируя частоту взмахов, дафнии могут не
только «парить», но и подниматься в верхние слои воды или, наоборот, уходить на
глубину. Таким образом, они совершают вертикальные перемещения (миграции),
связанные с поиском пищи, изменением температуры воды или времени суток.
Рост, развитие и размножение. Наиболее интенсивно дафния растет первые дни после
рождения, при каждой линьке сбрасывая старый панцирь. Оптимальное питание
обеспечивает удвоение размеров рачков в промежутке между линьками. После
наступления половой зрелости рост дафний замедляется, снижается и частота линек.
Всего в течение жизни дафния может линять до 24 раз. Выметанная молодь имеет в длину
0,7 - 0,9 мм, половозрелые самки - 2,2 - 2,4 мм, самцы - 2,0 - 2,1 мм. Максимальные
размеры самок - 6,0 мм при сыром весе 7 - 10 мг. В природе в летнее время, а в
лаборатории при оптимальных условиях культивирования круглый год дафнии
размножаются без оплодотворения - партеногенетически (рождаются только самки).
Резкое изменение условий существования вызывает переход к половому размножению,
дафнии откладывают «зимние яйца» .
Период созревания рачков при оптимальной температуре (+20 ± 2 °С) и хорошем питании
- 5 - 8 суток, длительность эмбрионального развития - 3 - 4 суток, а при повышении
температуры до 25 °С - 46 часов. Затем происходит вымет молоди (партеногенетических
самок) каждые 3 - 4 суток. Количество молоди у молодых самок - 10 - 15, у зрелых - 30 40 особей.
В природе дафнии живут в среднем 20 - 25 суток, а в лаборатории при оптимальном
режиме 3 - 4 месяца и более. При температуре свыше 25 °С продолжительность жизни
дафний может сокращаться до 25 суток. Голодание увеличивает продолжительность
жизни, но задерживает рост и наступление линек.
Питание и отношение к содержанию кислорода. По характеру питания относятся к
фильтраторам, в природе дафнии питаются взвешенными в воде бактериями,
одноклеточными водорослями, детритом, растворенными органическими веществами.
Пища поступает с потоком воды, направленным грудными конечностями, через выросты в брюшной желоб вдоль основания конечностей и ко рту рачка.
Пища
отфильтровывается веерами фильтрующих щетинок, которые расположены на
эндоподитах III и IV пар грудных ног. При средней концентрации корма в воде, взрослые
дафнии различных видов фильтруют со скоростью от 1 до 10 мл/сутки. Суточное
потребление пищи взрослой D. magna может достигать 600 % от веса ее тела[2] . Дыхание
происходит через покровы тела, в первую очередь грудных ног, на которых имеются
дыхательные придатки — эпиподиты. Окраска, в зависимости от питания, колеблется от
розово-желтой до красной при дефиците кислорода.
Рисунок Г.1 - Строение Daphnia magna Straus:
а - самка: 1 - антенна, 2 - сложный глаз, 3 - антеннула, 4 - грудные ножки, 5 - яичник, 6 створки панциря, 7 - каудальные когти, 8 - постабдомен, 9 - хвостовые щетинки, 10 -
выводковая камера, 11 - сердце, 12 - кишечник, 13 - печеночные выросты; б - самец; в внешний вид эффипиума
Расшифровка генома дафнии
За последние годы осуществлена частичная расшифровка генома дафнии Daphnia pulex, в
2011 г. был завершен его черновик[5]. Геном дафнии состоит из 200 миллионов
нуклеотидов, но при этом содержит минимум 30,9 тысяч генов — больше, чем у других до
сих пор изученных многоклеточных животных (например в геноме человека около 20-25
тысяч генов). Геному дафнии оказался свойственен высокий темп генных дупликаций, что
привело к созданию многочисленных генных кластеров. Более трети продуктов генов,
обнаруженных в геноме дафнии, не имеют известных гомологов в протеомах других
организмов. Уникальные для дафний гены наиболее чувствительны к изменениям
условий. Можно предполагать, что генные дупликации увеличили экологическую
пластичность дафний, позволяя им приспособиться к условиям разных водоёмов и к
меняющимся условиям в одном водоёме[6][7][8].
Авторы исследования отмечают, что изучение дафний имеет крайне важное значение для
экологических исследований, поскольку они являются ключевым видом для многих
пресноводных экосистем и могут служить своеобразным индикатором состояния среды.
"Их популяции, населяющие пруды и озера, чувствительны к современным токсическим
веществам и окружающей среде, и, следовательно, могут быть использованы для оценки
экологического ущерба от изменений в окружающей среде",
Культура дафний[14].
Исходный материал желательно приобрести в специальных учреждениях и организациях.
В школьных опытах можно использовать и свою культуру. Для этого из самого чистого в
вашей местности водоема с помощью гидробиологического сачка отлавливают дафний и
помещают в стеклянные емкости, которые заполняют под пробку водой из того же
водоема.
Культура дафний для проведения опытов выращивалась автором работы следующим
образом. У наиболее плодовитой дафнии отбиралась молодь одного помета и помещалась
в аквариум объемом 20 литров. В нем проводилось подращивание молоди до
половозрелости (резервная популяция). Самки с яйцами отсаживались по отдельности в
емкости по 500 мл. Таким образом, в опыте использовалась однопометная молодь
третьего
поколения
в
возрасте
1–
2
дней.
Пересаживались дафнии при помощи стеклянной трубки внутренним диаметром 5–7 мм с
оплавленным концом так, чтобы их не травмировать. Для этого конец трубки помещался
под поверхность воды и удерживался там до тех пор, пока дафнии не перейдут в трубку.
Начальная плотность посадки - 6 - 10 особей на 1 л воды. Спустя 5 - 7 суток, в течение
которых дафнии привыкают к лабораторным условиям существования и начинают
размножаться, в сосуды доливают воду для дальнейшего культивирования. Культура
дафний выращивалась в помещении, не содержащем токсических паров или газов при
постоянных условиях. Температура находилась в пределах от 23С до 25С.
Продолжительность светового дня составляла 12 – 14 часов.
Для культивирования
рачков использовалась вода из под крана, отстоянная в течение семи суток, и настоенная
на сушеной элодее, обогащенная кислородом, Ph 6,8. В качестве корма использовалась
колония простейших. Плотность культуры не превышала 25 половозрелых самок в 1 л
воды. Раз в 7—10 суток половина объема воды в сосуде с культурой дафний заменялась на
свежую, удалялся сифоном скопившийся на дне осадок и при большой плотности
культуры проводилось ее прореживание. Питательный раствор для выращивания
простейших готовился следующим образом: 2 см3 моркови на 300 мл. волы. Спустя три
дня мутный раствор процеживался через мелкое сито. Затем в него вносилось некоторое
количество инфузорий. Раствор использовался в качестве корма, спустя несколько дней,
когда
жидкость
становится
прозрачной.
.
Кормом для дафний служат хлебопекарные дрожжи. Для приготовления дрожжевого
корма берут 1 г свежих или 0,3 г воздушно-сухих дрожжей, заливают их 100 мл
дистиллированной воды. После набухания дрожжи тщательно перемешивают, дают
отстояться в течение 30 мин. Надосадочную жидкость добавляют в сосуды с дафниями в
количестве 3 мл на 1 л воды. Кормят дафний 1-2 раза в неделю. При невозможности
культивирования дафний в школьном опыте можно допустить использование только что
отловленных дафний.
Виды загрязнений
В настоящее время в связи с ростом крупных предприятий и увеличением антропогенной
нагрузки на окружающую среду все большее внимание начали уделять экологии и в
особенности состоянию водных объектов. Под загрязнением водоемов понимают
снижение их биосферных функций и экологического значения в результате поступления в
них вредных веществ. Загрязнение вод проявляется в изменении физических и
органолептических свойств (нарушение прозрачности, окраски, запахов, вкуса),
увеличении содержания сульфатов, хлоридов, нитратов, токсичных тяжелых металлов,
сокращении растворенного в воде кислорода воздуха, появлении радиоактивных
элементов,
болезнетворных
бактерий
и
других
загрязнителей.
Химическое загрязнение — наиболее распространенное, стойкое и далеко
распространяющееся. Оно может быть органическим (фенолы, нафтеновые кислоты,
пестициды и др.) и неорганическим (соли, кислоты, щелочи), токсичным (мышьяк,
соединения ртути, свинца, кадмия и др.) и нетоксичным. При осаждении на дно водоемов
или при фильтрации в пласте вредные химические вещества сорбируются частицами
пород, окисляются и восстанавливаются, выпадают в осадок, и т. д., однако, как правило,
полного самоочищения загрязненных вод не происходит. Очаг химического загрязнения
подземных вод в сильно проницаемых грунтах может распространяться до 10 км и более.
Наибольший вред водоемам и водотокам причиняет выпуск в них неочищенных сточных
вод — промышленных, коммунально–бытовых, коллекторно–дренажных, а также автотранспорт. Промышленные сточные воды загрязняют экосистемы самыми
разнообразными
компонентами.
Загрязнение водных экосистем представляет огромную опасность для всех живых
организмов и, в частности, для человека. Установлено, что под влиянием загрязняющих
веществ в пресноводных экосистемах отмечается падение их устойчивости вследствие
нарушения пищевой пирамиды и ломки сигнальных связей в биоценозе,
микробиологического загрязнения, эвтрофирования и других край не неблагоприятных
процессов. Они снижают темпы роста гидробионтов, их плодовитость, а в ряде случаев
приводят к их гибели. [12].
Определение пригодности биообъекта для тестирования
При определении пригодности биообъекта для тестирования, а также для показа в
демонстрационном эксперименте использован стандартный токсикант бихромат калия,
который продолжительное время сохраняет первоначально внесенную концентрацию,
стабилен в растворах и относится к классу сильнотоксичных веществ[10 ]. Разбавленный
раствор бихромата калия получают, добавляя 1-2,5 мл маточного раствора (1 г K2Cr2O7 в
1 л дистиллированной воды) к 1 л контрольной воды.
1. А) Для эксперимента из исходного раствора (1 г/л) была приготовлена серия
разведений от 1 до 10 мг/л. В специальные планшеты с объемом камеры 10 мл в
контроль и соответствующие концентрации токсиканта были помещены ювенисы,
по одному в камеру. Эксперимент выполнялся в 10 повторностях. В первый час
экспозиции наблюдения за животными велись непрерывно, с 2 до 12ч – ежечасно,
далее – через 24ч экспозиции. Фиксировали нарушения фототаксиса, характера
движения, остановки движения, отсутствие реакции на прикосновение и гибель.
Наблюдения за животными в течение первых часов экспозиции позволили
установить пороговые концентрации, вызывающие изменения в поведении и
характере движения ракообразных, а также близкие к ним LC 0 или NOEC (no
observed effect concentration) – концентрации, не вызывающие токсического
эффекта [10 ].
В) Рассмотрели также влияние плотности посадки тест-организмов на чувствительность
биотеста.
Определение выживаемости рачков при увеличении числа тест-организмов
в том же объеме пробы.
Засекалось время гибели дафний. Количество живых дафний подсчитывалось визуально.
Живыми считают дафний, которые свободно передвигаются в толще воды или всплывают
со дна сосуда не позже, чем через 15 сек после его легкого встряхивания. Остальных
дафний считают погибшими.
Исследование
Исследована изменчивость биологических параметров лабораторной культуры D. magna
под влиянием различных токсикантов в условиях лабораторного культивирования. В
ходе эксперимента отслеживались
динамика смертности (выживаемости) и
продуктивности лабораторной культуры D. Magna, а также её двигательная активность.
1. Данные о движении ракообразных необходимы для моделирования процессов в
пресноводных экосистемах. Но, в первую очередь, измерение скорости движения
ракообразных используют для биотестрирования, биоиндикации. Так, немецкие ученые и
инженеры из Гамбурга сделали установку, с помощью которой можно проводить
мониторинг (постоянный контроль) качества воды.
Они воспользовались тем, что
дафнии при разной степени загрязнения перемещаются с разной скоростью. Выглядит эта
установка так: вода, качество которой надо определить, поступает в небольшую
прозрачную камеру, в которой живут дафнии. Цифровая видеокамера постоянно снимает
их и передает данные на компьютер. Специально разработанная программа позволяет
определить скорость движения дафний, расстояние между ними и т.д. Когда в воде
содержатся загрязняющие вещества, эти показатели изменяются. Для того, чтобы дафнии
жили в камере долго, их время от времени подкармливают одноклеточными водорослями
(хлореллой). Такая установка позволяет более оперативно определять моменты сброса в
водоем загрязняющих веществ, чем традиционные тесты на токсичность.
Из опыта с немецкой установкой мы знаем, что в чистой воде скорость дафний
приблизительно равна 35 мм/сек. [13].
У нас нет такой установки, поэтому двигательную активность
отслеживали очень
простым способом. Дафнию помещали в чашку Петри, под дном которой находился лист
бумаги. Считали количество клеток (1см ×1см) на листе бумаги,
по которым
перемещалась дафния в течение 3 минут. Животные из разных проб вели себя по
разному.
2. Для исследования изменения смертности и плодовитости дафний использовали
« МЕТОДИКУ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ВОДЫ И ВОДНЫХ ВЫТЯЖЕК ИЗ
ПОЧВ, ОСАДКОВ СТОЧНЫХ ВОД, ОТХОДОВ ПО СМЕРТНОСТИ И ИЗМЕНЕНИЮ
ПЛОДОВИТОСТИ ДАФНИИ», взятую в Федеральном реестре (ФР.1.39.2007.03222).
[16]. Методика основана на определении смертности и изменений в плодовитости дафний
(Daphnia magna Straus, Cladocera, Crustacea) при воздействии токсических веществ,
присутствующих в исследуемой водной среде, по сравнению с контрольной культурой в
пробах, не содержащих токсических веществ (контроль).
Острое токсическое действие растворов отдельных химических веществ, исследуемой
воды или водной вытяжки из почв, талой воды, осадков сточных вод и отходов на дафний
определяется по их смертности (летальности) за определенный период экспозиции
(выражается в гибели отравленного организма за короткие промежуток времени – от
нескольких секунд до 48 ч).
Критерием острой токсичности служит гибель 50 % и более дафний за 96 часов в
исследуемой воде при условии, что в контрольном эксперименте гибель не превышает 10
% (безвредная концентрация)
Хроническое токсическое действие растворов отдельных химических веществ
исследуемой воды или водной вытяжки из почв, талой воды, осадков сточных вод и
отходов на дафний определяется по смертности и изменению их плодовитости за период
до 24 суток в исследуемой воде по сравнению с контрольным экспериментом. Критерием
хронической токсичности служит гибель 20 % и более и (или) достоверное отклонение в
плодовитости из числа выживших тест-организмов по сравнению с контрольным
экспериментом.
Отбор пробы
Эксперимент 1. В качестве токсикантов использовали растворы солей тяжелых металлов:
бихромат калия (K2Cr2O7), сульфата меди (CuSO4×5H2O), сульфата кадмия
(CdSO4×8/3H2O), сульфата цинка (ZnSO4×7H2O) и ) в различных концентрациях
Эксперимент 2.
Было взято 4 пробы снега из разных участков территории села Горьковка:
1.
контрольная проба – водопроводная вода (контроль)
2.
лес возле села
(проба № 1).
2.
в 5 м от железнодорожного полотна (проба № 2),
3.
обочина автодороги при въезде в село, ул. Сибирская (проба № 3),
4.
проезжая часть около магазина «Росинка» по ул. Молодежная 7 (проба № 4),
5.
со школьного двора (проба № 5),
Пробу природной (талой) воды отбирают объемом до 1 л. До биотестирования возможно
хранение ее не более 6 часов при температуре 4 °С. Далее пробу фильтруют через
фильтровальную бумагу и заливают в емкости для биотестирования.
Проведение опыта.
Берут 3 сосуда для исследуемой воды каждой пробы и 3 сосуда для контрольной пробы,
не содержащей токсичных веществ. Наливают в них по 100 мл исследуемой воды и по 100
мл чистой воды для контроля. Исследуемую воду можно разбавить водой, не содержащей
токсичных веществ. Контрольную
воду готовят отстаиванием в течение 7 суток
водопроводной воды средней (не более 3,0 мг-экв./л) жесткости, проверяя pH (7,0-8,2),
температуру (20° С), содержание кислорода (не менее 2 мг/л).
В каждый сосуд
помещают по 10 особей дафний. Их переносят стеклянной трубкой диаметром 5-7 мм
сначала
в
сачок,
а
затем
в
сосуды,
погрузив
его
в
воду.
Оценка выживаемости дафний в присутствии токсикантов проводилась в сравнении
с контрольными пробами.
- При проведении эксперимента 1. в качестве токсикантов использовали растворы солей
тяжелых металлов: сульфата меди (CuSO4×5H2O), сульфата кадмия (CdSO4×8/3H2O),
сульфата цинка (ZnSO4×7H2O) и ) в различных концентрациях.
- В ходе эксперимента 2. использовали 5 проб: контрольную (водопроводная вода) и 4
пробы талой воды из снега с разных участков территории села Горьковка.
Наблюдение за ходом 1 эксперимента (острое через 24,48 или 96 часов). Дафний во
время эксперимента не кормят. По окончании эксперимента проводят учет выживших
дафний. Выжившими считаются дафнии, если они свободно передвигаются в толще воды
или всплывают со дна сосуда не позднее 15 с после его легкого покачивания.
Проведение подсчета. На основании полученных результатов в 3-х повторностях
рассчитывают среднее арифметическое количество выживших дафний в контроле и
опыте. Для расчета тест-параметра - процента гибели дафний в опыте по отношению к
контролю - используют формулу:
100x(Х1 - Х2)/Х1, где Х1 и Х2 - среднее арифметическое количество (экз.) выживших
дафний
в
контроле
и
опыте.
Проба воды оценивается как обладающая острой токсичностью, если за 24 ч.
биотестирования в ней гибнет 50% и более дафний по сравнению с контролем.
Если в течение опыта в контрольном варианте произошла гибель более 10% дафний, то
полученные результаты не учитывают, опыт повторяют, предварительно проверив
пригодность тест-объекта для биотестирования.
Острая токсичность выражается в гибели отравленного организма за короткий
промежуток времени – от нескольких секунд до 48 ч. Повторность была равна трем.
Подсчитывалась средняя арифметическая скорость гибели рачков в каждой пробе. Данные
заносились в таблицу. [14].
Наблюдение за ходом эксперимента 2. Хроническое токсическое действие растворов
отдельных химических веществ
исследуемой воды определяется по динамике
двигательной активности, смертности и изменению их плодовитости за период до 24
суток (14 суток) в исследуемой воде по сравнению с контрольным экспериментом. Кормят
дафний 1-2 раза в неделю дрожжевым кормом, 1 раз в день водорослями – хлореллой.
Критерием хронической токсичности служит гибель 20 % и более и (или) достоверное
отклонение в плодовитости из числа выживших тест-организмов по сравнению с
контрольным экспериментом.
Выводы:
1. Тест-объект Daphnia magna, выращенная в домашних условиях, вполне подходит для
проведения биотестирования, т. к. смертность за 24 часа под действием бихромата калия
приблизилась к 50%, что не противоречит литературным данным.
2. Выявлены пороговые концентрации токсичности исследуемого ряда металлов: – в
растворах, приготовленных на водопроводной воде, ионы меди - 0,1 мг/л, кадмия - 0,2
мг/л, хрома - 0,5 мг/л и цинка - 1,0 мг/л;
3. Дафнии чувствительны даже к небольшим концентрациям некоторых солей, например,
добавление солей меди в концентрации 0,01 мг/л вызывает замедление движений рачков,
они либо опускаются на дно, либо замирают у поверхностной плёнки воды
4. В качестве тест-реакции в анализе на острую токсичность используют смертность
рачков, а при установлении хронического токсического действия проводят наблюдения за
двигательной активностью дафний, а также изменением её выживаемости и плодовитости.
4. Токсическое действие на дафний уменьшается при увеличении количества рачков в
объеме тестируемой пробы. При увеличении числа тест-организмов в том же объеме
пробы выживаемость и плодовитость рачков в присутствии токсикантов возрастает.
5. Чувствительность биотеста на основе оценки выживаемости дафний увеличивается при
снижении плотности посадки рачков в тестируемую среду. Оптимальная плотность
посадки 10 рачков на 50 мл тестируемой воды.
6. По показателям двигательной активности, выживаемости и плодовитости (количества
молодых особей, живых и мертвых) планктонных ракообразных D. magna была оценена
степень загрязненности снега в селе Горьковка.
7. Убедились в том, что Daphnia magna можно использовать как тест-объект для
определения степени токсического действия неблагоприятных факторов среды,
потенциально опасных для живых организмов экосистем, в контролируемых
экспериментальных лабораторных или натурных условиях путем регистрации изменений
биологически значимых показателей исследуемых водных объектов с последующей
оценкой их состояния в соответствии с выбранным критерием токсичности.
Daphnia magna как объект биотестирования водной среды
Дементьева Светлана Владимировна
Россия, Тюменская область, Тюменский район, село Горьковка, муниципальное
образовательное учреждение Горьковская средняя общеобразовательная школа, 11 класс
План исследований
В настоящее время в связи с ростом крупных предприятий и увеличением
антропогенной нагрузки на окружающую среду все большее внимание начали уделять
экологии и в особенности состоянию водных объектов.
Существует множество способов определения степени загрязнения водных объектов:
химический анализ, биоиндикация и биотестирование. Каждый из методов имеет свои
преимущества.
Особую роль в оценке состояния окружающей среды играют биологические тесты. Это
связано с тем, что результаты химического анализа проводимого с помощью сложного
аналитического оборудования, во многих случаях не позволяет оценить истинную
опасность тех или иных загрязнителей на среду обитания, прогнозировать последствия их
воздействия на живые организмы. Многообразные загрязняющие вещества, попадая в
воду, могут претерпевать в ней различные превращения, усиливая при этом свое
токсическое действие. По этой причине оказались необходимы методы интегральной
оценки качества воды. Огромную роль при этом играют методы биотестирования и
биоиндикации.
Под биотестированием понимают приемы исследования, при которых о качестве среды,
факторах, действующих самостоятельно или в сочетании с другими, судят по
выживаемости, состоянию и поведению специально помещенных в эту среду организмов
– тест-объектов. Биоиндикация – родственный биотестированию прием, использующий
для этих целей организмы, обитающие в исследуемой среде. Главный критерий выбора
тест–объекта необходимо соблюдать определенные требования, среди которых
возможность фиксировать четкий, воспроизводимый и объективный отклик на
воздействие внешних факторов, чувствительность этого отклика на малые содержания
загрязнителей. Поэтому в качестве биотестов выбирают наиболее чувствительные к часто
встречающимся загрязнителям: бактерии, водоросли, высшие растения, пиявки, дафнии,
моллюски, рыбы и др. Показателем служит их выживаемость. Каждый из этих объектов
заслуживает внимания и имеет свои преимущества.
Объект нашего исследования - Daphnia magna Strauss (дафния магна)
Дафнии — один из стандартных объектов для тестирования токсичности водных
растворов .
Предмет исследования – изменение биологически значимых показателей исследуемого
тест-объекта при токсическом действии неблагоприятных факторов среды.
Цель работы: исследование действия токсичных веществ и загрязненных водных
сред на жизнедеятельность организмов на примере Daphnia magna в зависимости от
условий проведения эксперимента.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести контроль чувствительности дафний, выращенных в домашних условиях, к
"эталонному" токсиканту бихромату калия (K2Cr2O7). Определение пригодности
биообъекта для тестирования .
2. Изучить действие на тест–объект водной экосистемы – Daphnia magna различных
токсикантов в условиях лабораторного культивирования.
3. Выявить изменение биологических параметров: двигательной активности,
выживаемости и плодовитости Daphnia magna при воздействии на неё загрязняющих
веществ, содержащихся в пробах снега.
4. Оценить степень загрязнения снежного покрова на разных участках территории села
методом биотестирования.
Для реализации поставленных целей и задач исследовательской работы мы
использовали методы исследования:
1. Теоретический (изучение и анализ литературы, постановка целей и задач, освоение
методики и проведения исследований).
2. Экспериментальный (постановка опытов, проведение определение пригодности
тест-объекта для тестирования и биотестирования проб снега)
3. Эмпирический (наблюдения, описания и анализ результатов исследований)
Сроки проведения исследования: февраль – апрель
Место проведения исследования: кабинет биологии Горьковской СОШ
Гипотеза: если водное животное дафния чувствительно к загрязнению среды, то её
жизненные показатели будут изменяться
при действия токсичных веществ и
загрязненных водных сред, в этом случае её можно использовать, как тест-объект.
Материал и методика исследования
1.Культура дафний. Исходный материал приобрели в лаборатории биофака ТГУ.
2. Отбор снежных проб производился в период максимального влагозапаса перед началом
таяния снега – в начале марта на разных участках, которые не испытывают никакого
техногенного влияния крупных промышленных предприятий, а только оказываются в
зоне воздействия вредных выбросов автотранспорта, железной дороги
3. Исследование
изменчивости биологических параметров лабораторной культуры D.
magna под влиянием различных
токсикантов
в условиях
лабораторного
культивирования.
В
ходе эксперимента отслеживались
динамика смертности
(выживаемости) и продуктивности лабораторной культуры D. Magna, а также её
двигательная активность.
4. Для исследования изменения смертности и плодовитости дафний использовали
« МЕТОДИКУ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ВОДЫ И ВОДНЫХ ВЫТЯЖЕК ИЗ ПОЧВ, ОСАДКОВ СТОЧНЫХ
ВОД, ОТХОДОВ ПО СМЕРТНОСТИ И ИЗМЕНЕНИЮ ПЛОДОВИТОСТИ ДАФНИИ», взятую в Федеральном
реестре (ФР.1.39.2007.03222).
Острое токсическое действие растворов отдельных химических веществ, исследуемой
воды или водной вытяжки из почв, талой воды, осадков сточных вод и отходов на дафний
определяется по их смертности (летальности) за короткие промежуток времени – от
нескольких секунд до 48 -96 ч). Критерием острой токсичности служит гибель 50 % и
более дафний за 96 часов в исследуемой воде при условии, что в контрольном
эксперименте гибель не превышает 10 % (безвредная концентрация)
Хроническое токсическое действие растворов отдельных химических веществ
исследуемой воды определяется по динамике двигательной активности, смертности и
изменению их плодовитости за период до 24 суток (14 суток) в исследуемой воде по
сравнению с контрольным экспериментом.
Критерием хронической токсичности
служит гибель 20 % и более и (или) достоверное отклонение в плодовитости из числа
выживших тест-организмов по сравнению с контрольным экспериментом.
Наметили следующий ход работы:
1. Изучить литературу, Интернет-ресурсы по теме исследования.
2. Составление плана исследований
3. Проведение экспериментов.
4. Анализ и результаты исследований.
5. Оформление работы.
Анализ и результаты исследований
Чувствительность Daphnia magna Strauss к химическим препаратам
1. Чувствительность к бихромату калия.
Перед проведением биотестов проводился контроль чувствительности дафний к
"эталонному" токсиканту бихромату калия.
Выживаемость
дафний
в
растворе
K2Cr2O7
различных
концентраций.
Концентрация бихромата калия, составляла 1,50 мг/л. В течение 24 часов иммобилизовала
46,67 ± 3,33% дафний, взятых для эксперимента. Исходя из полученных результатов,
можно с уверенностью сказать, что культура дафний, выращенная нами в домашних
условиях, полностью подходит для проведения дальнейшего биотестирования.
Провели ещё один опыт в з-х вариантах: изменяли число дафний в пробе -2, 6, 18. При
увеличении числа тест-организмов в том же объеме пробы выживаемость рачков в
присутствии токсикантов возрастает, а смертность, как показатель токсичности,
снижается. При этом близкие значения выживаемости рачков наблюдаются в вариантах
опыта, в которых 3-кратному повышению концентрации токсиканта соответствует 3кратное увеличение плотности посадки. Этот факт указывает на то, что в определенных
условиях концентрация токсиканта и плотность посадки рачков могут рассматриваться
как взаимозаменяемые факторы при установлении дозы токсического воздействия на
данные тест-организмы. С учетом этих обстоятельств была принята как оптимальная
плотность посадки 10 рачков на 50 мл тестируемой воды.
Таблица 1. Влияние плотности посадки
на выживаемость дафний (в %) в среде с различными концентрациями
модельных
токсикантов. Объем среды – 50 мл, время экспонирования 48 часов.
Сравнение чувствительности тест-функций выживаемость дафний к тяжелым металлам,
показали, что в большинстве случаев при низких концентрациях металлов наблюдается
их гибель. При этом тест-организмы остаются живыми в течение двадцати двух часового
периода экспонирования при всех исследуемых концентрациях токсиканта. Снижение
выживаемости на 50% наблюдалось только при концентрации ионов кадмия 0,0125 мг/л
по завершению вторых суток эксперимента. Аналогичный эффект прослеживался в
опытах с ионами меди и бихроматом калия (таблица 2).
Таблица 2. Концентрации
(мг/л) токсикантов, вызывающие
смертность 50%
(LC50)да
фний
Концентрации
(мг/л), вызывающие
смертность 50% дафний (LC50)
Токсиканты
К2Сr2O7
1,0
Cu2+
Cd2+
Zn2+
0,025
0,012
0,250
Анализируя данные таблицы 3., сравнивая двигательную активность дафний в разных
пробах, мы сделали вывод о наибольшей токсичности снега в пробе 2. (в 5 м от железнодорожного полотна), примерно в равной степени загрязнен снег в пробах 3,4 (вдоль
автодороги по ул. Сибирской, ведущей в г. Тюмень и проезжая часть около магазина
«Росинка» по ул. Молодежная 7.), территории, которые испытывают большую
транспортную нагрузку. Меньшей степенью химической токсичности отличаются пробы
снега № 5.
Таким образом, мы попытались проследить влияние общей токсичности
снега, вызванной присутствием загрязнителей на двигательную активность Daphnia
magna. Активность тест-объекта уменьшается с увеличением загрязнения водной среды.
Полученные результаты доказывают, что снег на территории села загрязняется вредными
веществами, выбрасываемыми автотранспортом, но степень загрязнения не столь высока
(среднее и слабое загрязнение).
Количество
Вариант эксперимента
2 день
14 день
дафний
Контроль
(водопроводная вода)
Проба 1.
(с.Горьковка, лес)
Проба 2.
( в 5 м от железнодорожного полотна)
Проба 3.
(обочина автодороги при
въезде в село, ул.
Сибирская
Проба 4.
( проезжая часть около
магазина «Росинка» по
ул. Молодежная 7.)
Проба 5.
( со школьного двора)
9
67, 2 ±2, 7
64,8 ± 3,2
64,8 ± 3,6
45,9 ± 5,1
15,8 ± 2,9*
34,6 ± 2,2*
47,1 ± 2,8*
47,7 ± 2,4
46,2 ± 3,5*
48,3 ± 3,7
54,7 ± 2,8*
60,7 ± 3,9*
9
9
9
9
9
Таблица 3. Двигательная активность
Таблица 4. Плодовитость дафнии в условиях эксперимента
Вариант эксперимента
Количество
дафний
Контроль
(водопроводная вода)
30
Проба 1.
(с.Горьковка, лес)
30
Проба 2.
( в 5 м от железнодорожного полотна)
Проба 3.
(обочина автодороги
при въезде в село, ул.
Сибирская
Проба 4.
( проезжая часть около
магазина «Росинка» по
ул. Молодежная 7.)
Проба 5.
(со школьного двора)
30
30
30
30
Плодовитость
9 день
14 день
56,7 ± 1,8
143,0 ± 7,0
16 ± 1,6
89,3 ± 1,5
0
22,7 ± 1,5
0
18,3 ± 4.6
4,3± 6,8
32,2 ± 2.3
14,3 ± 2,9
110,7 ± 2,3
Анализируя полученные результаты по выживаемости и смертности Daphnia magna в ходе
эксперимента (таблица5.), можно сделать следующие выводы: наибольшей токсичностью
обладает снег в пробе 2, 3, чуть меньше загрязнен снег в пробе 4. Меньшей степенью
химической токсичности отличаются пробы снега №1, 5.
Таким образом, мы
попытались проследить влияние общей токсичности снега, вызванной присутствием
загрязнителей на выживаемость и смертность Daphnia magna.
Таблица 5. Выживаемость, смертность Daphnia magna в ходе эксперимента .
Вариант
эксперимента
6 день
14 день
Количество Выживаемость
Выживаемость
дафний
(ср. ариф. 3-х
(ср. ариф. 3-х
проб)
%смертности проб)
%смертности
Контроль
(водопроводная
вода)
30
10
0%
10 ± 0
0%
Проба 1.
(с.Горьковка, лес)
30
10
0%
9,7 ± 0,3
3%
30
10
0%
8,3 ± 0,9
16,6%
30
10
0%
8,3 ± 0,3
16,6%
30
10
0%
8,7 ± 0,9
13%
30
10
0%
9,3 ± 0,3
6%
Проба 2.
( в 5 м от железнодорожного полотна)
Проба 3.
(обочина
автодороги при
въезде в село, ул.
Сибирская
Проба 4.
( проезжая часть
около магазина
«Росинка» по ул.
Молодежная 7.)
Проба 5.
(со школьного
двора)
Выводы:
1. Тест-объект Daphnia magna, выращенная в домашних условиях, вполне подходит для
проведения биотестирования, т. к. смертность за 24 часа под действием бихромата калия
приблизилась к 50%, что не противоречит литературным данным.
2. Выявлены пороговые концентрации токсичности исследуемого ряда металлов: – в
растворах, приготовленных на водопроводной воде, ионы меди - 0,1 мг/л, кадмия - 0,2
мг/л, хрома - 0,5 мг/л и цинка - 1,0 мг/л;
3. Дафнии чувствительны даже к небольшим концентрациям некоторых солей, например,
добавление солей меди в концентрации 0,01 мг/л вызывает замедление движений рачков,
они либо опускаются на дно, либо замирают у поверхностной плёнки воды
4. В качестве тест-реакции в анализе на острую токсичность используют смертность
рачков, а при установлении хронического токсического действия проводят наблюдения за
двигательной активностью дафний, а также изменением её выживаемости и плодовитости.
4. Токсическое действие на дафний уменьшается при увеличении количества рачков в
объеме тестируемой пробы. При увеличении числа тест-организмов в том же объеме
пробы выживаемость и плодовитость рачков в присутствии токсикантов возрастает.
5. Чувствительность биотеста на основе оценки выживаемости дафний увеличивается при
снижении плотности посадки рачков в тестируемую среду.
посадки 10 рачков на 50 мл тестируемой воды.
Оптимальная плотность
6. По показателям двигательной активности, выживаемости и плодовитости (количества
молодых особей, живых и мертвых) планктонных ракообразных D. magna была оценена
степень загрязненности снега в селе Горьковка.
7. Убедились в том, что Daphnia magna можно использовать как тест-объект для
определения степени токсического действия неблагоприятных факторов среды,
потенциально опасных для живых организмов экосистем, в контролируемых
экспериментальных лабораторных или натурных условиях путем регистрации изменений
биологически значимых показателей исследуемых водных объектов с последующей
оценкой их состояния в соответствии с выбранным критерием токсичности.
Заключение
В последнее время экологические загрязнения среды стали очень актуальной проблемой.
Изучение дафний имеет крайне важное значение для экологических исследований,
поскольку они являются ключевым видом для многих пресноводных экосистем и могут
служить своеобразным индикатором состояния среды. Их популяции, населяющие пруды
и озера, чувствительны к современным токсическим веществам и окружающей среде, и,
следовательно, могут быть использованы для оценки экологического ущерба от
изменений в окружающей среде.
Наша работа может стать частью более масштабного проекта по применению
пресноводных планктонных ракообразных в исследованиях с применением
биотестирования, биоиндикации В перспективе результаты этих исследований могут
быть использованы не только в научной деятельности, но и в народнохозяйственных
целях.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ивлева И. В. Биологические основы и методы массового культивирования кормовых
беспозвоночных. — М.: «Наука», 1969. ,
2. Keonho Kim, Alexey A Kotov, and Derek J. Taylor. Hormonal induction of undescribed
males resolves cryptic species of cladocerans//Proceedings of the Royal Society B: Biological
Sciences. 2006 January 22; 273(1583): 141—147.
3. Макрушин А. В., Лянгузова И. В. Оболочка пропагул беспозвоночных и растений:
избирательная проницаемость и барьерные свойства // Журнал общей биологии. — 2006.
— Т. 67. — № 2. — С. 120—126
4. Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988.
5. Методы биотестирования качества водной среды. М., МГУ, 1989.
6. Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02–90. М.: 1991.
7. Филенко О.Ф., Дмитриева А.Г. Биотестирование как способ контроля токсичности
загрязняемой водной среды // Приборы и системы управления. 1999. № 1.
8. Kolkwitz R., Marsson M. Ökologie der pflanzlichen Saprobien. Berichte der deutschen
botanischen Geselschaft, 1908, 26a, 26.
9. Макрушин А.В. Биологический анализ качества вод. Л.: 1974 (две брошюры)
10. Фомина Е.С., Трошина Е.А. Биоиндикация и биотестирование как методы определения
загрязненности водных объектов // Сборник статей V Международной научной
конференции студентов и аспирантов «Охрана окружающей среды и рациональное
использование природных ресурсов», 12-14 апреля 2006г., Донецк
11. Летние школьные практики по пресноводной гидробиологии. Методическое пособие.
М.: Добросвет, МЦНМО, 1999.– 288 с.
12. http://www.newchemistry.ru/printletter.php?n_id=2694 Биологические методы
экомониторинга.
13. http://kriorazum.ru/livescienceru/shampun/shampun.pdf
14. http://docload.spb.ru/Basesdoc/48/48871/index.htm Методическое руководство
15. www.nauka.relis.ru
16. http://gran.baikal.net/water4life/water_daphnia.shtml
17. Найдено животное с самым большим количеством генов — Lenta.ru
18. http://ria.ru/science/20110203/330058927.html МОСКВА, 3 фев 2011- РИА Новости