ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОСТИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ТОЛСТОЙ КИШКИ НА ОСНОВЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОФЕНОТИПА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
advertisement
На правах рукописи Корсакова Нина Анатольевна ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОСТИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ТОЛСТОЙ КИШКИ НА ОСНОВЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОФЕНОТИПА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК 14.00.15. – патологическая анатомия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2007 Работа выполнена в Московском областном научно-исследовательском клиническом институте им. М.Ф.Владимирского (МОНИКИ) Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук Ирина Александровна Казанцева Лариса Евсеевна Гуревич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук, профессор, Леонард Леонидович Капуллер Юрий Георгиевич Пархоменко Ведущая организация: Кафедра патологической анатомии Российского Университета Дружбы Народов Защита состоится «-----» 2007г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.001.004.01 ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418 Москва, ул.Цюрупы, д.3 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РУ НИИ морфологии человека РАМН Автореферат разослан «____»__________2007 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Лилия Петровна Михайлова 2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АК аденокарцинома(ы) ВД АК высокодифференцированная аденокарцинома Е-кад Е-кадхерин ИГХ иммуногистохимия; иммуногистохимический НД АК низкодифференцированная аденокарпцинома ТК толстая кишка УД АК умереннодифференцированная аденокарцинома β-кат β-катенин СК цитокератин(ы) MUC муцин(ы) 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Проблема морфологической диагностики рака толстой кишки в настоящее время имеет особую актуальность, что связано с постоянным ростом заболеваемости раком этой локализации. В большинстве экономически развитых стран Европы и Северной Америки частота заболеваемости колоректальным раком среди злокачественных новообразований занимает второе-третье место у лиц обоего пола [ P.Buckhaults et al, 2001 ]. В России колоректальный рак в общей структуре онкозаболеваемости в 1999г. занял 5 место и составил 9,3%. Показатель неблагоприятного прогноза данного заболевания, «груз заболеваемости», т.е. соотношение показателей смертности к заболеваемости, по данным 1999 г. в России достиг 0,72 при раке ободочной и 0,76 при раке прямой кишки [Е.М.Аксель, Т.И.Ушакова, 2001; В.И. Кныш., 1997 ]. Высокий уровень смертности во многом связан с поздней диагностикой, что и определяет низкую эффективность лечения. Известно, что значительный процент опухолей выявляют в инкурабельном состоянии, поэтому 90% пациентов умирает от рецидива заболевания [Ю.И.Патютко, И.В.Сайгадак, 2001]. В связи с этим очень важной проблемой является изучение факторов прогноза, которые непосредственно влияют на выживаемость больных. Основным критерием степени злокачественности в патоморфологической диагностике аденокарцином толстой кишки согласно «Международной Гистологической Классификации опухолей кишечника» (ВОЗ, Женева, 2000) является степень дифференцировки опухолевых клеток. Подобное подразделение опухолей по мнению большинства исследователей достаточно субъективно и не может характеризовать истинный злокачественный потенциал новообразования [ А.Г. Перевощиков, 1997; C.C.Compton. et al, 2000; C.C.Compton, 2000; С.С. Compton et al, 1999]. Для того, чтобы оценить инвазивность опухоли и судить о ее прогнозе недостаточно рутинного гистологического исследования. Особое значение имеет изучение экспрессии ряда клеточных маркеров, участвующих в механизмах канцерогенеза, таких как онкобелки, протеины, связанные с апоптозом, межклеточной адгезией и пролиферацией. С этих позиций исследование иммунофенотипа клеток эпителиальных опухолей толстой кишки имеет большое практическое значение, оно позволяет уточнить диагноз и более объективно судить о прогнозе заболевания. Проведенное нами комплексное гистологическое и иммуногистохимическое исследование факторов, участвующих в механизмах канцерогенеза и опухолевой 4 прогрессии с определением иммунофенотипа клеток разных гистологических вариантов опухолей толстой кишки направлено на совершенствование морфологической диагностики предраковых заболеваний и рака толстой кишки, а также уточнение прогноза заболевания, что может быть использовано при разработке оптимальной тактики их лечения. Цель исследования: На основе иммунофенотипирования клеток опухоли установить морфологические критерии дифференциальной диагностики и прогноза эпителиальных опухолей толстой кишки. Задачи исследования 1. Сравнительное изучение различных тканеспецифических маркеров, исследование особенностей экспрессии их в клетках эпителиальных опухолей толстой кишки разной степени дифференцировки. 2. Исследование экспрессии молекул клеточной адгезии в различных гистологических вариантах опухолей толстой кишки. 3. Изучение особенностей экспрессии в опухолевых клетках протеинов, участвующих в регуляции процессов апоптоза и клеточной пролиферации ( р53, ВАХ, Bcl-X и Ki 67). 4. Выявление клинико-морфологических корреляций при раке толстой кишки с учетом фенотипической характеристики опухолевых клеток. Научная новизна исследования В работе впервые выполнено комплексное гистологическое и иммуногистохимическое исследование клеток доброкачественных и злокачественных эпителиальных новообразований толстой кишки с использованием специально разработанной панели молекулярно-биологических маркеров – антител. Осуществлен сравнительный анализ фенотипических особенностей клеток нормальной слизистой и новообразований толстой кишки – аденом и аденокарцином. Показано, что при изменении клеточной дифференцировки и инвазивных свойств аденокарцином менялся иммунофенотип клеток опухолей. На основе анализа результатов исследования иммунофенотипа опухолевых клеток проведена оценка биологического потенциала опухолей толстой кишки. В работе выявлены существенные различия в интенсивности и локализации экспрессии тканеспецифических протеинов (цитокератинов 19, 20 типа и муцинов 1, 2 типа), а также молекул межклеточной адгезии (Е-кадхерина, β-катенина и CD44H) и протеинов регуляторов клеточного цикла (ВАХ и Bcl-X, р53, Ki67) в клетках тубуло-ворсинчатых аденом и аденокарцином толстой кишки в зависимости от степени дифференцировки и 5 клинической стадии заболевания. Показано, что при снижении степени дифференцировки и возрастании инвазивного потенциала опухолей интенсивность экспрессии антигенов, характерных для нормального эпителия толстой кишки, цитокератинов 19 и 20, муцина 2 типа в цитоплазме опухолевых клеток снижается, а муцина 1 типа возрастает. Для низкодифференцированных аденокарцином с высоким потенциалом злокачественности было свойственно появление аномальных типов экспрессии молекул межклеточной адгезии Е-кадхерина, β-катенина и СD44H. Показано, что следствием нарушения дифференцировки клеток является и изменение локализации, а также и интенсивности экспрессии в клетках злокачественных опухолей протеинов-регуляторов апоптоза ВАХ и Bcl-X. Выявлено, что сверхэкспрессия белка р53 свидетельствует о неблагоприятном прогнозе течения заболевания. Уровень пролиферативной активности эпителиальных опухолей толстой кишки варьирует в широких пределах и, по нашим данным, индекс пролиферации Ki 67 не может служить безусловным признаком злокачественного потенциала опухолей этого типа. Полученные результаты могут быть использованы для диагностики и прогнозирования новообразований толстой кишки, а также для разработки более эффективных схем их терапии. Теоретическая и практическая значимость работы В работе показаны различные молекулярно-клеточные механизмы, лежащие в основе злокачественной трансформации клеток эпителиальных опухолей толстой кишки. Установлены иммуногистохимические маркеры, совокупность которых позволяет проводить дифференциальную диагностику этих новообразований. Полученные данные могут быть использованы для более точной оценки инвазивного потенциала и прогноза данной группы опухолей. Результаты работы могут быть использованы для дифференциальной диагностики в практической деятельности патологоанатомических отделений, в работе отделений колопроктологии, онкологии, а также для научно-исследовательских разработок на кафедрах и в научно-исследовательских институтах. Структура диссертации Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, собственных результатов, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и списка испльзованной литературы. Работа иллюстрирована 37 таблицами, 43 микрофотографиями, 6 графиками. 6 Апробация работы Результаты работы доложены на IX научной конференции «Новые направления и разработки в онкоморфологии», посвященной 75-летнему юбилею академика РАМН, профессора Ю.Н. Соловьева (Москва, клинической 2003); межотделенческой конференции в МОНИКИ (октябрь, 2006 г.); межлабораторной конфереции ГУ НИИ Морфологии человека РАМН (февраль, 2007 г.). ХАРАКТЕРИСТИКА МАТЕРИАЛА И МЕТОДОВ В работе был использован операционный и аутопсийный материал эпителиальных опухолей толстой кишки от 71 пациента, из них 5 – тубуло-ворсинчатые аденомы, 66 аденокарциномы различной степени дифференцировки. АК толстой кишки были выявлены у 66 пациентов, из которых 30 случаев (45,5%) были отнесены ко II клинической стадии, 28 (42,5%) – к III, а 8 (12%) – к IV стадии. В соответствии с гистологическим строением в 13 наблюдениях (20%) установлена высокая степень дифференцировки, в 44 (66%) – умеренная степень, а в 9 (14%) – низкая степень дифференцировки опухолевых клеток. В качестве контроля была исследована внеопухолевая слизистая ТК, которая была получена при радикальной резекции фрагмента кишечника с опухолью. Материал фиксировали в 10% растворе формалина, забуференном по Лилли при рН-7,4, затем заливали в парафин по обычной методике. Серийные срезы толщиной 5 мкм депарафинировали по стандартной схеме и окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимический метод ИГХ исследование проводили в соответствии со стандартным протоколом. Был использован набор маркеров, приведенный в таблице 1. Эти ИГХ маркеры (антитела) в соответствии с поставленными задачами разделили на 3 группы: 1 группа – тканеспецифические антитела, использованные для фенотипирования клеток опухолей; 2 группа – антитела к молекулам межклеточной адегезии; 3 группа – антитела к протеинам, регулирующим клеточный цикл. Для ИГХ исследования ткани фиксировали в 10%-ном забуференном формалине (рН 7,2), проводили по спиртам и ксилолам, заливали в парафин. Использовали парафин с температурой плавления 54 С (Германия). 7 Затем с помощью одноразовых лезвий марки R35 готовили серийные парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм и наносили их на стекла с адгезивным покрытием (полилизин), депарафинировали по стандартному протоколу. Далее срезы по 5 минут промывали в деионизированной дистиллированной воде и фосфатном буфере (рН-7,4). Исследование проводили в соответствии с методикой C.R.Taylor., R.Cote., [1994] и L.A.Sternberger. [1979]. Предварительная обработка срезов производилась по методу восстановления антигенных детерминант ткани по методике S-R.Shi и соавт. [1997] с помощью предварительной обработки срезов, погруженных в цитратный буфер (рН6,0) в микроволновой печи при мощности 690 Вт 2 раза по 5 минут. Таблица 1 Характеристика антител. Антитела Клон Развед. Фирма Дифференциально-диагностические 1 Карциноэмбриональный антиген (КЭА) кроличьи Readу to use DAKO 2 Эпителиально-мембранный антиген (ЭМА) Е29/ЕР1 « « 3 Цитокератины широкого спектра (А1/А3) АЕ1/АЕ3 « « 4 Цитокератин 19 RCK 108 1:100 « 5 Цитокератин 20 Ks 20.8 Readу to use « 6 Муцин 1 типа Ма695 1:100 « 7 Муцин 2 типа Сср58 1:200 Novocastra Адгезивные молекулы 8 Е-кадхерин 36В5 1:50 Novocastra 9 β-катенин 17С2 1:200 « 10 CD 44 F 10-44-2 1:50 « Регуляторные протеины 11 Ki 67 B 56 1:10 Bioscienses 12 p 53 DO-7 1:100 DAKO 13 BAX Кроличьи, 1:50 « 1:50 « A 3533 14 Bcl X Кроличьи, A 3535 Затем срезы охлаждали 20 минут при комнатной температуре, слегка подсушивали и на них наносили первичные антитела. Инкубация с первичными антителами составляла 8 30 минут при комнатной температуре, затем 12 часов при 4 С. Использовались позитивные и негативные контроли – иммунные и неиммунные сыворотки. Срезы тщательно отмывали в буфере, подсушивали, затем на них наносили систему En Vision (anti-mouse и anti-rabbit, фирмы DAKO, Дания) или универсальный LSAB System kit (фирмы DAKO, Дания). При использовании одноступенчатой системы En Vision реактив наносился на срезы на 30-40 минут. При использовании двуступенчатого универсального авидин-стрептавидинового комплекса на срезы на 30 минут наносились вторичные антитела, которые затем промывались забуференным физиологическим раствором, а затем еще на 30 минут – пероксидазный комплекс. После каждой инкубации срезы тщательно отмывали, подсушивали вокруг, затем, для визуализации реакции, на них наносили DAB +(3,3 диаминобензидин) или АЕС (3амино-9этилкарбазол (фирмы что DAKO), позволяло получать соответственно специфическую коричневую или красную окраску. Интенсивность ИГХ реакции в каждом препарате контролировалась под микроскопом: по достижении необходимой интенсивности окрашивания срезы отмывали в дистиллированной воде, после чего в течение 2-5 минут докрашивали гематоксилином Майера, снова промывали и погружали в проточную воду, в которую для получения щелочной среды добавляли несколько капель нашатырного спирта. После того, как срезы приобретали голубой оттенок, стекла извлекали, обезвоживали в батарее спиртов и ксилолов по стандартной схеме, заключали в бальзам и исследовали под микроскопом. Системы оценки экспрессии различных ИГХ маркеров 1. Интенсивность пероксидазной метки для каждого маркера оценивали полуколичественным методом – число позитивных на 100 учтенных опухолевых клеток. Параллельно оценивали интенсивность окрашивания: + - слабое, ++ - умеренновыраженное, +++ - интенсивное. Разработанная система оценки экспрессии тканеспецифических антигенов, адгезивных молекул и протеинов ВАХ и Bcl-X описана при изложении соответствующего материала. Определение индексов пролиферации Ki 67, а также экспрессии протеина р 53 в ядрах клеток вычислялось как среднее от числа меченных ядер на 100 учтенных ядер ( при учете 500-1000 опухолевых клеток). 9 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование гистогенеза, биологического потенциала и инвазивных свойств эпителиальных опухолей толстой кишки проводилось на основании гистологического исследования в соответствии с классификацией эпителиальных новообразований толстой кишки (ВОЗ, 2000), а также молекулярно-генетических особенностей клеток новообразований. Исследование фенотипа клеток АК Исследовано 5 тубуло-ворсинчатых аденом с признаками дисплазии эпителия желез слабой и умеренной степени. Аденокарциномы ТК в зависимости от выраженности железистых структур, а также от клеточного и ядерного полиморфизма делят на высоко-, умеренно- и низкодифференцированные опухоли. Однако подобное разделение является в определенной степени условным и не дает полной информации об инвазивном потенциале клеток АК. [ А.Г. Перевощиков, 1997] Таблица 2. Распределение аденокарцином толстой кишки на группы по степени дифференцировки и на основании клинической стадии заболевания. Стадия Аденокарциномы Всего опухолевого развития T3N0M0 высокодифференцированные 8 11 61% 9 II T4N0M0 T3N1M0 III T4N1M0 умереннодифференцированные 69% 1 8% низкодифференцированные 0 25% 20 45% 9 20% 1 2 7 1 16% 11% 4 8% 31% 7 18 16% 41% 2 1 4 3 3M0 8% 9% 33% T3-4N1-3M1 0 6 22% T3-4N2- IV 45,5% 11% 15% 1 11% 1 30 67% 28 42,5% 6 2 8 14% 22% 12% Всего 13 44 9 наблюдений 20% 66% 14% 66 Клинически в соответствии с Международной классификацией по системе TNM АК ТК были разделены на 4 группы, в которой Т-степень инвазии, N-метастазы в 10 регионарные лимфатические узлы и М-отдаленные метастазы [В.Л.Черкес, 2001; C.C.Compton, 2000]. Всего было исследовано 66 АК ТК. Самую многочисленную группу опухолей составили АК умеренной степени дифференцировки – 66% (44 из 66) ( таблица.2). Характерно, что большинство ВД АК ТК в (69% случаев, 9 из 13) выявлялись во II стадии, их не было в IV клинической стадии, а большинство НД АК (89% наблюдений, 8 из 9) выявлялись в поздних стадиях - III и IV. При сравнительной клинико-морфологической оценке АК ТК была выявлена обратная корреляция между такими параметрами опухолевой прогрессии, как степень дифференцировки и клиническая стадия заболевания Исследование экспрессии тканеспецифических маркеров в клетках эпителиальных опухолей ТК В клетках исследованных эпителиальных опухолей ТК (ТВА и АК ТК) наблюдалась выраженная экспрессия цитокератинов широкого спектра в цитоплазме, канцеро-эмбрионального и эпителиально-мембранного антигенов в просвете желез, в цитоплазме и на мембране клеток. Экспрессия цитокератинов 19 и 20. Цитокератины 19 и 20 типа относятся к промежуточным филаментам и составляют структурную основу эпителиальной клетки [P.A Coulombe et al, 2002]. СК 20 в норме выявляется в эпителиоцитах слизистой тонкой и толстой кишки и является маркером зрелых энтероцитов [ P.Tamboli et al, 2002 ]. Цитокератин 19 выявляется в более широком спектре тканей: в многослойном плоском, протоковом и железистом эпителии [R.Moll et al, 1982]. В результате проведенного исследования было выявлено, что в эпителии нормальной слизистой ТК экспрессия цитокератинов имела некоторые топографические особенности. СК 20 выявлялся преимущественно в клетках апикальных отделов крипт, тогда как СК 19 отмечался в эпителиальных клетках вне зависимости от зональной принадлежности крипты, хотя реакция в поверхностных участках слизистой ТК была более интенсивной. В клетках ТВА экспрессия исследуемых цитокератинов была достаточно равномерной, интенсивной и обнаруживалась как в поверхностных, так и в центральных отделах опухолей. В клетках АК ТК отмечалась неоднородность экспрессии СК 19, которая отличалась и по интенсивности, и по локализации в клетке. В связи с этим была разработана система оценки экспрессии СК 19: равномерная экспрессия более, чем в 90% клеток - 1 балл; цитоплазматическая экспрессия более, чем в 50% клеток - 2 балла; цитоплазматическая экспрессия менее, чем в 50% клеток - 3 балла. 11 Нами было выявлено, что при уменьшении степени дифференцировки опухолей наблюдалось уменьшение интенсивности экспрессии СК 19. В группе ВД АК интенсивная иммунореактивность к СК 19, которая отмечалась в нормальной неповрежденной слизистой ТК, была обнаружена в 43% ( 6 из 14) случаев, в группе УД АК количество наблюдений с выраженной экспрессией СК 19 уменьшилось в полтора раза (35% - 11 из 31), а в группе НД АК – в 3 раза (14% - 1 из 7) (рис.1). Экспрессия СК 20 в АК ТК также была неравномерной, но выявлялась как в центральных, так и периферических участках опухолей. В связи с этим оценка иммунореактивности СК 20 проводилась с учетом следующих критериев: цитоплазматическая экспрессия более, чем в 70% опухолевых клеток - 1 балл; цитоплазматическая экспрессия не менее, чем в 50% клеток - 2 балла; цитоплазматическая экспрессия менее, чем в 30% клеток - 3 балла. В группе ВД АК экспрессия СК 20 была интенсивной (1 балл) в клетках 11% (1 из 9) АК, в клетках УД АК этот показатель соответствовал 10% (3 из 29) случаев, в НД АК данный тип экспрессии отсутствовал. Итак, было обнаружено, что при снижении степени дифференцировки опухолевых клеток уменьшается процент позитивных клеток, т.е. содержания СК 19 и 20 в опухолевой ткани, тогда как характерной закономерности в экспрессии протеинов в клетках эпителиальных опухолей ТК в зависимости от клинической стадии выявлено не было. 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% цитокератин 20 ТВА ВД АК УД АК НД АК цитокератин 19 Рис 1. Зависимость гиперэкспрессии цитокератинов от степени дифференцировки клеток 12 Экспрессия муцинов 1 и 2 типа в клетках эпителиальных опухолей ТК Муцины – семейство высокомолекулярных гликопротеинов, которые выявляются в железистом эпителии и являются одним из основных компонентов слизи в респираторном, пищеварительном и урогенитальном тракте, выполняя защитную функцию [J.Perez-Vilar et al, 1999]. Муцин 2 типа относится к секреторным муцинам и в норме секретируется в бокаловидных клетках кишечника [A.Velcich, 1997], тогда как муцин 1 типа появляется только при дисплазии эпителия слизистой, и в клетках нормальной слизистой толстой кишки не выявляется [C Carrato et al, 1994]. В клетках ТВА отмечалась выраженная экспрессия MUC2 в поверхностных и в центральных отделах опухоли, тогда как иммунореактивности к MUC1 выявлено не было. Шкала полуколичественной балльной оценки экспрессии муцинов 1 и 2 типов разрабатывались нами с учетом экспрессии протеинов в клетках нормальной слизистой, в связи с чем они представляют собой противоположные последовательности. Оценка экспрессии MUC1: отсутствие экспрессии (как в норме) - 0 баллов; экспрессия локализовалась в просвете менее 50% опухолевых желез - 1 балл; экспрессия локализовалась в просвете более 50% опухолевых желез - 2 балла; экспрессия локализовалась в просвете желез и цитоплазме менее, чем в 50% опухолевых клеток - 3 балла; в просвете желез и цитоплазме более, чем в 50% опухолевых клеток - 4 балла. В ткани АК ТК экспрессия MUC1 была гетерогенной: выявлялась в слизистом содержимом просвета желез, на апикальной поверхности мембран железистых клеток и/или в цитоплазме опухолевых клеток. В зависимости от клинической стадии опухоли ТК отмечалось тенденция к увеличению накопления MUC1 в тканях АК ТК: во II стадии в 17% (3 из 18) случаев выявлялась экспрессия в цитоплазме опухолевых клеток, в III стадии - в 35% (7 из 20) случаев, в IV стадии число позитивных случаев увеличивалось до 43% (3 из 7) случаев. Оценка экспрессии MUC2 в клетках АК ТК: антиген экспрессировали более 30% клеток опухоли - 1 балл; антиген экспрессировали 10-30% клеток - 2 балла; антиген экспрессировали менее 10% клеток - 3 балла; единичные клетки, не более 3% - 4 балла; В 52% (14 из 27) АК ТК II клинической стадии интенсивность экспрессии MUC2 была 1-2 балла, в III стадии - 48% (12 из 25), в IV - 37,5% (3 из 8) случаев. В результате дифференцировки исследования опухолей и было показано, увеличении что при клинической снижении стадии степени заболевания 13 интенсивность экспрессии муцина 2, в норме выявляющегося в бокаловидных клетках слизистой ТК, уменьшается, а муцина 1 - увеличивается. Исследование адгезивных свойств клеток эпителиальных опухолей ТК В процессе эмбрионального развития и гистогенеза тканевых структур важная роль принадлежит межклеточным контактам, которые осуществляются при помощи ряда адгезивных факторов. Аномалии межклеточных контактов в опухолевой ткани могут стать пусковым механизмом инвазии и опухолевой прогрессии. Экспрессия Е-кадхерина Е-кадхерин – адгезивная молекула, характерная для клеток эпителия, в том числе, слизистой кишечника [T.Omelchenko et al, 2001]. В неизмененном эпителии слизистой ТК Е-кадхерин выявлялся в 100% клеток в виде равномерного мембранного окрашивания. В опухолевой ткани реакция с антителами к Е-кад имела ряд особенностей. Поэтому анализ производился с учетом количества позитивных клеток и типа экспрессии молекул. Нами были выделены следующие типы иммунореативности к Е-кад.: 1) мембранный, нормальный, тип экспрессии с равномерным распределением по мембране; 2) мембранно-редуцированный тип экспрессии при распределении иммунореактивности на отдельных участках клеток; 3) цитоплазматический тип – равномерное распределение экспрессии в цитоплазме; цитоплазматического типов 4) гетерогенный экспрессии; 5) тип – сочетание отсутствие мембранного и иммунореактивности. В соответствии с интенсивностью реакции и локализацией экспрессии Е-кад была разработана шкала оценки: 1 балл – нормальный, мембранный тип экспрессии в 100% клеток; 2 балла - цитоплазматический и гетерогенный типы экспрессии в 100% клеток; 3 балла - редуцированный мембранный, диффузный цитоплазматический и гетерогенный типы в менее 50% клеток. В клетках исследованных нами ТВА экспрессия Е-кад соответствовала 1 баллу, т.е. была мембранной, равномерной по интенсивности, аналогичной экспрессии прилежащей к опухоли непораженной слизистой ТК. По типу экспрессии Е-кад все исследованные опухоли толстой кишки были разделены на 2 большие группы: с нормальной, мембранной, экспрессией и с аномальной (цитоплазматической, гетерогенной и мембранно-редуцированной) экспрессией этих адгезивных молекул в клетках. В зависимости от клинической стадии опухоли доля клеток с мембранной экспрессией снижался. В клетках ТВА мембранная экспрессия Е-кад выявлялась в 100% случаев, в АК II стадии количество случаев с нормальной экспрессией 14 Е-кад соответствовало уже 30%, в АК III стадии – 8%, а в IV стадии – мембранный тип экспрессии не отмечался вообще. Напротив, аномальная экспрессия Е-кад в клетках ТВА отсутствовала, в АК II стадии отмечалась в 70% случаев, в АК III стадии - в 89%, а в АК IV стадии – в 100%. При снижении степени дифференцировки опухолевых клеток также меняется характер экспрессии Е-кад. Интенсивная мембранная реакция Е-кад в 100% случаев отмечалась в клетках ТВА, в 54% случаев – в клетках ВД АК, в 11% случаев – УД АК, а в клетках НД АК экспрессия Е-кад была аномальной. Снижение степени дифференцировки эпителиальных опухолей ТК и возрастание их инвазивного потенциала сопровождалось уменьшением, а также изменением типа экспрессии Е-кадхерина в опухолевых клетках. Очевидно, что аномальная экспрессия Екадхерина в клетках АК ТК, которая является следствием клеточных мутаций, ведет к изменению клеточной дифференцировки и способствует прогрессированию опухолей. Экспрессия β-катенина. β-катенин – это цитоплазматический протеин, который, связываясь с Е-кад, обеспечивает стабильные межклеточные адгезивные связи [N.A.Chitaev et al, 1998; M.F.McEntee et al, 1999 ]. В слизистой толстой кишки β-катенин равномерно выявлялся на клеточной мембране и в цитоплазме клеток поверхностных и базальных отделов крипт. Во всех исследованных нами эпителиальных опухолях ТК отмечалась экспрессия β-кат в подавляющем большинстве клеток, которая варьировала в зависимости от локализации молекул в клетке. Наблюдались следующие типы экспрессии β-кат: А). нормальный - мембранный - экспрессия на поверхности аномальные типы экспрессии: 1) цитоплазматический клеточной мембраны, Б). - локализация в цитоплазме клеток; 2) гетерогенный - сочетание мембранного и цитоплазматического типов; 3) ядерный – экспрессия протеина в ядре. В неповрежденной слизистой ТК и в клетках ТВА выявлялся мембранный и цитоплазматический типы экспрессии. В 3 из 5 случаев (60%) ТВА отмечалась гетерогенная экспрессия к β-кат, представленная и мембранным, и цитоплазматическим типами. В результате проведенного исследования было установлено, что β-кат может выявляться в различных клеточных структурах: на мембране, в цитоплазме, а также в ядре опухолевых клеток. При этом мембранный, а также цитоплазматический типы экспрессии, помимо АК ТК, были обнаружены в эпителии слизистой ТК и ТВА, тогда как ядерный тип экспрессии проявлялся только в клетках АК ТК, в основном, в III-IV клинических стадиях опухолей. Характерно также, что ядерный тип экспрессии чаще выявлялся в 15 участках инвазивного роста. В солидных участках НД АК экспрессия этих молекул также была ядерной. Экспрессия CD44H. CD44H – трансмембранный гликопротеин, участвующий в межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействиях [P.Herrlich et al, 1995; H Gorham, 1996]. В нормальной слизистой ТК экспрессия CD44H отмечалась в эпителии базальных отделов крипт ТК на поверхности клеточных мембран. Однако в ткани опухолей ТК иммунореактивность CD44H также имела различную локализацию. В связи с этим были предложены следующие критерии оценки: апикальный мембранный тип – мембранная экспрессия, преимущественно в апикальной части клетки; базальный и базолатеральный типы – мембранная экспрессия, преимущественно в базальных и базолатеральных отделах клеток; мембранный равномерный тип равномерная экспрессия по всей поверхности мембраны клеток; цитоплазматический тип – распределение молекул в цитоплазме клеток ; отсутствие экспрессии молекул. Установлено, что в зависимости от степени дифференцировки опухоли и стадии опухолевого процесса экспрессия CD44Н имела различную интенсивность и локализацию в клетке. В клетках ТВА ТК и части ВД АК отмечалась выраженная равномерная базолатеральная и базальная экспрессия адгезивных молекул в опухолевых клетках, тогда как в низкодифференцированных (87,5%) и в ряде умереннодифференцированных (53%) АК реакция была цитоплазматической или отсутствовала. Изучение факторов, участвующих в регуляции клеточного цикла – р 53, ВАХ и BclX, Ki67 Экспрессия ВАХ и Bcl-X. Нами были исследованы особенности экспрессии протеинов индуктора и ингибитора апоптоза ВАХ и Bcl-X в эпителиальных опухолях ТК [W.M.Boedefeld et al, 2003; A.Gradiolone et al, 2003]. Реакция оценивалась по локализации протеинов, интенсивности экспрессии и проценту позитивных клеток опухоли. Для оценки локализации экспрессии ВАХ и Bcl X была предложена следующая система: экспрессия в виде мелких гранул в апикальной зоне клеток - 1 балл; сочетание крупногранулярной или диффузной цитоплазматической экспрессии с апикальной зернистостью - 2 балла; крупногранулярная и диффузная цитоплазматическая экспрессия 3 балла. Было выявлено, что при возрастании инвазивного потенциала АК изменяется тип экспрессии протеинов, а также уменьшается количество, главным образом, Bcl-Xположительных клеток, особенно в зоне инвазии опухоли. 16 Экспрессия ВАХ и Bcl-X в нормальной слизистой, ТВА и части АК ТК выявлялась в цитоплазме апикальной зоны клеток в виде мелких гранул. В клетках УД и НД АК отмечались и другие типы экспрессии, которые были расценены нами как аномальные – цитоплазматическая, в виде крупных гранул в перинуклеарных или базальных отделах клеток и диффузное распределение экспрессии по всей цитоплазме клеток. Учитывая выраженную гетерогенность экспрессии протеинов Вcl X и ВАХ, нами была разработана формула для оценки экспрессии ВАХ и Вcl X, в которой учитывались процент позитивных клеток (ППК), интенсивность (И) реакции (в баллах) и локализация (Л) экспрессии протеинов ВАХ и Bcl X (в баллах): ППК х И х Л Для сравнительной оценки экспрессии протеинов ВАХ и Bcl-X мы использовали условный «коэффициент апоптоза» как отношение интенсивности экспрессии Bcl-X к ВАХ, выраженных в баллах. В результате исследования показано, что коэффициент апоптоза снижался по мере возрастания инвазивного потенциала опухоли. Количество наблюдений с коэффициентом апоптоза менее 1 резко возрастало в группе АК с низкой степенью дифференцировки ( 86%, 6 из 7), тогда как случаев с коэффициентом апоптоза более 1 выявлено не было. Экспрессия р53. Р53 – белок-регулятор апоптоза и клеточного цикла [Б.П.Копнин и соавт., 2000; N.J.Carr et al, 2002]. В клетках слизистой ТК и ТВА экспрессии протеина р53 выявлено не было, тогда как в АК ТК она наблюдалась в 68% случаев. В клетках АК II клинической стадии экспрессия протеина р53 наблюдалась в 59% ( 16 из 27) случаев, из них только в 33% (9 из 27) случаев отмечалась интенсивная реакция (более 40% меченых ядер). На III клинической стадии количество позитивных наблюдений составило 73% ( 16 из 22), при этом количество случаев с выраженной иммунореактивностью р53 достигло 50% (11 из 22). В IV стадии в клетках всех АК выявлялась экспрессия протеина. Соответственно, отсутствие экспрессии р53 в клетках АК II клинической стадии было обнаружено в 41% (11 из 27) случаев, в III стадии – в 27% (6 из 22) случаев, а в IV клинической стадии р53-негативных опухолей не было выявлено вообще. В группе ВД АК отсутствие экспрессии р53 в клетках отмечалось в 42% (5 из 12), в УД АК – в 33% (11 из 33), а в НД АК – в 14% (1 из 7) случаев. При снижении степени дифференцировки опухолевых клеток отмечается увеличение р53-позитивных случаев. Была выявлена зависимость между наличием экспрессии протеина р53 в клетках АК ТК и клинической стадией опухоли, а также степенью дифференцировки опухолей. При увеличении клинической стадии и снижении степени дифференцировки опухолей количество р53-позитивных случаев увеличивается. 17 Изучение пролиферативной активности эпителиальных опухолей ТК. Пролиферативная активность клеток 71 опухоли оценивалась с помощью индекса пролиферации Ki67 [Y.Suzuki et al, 2002; M.Parton et al, 2002], способ оценки которого описан выше. В прилежащей к опухоли слизистой ТК Ki 67 выявлялся в базальных отделах крипт (камбиальной зоне), где индекс пролиферации был не менее 40%. В ТВА он был достаточно высоким, максимальное значение его достигало 47%. В исследованных АК ТК индекс Ki67 варьировал в широких пределах 12-81%. Таким образом, исследование пролиферативной активности клеток нормальной слизистой и эпителиальных новообразований ТК показало, что четкой корреляции между этим показателем, степенью дифференцировки опухоли и стадией опухолевого процесса не выявляется. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Изучение молекулярно-биологических механизмов канцерогенеза открывает новые возможности диагностики и профилактики рака толстой кишки, помогает в определении инвазивных свойств и злокачественного потенциала опухолей этой локализации. В связи с этим, в последнее время возрастает интерес к изучению закономерностей гистогенеза рака толстой кишки, фенотипических и ультраструктурных особенностей дифференцировки опухолевых клеток [Ю.И.Патютко, И.В.Сайгадак , 2001]. Экспрессия цитокератина 20, в большей степени, и цитокератина 19, в меньшей степени, характеризует особенности дифференцировки эпителия ТК. Эти молекулы являются тканеспецифическими маркерами клеток эпителиальных опухолей ТК – аденом и аденокарцином. Однако, помимо дифференциально-диагностической значимости, выявление этих протеинов может быть использовано в качестве фактора прогноза клинического течения опухолей, как показателя степени дифференцировки опухолевых клеток. В результате проведенного исследования было установлено, что в АК ТК при уменьшении степени клеточной дифференцировки интенсивность экспрессии этих цитокератинов прогрессивно снижалась. Экспрессия цитокератинов 19 и 20, характерная для дифференцированных энтероцитов неизмененной слизистой, отмечалась в клетках 43% и 11% случаев ВД АК, 35% и 10% - УД АК и 14% и 0% - НД АК. Однако зависимости между клинической стадией опухолей и особенностями экспрессии цитокератинов 19 и 20 выявить не удалось. 18 Другими тканеспецифическими маркерами эпителиальных опухолей ТК являются муцины – гликопротеины, которые синтезируются в клетках опухолей ТК. В норме в клетках слизистой ТК выявляется муцин 2, тогда как экспрессия муцина 1 является одним из признаков злокачественной трансформации клеток. Уменьшение степени дифференцировки клеток сопровождалось уменьшением экспрессии муцина 2 и накоплением муцина 1 в просвете железистоподобных структур и в цитоплазме клеток опухолей. Та же картина отмечалась и по мере увеличения клинической стадии АК ТК. Следовательно, при увеличении инвазивных свойств опухолей продукция муцина 2 клетками уменьшается, а муцина 1 - увеличивается. Роль молекул межклеточной адгезии в канцерогенезе ещё недостаточно хорошо изучена. В результате проведенного исследования были описаны характерные особенности локализации молекул межклеточной адгезии в норме и в опухолях. В неизмененной слизистой Е-кадхерин выявлялся на поверхности клеточной мембраны в 100% клеток, β-катенин – на поверхности клеточной мембраны и в цитоплазме клеток, а CD44H – на мембране клеток преимущественно базальных отделов крипт. Появление аномальных типов экспрессии Е-кадхерина (цитоплазматического, мембранно- редуцированного), а также уменьшение интенсивности экспрессии этого протеина отмечалось на более поздних клинических стадиях заболевания. Ядерная аккумуляция βкатенина и цитоплазматический тип экспрессии СD44H, а также полное отсутствие иммунореактивности к Е-кадхерину и CD44H в клетках характеризуют наиболее злокачественные опухоли и указывают на плохой прогноз. В эпителиальных опухолях ТК функции генов, регулирующих клеточный цикл, изучались достаточно широко, однако полученные результаты противоречивы. В настоящем исследовании показано, что в ткани АК по сравнению с нормальной слизистой и ТВА, отмечалось сверхэкспрессия протеинов ВАХ и Bcl-X, и выявлен ряд характерных особенностей их экспрессии. В нормальных энтероцитах экспрессия как ВАХ, так и Bcl-Х имела вид мелкой зернистости, преимущественно в апикальных участках клеток, тогда как в клетках АК ТК протеины преимущественно распределялись равномерно по всей цитоплазме или в виде крупных гранул в перинуклеарных зонах. По мнению ряда исследователей уменьшение экспрессии индуктора апоптоза ВАХ и накопление ингибитора апоптоза Bcl-X в клетках АК ТК является критерием плохого прогноза [A.Biroccio et al, 2001; Е. Ogura et al, 1999]. Однако, по данным настоящего исследования, рост опухоли, сопровождающийся уменьшением степени дифференцировки клеток и увеличением инвазивного потенциала, ассоциирован с тенденцией к снижению интенсивности экспрессии Bcl-X относительно ВАХ. 19 Во многих исследованиях было показано, что в клетках злокачественных эпителиальных опухолей ТК наблюдают сверхэкспрессию протеина р53, что свидетельствует об ухудшении прогноза опухоли и повышении резистентности клеток к противоопухолевой терапии. В настоящем исследовании экспрессия р53 отмечена в 68% (36 из 53) случаев АК, при этом количество р53-позитивных опухолей увеличивалось по мере снижения клеточной дифференцировки и увеличения клинической стадии опухоли. Имеются данные [H.H.J.Backus et al, 2002], что активная клеточная пролиферация свидетельствует о неблагоприятном прогнозе, однако полученные нами результаты этому противоречат. В нашем исследовании было выявлено, что средний индекс пролиферации Ki 67 в клетках ТВА часто значительно выше, чем в клетках АК, т.е. пролиферативная активность опухолевых клеток не всегда коррелирует со степенью злокачественности процесса. При сравнительной оценке экспрессии различных групп маркеров в клетках АК ТК выявлена корреляция между экспрессией молекул межклеточной адгезии и рядом тканеспецифических маркеров. Так, снижение иммунореактивности клеток к цитокератинам 19 и 20 типов сопровождалось уменьшением интенсивности экспрессии нормального типа и появлением аномальных типов экспрессии Е-кадхерина, CD44H и βкатенина в клетках АК ТК. В клетках АК ТК с ядерной локализацией β-катенина отмечалась гиперэкспрессия муцина 1 и р53. 20 ВЫВОДЫ: 1. Важными аденокарцином параметрами толстой для оценки кишки прогноза является клинического совокупность течения особенностей гистологического строения опухоли и иммунофенотипической характеристики опухолевых клеток. При исследовании установлено, что иммунофенотип клеток аденокарцином толстой кишки различной степени дифференцировки и различной клинической стадии заболевания ассоциирован со степенью дифференцировки опухолевых клеток. 2. Экспрессия цитокератинов 19 и 20 и ее локализация в цитоплазме характеризует степень дифференцировки опухолевых клеток. В низкодифференцированных опухолях интенсивность экспрессии цитокератинов 19 и 20 в опухолевых клетках уменьшается. 3. Муцины 1 и 2 типа являются тканеспецифическими маркерами клеток железистого эпителия. Муцин 1 типа иммуногистохимически не выявляется в эпителии нормальной слизистой и тубуло-ворсинчатых аденомах толстой кишки, тогда как муцин 2 типа экспрессируется в бокаловидных клетках слизистой, всех клетках тубуло-ворсинчатых аденом и части высокодифференцированных аденокарцином. Экспрессия муцина 1 выявляется в просвете желез аденокарцином толстой кишки, а при увеличении злокачественного потенциала опухолей - и в цитоплазме опухолевых клеток. Интенсивность экспрессии муцина 2 типа при уменьшении степени опухолевой дифференцировки и увеличении клинической стадии заболевания снижается. 4. Эпителиальные новообразования толстой кишки отличаются по интенсивности и типу экспрессии молекул межклеточной адгезии. В клетках тубуло-ворсинчатых аденом отмечалась нормальная экспрессия Е-кадхерина, β-катенина и CD44H. Мембранная экспрессия Е-кадхерина и CD44H выявлялись в 100% случаев, а βкатенин выявлялся на мембране и в цитоплазме опухолевых клеток. В клетках аденокарцином толстой кишки снижение степени дифференцировки, возрастание инвазивного потенциала и стадии опухоли ассоциировалось с уменьшением 21 нормальной мембранной экспрессии, а также появлением аномальных типов экспрессии Е-кадхерина, CD44H и β-катенина. 5. Протеины-регуляторы апоптоза ВАХ и Bcl-X выявлялись в клетках опухолей толстой кишки в виде мелких и крупных гранул или в виде диффузного окрашивания в различных участках цитоплазмы. В эпителиоцитах нормальной слизистой, тубуло-ворсинчатых аденом и части аденокарцином отмечалась мелкогранулярная экспрессия протеинов в апикальной части клеток. В клетках низкодифференцированных аденокарцином и на более поздних клинических стадиях заболевания иммунореактивность к протеинам ВАХ и Bcl-X была диффузной или крупногранулярной и выявлялась перинуклеарно. 6. Экспрессия белка р53 в эпителиоцитах нормальной слизистой, тубуловорсинчатых аденом и части высокодифференцированных аденокарцином отсутствовала. Среди низкодифференцированных аденокарцином толстой кишки и при увеличении стадии опухолевого роста частота р53-позитивных опухолей увеличивалась. 7. В клетках АК ТК была выявлена зависимость между экспрессией тканеспецифических маркеров и молекул межклеточной адгезии. Снижение экспрессии цитокератинов 19 и 20 сопровождалось изменением типа и интенсивности нормальной экспрессии Е-кадхерина, CD44H и β-катенина в опухолевых клетках. В клетках низкодифференцированных аденокарпцином толстой кишки с ядерной локализацией β-катенина отмечалась гиперэкспрессия MUC1. 22 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. The analysis of immunophenotype of gastrin-producing tumors of pancreas and gastrointestinal tract// Cancer, 2003, V.98,№9, P.1967-76 ( соавт. - L.Gurevich, I.Kazantseva, V.Isakov, A.Egorov) 2. Особенности экспрессии Е-кадхерина, муцина-2 Ki 67 в аденокарциномах толстой кишки // Архив патологии.- 2003.- №5.-15-17 3. Особенности экспрессии CD44 в эпителиальных опухолях толстой кишки// Материалы IV конференции российских патологоанатомов «Новые методы и разработки в онкоморфологии», 2005. 91-92 (соавт. - Казанцева И.А., Гуревич Л.Е., Устинова Е.И.) 23