На правах рукописи ТИЛИК Татьяна Валерьевна

На правах рукописи
ТИЛИК
Татьяна Валерьевна
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ
МЕТАБОЛИЗМА СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ
БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ И ЕЕ СОЧЕТАНИИ
С ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА
14.01.04 – внутренние болезни
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Владивосток – 2012
2
Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего профессионального образования
«Владивостокский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения и социального развития
Российской Федерации
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор
Невзорова Вера Афанасьевна
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Кулаков Юрий Вячеславович
ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России
доктор медицинских наук, профессор
Шакирова Ольга Викторовна
ФГАОУ ВПО ДВФУ Минобрнауки России
Ведущая организация: государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего профессионального образования
«Амурская государственная медицинская академия» Министерства
здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита диссертации состоится « 24 » февраля 2012 года
в « 10 » часов на заседании диссертационного совета К 208.007.01
при ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России
по адресу: 690002, г. Владивосток, проспект Острякова, 2
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Владивостокского государственного медицинского университета
Автореферат разослан « 20 » января 2012 года
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат медицинских наук, доцент
Шестакова Н.В.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Поиск эффективных методов предупреждения и лечения состояний с полиморбидным фоном является одной из важнейших медико-социальных проблем в связи с увеличением продолжительности жизни населения и накоплением в популяции пациентов с сочетанными заболеваниями, взаимоотягощающими течение друг друга [Бессонова Л.О., 2008]. Учитывая общность факторов риска, одним из которых является курение, наличие
коморбидной патологии в виде хронической обструктивной болезни
легких (ХОБЛ) и ишемической болезни сердца (ИБС) чаще является
правилом, чем исключением. При ХОБЛ создаются условия для возникновения кардиоваскулярных нарушений и для усугубления проявлений коморбидности [Невзорова В.А., 2007; Boudestein L.C.M.,
2009]. Среди лидирующих, но нераспознанных при жизни причин
смерти у больных ХОБЛ является ИБС. По данным крупных популяционных исследований, риск смерти от сердечно-сосудистой патологии у больных ХОБЛ повышен в 2-3 раза [Huiart L., 2005].
ХОБЛ и ИБС рассматриваются в качестве никотинассоциированных
заболеваний, с доказанным взаимоотягощающим течением, в патогенезе развития которых немаловажное значение имеет состояние
соединительной ткани, составляющей основу сердечно-сосудистой и
дыхательной систем [Suellen M. C., 2006]. Признается актуальным
поиск наиболее информативных маркеров риска развития сердечнососудистых заболеваний при ХОБЛ, выявление которых на ранних
стадиях до развития сердечно-сосудистых катастроф следует относить к вопросам предиктивной диагностики.
Целью исследования является поиск информативных маркеров
риска развития ХОБЛ и ее сочетания со стабильной стенокардией
напряжения на основе исследования содержания матриксной металлопротеиназы MMP-9, а также генетических полиморфизмов геновкандидатов патологии метаболизма соединительной ткани.
Задачи исследования:
1. Определить содержание матрикс-разрушающей металлопротеиназы MMP-9, ее комплекса с тканевым ингибитором TIMP-1, а
также соотношение указанных показателей при ХОБЛ и ее сочетании со стабильной стенокардией напряжения.
2. Изучить распределение делеций генов глутатионтрансфераз
(GSTs) GSTT1 и GSTM1 при ХОБЛ и ее ассоциации с ИБС.
4
3. Оценить содержание аллелей G и T гена коллагена I типа
COL1A1 при изолированной ХОБЛ и ее ассоциации со стабильной
стенокардией напряжения. Охарактеризовать состояние гомозиготных GG и TT, и гетерозиготного GT генотипов гена COL1A1 при
ХОБЛ и ее сочетании с ИБС.
4. Выяснить вклад изменения содержания MMP-9, комплекса
MMP-9/TIMP-1, делеций генов GSTs, наличия аллелей G и T, генотипов GG, TT, GT гена COL1A1 в риск развития ХОБЛ и ее сочетания со стабильной стенокардией напряжения.
Научная новизна исследований. В результате проведенных исследований получены данные, расширяющие представления о патогенетических механизмах развития ХОБЛ и ее комбинации с ИБС.
Установлен вклад дисбаланса системы «протеолиз-антипротеолиз» в
формирование ХОБЛ и ее комбинации с ИБС. Выявлено, что наиболее выраженные изменения содержания MMP-9 и ее комплекса
MMP-9/TIMP-1 зафиксированы при кардиореспираторной патологии. Охарактеризовано распределение аллелей и генотипов генов
ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTs и коллагена I
типа COL1A1 при ХОБЛ и ее ассоциации с ИБС, в том числе в зависимости от стадии ХОБЛ. Определены возможности предиктивной
диагностики развития ХОБЛ и ее ассоциации с ИБС, основанной на
данных исследования полиморфизма генов GSTs и COL1A1. Установлено, что наличие делеции GSTT1 увеличивает риск развития
изолированной ХОБЛ и, особенно, сочетанной патологии. Наличие
генотипа ТТ и увеличение доли генотипа GT гена COL1A1 наиболее
значимо увеличивает риск развития ХОБЛ.
Практическая значимость работы. Расширены представления о патогенетических аспектах формирования изолированной
ХОБЛ и кардиореспираторной патологии. Установлен вклад дисбаланса в системе «протеолиз-антипротеолиз» в развитие ХОБЛ и
ее комбинации со стабильной стенокардией напряжения, с наиболее выраженными изменениями в последней группе. Определена
значимость оценки генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при ХОБЛ, ассоциацированной с ИБС. Установлена необходимость оценки генотипов гена COL1A1 у пациентов с ХОБЛ. Результаты исследования могут найти применение в практической
медицине в программах обследования и лечения ХОБЛ и ее комбинации с ИБС.
5
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Для ХОБЛ и ее комбинации с ИБС характерно возникновение
дисбаланса в системе «протеолиз-антипротеолиз» со сдвигом в сторону активации протеолиза и максимальным повышением в сыворотке крови его маркеров – MMP-9 и комплекса MMP-9/TIMP-1 при
сочетанной патологии.
2. Среди выявленных полиморфизмов генов глутатионтрансфераз наибольшее значение в риске развития ХОБЛ и, особенно, сочетанной патологии, имеет нулевой генотип GSTT1.
3. Важным фактором формирования соединительнотканного
дисметаболизма при ХОБЛ и ее с ИБС является увеличение частоты
содержания аллеля T, наличие генотипов TT и GT гена COL1A1.
Наиболее высокая частота встречаемости генотипа TT и GT установлена при изолированной ХОБЛ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, из
них 5 – в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Внедрение результатов исследования: Материалы диссертации внедрены в работу лечебно-профилактических учреждений г.
Владивостока и используются в учебном процессе при подготовке
интернов, ординаторов и врачей на кафедре терапии, функциональной и ультразвуковой диагностики ФПК и ППС.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на научных конференциях регионального, российского и
международного уровней: на ХVIII - ХХI Европейском респираторном конгрессе (Berlin, 2008; Vienna, 2009; Barcelona, 2010; Amsterdam, 2011); VI и VII Дальневосточном регионального конгресса с
международным участием (Владивосток, 2009 и 2010); Российском
Национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2010).
Структура и объем диссертации. Диссертации изложена на
150 страницах, содержит 14 рисунков и 3 таблицы, состоит из введения, четырех глав, обсуждения результатов, выводов, практических
рекомендаций и списка литературы, включающего 186 источников
(33 – отечественных и 153 – зарубежных авторов).
Диссертации изложена на 150 страницах, содержит 14 рисунков
и 3 таблицы, состоит из введения, четырех глав, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы,
6
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследования. Обследовано 120 пациентов, находившихся на амбулаторном наблюдении в аллергореспираторном центре и поликлиниках г. Владивостока в течение
2008-2011 гг. Для диагностики ХОБЛ применялись рекомендации
международной программы GOLD (Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики ХОБЛ, пересмотр 2010 г.). Подтверждение или исключение диагноза ИБС у всех обследованных осуществлялось согласно рекомендациям Всероссийского научного общества кардиологов и МКБ-10.
В исследование были включены лица обоего пола с фенотипическими признаками европейской расы. У 60 пациентов установлена
изолированная ХОБЛ II-III стадии заболевания стабильного течения
(I группа). У 60 пациентов ХОБЛ II-III стадии заболевания в сочетании со стабильной стенокардией напряжения I-II ФК (II группа).
Группы обследованных делились на подгруппы в зависимости от
стадии ХОБЛ: ХОБЛ II стадии – при 50%<ОФВ1<80% от должных
величин, ХОБЛ III стадии – при 30%<ОФВ1<50% от должных величин, ОФВ1/ФЖЕЛ<70%. Соответственно, были выделены следующие подгруппы: IА – ХОБЛ II стадии (n=30); IВ – ХОБЛ III стадии
(n=30); IIА – ХОБЛ II стадии, ассоциированная с ИБС (n=30); IIВ –
ХОБЛ III стадии, ассоциированная с ИБС (n=30). Контрольную
группу (n=30) составили условно здоровые добровольцы, соответствующие основной группе по возрасту, полу, этнической принадлежности. Определение содержания ММР-9 и комплекса ММР9/ТІМР-1 проводилось методом иммуноферментного анализа
[Mosman T.R., 1998] с помощью реактивов R&D Diagnostics Inc.
(США). Учет результатов проводили с помощью анализатора
Multiscan (Финляндия). Количество MMP-9 и MMP-9/TIMP-1 рассчитывали путем построения калибровочной кривой и выражали в
нанограммах/мл (нг/мл). ДНК выделяли из лейкоцитов с использованием фенольно-хлороформной экстракции. Анализ полиморфных
локусов проводили методом ПЦР. Амплификацию производили на
амплификаторе GeneAmp PCR System 2700, Applied Biosystems производства США с использованием наборов реагентов для полиморфных маркеров: G1546T гена COL1A1 и генов GSTs (производства
«ГосНИИгенетика» полиморфные маркеры: I/D гена GSTM1, I/D гена GSTT1, G1546T гена COL1A1) в соответствии с рекомендациями
производителя. Продукты амплификации и гидролиза визуализиро-
7
вали на трансиллюминаторе при помощи гель-документирующей
системы Bio-Print 1500/20M (Франция). Для генотипов GSTs гомозиготные делеции определялись наличием одного амплификационного
фрагмента длиной 350 п.н. Генотипы COL1A1 по мутации G1546T
определялись набором фрагментов: ТТ-генотип – 312 п.н.; GTгенотип – 312, 235 и 77 п.н.; GG - 235 и 77 п.н.
Результаты оценены с помощью программы STATISTICA 6.0.
Достоверность различий в распределении частот аллелей и генотипов между группами и контролем оценивали по тесту χ². Вычисляли
относительный риск по формуле: ОР=ахd/bхс, где а – число больных
с наличием и b — с отсутствием признака у больных; с и d – число
здоровых соответственно с наличием и отсутствием признака.
Автор выражает глубокую признательность сотрудникам Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН, на базе которых проведены биохимические и генетические исследования: руководителю лаборатории химии неинфекционного иммунитета д.х.н.,
профессору П.А. Лукьянову, старшему научному сотруднику лаборатории морской биохимии к.м.н. М.П. Исаевой.
Результаты собственных исследований и их обсуждение
MMP-9 является одним из основных протеолитических ферментов, отвечающих за ремоделирование соединительной ткани.
Установлено повышение ее уровня с сыворотке как при ХОБЛ, так и
при ИБС [Zourdidakis E., 2004; Kim S.E., 2009]. Однако в литературе
отсутствуют сведения о содержании MMP-9 при сочетанной патологии. Согласно полученным результатам, при кардиореспираторной
патологии содержание MMP-9 достоверно выше, чем в контроле и
при изолированной ХОБЛ в 1,9 и в 1,5 раза соответственно (рис.1).
200,37±19,54
256,42±23,47*
&
384,54±36,13*&
Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05,
&
- разница между I и II группами достоверна при р<0,05.
Рис. 1. Содержание MMP-9 в сыворотке крови при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС.
8
Полученные нами данные свидетельствуют о более значимом
увеличении содержания MMP-9 именно при сочетании ХОБЛ и
ИБС. Исходя из предыдущих исследований, указывающих на изменение уровня ММР-9 в зависимости от стадии ХОБЛ, нам представилось интересным исследовать состояние ММР-9 при различных
стадиях ХОБЛ в обеих группах (рис. 2).
445,17± 43,32*# "
500
450
323,9±28,93*#"
299,84±26,24*#"
400
350
300
250
200
200,37±19,54
ХОБЛ II
стадии
213±20,69*#"
ХОБЛ III
стадии
150
100
50
0
Контроль
Изолированная ХОБЛ
ХОБЛ, ассоциированная с
ИБС
Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05,
#
- разница между подгруппами пациентов IА и IIА, IВ и IIВ достоверна при
р<0,05, " - разница между подгруппами пациентов IА и IВ, IIА и IIВ достоверна при р<0,05.
Рис. 2. Содержание MMP-9 при II и III стадиях ХОБЛ в I и II группах пациентов.
Как следует из представленных данных, концентрация MMP-9
достигает максимальных значений при III стадии ХОБЛ в обеих
группах. В то же время при III стадии ХОБЛ содержание ММР-9
выше при сочетанной патологии, чем при изолированной ХОБЛ
(299,84±26,24, 445,17±43,32 нг/мл, соответственно, р<0,001). Повышение содержания MMP-9 по мере увеличения стадии ХОБЛ может
быть связано с глубокими процессами ремоделирования легочной
ткани при более тяжелых стадиях заболевания, что отмечено и в
предыдущих исследованиях [Huiart L., 2005]. Увеличение содержания MMP-9 может быть рассмотрено в качестве индикатора более
тяжелого течения ХОБЛ и одновременно быть связанным с риском
развития ИБС. Для характеристики протеолитической активности
используют не только концентрацию ММР-9, но и ее комплекс с ин-
9
гибитором TIMP-1. В нашем исследовании содержание комплекса
MMP-9/TIMP-1 имеет сходную динамику с ММР-9 (рис. 3).
11,44±0,72*&
6,41±0,57*&
3,15±0,3
Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05,
&
- разница между I и II группами достоверна при р<0,05
Рис. 3. Содержание MMP-9/TIMP-1 в сыворотке крови при ХОБЛ и
ее сочетании с ИБС.
Уровень комплекса повышен в обеих группах по сравнению с
контролем (11,44±0,72; 6,41±0,57; 3,15±0,3 нг/мл, соответственно;
p<0,001, p<0,001). Установлена достоверная разница между содержанием комплекса при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС в сторону увеличения в последнем случае (6,41±0,57; 11,44±0,72 нг/мл; p<0,001,
соответственно). Концентрация комплекса MMP-9/TIMP-1, также
как и содержание свободной ММР-9, зависит как от стадии ХОБЛ,
так и от наличия или отсутствия ИБС (рис. 4).
14,96±0,87*# "
8,82±0,79*#"
7,92±0,56*#
3,15±0,3
4,07±0,35*#"
"
Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05,
#
- разница между подгруппами пациентов IА и IIА, IВ и IIВ достоверна при
р<0,05, " - разница между подгруппами пациентов IА и IВ, IIА и IIВ достоверна при р<0,05.
Рис. 4. Содержание MMP-9/TIMP-1 при II и III стадиях ХОБЛ в I и
II группах пациентов
10
В обеих группах содержание MMP-9/TIMP-1 достоверно выше
при III стадии ХОБЛ. Полученные данные о содержании MMP9/TIMP-1 согласуются с результатами исследования свободной
MMP-9 и указывают на наличие дисметаболизма соединительной
ткани в сторону активации процессов протеолиза при стабильном
течении ХОБЛ и при сочетании ХОБЛ и ИБС.
Помимо изучения процессов протеолиза нам представилось интересным оценить антипротеазную активность сыворотки, рассчитав
соотношение содержания свободной MMP-9 к комплексу MMP9/TIMP-1 (соотношение «M:К»). Результаты исследования соотношения «M:К» в группе пациентов представлены на рисунке 5.
63,61±5,69
41,54±15,81*&
35,33±22,93*&
Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05,
&
- разница между I и II группами достоверна при р<0,01
Рис. 5. Соотношение концентрации MMP-9 и MMP-9/TIMP-1при
ХОБЛ и ее сочетании с ИБС
Соотношение «M:К» имеет противоположную тенденцию относительно содержания MMP-9 и комплекса MMP-9/TIMP-1. Так в
контроле показатель «M:К» максимальный и составляет 63,61±5,69.
В группе изолированной ХОБЛ показатели «M:К» меньше, чем в
контроле. Наиболее низкие значения соотношения «M:К» установлены при сочетании ХОБЛ и ИБС. Если расценивать «M:К» в качестве косвенного показателя, отражающего состояние антипротеазной
активности сыворотки крови, то следует предположить, что антипротеазная активность максимальна в контроле и снижена у пациентов ХОБЛ и, особенно, при ее сочетании с ИБС. Анализ соотношения «M:К» в зависимости от стадии ХОБЛ показал, что наименьшее
значение «M:К» установлено при III стадии ХОБЛ в обеих группах
обследованных (рис. 6). Итак, при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС происходит сдвиг в сторону активации протеолиза с наибольшими изменениями в группе пациентов с кардиореспираторной патологией.
11
63,61±5,69
49,08±10,56*#"
40,9±22,12*#"
#
33,99±21,0* "
29,76±23,73*#"
Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05,
#
- разница между подгруппами IА и IIА, IВ и IIВ достоверна при р<0,05,
" - разница между подгруппами IА и IВ, IIА и IIВ достоверна при р<0,05.
Рис. 6. Соотношение концентрации MMP-9 и MMP-9/TIMP-1 при II
и III стадиях ХОБЛ в I и II группах пациентов.
Соответственно, исследование содержания MMP-9, комплекса
MMP-9/TIMP-1 и расчет их соотношения информативно для характеристики процессов соединительнотканного дисметаболизма при
ХОБЛ и для дополнительной оценки сердечно-сосудистого риска.
ХОБЛ и ИБС относятся к никотин-ассоциированным заболеваниям. Гены GSTM1 и GSTT1 играют важную роль в биотрансформации продуктов сгорания табака. Согласно нашим исследованиям частота встречаемости делеции GSTТ1 в группе контроля составляет
3,33 % и не отличается от данных крупных популяционных исследований [Imboden M., 2007]. У пациентов с изолированной ХОБЛ частота делеции GSTT1 возрастает по сравнению с контролем в 4 раза
(13,33%, χ²=6,79, ρ=0,009), а в группе пациентов с ХОБЛ в сочетании
с ИБС – в 6 раз (20%, χ²=14,20, ρ=0,0002) (рис. 7).
20%*
13,33%*
3,33%
Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05
Рис. 7. Частота делеции GSTT1 у пациентов ХОБЛ и при ее сочетании с ИБС.
12
Исследование частоты делеции гена GSTТ1 в подгруппах пациентов со II и III стадией ХОБЛ показало отсутствие общей закономерности частоты делеции GSTT1 от стадии ХОБЛ (рис. 8). Хотя в
ранее проведенном исследовании Imboden M. [2007] были получены
данные о наличии прямой связи между частотой встречаемости делеции GSTТ1 и увеличением тяжести течения ХОБЛ.
33,33%*#"
16,67 %*"
10%*"
3,33%
6,67%#"
Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05,
#
- разница между подгруппами IА и IВ, IIА и IIВ достоверна при р<0,05,
" - разница между подгруппами IА и IIА, IВ и IIВ достоверна при р<0,05.
Рис. 8. Частота встречаемости гомозиготной делеции гена GSTT1
при II и III стадиях ХОБЛ в I и II группах пациентов
Обращает внимание факт наибольшей доли делеции GSTТ1 в
группе с III стадией ХОБЛ в сочетании с ИБС, когда она составляет
33,33% и регистрируется практически у каждого третьего пациента,
Исследование полиморфизма гена GSTM1 показало, что в контроле делеция выявлена у 46,67%, что сопоставимо с данными исследований в других популяциях (42-46%) [Jian-Qing H., 2002]. Достоверных различий в частоте встречаемости полиморфизма GSTM1
между группами и подгруппами не установлено (48,33%, 58,33%,
соответственно, χ²=2,01, ρ=0,16). Наличие сочетанного нулевого генотипа GSTM1 и GSTT1 зарегистрировано у четырех пациентов с III
стадией ХОБЛ в сочетании с ИБС. Нулевые генотипы являются потенциально патологическими: они не кодируют функционально активные ферменты, которые являются важнейшим компонентом фазы
детоксикации продуктов сгорания табака [Jeffery P.K., 2004].
Таким образом, установлено максимальное значение делеции
GSTT1 в группе пациентов с сочетанной патологией при III стадии
ХОБЛ, что позволяет рассматривать делецию GSTT1 в качестве по-
13
тенциального маркера более тяжелого течения ХОБЛ в сочетании с
ИБС. В то время как делеция GSTM1 не имеет существенного значения для оценки риска развития и ХОБЛ и ее сочетания с ИБС.
Вклад в формирование соединительной ткани сердечнососудистой и дыхательной систем вносит коллаген I типа COL1A1,
противодействующий силам растяжения и создающий прочность соединительнотканного матрикса. Полученные ранее данные позволяют утверждать, что повышенная экспрессия гена COL1A1 связана с
дисбалансом процесса синтеза — деградации коллагена при ХОБЛ
[Nevzorova V.A., 2005]. Согласно результатам нашего исследования,
частота аллеля Т по сравнению со здоровыми достоверно увеличивается при ХОБЛ в 5,3 раза (χ²=61,89, p=0,00001) (табл. 1).
Таблица 1
Частота встречаемости аллелей G и T и генотипов GG, GT и TT
гена COL1A1 при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС
маркер
контроль
I группа
II группа
Аллель G
86,67%
29,63%*#
51,67%*#
Аллель T
13,33%
70,37% *#
48,33%*#
Генотип GG
70%
1,85%*#
23,33%*#
Генотип GT
30%
51,85%*
56,67%*
Генотип TT
0%
46,3%*#
20%*#
Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05,
#
- разница между группами достоверна при р<0,05.
При сочетании ХОБЛ и ИБС частота аллеля Т достоверно повышается по сравнению с контролем в 3,6 раза (χ²=25,23, ρ=0,00001),
но менее значительно относительно изолированной ХОБЛ (χ²=10,00,
ρ=0,0016). В ранее проведенных исследованиях показано, что аллель
T является неблагоприятным и чаще встречается при ХОБЛ более
тяжелого течения [Невзорова В.А., 2008; Herd R., 2009].
В литературе практически отсутствуют сведения о частоте
встречаемости генотипов GG, GT и TT гена COL1A1 при ХОБЛ в
сочетании с ИБС. Как следует из данных, представленных в таблице
1, первые два генотипа представлены у здоровых, причем гомозиготный генотип GG в данном случае является преобладающим. Патологический генотип TT в контроле не установлен. У пациентов с
14
ХОБЛ и ее сочетании с ИБС доля генотипа GG уменьшается наиболее заметно в первом случае, составляя 1,85% (χ²=100,35, ρ=0,00001).
В то время как доля генотипа TT резко увеличивается с максимальными значениями при ХОБЛ (46,3%, χ²=63,16, p=0,00001). В обеих
группах почти в 2 раза возрастает содержание гетерозигот GT
(51,85%, χ²=10,0, ρ=0,0016 и 56,67%, χ²=14,83, ρ=0,0001, соответственно). Анализ аллелей и генотипов COL1A1 при различной тяжести ХОБЛ в обеих группах представлен в таблице 2.
Таблица 2
Частота встречаемости аллелей и генотипов гена COL1A1
при II и III стадиях ХОБЛ в I и II группах пациентов
конI группа
II группа
троль
маркер, %
IА
IВ
IIА
IIВ
Аллель G
86,67%
40%*"#
16,67%*"#
70%*"# 33,3%*"#
Аллель T
13,33%
60%*"#
83,33% *"#
30%*"# 66,7%*"#
Генотип GG
70%
3,33%*#
0%*#
40%*"#
6,7%*"#
Генотип GT
30%
83,33%*"#
12,5%*"#
60%*#
53,3%*#
Генотип TT
0%
13,34% *"#
87,5%*"#
0%"#
40%*"#
Примечание: * - разница по сравнению с контролем достоверна при р<0,05,
" - разница между подгруппами IА и IВ, IIА и IIВ достоверна при р<0,05,
#
- разница между подгруппами IА и IIА, IВ и IIВ достоверна при р<0,05.
Согласно данным, аллель Т в контроле выявлен у 13,33%, частота его встречаемости увеличивается по сравнению с контролем во
всех группах (χ²=43,20, ρ=0,00001; χ²=92,52, ρ=0,00001; χ²=6,45,
ρ=0,01; χ²=55,89, ρ=0,00001). Максимальное содержание аллеля Т
установлено при III стадии ХОБЛ в обеих группах. Как следует из
данных таблицы 2 наименьшее количество аллеля G и наибольшее
аллеля Т установлено при III стадии изолированной ХОБЛ (16,67%,
χ²=92,52, ρ=0,00001 и 83,33%, χ²=6,83, ρ=0,01 по отношению к контролю, соответственно). При сочетанной патологии достоверное
уменьшение аллеля G и увеличение аллеля Т зарегистрировано только при III стадии ХОБЛ. При этом их количество достоверно отличается от содержания у пациентов с III стадией изолированной ХОБЛ.
Количество гомозигот GG резко уменьшается по мере нарастания тяжести ХОБЛ в каждой группе и не встречается при III стадией
15
заболевания. Патологический генотип TT, напротив, преобладает в
этой группе пациентов, достигая 87,5% (χ²=157,14, ρ=0,00001 по отношению к контролю), достоверно обнаруживаясь практически во
всех подгруппах. Достоверно более высокая частота генотипа GT
выявлена в IА подгруппе. Полученные данные могут свидетельствовать об ответственности генотипов GT и TT за развитие изолированной ХОБЛ [Nevzorova V.A., 2005]. При сочетанной патологии изменения в содержании генотипов COL1A1 установлены только при III
стадии ХОБЛ. В этой группе значительно снижается доля гомозиготного генотипа GG и увеличивается доля генотипа TT (6,7%,
χ²=83,81, ρ=0,00001 и 40%, χ²=50,0, ρ=0,00001, соответственно). Очевидно увеличение доли аллеля Т и появление патологического генотипа TT в большей степени связано с ремоделированием дыхательных путей. Однако высказанное предположение носит гипотетический характер и требует дальнейших исследований. Так или иначе,
полученные результаты свидетельствуют о большей предрасположенности к значительным изменениям соединительнотканного метаболизма у пациентов с ХОБЛ при наличии аллеля Т и генотипов
GT и TT гена COL1A1 [Nevzorova V.A., 2005; Гельцер Б.И., 2006].
Установленные в исследовании данные, касающиеся состояния
дисбаланса в системе «протеолиз-антипротеолиз» и процессов соединительнотканного дисметаболизма, связанного с полиморфизмами генов GSTT1 и COL1A1, позволили выяснить вклад указанных
изменений в ОР ХОБЛ и ассоциированной патологии.
Примененный в исследовании метод расчета ОР показал, что
увеличение содержания свободной MMP-9 выше 200,37±19,54 нг/мл
связано с повышением ОР ХОБЛ и ассоциированной ИБС в целом
по группе в 13,95 раз (95%ДИ=8,18-23,76). Рассчитать ОР отдельно
по группам невозможно, поскольку при сочетанной патологии у всех
пациентов содержание MMP-9 выше контрольных значений
200,37±19,54 нг/мл. Также превышение содержания комплекса
MMP-9/TIMP-1 выше 3,15±0,3 нг/мл (показатель контроля) увеличивает ОР ХОБЛ и ассоциированной ИБС в целом по группе в 136 раз
(95% ДИ=20-914,62). Для того, чтобы рассчитать ОР развития ИБС у
пациентов ХОБЛ нами было определено среднее значение MMP-9 и
MMP-9/TIMP-1 в целом по группе, которые составили 320,48±29,8
нг/мл и 8,95±0,64 нг/мл, соответственно. При содержании MMP-9
выше 320,48±29,8 нг/мл, а комплекса более 8,95±0,64 нг/мл увеличивается ОР ИБС у пациентов ХОБЛ в 32 раза (95% ДИ=19,34-52,96) и
3,3 раза (95% ДИ=2,39-4,56), соответственно. Примененный метод
16
расчета ОР подчеркнул информативность использования содержания
MMP-9 и ее комплекса с TIMP-1 в сыворотке для оценки течения
ХОБЛ и степени сердечно-сосудистого риска.
Изучение распределения делеций генов GSTT1 и GSTМ1 при
ХОБЛ и ее комбинации с ИБС продемонстрировало существенные
изменения только в состоянии гена GSTT1. Метод ОР показал, что
наличие делеции GSTT1 увеличивает ОР изолированной ХОБЛ в
4,46 раза (95% ДИ=3,36-5,94), а сочетанной кардиореспираторной
патологии - в 7,26 раза (95% ДИ=5,76-9,15). Соответственно, ухудшение процессов детоксикации ксенобиотиков значимо способствует развитию ХОБЛ, но еще более значительно увеличивает ОР развития ее ассоциации с ИБС.
Полученные данные выявили, что частота аллеля Т гена
COL1A1 достоверно больше увеличивается при ХОБЛ, чем при сочетании ХОБЛ и ИБС. Наличие аллеля T увеличивает ОР изолированной ХОБЛ в 13,45 раза (95% ДИ=9,72-18,63), ее сочетания с ИБС
– в 5,3 раза (95% ДИ=4,11-6,84). Частота встречаемости генотипа
GT в обеих группах практически одинакова, тогда как частота генотипа TT достоверно повышается как при изолированной ХОБЛ, так и
при сочетанной патологии, однако максимальное значение данный
показатель имеет именно при изолированной ХОБЛ. Генотип GT
более значимо увеличивает ОР изолированной ХОБЛ (ОР=65,4, 95%
ДИ=15,62-273,78) по сравнению с сочетанной патологией (ОР=5,67,
95% ДИ=3,86-8,32). Присутствие комбинации генотипов ТТ и GT
сопряжено с повышением ОР изолированной ХОБЛ в 126,13 раз
(95% ДИ=30,32-524,66), а ее ассоциации с ИБС – в 7,67 (95%
ДИ=5,29-11,11), что подчеркивает значимость указанных генотипов
в развитии соединительнотканного дисметаболизма при ХОБЛ.
Итак, исследование состояния маркеров соединительнотканного метаболизма при ХОБЛ и ее сочетании с ИБС показало, что в
обеих группах, несмотря на стабильное течение заболевания, присутствует активация процессов протеолиза в виде повышения содержания MMP-9 и ее комплекса с TIMP-1 с наиболее значимыми
изменениями в группе пациентов с сочетанной патологией. Из генов
детоксикации ксенобиотиков на развитие ХОБЛ и, особенно, ее сочетания с ИБС наиболее значим полиморфизм гена GSTT1. В то
время как изменение содержания аллелей и генотипов COL1A1 более тесно связано с развитием изолированной ХОБЛ. Указанные изменения могут быть использованы для формирования программ предиктивной диагностики ХОБЛ и ее сочетания с ИБС.
17
ВЫВОДЫ
1. При ХОБЛ и ее ассоциации с ИБС происходит активация протеолиза, о чем свидетельствует повышение содержания матриксной металлопротеиназы 9 и ее комплекса с тканевым ингибитором 1 в сыворотке крови с максимальными изменениями
при III стадии ХОБЛ и ее сочетании с ИБС (445,17±43,32 нг/мл,
14,96±0,87 нг/мл). Антипротеазная активность, оцененная по
соотношению матриксной металлопротеиназы 9 к ее комплексу
с тканевым ингибитором 1 снижается по сравнению со здоровыми, как при изолированной ХОБЛ, так и, особенно, при коморбидной патологии (41,54±15,81 нг/мл, 35,33±22,93 нг/мл,
соответственно). Минимальное значение соотношения установлено при ІІІ стадии ХОБЛ в обеих группах.
2. Изучение полиморфизмов генов глутатионтрансфераз T1 и M1
показало достоверное увеличение делеций глутатионтрансферазы T1 у пациентов ХОБЛ и при наличии ее ассоциации с
ИБС. Максимальное присутствие (до 33,33%) нулевого генотипа гена глутатионтрансферазы T1 установлено у пациентов с III
стадией ХОБЛ в комбинации с ИБС.
3. Исследование содержания аллелей G и T и генотипов гена коллагена I типа показало значительное увеличение частоты встречаемости аллеля T гена коллагена I типа как у пациентов
ХОБЛ, так и при наличии ИБС с максимальный присутствием
при III стадией ХОБЛ (83,33%). В обеих группах значительно
увеличивается доля генотипа TT и гетерозигот GT по сравнению с контролем. Наибольшее количество гомозигот TT
(87,5%) установлено при III стадии изолированной ХОБЛ.
4. При повышение содержания матриксной металлопротеиназы 9
выше 200,37±19,54 нг/мл и ее комплекса с тканевым ингибитором 1 выше 3,15±0,3 нг/мл увеличивается относительный риск
ХОБЛ, в том числе в сочетании с ИБС, в 13,95 раз и в 136 раз,
соответственно. При содержании матриксной металлопротеиназы 9 выше 320,48±29,8 нг/мл, а комплекса более 8,95±0,64
нг/мл увеличивается относительный риск ИБС у пациентов
ХОБЛ в 32 раза и 3,3 раза, соответственно.
5. Полиморфизм генов глутатионтрансферазы T1 и коллагена I
типа у пациентов ХОБЛ и при ассоциации с ИБС может быть
использован в программах предиктивной диагностики указанных заболеваний. Так, наличие нулевого генотипа гена глута-
18
тионтрансферазы T1 в большей степени определяет относительный риск возникновения сочетанной патологии, чем изолированной ХОБЛ. Наличие аллеля Т, генотипа GT и комбинация генотипов ТТ и GT коллагена I типа более значимо увеличивает относительный риск изолированной ХОБЛ по сравнению с ассоциированной ИБС.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Для оценки протеолитической активности сыворотки крови при
ХОБЛ и ее комбинации с ИБС может быть использован метод
исследования свободной ММР-9 и ее комплекса с TIMP-1. В
первом случае содержание выше 200,4 нг/мл, а во втором –
выше 3,2 нг/мл в 13,9 и 136 раз, соответственно, увеличивает
относительный риск ХОБЛ и ее сочетания с ИБС.
2. Соотношение MMP-9 и комплекса может применяться для характеристики антипротеазной активности сыворотки крови.
Для ХОБЛ характерно снижение этого соотношения до 41,5, а
для ассоциированной патологии до 35,3.
3. Исследование протеолитической активности сыворотки крови с
помощью определения MMP-9 и комплекса MMP-9/TIMP-1
может быть использовано в программах оценки сердечнососудистого риска при ХОБЛ. Так превышение содержания
MMP-9 и комплекса MMP-9/TIMP-1 выше 320,5 нг/мл, а комплекса более 8,9 нг/мл, увеличивает относительный риск ИБС у
пациентов ХОБЛ в 32 раза и 3,3 раза, соответственно.
4. Исследование полиморфизма генов глутатионтрансферазы
GSTT1 и коллагена I типа COL1A1 может быть включено в
программы предиктивной диагностики ХОБЛ и ее сочетания с
ИБС. Для изолированной ХОБЛ более значимо определение
наличия аллеля Т, гомозиготного патологического генотипа ТТ
и его комбинации с GT гена коллагена I типа. В этом случае
относительный риск изолированной ХОБЛ возрастает в 13,5 раза, 126,1 раза, 5,7 раза, соответственно. Для сочетанной патологии более значимо присутствие нулевого гомозиготного генотипа GSTT1, когда относительный риск ассоциированной патологии возрастает в 7,3 раза, а изолированной ХОБЛ – в 4,5 раза,
соответственно.
19
СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Тилик Т.В., Невзорова В.А., Вахрушева С.Е., Панченко Е.А.,
Исаева М.П. Полиморфизм генов глутатионтрансфераз при
хронической обструктивной болезни легких, ассоциированной с ишемической болезнью сердца // Тихоокеанский медицинский журнал. 2010. №1. С. 13-15.
2. Невзорова В.А., Гилифанов Е.А., Тилик Т.В. Курение табака и функционально-морфологическое ремоделирование
слизистой оболочки верхних дыхательных путей // Российская отоларингология. 2010. №4 (47). С. 115-120.
3. Невзорова В.А., Гилифанов Е.А., Тилик Т.В. Клинические
проявления патологии верхних дыхательных путей при
хронической обструктивной болезни легких // Российская
отоларингология. 2010. №6 (49). С. 83-85.
4. Невзорова В.А., Тилик Т.В., Гилифанов Е.А., Панченко Е.А.,
Вахрушева С.Е. Роль матриксных металлопротеиназ в формировании морфофункционального дисбаланса воздухоносных путей при хронической обструктивной болезни легких //
Тихоокеанский медицинский журнал. 2011. №2. С. 9-13.
5. Невзорова В.А., Тилик Т.В., Гилифанов Е.А., Вахрушева
С.Е., Панченко Е.А., Кудрявцева В.А., Лукьянов П.А. Содержание свободной металлопротеиназы MMP9 и комплекса MMP9/TIMP1 в сыворотке крови при стабильном течении хронической обструктивной болезни легких, ассоциированной с ишемической болезнью сердца // Пульмонология. 2011. № 2. С. 75-80.
6. Kochetkova E., Maistrovskay U., Albavichus S., Tilik T., Massard
G., Kessler R. Effect of the matrix metalloproteinase-9 on bone in
chronic obstructive pulmonary disease // Abstract of 19-th European Respiratory Society Annual Congress. Vienna, Austria, Barcelona. 2009. P. 3253.
7. Nevzorova V., Tilik T., Vakhrusheva S., Maistrovska J., Gilifanov
E., Golotina O. The role of matrix metalloproteinase-9 in the formation of chronic obstructive pulmonary disease associated with
coronary heart disease // Abstract of 20-th European Respiratory
Society Annual Congress. Barcelona. 2010. P. 4296.
8. Tilik T., Vakhrusheva S., Maistrovska J., Gilifanov E., Golotina O.,
Panchenko E., Nastradin O. Polymorphism of collagen I gene in
20
chronic obstructive pulmonary disease associated with coronary
heart disease // Abstract of 20-th European Respiratory Society Annual Congress. Barcelona. 2010. P. 4295.
9. Tilik T., Nevzorova V., Vakhrusheva S., Nastradin O., Khasina M.,
Panchenko E. Association between glutation-S-transferases genotypes and risk of chronic obstructive pulmonary disease and coronary heart disease development.// Abstract of 20-th European Respiratory Society Annual Congress. Barcelona. 2010. P. 5211.
10. Tilik T., Nevzorova V., Vakhrusheva S., Gilifanov E., Issaeva М.
Polymorphism of collagen I gene and glutation-S-transferases T1
and M1 in chronic obstructive pulmonary disease associated with
cardiovascular disease //Abstract of 20-th European Respiratory Society Annual Congress. – Amsterdam. 2011. P. 114.
11. Vakhrusheva S., Nevzorova V., Tilik T., Gilifanov E., Issaeva М.
Polymorphism of glutation-S-transferases T1 and M1 in chronic obstructive pulmonary disease // Abstract of 21-th European Respiratory Society Annual Congress. – Amsterdam. 2011. P. 114.
12. Невзорова В.А., Тилик Т.В., Вахрушева С.Е., Минакова Е.Ю.
Металлопротеиназа MMP9 как причина коморбидности хронической обструктивной болезни легких и ишемической болезни
сердца // Вопросы повышения качества оказания медицинской
помощи в муниципальном здравоохранении : Материалы научно-практической конференции. Владивосток. 2010. С. 22.
13. Невзорова В.А., Гилифанов Е.А., Иченко В.Б., Лепейко Ю.Б.,
Тилик Т.В., Лобода О.В., Елецкая М.П., Красникова А.А. Ремоделирование слизистой оболочки и клинические аспекты влияния курения табака на органы дыхания // Актуальные вопросы
оториноларингологии : Материалы научно-практической конференции оториноларингологов Южного и Северо-Кавказского
федеральных округов РФ. Волгоград. 2010. С. 46 – 47.
14. Тилик Т.В., Невзорова В.А., Вахрушева С.Е., Панченко Е.А.,
Настрадин О.В. Полиморфизм генов глутатионтрансфераз при
ишемической болезни сердца в сочетании с хронической обструктивной болезнью легких // Российский Национального
конгресс кардиологов: материалы конгресса. Москва. 2010.
(Приложение 1 к журналу «Кардиоваскулярная терапия и профилактика». 2010. №9 (6)). С. 328.
15. Тилик Т.В., Вахрушева С.Е. Содержание свободной металлопротеиназы MMP9 и комплекса MMP9/TIMP1 в сыворотке крови при стабильном течении хронической обструктивной болез-
21
ни легких, ассоциированной с ишемической болезнью сердца //
Человек и лекарство : Материалы VII Дальневосточного регионального конгресса ученых с международным участием. Владивосток : Медицина ДВ. 2010. №3. С.139 -140.
16. Тилик Т.В., Вахрушева С.Е., Минакова Е.Ю. Полиморфизм генов глутатионтрансфераз GSTM1 и GSTT1 у курильщиков и
при ранних стадиях хронической обструктивной болезни легких // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины : Материалы XII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых
ученых с международным участием. Владивосток : Медицина
ДВ. 2011. С. 76-77.
17. Тилик Т.В., Вахрушева С.Е., Панченко Е.А., Исаева М.П.,
Невзорова В.А. Вопросы предиктивной диагностики развития
ишемической болезни сердца у больных хронической обструктивной болезнью легких // Материалы VI Научно-практической
конференции «Фундаментальная наука – медицине», 2011, Владивосток, С.65-79.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ИБС – ишемическая болезнь сердца
ОР – относительный риск
ХОБЛ – хроническая обструктивная болезнь легких
COL1A1 – ген коллагена I типа α1 цепи
GSTТ1 – глутатион-S-трансфераза Т1
GSTM1 – гены глутатион-S-трансфераза М1
GSTs – гены глутатион-S-трансфераз
MMP-9 – матриксная металлопротеиназа
TIMP-1 – тканевой ингибитор металлопротеиназы MMP-9
MMP-9/TIMP-1 – комплекс MMP-9 с тканевым ингибитором TIMP-1
Работа выполнена при поддержке государственного контракта
№ 14.740.11.0186 в рамках федеральной целевой программы
«Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.
22
Тилик Татьяна Валерьевна
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ
МЕТАБОЛИЗМА СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ
И ЕЕ СОЧЕТАНИИ С ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Подписано в печать 18.01.2012
Формат 60×90 1/16. Усл. п.л. 1,0.
Уч. изд. л. 0,75. Тираж 100 экз. Заказ 18
Отпечатано на участке оперативной полиграфии
типографии ООО «Рея»
г. Владивосток, ул. Адм. Юмашева, 42б