4 этап

Министерство образования и науки Российской Федерации
УДК
ГРНТИ
Инв. №
УТВЕРЖДЕНО:
Исполнитель:
федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего
профессионального образования "Российский
экономический университет имени Г.В.
Плеханова"
Проректор по научной деятельности
______________/Шишкин А. В./
М.П.
НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ
ОТЧЕТ
о выполнении 4 этапа Государственного контракта
№ 16.740.11.0531 от 16 мая 2011 г. и Дополнению от 07 октября 2011 г. № 1
Исполнитель: федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования "Российский экономический университет
имени Г.В. Плеханова"
Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации
мероприятия № 1.2.1 Проведение научных исследований научными группами под
руководством докторов наук.
Проект: Разработка инновационных ресурсосберегающих технологий производства
натуральных комплексных поликомпонентных экологически безопасных пищевых
продуктов с высокой добавленной пищевой ценностью, компенсирующих недостаток
белков, витаминов, минеральных веществ, антиоксидантов и других биологически
активных веществ в продуктах питания на основе сырьевых источников средней зоны
Российской Федерации
Руководитель проекта:
______________/Елисеева Людмила Геннадьевна
(подпись)
Москва
2012 г.
1
СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСПОЛНИТЕЛЕЙ
по Государственному контракту 16.740.11.0531 от 16 мая 2011 на выполнение поисковых
научно-исследовательских работ для государственных нужд
Организация-Исполнитель:федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования "Российский экономический университет имени Г.В.
Плеханова"
Руководитель темы:
доктор технических наук,
профессор
______________________ Елисеева Л. Г.
подпись, дата
Исполнители темы:
доктор технических наук,
профессор
______________________ Рыжакова А. В.
подпись, дата
кандидат технических
наук, доцент
______________________ Положишникова М. А.
подпись, дата
кандидат технических
наук, звание не указано
______________________ Махотина И. А.
подпись, дата
без ученой степени, без
ученого звания
______________________ Белкин Ю. Д.
подпись, дата
без ученой степени, без
ученого звания
______________________ Потанина Л. С.
подпись, дата
доктор технических наук,
профессор
______________________ Поверин Д. И.
подпись, дата
без ученой степени, без
ученого звания
______________________ Бабина О. А.
подпись, дата
2
без ученой степени, без
ученого звания
______________________ Юрина О. В.
подпись, дата
без ученой степени, без
ученого звания
______________________ Бухарина Е. А.
подпись, дата
3
Реферат
Отчет 116 с., 1 ч., 29 рис., 33 табл., 120 источн., 2 прил.
люпин, белок, биотехнология , автолиз , функциональные свойства , гидролиз , автолиз , углеводы,
фитаты , биотехнологическая схема , антиалиментарные факторы
В отчете представлены результаты исследований, выполненных по 4 этапу Государственного
контракта № 16.740.11.0531 "Разработка инновационных ресурсосберегающих технологий
производства натуральных комплексных поликомпонентных экологически безопасных пищевых
продуктов с высокой добавленной пищевой ценностью, компенсирующих недостаток белков,
витаминов, минеральных веществ, антиоксидантов и других биологически активных веществ в
продуктах питания на основе сырьевых источников средней зоны Российской Федерации" (шифр
"2011-1.2.1-220-010") от 16 мая 2011 по направлению "Проведение научных исследований
научными группами под руководством докторов наук в следующих областях:- мониторинг и
прогнозирование состояния атмосферы и гидросферы;- оценка ресурсов и прогнозирование
состояния литосферы и биосферы;- переработка и утилизация техногенных образований и
отходов;- снижение риска и уменьшение последствий природных и техногенных катастроф;экологически безопасные разработки месторождений и добыча полезных ископаемых;экологически
безопасные
ресурсосберегающие
производства
и
переработки
сельскохозяйственного сырья и продуктов питания" в рамках мероприятия 1.2.1 "Проведение
научных исследований научными группами под руководством докторов наук.", мероприятия 1.2
"Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук и
кандидатов наук", направления 1 "Стимулирование закрепления молодежи в сфере науки,
образования и высоких технологий." федеральной целевой программы "Научные и научнопедагогические
кадры
инновационной
России"
на
2009-2013
годы.
Цель работы - 1. Обеспечение достижения научных результатов мирового уровня в области
комплексной переработки экологически чистого сырья, выращенного в средней зоне РФ,
позволяющего производить поликомпонетные пищевые продуты, отвечающие требованиям
рационального питания, установленных всемирной организацией здравоохранения;
2. Разработка инновационных технологий переработки с использованием современных
международных
тенденций
решения
проблемы
обеспечения
населения
страны
сбалансированными продуктами питания отечественного производства;
3.Работы, направленные на решение актуальных проблем, сформулированных в доктрине
обеспечения продовольственной безопасности России, служат необходимым фундаментом для
подготовки и закрепления в сфере науки и образования научно-педагогических кадров и
направлены на формирование эффективного и жизнеспособного научного коллектива.
Дедуктивный и индуктивный методы;
методы анализа и синтеза; метод отбора фактов; метод абстрагирования; метод обобщения; метод
классификации; метод сравнения; метод аналогии; метод наблюдения; эксперимент
Программно-целевая иерархическая модель построения дерева результатов по исследуемой
проблеме
1. Аналитический обзор полученных закономерностей гидролитических изменений
белков, углеводов и фитатов под действием экзогенных кислых протеаз и в результате
активации собственного эндогенного ферментного потенциала семян люпина;
2. Выводы об изменении концентрации белка люпина в процессе индуцированного автолиза
методом ВЭЖХ на гель-фильтрационной колонке при решении проблемы получения
белкового препарата из семян люпина с учетом проведенных исследований в форме статей в
4
журналах ВАК и зарубежных журналах на английском языке;
3. Описание алгоритма снижения негативного влияния антиалиментарных факторов люпина на
потребительские свойства белковых препаратов;
4. Схема биотехнологического процесса производства модифицированного белкового
препарата из семян люпина;
5. Учебный курс «Биотехнология»и программа НИР для студентов.
5
Содержание.
№ стр.
Список исполнителей
2
Реферат
4
Введение
7
Этап 4. Изучение влияния технологии индуцированного автолиза на модификацию
8
химического состава и технолого-функциональных свойств белковых препаратов
люпина
Аналитический обзор полученных закономерностей гидролитических изменений
8
белков, углеводов и фитатов под действием экзогенных кислых протеаз и в результате
активации собственного эндогенного ферментного потенциала семян люпина
4.1
Исследование
степени
гидролитических
изменений
белков
в
процессе
8
4.2 Исследование динамики изменения углеводов и фитатов люпина в процессе
26
индуцированного автолиза муки семян люпина
индуцированного автолиза
4.2.1 Изучение динамики изменения фитатов люпина в процессе индуцированного
27
автолиза
4.2.2 Изучение динамики изменения углеводов люпина в процессе индуцированного
32
автолиза
4.2.3 Исследование переваримости белковых препаратов люпина и сои.
39
4.2.4 Изучение влияния технологии индуцированного автолиза на модификацию
41
технолого-функциональных свойств белковых препаратов люпина
4.2.5
Сравнительная
характеристика
органолептических
свойств
исследуемых
60
4.2.6 Определение степени потенциальной мутагенности белковых препаратов люпина
62
белковых препаратов люпина и сои
и сои
4.3
Разработка
биотехнологической
схемы
производства
модифицированного
66
белкового препарата из муки семян люпина
Заключение
81
Список использованных источников
85
Приложение А. Программа дисциплины «Биотехнология»
95
Приложение Б. Программа НИР для студентов
112
6
Введение.
Сегодня все большую роль в рационе человека занимают продукты функционального
питания, обладающие высокой биологической ценностью. В рамках четвертого этапа научноисследовательской работы были проведены исследования в области применимости белковых
препаратов из муки бобов люпина узколистного для биотехнологического производства белковых
и аминокислотных продуктов с заданными технолого-функциональными и потребительскими
свойствами.
В ходе процесса ограниченного протеолиза, используемого в производстве белковых
препаратов, изменяется соотношение между концентрацией белков разной молекулярной массы.
Изменение
данного
соотношения,
по
литературным
данным,
ведет
к
изменению
влагоудерживающей и жироудерживающей способности белковых препаратов. Повышение
влагоудерживающей способности и приближение её к свойственной мясу очень важно при
изготовлении колбасных изделий. Понижение влагоудерживающей способности необходимо при
производстве творожных и сырных продуктов.
Также была изучена динамика антиалиментарных факторов в белковых препаратах люпина.
Соли фитиновой кислоты, алкалоиды, сапонины, олигосахариды рафинозной группы снижают
пищевую ценность готовой продукции. В настоящей работе предложены оптимальные режимы
ограниченного гидролиза и автолиза, позволяющие минимизировать негативное воздействие
данных факторов как на организм человека, так и на технолого-функциональные свойства готовой
продукции.
По результатам выполнения четвертого этапа НИР была исследована возможность
построения полного биотехнологического цикла производства белковых и аминокислотных
препаратов из муки люпина узколистного, была построена общая схема, включающая в себя
технологические и биотехнологические особенности производства: селекцию новых соротов
люпина с улучшенными свойствами, а также методы совершенствования ассортимента
выпускаемой продукции на основе продолжения управляемого процесса протеолиза за счет
микробиологических ферментов.
Дополнительно в рамках НИР была разработана программа дисциплины «Биотехнология»
для студентов, обучающихся по направлению 100800 «Товароведение» и тематическая программа
научно-исследовательской работы студентов.
7
Этап 4. Изучение влияния технологии индуцированного автолиза на модификацию
химического состава и технолого- функциональных свойств белковых препаратов люпина
Аналитический обзор полученных закономерностей гидролитических изменений
белков, углеводов и фитатов под действием экзогенных кислых протеаз и в результате
активации собственного эндогенного ферментного потенциала семян люпина
На четвертом этапе проводимых исследований представлялось целесообразным изучить
влияние использования для модификации растительных белковых препаратов собственных
эндоферментов, активизирующих катаболические биохимические процессы, на химический состав
и технолого-функциональные свойства препаратов люпина. Как было показано в предыдущих
частях
исследования
аналогичные
процессы,
вызывающие
активизацию
собственного
метаболического потенциала растений, происходят при проращивании семян. В результате
проращивания происходит повышение пищевой ценности и улучшение функциональных свойств
белков [1]. При этом установлено, что в результате комплекса биохимических процессов, протекающих при проращивании семян, происходит деградация антиалиментарных факторов – αгалактозидных олигосахаридов, ингибиторов протеиназ, липазы, фитогемагглютининов, таннинов,
фитатов [2].
Достоверно установлено, что в процессе прорастания семян бобовых культур активизируются эндопептидазы, в частности пепсиноподобные кислые пептидазы, которые атакуют
запасные белки и вызывают их гидролиз, в результате чего образуется аминокислотный пул,
необходимый для синтеза новых гидролаз, которые в свою очередь активизируют соответствующие процессы мобилизации запасных веществ.
Е.Е. Браудо было высказано предположение, что методом индуцированного автолиза
растительных белковых препаратов можно достичь лучших результатов, чем при ограниченном
ферментативном гидролизе, при этом будут задействованы собственные протеолитические
ферменты сырья, которые позволят воспроизвести процессы, происходящие при прорастании.
Метод индуцированного автолиза – метод переработки сельскохозяйственного или
микробного сырья под действием собственных гидролитических ферментов (гидролаз), активность которых инициируется действием внешнего индуктора. Сущность метода заключается в
инициировании ферментной системы, «работающей» при прорастании семян, в результате
действия «протеолитической затравки» - кислой протеазы, имитирующей действие ключевого
эндогенного фермента, синтезируемого de novo в момент начала прорастания [1].
8
Согласно
литературным
данным,
интенсивность
процессов,
происходящих
при
прорастании, значительным образом возрастает на третьи сутки проращивания [3,4]. Так, Mostafa
с коллегами [5] заметили, что на третьи сутки проращивания происходит увеличение содержания
незаменимых аминокислот. Chandrasiri с коллегами [2] отметили исчезновение лигнина в семенах
сои, в исследованиях Bau и Debry [6] было показано снижение содержания фосфора и увеличение
содержания витамина С в бобах сои.
При этом установлено, что в результате комплекса
биохимических процессов, протекающих при проращивании семян, происходит деградация
антиалиментарных факторов – ингибиторов протеиназ, липазы, фитогемагглютининов, танинов.
Исследованиями Jaya, Venkataraman, Kon, Colmenares de Ruiz было доказано, что происходит
снижение содержания олигосахаридов и даже полное их исчезновении, при увеличении числа
растворимых углеводов [7,8,9], также отмечено снижение алкалоидов и фитатов через 180 часов
проращивания [10].
Необходимо выяснить проявляются ли данные закономерности, выявленные при
проращивании
семян,
в
белковых
препаратах
люпина,
модифицированных
методом
индуцированного автолиза.
В качестве объекта на втором этапе исследования были рекомендованы сорта люпина
узколистного, отличающиеся пониженным содержанием антиалиментарных факторов (табл. 1)
[11,12].
Таблица 1 - Содержание антиалиментарных факторов в семенах люпина узколистного и сои
Антиалиментарный
фактор
Алкалоиды, %
Олигосахариды (сумма
раффинозы, стахиозы и
вербаксозы), %
Фитаты, %
Сапонины, мг/кг
Лектины, %
Ингибиторы трипсина, %
Люпин узколистный
Минимальное
Максимальное
содержание
содержание
<0,01
0,04
2,90
0,32
442
5,20
0,84
740
Не обнаружено
Не обнаружено
Соя
Среднее
содержание
0,02
<0,01
4,07
7,3
0,50
573
1,75
4000
1,8
2,5
Анализируя данные таблицы 1, можно отметить, что содержание антиалиментарных
факторов в сое существенно выше, чем в семенах люпина узколистного. В семенах сои содержится значительное количество сапонинов, олигосахаридов раффинозной группы, фитатов,
лектинов и ингибиторов трипсина. Ряд антиалиментарных компонентов, таких как лектины и
9
ингибиторы трипсина, полностью отсутствовали в семенах люпина узколистного. Одной из
отличительных особенностей люпиновой муки является отсутствие у нее привкуса и запаха
бобовых.
Содержание алкалоидов в люпине узколистном находится на низком - безопасном уровне,
который, согласно принятой классификации [13], называют малоалкалоидным.
Представленные в таблице 1 данные характеризуют люпин узколистный, как безопасный
источник белка с низким содержанием антиалиментарных компонентов.
4.1
Исследование
степени
гидролитических
изменений
белков
в
процессе
индуцированного автолиза муки семян люпина
Определение концентрации белка микробиуретовым методом
Концентрацию белка в растворе определяли микробиуретовым методом [14]. Готовили
раствор биурета CuSO4NaOH, для этого смешивали 38%-ный NaOH (79 мл) и 1%-ный CuSO4·5H2O
(21 мл). Исследуемый раствор белка смешивали с биуретом в соотношение 2:1 и выдерживали 15
минут для прохождения реакции (происходит необратимое связывание пептидных связей белка с
ионами меди), после этого измеряли оптическую плотность полученного раствора на
спектрофотометре при длине волны 310 нм. В качестве контроля использовали дистиллированную
воду, смешанную с биуретовым реактивом в том же соотношении. Концентрацию белка
определяли по калибровочной кривой (зависимость оптической плотности от концентрации
белка), построенной по бычьему сывороточному альбумину (БСА).
Для построения калибровочной кривой готовили растворы БСА с концентрацией от 0,1
мг/мл до 0,7 мг/мл. БСА был выбран в качестве белка для построения калибровочной кривой, в
связи с хорошей изученностью свойств и относительно невысокой ценой. Бычий сывороточный
альбумин, БСА (bovine serum albumine, BSA) – белок плазмы крови быка, состоящий из 582
аминокислот, используемый как носитель и в качестве стандарта при различных белковых
анализах, а также как стандартный антиген при определении изменения иммунного ответа под
действием иммуномодуляторов или других факторов.
Исследование динамики изменения концентрации белка муки люпина в процессе
индуцированного автолиза
Для того чтобы охарактеризовать гидролитические изменения белка в процессе индуцированного автолиза и сопоставить их с данными, полученными при проращивании, нами был
использован микробиуретовый метод определения концентрации белка.
10
Определение белка проводили до начала автолиза и через 24, 48 и 72 часа автолиза.
Параллельно с опытом осуществлялся контроль, аналогично опыту, но без внесения в суспензию
муки люпина куриного пепсина. Полученные результаты представлены в таблице 2 и на рис. 1.
Таблица 2 - Изменение концентрации (С) белка в муке люпина в зависимости от времени автолиза
C белка по биурету, C белка по биурету,
Δ*
мг/мл, опыт
мг/мл, контроль
0
26,39+0,70
22,79+0,4
3,60+0,01
24
31,84+0,50
29,19+0,4
2,65+0,05
48
37,79+0,50
36,00+0,5
1,79+0,05
72
34,79+0,50
33,59+0,3
1,20+0,01
*Δ - разность значений С белка (по биуретовому методу), мг/мл, между опытом и контролем
Время автолиза, ч
R2 = 0,9896
4
3,5
3
Δ C, мг/мл
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
10
20
30
t, ч
40
50
60
70
80
Рисунок 1 - Изменение концентрации белка в растворе в зависимости от времени автолиза
Представленная на рис. 1 зависимость позволяет констатировать более высокую скорость
гидролиза белка в пробах опыта, по сравнению с контролем.
Полученные результаты коррелируют с литературными данными об изменении запасных
белков при прорастании семян. В работах Wilson с коллегами [15] описан распад основных
запасных белков соевых бобов во время проращивания. В пользу снижения концентрации белков
говорят данные, полученные Colmenares de Ruiz и Bressani, о значительном увеличении
содержания свободных аминокислот в проращенных семенах амаранта [7]. В работе Hwei-Ming
11
Bau и Christian Villaume также говорится о распаде основных запасных веществ – крахмала,
белков, триглицеридов во время прорастания семян [2].
Исследование динамики гидролитических изменений белков в процессе индуцированного
автолиза методом ВЭЖХ на гель-фильтрационной колонке
Протеолизом белка называется гидролиз белка с помощью протеолитических ферментов.
Протеолиз с образованием устойчивого высокомолекулярного продукта называют ограниченным
протеолизом. Ограниченный протеолиз наряду с индуцированным автолизом является одним из
наиболее перспективных методов регулирования функциональных свойств пищевых белков, в
частности легуминов зернобобовых [7,16]. При ограниченном протеолизе запасных белков
образуются высокомолекулярный компонент (модифицированный белок), а также пептиды с
существенно более низкой молекулярной массой [17,18,19]. В зависимости от требований,
предъявляемых к свойствам белкового компонента пищевого продукта, возникает задача
получения в процессе гидролиза преимущественно либо модифицированного белка, либо
пептидов. Так, для обеспечения способности стабилизировать пены и эмульсии необходимо,
чтобы в гидролизате содержался модифицированный белок [20,21,22], а для улучшения
растворимости белкового препарата, плохо растворимого в заданных условиях, желательно, чтобы
гидролизат состоял в основном из пептидов [21,22]. Таким образом, для получения гидролизата
белка с требуемыми свойствами необходимо уметь управлять процессом гидролиза. Поэтому
основными направлениями в области применения индуцированного автолиза являются
исследования функциональных свойств модифицированного белка и изучение механизма
автолиза.
На основании кинетических данных гидролиза запасных 11 S и 7S белков зернобобовых
ферментами животного и растительного происхождения обнаружены общие закономерности
механизма гидролиза этих белков. В настоящее время изучено действие гидролиза трипсином,
химотрипсином, пепсином, эндогенными и экзогенными протеназами на легумины семян вики,
сои, гороха, кормовых бобов и др. культур [17,23, 24,25,26,27,28]. В ходе протеолиза легуминов
перечисленных культур выделяют две основные стадии.
В течение первой, относительно быстрой стадии, наблюдаются качественные изменения
белка: увеличение его отрицательного заряда, снижение молекулярной массы начинается за счет
отщепления фрагментов С-концевого участка - (кислых) цепей. Чувствительность к протеолизу
этого участка - цепей является общей характеристикой легуминов многих семян. Молекулярная
масса - (основных) цепей 11 S глобулинов на этой стадии протеолиза остается неизменной
12
[24,26,27,29], за исключением 11 S глобулина сои (глицинина), при гидролизе которого
наблюдается незначительное снижение на (0,5 – 1,0 кДа) молекулярной массы - цепей в их Сконцевой области [28]. Следует отметить, что при действии фермента на легумины различных
культур происходит отщепление различных (по молекулярной массе и аминокислотной
последовательности) фрагментов кислых цепей, о чем свидетельствуют данные электрофореза
при гидролизе трипсином 11 S глобулинов сои [30] и вики [17]. Наблюдаемые изменения
субъедичного состава белков при гидролизе происходят только до определенного предела, после
чего молекулярная масса образовавшихся крупных фрагментов кислых субъединиц остается
неизменной, тогда как их содержание изменяется. При количественной оценке степени гидролиза
легуминов
обнаруживается
их
способность
к
глубокому
расщеплению
трипсином,
химотрипсином, пепсином и эндогенными протеиназами [17,31,32]. В этих работах показано, что
постоянство молекулярной массы основных субъединиц и фрагментов кислых субъединиц
является следствием второй стадии гидролиза, при котором происходит глубокое расщепление
молекул субстрата. Скорость второй стадии гидролиза значительно ниже, чем первой. На этом
этапе, продолжающемся, по-видимому, вплоть до полного исчезновения высокомолекулярного
белка в гидролизате [17], молекулярная масса и электрофоретическая подвижность частично
гидролизованного легумина остаются неизменными.
Изменения легуминов в течение первой стадии протеолиза трипсином, химотрипсином и
пепсином, указывают на последовательный или «zipper» [33] механизм протеолиза. При
последовательном протеолизе скорость каждой последующей стадии значительно меньше
предыдущей. Вследствие этого последовательный протеолиз протекает упорядоченно и позволяет
обнаружить
промежуточные
продукты
определенного
состава.
Характерным
признаком
последовательного протеолиза является уменьшение молекулярной массы высокомолекулярного
остатка белка при сохранении его молярной концентрации. Завершение первой стадии протеолиза
соответствует образованию устойчивого высокомолекулярного продукта [30,34].
Вторая стадия протеолиза развивается по одиночному («one-by-one» [33]) механизму, при
котором происходит поочередное (поодиночное ) глубокое расщепление молекул субстрата.
Вероятно, на первом этапе скорость «поодиночного» расщепления легумина мала, но она
возрастает по мере развития конформационных изменений белка [17]. По характеру действия
молекул фермента на молекулы белка первая стадия протеолиза является ‘некооперативной’, а
вторая стадия имеет ‘кооперативный’ характер [27].
13
В процессе гидролиза легуминов эндогенными протеиназами А и В in vitro прослеживаются
другие закономерности. Уже с самого начала процесса гидролиз легумина вики протеиназой А
носит смешанный характер. Преобладает поодиночный («one-by-one») механизм протеолиза, но
одновременно наблюдается и последовательный («zipper») протеолиз. Протеиназа В не
действующая на нативный легумин, расщепляет легумин, модифицированный ограниченным
гидролизом протеиназой А, практически только поодиночно. При увеличении степени
предварительного
воздействия
протеиназы
А
скорость
поодиночного
расщепления
модифицированного легумина протеиназой В вначале остается постоянной, а затем постепенно
возрастает. Особенности хода протеолиза этими ферментами определяются специфичностью их
действия [32].
Критерием получения модифицированного белка служит постоянство молекулярной массы
в ходе протеолиза. На кинетической кривой этот момент соответствует смене типов протеолиза.
Условия получения устойчивого промежуточного продукта для различных культур неодинаковы.
Так, например, в случае гороха и кормовых бобов образованию легумина-Т соответствует время
гидролиза порядка 15 мин. при соотношении фермент/субстрат 1/1000 [25]. Для получения
легумина-Т (глицинина-Т) сои требуется время порядка 60 мин. при отношении фермент/субстрат
1/250 [26,30]. Поэтому различия в кинетике протеолиза легуминов различных культур могут
приводить к различиям в структуре и свойствах модифицированных белков этих культур.
В процессе проращивания семян происходит изменение структуры запасных белков и их
молекулярной массы. В литературе описан процесс распада запасных белков при проращивании
бобов сои [15]. Согласно этим данным, в процессе проращивания уменьшается содержание белков
с большой молекулярной массой, и появляются субъединицы с меньшим молекулярным весом.
Наиболее существенные изменения в молекулярной массе белков происходят на вторые сутки
проращивания [2,35].
Установлено, что изменение условий протекания гидролитической реакции, таких, как рН,
температура, концентрация субстрата (белка), отношение концентраций фермента и субстрата
(E/S), может влиять как на кинетику, так и на механизм гидролитической реакции, а значит и на
свойства продуктов реакции [23,33,36]. Так, в работе [37] исследованы кинетика и механизм
гидролиза
легумина
кормовых
бобов
трипсином
при
различных
фермент-субстратных
отношениях. Установлено, что уменьшение фермент-субстратного отношения приводит не только
к непропорциональному снижению скорости гидролиза, но и к снижению относительного вклада
‘кооперативного’
гидролиза.
Изменение
E/S
14
отношения
сопровождается
изменением
субъединичного состава продукта ‘некооперативного’ гидролиза - модифицированного белка,
изменением температуры и энтальпии его денатурации. Кроме того, при увеличении
концентрации фермента наблюдается увеличение значений относительной гидрофобности
модифицированного белка и изменение эмульгирующих свойств [18].
Определение изменения молекулярной массы белков методом гель-фильтрации
Для определения степени гидролитических изменений, происходящих в белках люпина во
время индуцированного автолиза (определения изменения молекулярной массы белков), нами был
использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии на гель-фильтрационной
колонке (ВЭЖХ). Сущность метода состоит в том, что в хроматографическом процессе
происходит фракционирование исходной смеси молекул на зоны в зависимости от их размеров.
Соответствующие хроматографические зоны мигрируют с различными скоростями и выходят из
колонки ввиде разделившихся пиков. Крупные молекулы вместе с подвижной фазой двигаются
вдоль колонки быстрее, т.е. зоны выходят из колонки в порядке убывания молекулярной массы
белков.
Гель – фильтрация – хроматографичекий метод фракционирования молекул по их
размерам. Среди используемых жестких пористых матриц главную роль играет силика-гель.
Неподвижная фаза представлена жидкостью, находящейся внутри пористых, хорошо смачиваемых
гранул, заполняющих хроматографическую колонку. Если на такую колонку подается
растворенное в элюенте смесь молекул различных размеров, то крупные молекулы, не способные
проникнуть внутрь гранул, будут двигаться вдоль колонки вместе с подвижной фазой. В то же
время наиболее мелкие молекулы, размеры которых заведомо меньше диаметра пор в гранулах,
будут равномерно распределяться между подвижной и неподвижной фазами. Для них будет
осуществляться
хроматографический
процесс
с
присущим
ему
замедлением
миграции
хроматографической зоны. Для молекул промежуточной величины благодаря статистическому
распределению размеров пор окажется доступной только часть объема неподвижной фазы. Зоны
таких молекул будут мигрировать вдоль колонки быстрее, чем мелкие молекулы, но медленнее,
чем крупные. В результате произойдет фракционирование исходной смеси молекул на зоны в
зависимости от их размеров. Зоны выходят из колонки в порядке убывания этих размеров. В
простейшем случае, когда в исходной смеси содержатся молекулы только двух категорий
(крупные и мелкие), гель-фильтрация позволяет осуществить «сортировку» этих молекул. Смесь
молекул нескольких промежуточных размеров в ходе гель-фильтрации разделяется на ряд
дискретных групп, различающихся между собой по степени доступности для них объема внутри
15
гранул. Соответствующие хроматографические зоны мигрируют с различными скоростями и
выходят из колонки в виде разделившихся «пиков» [38].
Пробоподготовка осуществлялась аналогично определению степени гидролитических
изменений ТХУ растворимых пептидов. Пробы отбирались после трех часов гидролиза и на
протяжении всего процесса автолиза со следующим интервалом 0, 48, 72 часа.
Условия хроматографии: хроматограф Gilson, колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5);
элюент - 50мM К-фосфатный буфер, pH 7,6; скорость протока - 0,5 мл/мин, УФ-детектирование
при 254 нм. Объем вводимой пробы - 100 мкл, концентрации белка - 10 мг/мл.
Параллельно с опытом осуществлялся контроль, аналогично опыту, но без внесения в
суспензию муки люпина куриного пепсина. Полученные результаты измерения гидролитических
изменений белков муки люпина представлены на рисунках 2,3,4,5,6,7,8,9. В таблицах
3,4,5,6,7,8,9,10 указаны время выхода фракций, различающихся по молекулярной массе, значения
площадей пиков, характеризующие концентрацию каждой конкретной фракции, доля каждой
фракции, в % к общему содержанию белка. Данные получены автоматически в ходе обработки
хроматограмм специальным программным обеспечением.
16
Рисунок 2 - Гель-хроматограмма контрольной пробы (интенсивное гидратирование в
течение 3 часов, рН 4,0) белков муки люпина. Условия хроматографии: колонка TSK-Gel
G2000SW (300 х 7,5); элюент - 50мM К-фосфатный буфер, pH 7,6; скорость протока - 0,5 мл/мин;
УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой пробы - 100 мкл. Концентрация пробы - 10
мг/мл
Таблица 3 - Результаты хроматографического анализа контрольной пробы белков муки люпина
(интенсивное гидратирование в течение 3 часов, рН 4,0): время выхода фракций, площадь пиков
фракций, доля фракции в общем белке
№
пика
п/п
1
2
3
4
Характеристика хроматограммы контрольной пробы
Доля фракции в общем
Время выхода пика, мин.
Площадь пика
содержании белка, %
13:09
4770,1
11,14
18:12
4064,1
9,49
23:16
6168,7
14,41
27:34
11931,8
27,87
17
5
6
Итого
29:59
34:45
5494,7
10375,6
42805,0
12,84
24,24
100,0
Рисунок 3 - Гель-хроматограмма пробы опыта (протеолиз белков муки люпина куриным
пепсином в течение 3 часов, при соотношении E/S=1/50, рН 4,0). Условия хроматографии: колонка
TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент - 50мM К-фосфатный буфер, pH 7,6; скорость протока - 0,5
мл/мин; УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой пробы - 100 мкл. Концентрация пробы 10 мг/мл
Таблица 4 - Результаты хроматографического анализа пробы опыта (протеолиз белков муки
люпина куриным пепсином в течение 3 часов, при соотношении E/S=1/50, рН 4,0): время выхода
фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке
№ пика
п/п
1
2
3
Характеристика хроматограммы пробы опыта
Доля фракции в общем
Время выхода пика, мин.
Площадь пика
содержании белка, %
13:27
4236,3
8,5
18:20
6181,6
12,4
23:19
8663,9
17,38
18
4
27:04
10263,9
20,6
5
28:14
9116,8
18,3
6
33:22
11373,3
22,82
Итого
49835,8
100,0
При сравнении хроматограмм опыта (рис.3) и контроля (рис.2) на первом этапе индуцированного автолиза (протеолиз), заметно, что содержание фракции с большим молекулярным
весом (пик 1) несколько меньше, а фракции с меньшим молекулярным весом (пик 5) больше, чем в
контрольной пробе, такое различие обусловлено действием куриного пепсина, внесенного в пробу
опыта
и
вызвавшего
гидролитические
изменения
в
белке,
в
виде
расщепления
высокомолекулярного белка, при этом происходит увеличение содержания белка с меньшим
молекулярным весом.
Рисунок 4 - Гель-хроматограмма контрольной пробы (0 часов, рН 7,0) белков муки люпина
Условия хроматографии: колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент - 50мM К-фосфатный
буфер, pH 7,6; скорость протока - 0,5 мл/мин; УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой
пробы - 100 мкл. Концентрация пробы - 10 мг/мл
Таблица 5 - Результаты хроматографического анализа контрольной пробы белков муки люпина (0
часов, рН 7,0): время выхода фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке
19
N пика
по п/п
1
2
3
4
5
6
Итого
Характеристика хроматограммы контрольной пробы
Доля фракции в общем
Время выхода пика, мин.
Площадь пика
содержание белка, %
21:18
4430,3
12,34
29:11
4306,4
12,0
36:52
10008,1
27,89
42:40
7769,5
21,65
47:38
3581,1
9,98
54:14
5792,0
16,14
35887,4
100,0
Рисунок 5 - Гель-хроматограмма пробы опыта (автолиз 0 часов, рН 7,0) белков муки люпина.
Условия хроматографии: колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент - 50мM К- фосфатный
буфер, pH 7,6; скорость протока - 0,5 мл/мин; УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой
пробы - 100 мкл. Концентрация пробы - 10 мг/мл
Таблица 6 - Результаты хроматографического анализа пробы опыта белков муки люпина (автолиз
0 часов, рН 7,0): время выхода фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке
N пика по
п/п
Характеристика хроматограммы пробы опыта
Время выхода пика, мин.
Площадь пика
Доля фракции в общем
20
содержание белка, %
1
21:00
4710,3
12,36
2
29:01
4358,6
11,44
3
36:34
11247,5
29,53
4
42:08
7889,9
20,71
5
47:01
3926,5
10,31
6
53:34
5962,3
15,65
Итого
38095,1
100,0
Исходя из представленных в таблице 5, 6 и на рис. 4,5 данных, разница между пробами
опыта и контроля в нулевой точке автолиза (рН 7,0) по содержанию фракций разного
молекулярного веса очень незначительна, возможно, это связано с тем, что при изменении рН с 4,0
до 7,0, внесенный фермент куриный пепсин уже перестал действовать, а собственные эндогенные
протеазы еще не активизировались.
Рисунок 6 - Гель-хроматограмма контрольной пробы (48 часов, рН 7,0) белков муки люпина.
Условия хроматографии: колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент- 50мM К- фосфатный
буфер, pH 7,6; скорость протока-0,5 мл/мин, УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой
пробы-100 мкл. Концентрация пробы 10 мг/мл.
21
Таблица 7 - Результаты хроматографического анализа контрольной пробы (48 часов, рН 7,0):
время выхода фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке.
N пика
по п/п
1
2
3
4
5
6
Итого
Характеристика хроматограммы контрольной пробы
Доля фракции в общем
Время выхода пика, мин.
Площадь пика
содержание белка, %
20:06
4125,8
14,28
28:02
3987,6
13,81
35:07
8409,8
29,12
40:59
5456,9
18,89
45:27
3109,0
10,76
51:45
3794,3
13,14
28883,4
100,0
Рисунок 7- Гель-хроматограмма пробы опыта (автолиз 48 часов, рН 7,0) белков муки люпина.
Условия хроматографии: колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент- 50мM К- фосфатный
буфер, pH 7,6; скорость протока-0,5 мл/мин, УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой
пробы-100 мкл. Концентрация пробы 10 мг/мл.
Таблица 8 - Результаты хроматографического анализа пробы опыта (автолиз 48 часов, рН 7,0):
время выхода фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке.
22
N пика
по п/п
1
2
3
4
5
6
Итого
Характеристика хроматограммы пробы опыта
Доля фракции в общем
Время выхода пика, мин.
Площадь пика
содержание белка, %
20:51
4530,4
12,96
27:52
4485,7
12,83
34:42
9595,7
27,45
41:05
7396,3
21,16
45:19
4205,7
12,03
51:51
4745,8
13,57
34959,6
100,0
Рисунок 8 - Гель-хроматограмма контрольной пробы (72 часа, рН 7,0) белков муки люпина.
Условия хроматографии: колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент - 50мM К- фосфатный
буфер, pH 7,6; скорость протока - 0,5 мл/мин; УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой
пробы - 100 мкл. Концентрация пробы - 10 мг/мл
Таблица 9 - Результаты хроматографического анализа контрольной пробы белков муки люпина
(72 часа, рН 7,0): время выхода фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке
23
N пика
по п/п
1
2
3
4
5
6
Итого
Характеристика хроматограммы контрольной пробы
Доля фракции в общем
Время выхода пика, мин.
Площадь пика
содержание белка, %
20:04
4615,8
14,93
26:31
7736,8
25,03
33:27
6509,3
21,06
39:28
5483,3
17,74
43:05
2485,3
8,04
49:42
4079,5
13,2
30910,0
100,0
Рисунок 9 - Гель-хроматограмма пробы опыта (автолиз 72 часа, рН 7,0) белков муки люпина.
Условия хроматографии: колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент - 50мM К- фосфатный
буфер, pH 7,6; скорость протока - 0,5 мл/мин; УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой
пробы - 100 мкл. Концентрация пробы - 10 мг/мл
Таблица 10 - Результаты хроматографического анализа пробы опыта белков муки люпина (автолиз
72 часа, рН 7,0): время выхода фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке
N пика
по п/п
Характеристика хроматограммы пробы опыта
Время выхода пика, мин.
Площадь пика
Доля фракции в общем со24
1
2
3
4
5
6
Итого
20:14
26:43
33:27
39:39
43:25
49:35
4328,2
4905,7
6646,0
5326,8
4049,9
4299,5
29556,1
держание белка, %
14,64
16,6
22,49
18,02
13,7
14,55
100,0
Данные, представленные на рис. 8,9 и в таблицах 9,10 позволяют сказать, что в процессе
автолиза идет уменьшение содержания высокомолекулярных фракций и увеличение содержания
низкомолекулярных. При сравнении содержания первых трех пиков, которые отличаются более
высокой молекулярной массой, заметно, что в пробе опыта по сравнению с контролем содержание
этих фракций на 7,3% меньше, что позволяет нам говорить об автолитических процессах,
происходящих в белке муки бобов люпина.
Исходя
из
представленных
на
рис.
2,3,4,5,6,7,8,9
хроматограмм
и
сущности
хроматографического метода, можно сделать вывод, что в ходе автолиза происходит увеличение
содержания белков с меньшим молекулярным весом. Особенно заметно эта тенденция
проявляется на 3 сутки автолиза (72-х часовые пробы). Изменение молекулярного веса белков
приводит к изменению технолого-функциональных свойств белковых препаратов люпина.
Определение содержания белка в муке люпина и сои
Пищевая ценность и функционально-технологические свойства белковых препаратов
зависят непосредственно от их химического состава. Было проанализировано содержание белка в
исследуемых белковых препаратах: нативной муке люпина, модифицированной муке люпина и
нативной соевой муке (дезодорированной).
Определение концентрации белка проводилось по методу Къельдаля в соответствии с
ГОСТ Р 51417-99. Сущность метода заключается в разрушение органического вещества серной
кислотой в присутствии катализатора. Высвобождение продукта реакции щелочью, отгонка и
титрование выделяющегося аммония, вычисление содержания азота, пересчет на сырой протеин
(коэффициент 6,25) [39].
Результаты, полученные при определении содержания белка в исследуемых образцах,
показаны в таблице 11.
Таблица 11 - Содержание белка в исследуемых образцах, %
Вид белкового препарата
25
Содержание белка, % (в
пересчете на сухой вес)
Нативная мука
люпина
Модифицированная
мука люпина
Мука соевая
42,6±0,26
43,0±0,17
44,3±0,15
Исходя из полученных данных, видно, что содержание белка в муке сои незначительно
выше, чем в муке люпина, соответственно 44,3 и 42,6-43,0%. Нативная и модифицированная мука
люпина по количеству белка не различались. По содержанию белка мука люпина незначительно
уступает соевой муке – на 1,3%.
4.2 Исследование динамики изменения углеводов и фитатов люпина в процессе
индуцированного автолиза
Антиалиментарные компоненты люпина представлены в первую очередь алкалоидами.
Содержание алкалоидов колеблется в семенах от 0,05 до 4,0%, в листьях — от 0,05 до 1,5% (на
сухое вещество). В настоящее время у различных видов люпина найдено около 20 алкалоидов. По
распространению и их количественному содержанию основными алкалоидами являются люпинин,
лупанин, спартеин и гидроксилупанин. В последнее время установлено, что некоторые алкалоиды
горького люпина имеют фармакологическую ценность, экстракты этих алкалоидов снижают
артериальное давление, влияют на моторную и психическую деятельность, не оказывают при этом
наркотического воздействия [40,41,42].
Существует несколько технологий снижения содержания алкалоидов до предельно
допустимой нормы (например, вымачивание в воде). Специалистами постоянно ведется селекция
на выведение низкоалкалоидных сортов. Уже выведены безалкалоидные сорта люпина, например,
L.angustifolius, который выращивают во многих странах [42,43].
Одним из достоинств люпина является меньшее количество ингибиторов протеаз, по
сравнению другими бобовыми культурами. Количество ингибиторов трипсина в зерне желтого и
узколистного люпина в 3-4 раза меньше, чем в кормовых бобах, в 4-10 раз, чем в горохе, и в 100
раз ниже, чем в зерне сои. Содержание другого антиалиментарного фактора – сапонинов в
зависимости от сорта люпина колеблется в широких пределах от 0 до 450 мг/кг. Для пищевых
целей используют сорта с низким уровнем содержания сапонинов. Также установлено, что такой
компонент, как геммаглютины, в экстрактах из сырых семян разных сортов люпина имеют низкую
активность.
26
Таким образом, ряд антиалиментарных соединений, характерных для семян бобовых
культур, в семенах люпина отсутствует или их количества минимальны, что является его
преимуществом перед другими бобовыми культурами [40, 42,44,45].
4.2.1 Изучение динамики изменения фитатов люпина в процессе индуцированного
автолиза
Фитаты известны как основной фосфорсодержащий компонент растений (являются
запасающей формной фосфора и инозитола в семенах), их содержание колеблется от 1 до 6% в
бобовых, злаковых и масличных семенах [46].
Фитаты представляют собой соли фитиновой кислоты и встречаются чаще всего в форме
смешанного фитата кальция и магния. Фосфор, содержащийся в фитатах, составляет наибольшую
часть (70-80%) от общего содержания фосфора в большинстве семян. Содержание фитатов связано
с морфологическим строением семян, например, у злаков, таких как пшеница, овес, содержание
фитатов выше в алейроновом слое, а у кукурузы 80% фитатов содержится в зародыше. На
содержание фитатов в семенах также влияют агротехнические факторы. В таблице 12
представлены данные по содержанию фитатов в злаковых и бобовых культурах.
Таблица 12 - Содержание фитатов в злаковых и бобовых культурах, г/100г продукта
Продукт
Пшеница
Пшеничные отруби
Сладкая кукуруза
Ячмень
Овес
Соя бобы
Соевая мука обезжиренная
Соя изолят
Соя концентрат
Содержание
фитатов
1,05
6,7
1,06
1,18
1,42
1,75
2,3
0,82
1,01
Продукт
Фасоль обыкновенная
Люпин
Изолят белка люпина
Горох
Нативная клейковина
Кормовые бобы
Бобы
Коричневый рис
Чечевица
Содержание
фитатов
1,69
1,63
1,43
1,23
1,9
0,98
1,44
1,6
0,7
Соединение фитатов с белками происходит в процессе созревания, когда они аккумулируются в алейроновом слое и в эндосперме бобов.
Доказано, что дефицит цинка, железа, магния и кальция в организме человека связан с
наличием фитатов в пище, т.е. фитин нарушает усвоение этих веществ, т.к. фитиновая кислота
является хелатирующим агентом, т.е. соединяется с двух- или трехвалентными катионами.
Установлено, что декальцинирующий эффект фитатов тем выше, чем меньше соотношение
кальция и фосфора в продукте и ниже обеспеченность организма витамином D [47,48,49].
27
Витамин А частично ингибирует эффект, оказываемый фитатами на абсорбцию железа.
Присутствие витамина А увеличивает усвоение железа при потреблении риса в три раза, в 2,4 раза
при потребление продуктов из пшеницы. Эти данные возможно говорят о том, что витамин А и
бета - каротин формируют комплекс с железом, сохраняющим его способность растворяться в
кишечном содержимом, предотвращают ингибирующий эффект фитинов и полифенолов на
абсорбцию железа [50].
Фитиновая кислота оказывает влияние на снижение активности пищеварительных
ферментов (амилаза, протеаза, липаза) [46]. Поступление значительных количеств фитиновой
кислоты с растительной пищей может способствовать развитию такого заболевания организма
человека как рахит [47].
Необходимо отметить, что у фитатов выявлены также и положительные свойства:
способность связывать и выводить из организма радионуклиды, ионы тяжелых металлов.
Антиоксидантное свойство фитатов имеет большое значение для кожи, т.к. окислительный стресс
напрямую связан с уменьшением воспалительного процесса. Кроме того в концентрациях 2-4%
фитиновая кислота эффективно применяется для лечения эпидермальной милазмы. Способность
фитатов к комплексообразованию с металлами успешно используется для предотвращения
образования камней в почках. Также была открыта их роль, как вторичного месенджера во
внутриклеточной системе передачи сигналов (в системе сигнальной трансдукции).
Фитаты оказывают положительное влияние на здоровье пожилых людей, препятствуя
усвоению ряда минеральных веществ, тем самым помогая избежать гиперминерализацию
кровяных телец, связок и других частей тела [51]. Инъекция солей фитиновой кислоты в мозг крыс
приводит к изменениям в частоте сердцебиения и давлении крови, степень которых зависит от
дозы. Сила и специфичность эффектов позволяет предположить, что эти молекулы участвуют в
контроле кровяного давления со стороны центральной нервной системы. Фитиновая кислота
используется как пищевая добавка в качестве консерванта Е391.
Несмотря на выше обозначенные положительные свойства фитиновой кислоты и ее солей, с
точки зрения пищевой химии и безопасности питания, фитаты, как компонент пищевых
продуктов, следует рассматривать в качестве антиалиментарного фактора, содержание которого
необходимо
снижать.
Способность
фитатов
к
образованию
комплексов
с
макро
и
микроэлементами особенно опасно для детей, а также для жителей развивающихся стран (т.к.,
согласно статистическим данным, получение ими растительных белков обеспечивается за счет
потребления зерновых культур).
28
Изменение содержания фитатов влияет как на пищевую ценность белковых препаратов, так
и на их функциональные свойства [46].
Метод определение содержания фитатов
Для определения фитиновой кислоты и ее солей использовали метод непрямого количественного анализа фитатов в пищевых продуктах. Метод основан на экстракции фитатов 2,4%
соляной кислотой, последующим центрифугированием полученной суспензии и пропусканием
отобранного супернатанта через анионообменную колонку, где фитаты элюируются раствором
определенной
NaCl
концентрации.
Полученный
элюат
используется
для
определения
концентрации фитатов спектрофотометрическим методом.
Пробоподготовка состоит из следующих этапов: 1) 1 г пробы экстрагируют 20 мл 2,4% HCl
в течение 2 часов. Если исследуемый образец отличается повышенной концентрацией жиров
(более 5%), то перед экстракцией соляной кислотой необходимо провести обезжиривание. 2)
Полученную суспензию центрифугируют 30 минут, скорость 8000 оборотов/минуту («JanetzkiT24», Германия). Супернатант в дальнейшем используют для определения в нем фитиновых
кислот.
В работе использовали стеклянную колонку размером 0,7 x 15 см, которую набивали 1,5 г
смолы (AG 1x4 хлорная форма). Подготовка колонки к работе включала промывку колонки 15 мл
0,7 н NaCl и 30 мл дистиллированной воды.
Перед нанесением пробы на колонку проводят разбавление, измеряют значение pH
раствора и при помощи 1,0 н NaOH доводят его до 6,0. Из приготовленного раствора отбирают 10
мл и наносят на колонку. Проводят элюирование 15 мл 0,1 н NaCl (для удаления неорганических
фосфатов), скорость протока - 1мл/мин. Затем фитаты элюируют 15 мл 0,7 м NaCl. Полученный
элюат используют для спектрофотометрического анализа.
До определения оптической плотности на спектрофотометре, необходимо довести pH
элюата до 3,0 при помощи 1 н HCl. Полученный раствор смешивают с реагентом Wage (смесь 0,03
% FeCl3*6H2O c 0,3 % сульфосалициловой кислотой в дистиллированной воде) в соотношении 3:1
и интенсивно перемешивают 5 секунд. Измерение проводят против воды на спектрофотометре при
длине волны 500 нм, в 1 см³ кварцевой кювете. Концентрация фитиновой кислоты и ее солей
определяют, исходя из предварительно построенной калибровочной кривой [49,51,52].
Определение изменения содержания фитатов в процессе индуцированного автолиза методом
анионообменной хроматографии
29
Как отмечалось ранее, в большинстве работ, посвященных изучению изменения содержания фитатов в процессе проращивания семян, были получены результаты, говорящие о
значительном снижение содержания фитатов [7,10,53]. Dagnia, и Petterson [54] в своих
исследованиях отмечали снижение фитата в проращенных семенах в три раза, Reddy с коллегами
[55] отмечал снижение содержания фитатов на 20,5-77,5%, в зависимости от вида бобовых.
Большинство исследователей отмечают, что снижение содержания фитиновый кислоты идет на
пятый день проращивания, однако, скорость снижения содержания фитатов зависит от вида и
сорта бобовых [53].
Для оценки изменения содержания фитатов в муке бобов люпина в процессе индуцированного автолиза, нами был выбран методом непрямого количественного анализа с использованием анионообменной хроматографии. Пробоподготовка для измерения количества
фитатов осуществлялась аналогично определению степени гидролитических изменений ТХУ
растворимых пептидов. Пробы отбирались через 3 часа гидролиза и 72 часа автолиза. В полученных пробах определяли содержание фитатов. Параллельно с опытом осуществлялся
контроль, аналогично опыту, но без внесения в суспензию муки люпина куриного пепсина.
Полученные результаты представлены в таблице 13 и на рис. 10.
Таблица 13 - Содержание фитатов в исследуемых пробах, мг/г
Содержание фитатов,
мг/г
Проба опыта
(гидролиз 3
часа, pH 4,0)
Контрольная
проба (3 часа,
pH 4,0)
Проба опыта
(автолиз 72
часа, pH 7,0)
Контрольная
проба (72
часа, pH 7,0)
9
11,73
7,66
10,43
Согласно данным, представленным в таблице 13 и на рис. 10, содержание фитиновых
кислот в пробе опыта после 3 часов гидролиза, по сравнению с контролем, уменьшилось на 23,27
%.
30
Содержание фитатов, мг/г
14
11,73
12
10,43
9,00
7,66
10
8
Контроль
Опыт
6
4
2
0
Гидролиз 3 часа
Автолиз 72 часа
Рисунок 10 Изменение содержания фитатов в муке семян люпина в процессе индуцированного автолиза, в
сравнении с нативной мукой люпина
Содержание фитиновых кислот в пробе автолизата через 72 часа автолиза, по сравнению с
контролем, уменьшилось на 26,55 %. Полученные данные позволяют сказать, что в процессе
индуцированного автолиза происходит значительное снижение содержание фитатов с 11,73 мг до
7,66 мг, т.е. на 34,7%.
Определение содержания фитатов в образцах муки люпина и сои
Для того чтобы характеризовать безопасность исследуемых образцов, как белковых
добавок в пищевых продуктах, необходимо определить содержание в них антиалиментарных
факторов, одним из которых являются фитиновая кислота и ее соли.
Согласно литературным данным, провидимые учеными исследования по усвоению железа,
содержащегося в зерновых кашах, показали, что в некоторых случаях происходит увеличение
усвоения железа в 12 раз при условии уменьшения содержания фитатов. Другая часть
исследований, посвященная усвоению цинка и кальция, показала, что при употреблении
испытуемыми хлеба, содержащего фитаты в нативной форме, происходило усвоение цинка в
количестве 23%, а кальция - 13%, в то время как люди, употреблявшие в пищу хлеб, из которого
были удалены фитаты, абсорбировали 30% цинка и 30% кальция [47].
31
Необходимость измерения фитатов во многом связана с тем, что интенсивном развитии
сельского хозяйства активно используются удобрения, которые растения аккумулируют из почвы,
что значительным образом влияет на содержание фосфора в растениях. По оценкам,
приблизительно 35 миллионов тонн фитиновой кислоты, включающей в себя 9,9 миллионов тонн
фосфора соединено с 12, 5 и 3,9 миллионами тонн калия и магния соответственно и образует
ежегодно 51 миллион тонн фитатов.
На современном этапе развития селекции происходит выведение различных сортов
зерновых культур с пониженным содержанием фитиновой кислоты, уже выведены гибриды маиса
и овса, отличающиеся пониженным содержанием фитатов, но сохраняющие содержание фосфора
на прежнем уровне.
Количество фитатов может быть оценено методами, окисления железа, бумажной
хроматографией, тонкослойной хроматографией, гель-хроматографией [46].
Для определения в исследуемых белковых препаратах содержания фитатов был
использован метод непрямого количественного анализа фитатов в пищевых продуктах (подробно
описан в подразделе 4.1). Полученные значения содержания фитатов в исследуемых образцах
представлены в таблице 14.
Таблица 14 - Содержание фитатов в исследуемых образцах муки люпина и сои, мг/г
Вид муки
Содержание фитатов, мг/г
Мука люпина
модифицированная
7,66
Соевая мука
17,50
Полученные результаты позволяют сказать, что содержание фитатов в люпине в два раза
ниже, чем в сое. Снижение содержания фитатов позволит повысить пищевую ценность продуктов
с белковой добавкой из муки люпина модифицированного.
4.2.2 Изучение динамики изменения углеводов люпина в процессе индуцированного
автолиза
Еще одной группой антиалиментарных веществ бобовых культур являются олигосахариды
рафинозной группы. К наиболее важным олигосахарам, которые необходимо отделять от белка,
относятся раффиноза и стахиоза. Они содержатся в семенах бобовых и масличных культур, травах
и листьях. Содержание олигосахаридов рафинозной группы в бобовых культурах показано в
таблице 15 [40].
Таблица 15 - Содержание олигосахаридов рафинозной группы в бобовых культурах, %
32
Бобовые
Нут обыкновенный
Вигна
Фасоль обыкновенная
Чечевица
Горох
Соя
Рафиноза
1,1
0,4
0,2
0,9
0,6
1,1
Стахиоза
2,5
4,8
1,2
2,7
1,9
5,4
Вербаскоза
0,5
4,0
1,4
2,2
-
У многих людей олигосахариды, представленные в табл. 15,
вызывают метеоризм
-
образование газов и расстройство желудочно-кишечного тракта. Метеоризм обусловлен
отсутствием у человека фермента β-галактозидазы, необходимого для гидролиза рафинозы и
стахиозы, т.е. они не гидролизуются ферментами желудочно-кишечного тракта, а подвергаются
анаэробному распаду под действием микрофлоры кишечника, сопровождающемся образованием
углекислого газа, водорода и метана [56]. α-галактозиды способствуют жизнедеятельности
вредных микроорганизмов в кишечнике человека и животных [57]. При кулинарной обработке
семян бобовых содержание олигосахаридов в них значительно возрастает, а при прорастании
снижается [56].
В результате ферментативного воздействия увеличивается пищевая ценность, повышается
степень экстракции белка, идет частичный гидролиз белков и полисахаридов, происходит
накопление свободных аминокислот и легкоусвояемых сахаров [58,59,60].
В
препаратах
протеолитического
действия
обычно
присутствуют
сопутствующие
ферменты, как правило, амилаза и β-глюканаза. Наличие таких сопутствующих ферментов
оказывает положительный эффект на выход конечного продукта, так как действие этих ферментов
проявляется в разрушении полисахаридов клеточных стенок сырья и улучшении экстракции в
целом [58,59].
Определения гидролитических изменений сахаров с помощью 3,5-динитросалициловой кислоты
Содержание олигосахаридов, как следует из таблицы 15, в муке люпина незначительно,
однако, исходя из вышеописанных эффектов, оказываемых олигосахаридами на организм
человека, представлялось целесообразным определить влияние
процесса индуцированного
автолиза на изменение содержание редуцирующих сахаров.
Метод основан на взаимодействии сахаров с 3,5-динитросалициловой кислотой, последняя
восстанавливается в 3-амино-5-нитросалициловую, а карбонильная группа моно-, ди-, олиго- и
33
полисахаридов окисляется до карбоксильной, что приводит к переходу окраски от желтой к
красно-бурой.
К 1 мл испытуемого раствора прибавляли 1 мл 10%-ного формамида и 1 мл 2,27 н NaOH,
через 30 минут добавляли 2 мл динитросалицилового реактива. 2,27 н NaOH используется для
лучшего растворения сахаров. Полученные образцы тщательно перемешивали и погружали в
кипящую водяную баню на пять минут, для того, чтобы компоненты прореагировали, и
произошло изменение окраски. Затем охлаждали до комнатной температуры. После этого на
спектрофотометре проводили определение оптической плотности при длине волны 545 нм. В
качестве контроля служил раствор, в котором 1 мл пробы заменяли 1 мл дистиллированной воды.
Содержание продуктов гидролиза сахаров рассчитывали по калибровочной кривой (зависимость
оптической плотности от концентрации сахаров), построенной по моногидрату мальтозы. Для
этого готовили растворы моногидрата мальтозы с концентрацией от 0,2 мг/мл до 2,0 мг/мл.
Динитросалициловый реактив готовили следующим образом: в мерной колбе на 250 мл
растворяли в 20 мл дистиллированной воды навеску 3,5-динитросалициловой кислоты (2,5 г),
полученный раствор кипятили на водяной бане до полного растворения реактива. К полученному
раствору добавляли 50 мл 8%-ного раствора NaOH и 125 мл 60%-ного раствора виннокислого
натрия-калия, и доводили до метки дистиллированной водой [61,62].
Исследование динамики изменения сахаров в процессе индуцированного автолиза
Согласно литературным данным, в процессе проращивания претерпевают изменения не
только белки, но и углеводы [35]. Colmenares de Ruiz с коллегами показали, что в течение 48 часов
проращивания происходит снижение содержания олигосахаридов, а к 72 часам они полностью
исчезают [7,54]. Аналогичные данные были получены Jaya и Venkataraman [8], Kon [9] и др.
Происходит распад запасных углеводов и увеличение общего содержания растворимых и
редуцирующих сахаров [7,63]. Схожие данные об увеличении в процессе проращивания
содержания моносахаридов и снижении концентрации олигосахаридов были получены East [64],
Kuo [65] и др.
Для выявления идентичности процессов, происходящих с углеводами в муке люпина,
модифицированной методом индуцированного автолиза, процессам, происходящим с углеводами
в семенах при проращивании, нами было проведено определение гидролитических изменений
сахаров в муке люпина с помощью 3,5-динитросалициловой кислоты, т.е. в качестве критерия
оценки нами также было выбрано определение динамики изменения редуцирующих сахаров в
процессе индуцированного автолиза.
34
Как было отмечено, одним из алиментарных факторов бобовых являются α-галактозиды
или рафинозные олигосахариды, такие как раффиноза, стахиоза и вербаскоза. Вопросу
исследования содержания этих веществ в бобовых культурах посвящено значительное количество
работ – Nakayama [66], Murphy [67], Mansour и Khalil [68] и др. Все эти исследования объединяет
одно – признание α-галактозидов антиалиментарным фактором бобовых и поиски путей снижения
их содержания.
В муке семян люпина узколистного содержится в среднем 4% рафинозных олигосахаридов,
что снижает их пищевую ценность и усвояемость, в связи с чем перед нами стояла задача
определить как будет влиять процесс индуцированного автолиза на содержание данной группы
углеводов. В процессе проращивания семян происходит снижение содержания рафинозных олигосахаридов, это отмечали в своих работах Mansour и Khalil [68], Cuadra и Burbano [10] и др. В
исследованиях Jaya и Venkataraman, Dagnia и Petterson [8,54,69] было показано, что концентрация
олигосахаридов раффинозной группы снижается практически до нуля.
Поэтому процесс изменения содержания нередуцирующих сахаров, к которым и относятся
α-галактозиды, был использован для сравнения процесса проращивания и индуцированного
автолиза.
Об изменениях, происходящих с олигосахаридами в процессе индуцированного автолиза,
судили по динамике образования редуцирующих сахаров в муке люпина. Данный выбор был
основан на том, что согласно литературным данным [44,63,7] олигосахариды, в том числе αгалактозиды, в процессе гидролиза распадаются до редуцирующих сахаров, не оказывающих
неблагоприятного воздействия на организм человека.
Параллельно с опытом осуществлялся контроль, аналогично опыту, но без внесения в
суспензию муки люпина куриного пепсина.
На первом этапе индуцированного автолиза (протеолизе) изменение оптической плотности
растворов, содержащих редуцирующие сахара, было равно 0, т.е. в образцах и опыта и контроля
были получены одинаковые значения оптической плотности. Это связано с тем, что в качестве
эндогенного фермента нами был использован куриный пепсин, который приводит к гидролизу
белков, но не затрагивает углеводы, а экзоферменты муки бобов люпина на первом этапе
индуцированного автолиза не работают.
В таблице 16 представлены полученные результаты измерения прироста продуктов
гидролиза сахаров во время автолиза (второй этап индуцированного автолиза). На рис. 11 показана
динамика изменения содержания редуцирующих сахаров.
35
Таблица 16 - Результаты измерения гидролитических изменений сахаров с помощью 3,5-динитросалициловой кислоты в процессе индуцированного автолиза (второй этап)
545 нм
Время автолиза,
Значение оптической плотности D
е.о.п.
545 нм
ΔD
*
ч
пробы опыта
пробы контроля
0
1,08
1,07
0,01
1
1,08
1,08
0,0
3
1,22
1,17
0,05
22
1,23
1,18
0,05
24
1,23
1,18
0,05
43
1,3
1,18
0,12
48
1,29
1,17
0,12
70
1,42
0,91
0,51
72
1,57
0,85
0,72
545 нм
545 нм
*Δ D
– разность значений D
е.о.п. между опытом и контролем, характеризующая
изменение содержания редуцирующих сахаров в опыте по отношению к контролю
Представленные в таблице 16 и на рис. 11 данные показывают, что в процессе автолиза
идет увеличение оптической плотности проб опыта, по сравнению с пробами контроля.
Полученные результаты можно интерпретировать следующим образом, в процессе автолиза под
действием собственных ферментов муки семян люпина происходит гидролиз нередуцирующих
сахаров, в результате которого увеличивается содержание редуцирующих сахаров.
36
0,8
0,7
0,6
Δ D 545 нм
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
20
30
40
t, час
50
60
70
80
Рисунок 11 - Динамика редуцирующих сахаров муки люпина в процессе индуцированного
автолиза (второй этап), в сравнении с контролем
Приведенные экспериментальные данные позволяют говорить о распаде нередуцирующих
сахаров до более простых, что коррелирует с результатами исследований Dagnia и Petterson [54],
Cuadra и Burbano [10], East [64] и др. В этих работах отмечалось увеличение содержания
растворимых и редуцирующих углеводов и снижение содержания олигосахаридов и крахмала в
процессе проращивания семян бобовых. Так, Kuo в своих исследованиях семян сои отмечал, что в
процессе проращивания идет превращение сахаров группы раффинозы в сахарозу и ее гидролиз до
моносахаров, которые используются проростком для развития. Этот процесс сопровождается
повышением инвертной активности проростков и значительным увеличением содержания
глюкозы и фруктозы в тканях проростка [65].
В ходе проведения исследования было выяснено, что максимальное наращивание
оптической плотности в растворах пробы опыта происходило после 40 часов автолиза, т.е.
увеличение концентрации продуктов гидролиза сахаров происходит к концу вторых суток, что
коррелируют с литературными источниками, так, Ruiz с Bressani [7] отмечали увеличение
содержания редуцирующих сахаров после 48 часов проращивания.
Определение содержания редуцирующих и нередуцирующих сахаров в муке люпина и
сои
37
Определение содержания сахаров проводилось методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии. Сущность метода состоит в простом изократическим разделении сахаров на
силикагелевых и полимерных колонках с привитыми амино-пропильными группами или
катионообменными смолами в соединении с рефрактометрическим детектированием [70].
Предварительно осуществляли пробоподготовка образцов. Навеску муки обезжиривали
смесью гексана и метанола. Для четкого разделения пиков при хроматографировании наибольшую
роль играет содержание именно жира, т.к. даже следы жира могут помешать определению
содержания сахаров. Сахара извлекают из исследуемых образцов 80% этиловым спиртом,
трехкратной экстракцией по 15 мин при температуре 75-80°С на водяной бане. Спиртовые экстракты объединяют, спирт упаривают под вакуумом при температуре не выше 40°С, разбавляют
водой и фильтруют через 0,45 мкм фильтр [70,71,72].
В исследовании использовали хроматограф фирмы Gilson (Франция), оснащенный
изократическим насосом, устройством для введения образца, рефрактометрическим детектором.
Колонка - силикагель с химически привитой аминофазой (Aminex HPX - 87 P (размеры 300x7,8мм)
фирмы Bio-RAD. На колонку наносили пробы объёмом 50 мкл. Подвижная фаза - вода
бидистиллят, скорость потока 0,6 мл/мин, температура термостатирования колонки 85ºС.
Обнаружение с помощью рефрактометрического детектора.
Идентификацию хроматографических пиков проводили, используя внешние стандарты
следующих сахаров (фирма «Supelco»): мальтозы, фруктозы, сахарозы, глюкозы. Обработка
результатов велась в программе Multichrom [73,74,75].
Углеводам в питании человека принадлежит важная роль, они являются главным источником энергии для организма. В пищевых продуктах углеводы представлены сахарами,
крахмалом, пищевыми волокнами и т.д. [76].
В таблице 17 представлено содержание общего сахара, а также редуцирующих и нередуцирующих сахаров в исследуемых образцах муки люпина и сои.
Таблица 17 - Содержание сахаров в исследуемых образцах муки люпина и сои
Исследуемый образец муки
Мука люпина
Мука люпина
Соевая мука
нативная
модифицированная
Массовая доля общего сахара, %,
в том числе
Массовая доля сахарозы, %
Массовая доля глюкозы, %
Массовая доля мальтозы, %
14,66
14,8
13,96
4,08
3,74
1,93
3,5
4,31
2,31
4,46
2,88
2,12
38
Массовая доля фруктозы, %
Массовая доля других сахаров, в
том числе олигосахаридов, %
0,55
1,12
-
4,36
3,56
4,5
Общее содержание сахаров в соевой муке коррелирует с литературными данными [71,76] и
достаточно близко по значению к муке люпина. Из усвояемых сахаров первостепенное значение
принадлежит сахарозе, содержание которой в исследуемых образцах почти одинаково и
составляет чуть более 4,0%, кроме муки люпина модифицированной, где содержание сахарозы
составляет 3,5%, что на 0,6% меньше, чем в нативной муке люпина, данное различие связано с
гидролитическими процессами, происходящими в сахарах в процессе индуцированного автолиза.
Также в муке люпина присутствуют моносахара, такие как глюкоза и фруктоза. Необходимо
отметить, что в состав сахаров входят также олигосахариды, вещества которые не гидролизуются
в организме человека и являются антиалиментарными факторами в питании [40]. Но в
модифицированной муке люпина содержание олигосахаридов меньше, это связано с изменениями,
происходящими в процессе индуцированного автолиза, в результате которого нередуцирующие
сахара (олигосахариды) гидролизуются до редуцирующих, этим и объясняется увеличение
количества глюкозы и фруктозы в модифицированной муке люпина по сравнению с нативной,
более чем на 1,5%.
4.2.3 Исследование переваримости белковых препаратов люпина и сои
Важное значение имеет не только количественное содержание белков и сбалансированность аминокислотного состава, но и степень атакуемости белков ферментами пищеварительного тракта, т.е. переваримость, которая является одним из основных показателей биологической ценности пищевого продукта [76].
Определение переваримости белка in vitro осуществлялось с использованием ускоренной
методики определения степени переваримости белка (СПБ). Сущность метода заключается в
моделировании условий пищеварительного тракта. СПБ характеризует скорость атакуемости
белков ферментами желудочно-кишечного тракта – пепсином и трипсином.
Степень переваримости белка выражают как отношение белка переваренного к общему
содержанию белка в продукте и определяют по формуле:
Б
перев
СПБ
%

100
,
Б
общ
где Бперев – количества переваренного белка в навеске пробы, мг;
Бобщ – исходное количества белка в навеске пробы, мг [77,78].
39
Результаты, полученные при определении показателя переваримости в исследуемых
образцах, показаны в таблице 18 и на рис. 12.
Таблица 18 - Степень переваримости белка в исследуемых образцах, %
Вид белкового препарата
Нативная мука
Модифицированная
люпина
мука люпина
Коэффициент
переваримости (КП) белка,
%
89,6±0,2
92,7±0,2
94
92
Соевая мука
83,5±0,2
92,7
89,6
90
КП, %
88
86
83,5
84
82
80
78
МЛН
МЛМ
СМ
Рисунок 12 - Переваримость «in vitro» исследуемых белковых препаратов, %: МЛН – мука
люпина нативная, МЛМ – мука люпина модифицированная, СМ – соевая мука
Согласно полученным данным, степень переваримости белка люпина была выше, чем белка
сои, и составляла соответственно 89,6 и 83,5%. При этом переваримость муки люпина в процессе
индуцированного автолиза возрастала и составила 92,7 %, что превысило значение переваримости
нативной муки люпина и сои на 3,1 и 9,2 % соответственно.
Одной из причин повышения степени переваримости белков муки люпина в процессе
индуцированного автолиза является гидролиз соединений пептидов с целлюлозой и гемицеллюлозой, затрудняющих доступ пищеварительных ферментов к полипептидам [79].
40
Одной из причин низкой переваримости белков семян бобовых культур является наличие
ингибиторов протеаз, в том числе трипсина и химотрипсина. Семена сои также богаты
сапонинами - веществами, ухудшающими переваримость белка.
По литературным данным установлено, что все виды и сорта люпина содержат меньше
ингибиторов протеаз, по сравнению с соей, горохом, кормовыми бобами и другими бобовыми
культурами. По данным Сизенко Е.И. и Лисицына А.Б. [45], количество ингибиторов трипсина в
семенах узколистного люпина в 3-4 раза меньше, чем в кормовых бобах и в 100 раз меньше, чем в
семенах сои. Низкий уровень ингибиторов протеаз в муке люпина объясняет высокую степень его
переваримости.
Также есть литературные данные, указывающие на то, что продукты с пониженным
содержанием фитатов имеют более высокую эмульгирующую способность и эмульсионную
стабильность, на другие функциональные свойства наличие фитатов влияние не оказывает [80,81].
4.2.4 Изучение влияния технологии индуцированного автолиза на модификацию
технолого-функциональных свойств белковых препаратов люпина
Функциональные свойства белков тесно связаны с их химическим и аминокислотным
составом, структурой, физико-химическими свойствами, от которых зависят взаимодействие:
белок-вода (набухаемость, водосвязывающая способность, растворимость)
белок-липиды (жиропоглощающая и жироудерживающая способности)
жир-белок-вода (поверхностно-активные свойства – образование эмульсий, пен)
белок-белок (гелеобразование)
адгезионные, реологические характеристики и др. [82]
Технолого-функциональные свойства белковых препаратов зависят от целого комплекса
физико-химических
характеристик,
которые
определяют
пригодность
данных
белковых
препаратов к переработке с целью обеспечения необходимого уровня органолептических
показателей, структурно-механических характеристик и других показателей, от которых зависят
потребительские свойства готовых изделий.
Предпочтение, которое отдается белковым изолятам при использовании в разнообразных
технологических процессах, по сравнению с белковыми препаратами на основе нативной муки,
полученной непосредственно из зернобобовых, обусловлено рядом преимуществ функциональнотехнологических характеристик, которыми обладают изоляты. Однако стратегия максимального
фракционирования семян бобовых культур, с целью получения ингредиентов с высокими
функциональными свойствами, в последние годы оспаривается многими учеными [1,83]. В
41
результате глубокого фракционирования происходит потеря большинства биологически активных
компонентов растительных тканей (флавоноидов, пищевых волокон, микро- и макроэлементов,
витаминов и др.), что приводит к снижению пищевой ценности и физиологической эффективности
продуктов питания, обогащенных белками. Установлено, что содержание изофлавоноидов,
являющихся
сильнейшими
антиканцерогенами
и
антиокссидантами,
снижется
при
фракционировании с 2,2 мг/г в соевой муке до 0,6 мг/г в изоляте [83]. Кроме того, в процессе
фракционирования снижается коэффициент эффективности белка (КЭБ). Например, для соевой
муки его значение составляет 2,2-2,5, для концентрата - 2,0-2,4, для изолята – 1,1-2,1.
Аналогичные данные получены для белковых препаратов разной степени фракционирования из
гороха, чечевицы и кормовых бобов, при выполнении условия, что все белковые продукты
получены из одного растительного объекта. Такие изменения биологической ценности белковых
изолятов объясняются уменьшением содержания незаменимых аминокислот в процессе
фракционирования [1].
Новые технологии модификации белковых растительных препаратов направлены на
повышение их функционально-технологических характеристик, при сохранении в сырье основного комплекса биологически активных нутриентов. Второй важной задачей разработки и
внедрения новых технологий является расширение сырьевой базы для производства белковых
препаратов за счет использования новых видов растительных объектов и снижения зависимости от
импорта соевых белковых препаратов, подавляющее большинство которых получено из
генетически-модифицированной сои.
Функциональные свойства белков определяются их способностью изменять структуру в
зависимости от условий среды и способности вступать в разнообразные взаимодействия с высокоили низкомолекулярными компонентами сложной пищевой системы [84,85,86]. Любое изменение
среды, окружающей молекулы белков, вызывает их конформационные изменение и модификацию
функциональных свойств. Технологические воздействия при переработке и модификации
изменяют
структуру
белков
и,
соответственно,
их
функциональные
свойства
[30,87].
Следовательно, производство модифицированной муки с использованием новых биотехнологий
влечет за собой изменение функциональных характеристик белковых препаратов.
Термин «технолого-функциональные свойства» был введен учеными именно с целью
описания степени пригодности новых видов растительных белков, в первую очередь соевых
белков, в технологическом процессе производства пищевых продуктов.
42
Наиболее важную роль в формировании функционально-технологических свойств играют
водоудерживающая, жироудерживающая, эмульгирующая, гелеобразующая способность и др.
Анализ разработанных нами оптимальных режимов биотехнологии модификации белковых
препаратов муки люпина методом индуцированного автолиза, позволяет предположить, что
структурные изменения химического состава, в том числе белков, углеводов, фитатов и других
соединений, приведут к улучшению функциональных свойств муки люпина.
В связи с тем, что основной задачей на данном этапе исследований являлась направленная
модификация с целью улучшения функциональных свойств белков люпина, в качестве контроля
использовали немодифицированную муку из семян люпина, а в качестве эталона - муку сои, как
основного монополиста на рынке белковых продуктов.
Наибольшее внимание было уделено определению эмульгирующей способности, т.к. из
литературных источников известно, что изменение содержания фитатов влияет на данное
функциональное свойство белковых препаратов.
Методы определения технолого-функциональных свойств белковых препаратов
Определение эмульгирующей способности
Исследуемый препарат диспергируют в дистиллированной воде в соотношении 1:5. К
полученной суспензии добавляют растительное масло и эмульгируют на гомогенизаторе 2 мин.
при скорости 8000-10000 об/мин. Соотношение компонентов в эмульсии препарат:вода:масло
составляет 1:5:5. Полученные эмульсии переносят в стеклянные центрифужные пробирки
объемом 10 мл (3 параллельные пробы), помещают в термостат с температурой 74-76оС и
выдерживают 15 мин. Эмульсии охлаждают холодной водой до комнатной температуры и
выдерживают 2 часа. Полученные эмульсии центрифугуют на центрифуге («Janetzki-T24»,
Германия) при 2500 об/мин в течение 15 мин. Определяют процентное отношение отделившихся
от эмульсии водной и масляной фаз [88].
Определение водоудерживающей способности (ВУС)
Из исходного образца готовят серию из 8 суспензий с интервалом 0,25 г воды на грамм
препарата. Суспензии тщательно перемешивают до получения однородной консистенции и
переносят в стеклянные центрифужные пробирки объемом 10 мл (приблизительно по 10 г),
помещают в термостат с температурой 74-76оС и выдерживают 15 мин. Затем пробирки
охлаждают холодной водой до комнатной температуры и центрифугируют на центрифуге
(«Janetzki-T24», Германия) при 1500 об/мин в течение 15 мин.
43
За величину ВУС принимают максимальное количество добавленной воды, при котором не
наблюдается отделения водной фазы в процессе испытания, в пересчете на 1 г препарата. Для
определения показателя ВУС использовали следующую формулу:
VwP
w
ВУС= Vw  100, где
ВУС – объем воды, удерживаемый 1 г исследуемого образца, г;
Vw – объем воды, вносимый в исследуемую пробу, согласно методике, г (гидромодуль);
Pw – количество отделившейся влаги после проведения испытаний, % [88].
Определение жироудерживающей способности (ЖУС)
В стеклянные центрифужные пробирки емкостью 30 мл помещают 2 г исследуемого
препарата и добавляют от 0,5 до 2,5 г растительного масла с интервалом 0,5 г. Содержимое
пробирок перемешивают в течение 10 мин, после чего пробирки с суспензиями препарата
выдерживают в термостате при температуре 74-76оС в течение 15 мин. После термостатирования
пробирки охлаждают холодной водой до комнатной температуры и центрифугируют на
центрифуге («Janetzki-T24», Германия) при 1500 об/мин в течение 15 мин. За величину ЖУС
принимают максимальное количество добавленного масла, при котором не наблюдается
отделения масляной фазы в процессе испытания, в пересчете на 1 г препарата.
Для определения показателя ЖУС использовали следующую формулу:
Vl Pl
ЖУС= Vl  100 , где
ЖУС – объем масла, удерживаемый 1 г исследуемого образца, г;
Vl – объем масла, вносимого в исследуемую пробу, согласно методике, г (жиромодуль);
Pl – количество отделившегося масла после проведения испытаний, % [88].
Определение критической концентрации гелеобразования (ККГ)
Из исходного препарата готовят серию из 10 суспензий в дистиллированной воде с
интервалом по концентрации 1%. Суспензии тщательно перемешивают до получения однородной
консистенции и переносят в стеклянные пробирки емкостью 10 мл (приблизительно по 10 г
суспензии). Пробирки закрывают резиновыми пробками, помещают в термостат и выдерживают
15 мин при температуре 74-76оС. После прогрева пробирки охлаждают холодной водой до
комнатной температуры, помещают в холодильник, где их выдерживают 16-18 ч при температуре
4-6оС. На поверхность суспензии помещают свинцовые шарики, имеющие среднюю массу 0,53 г,
и выдерживают 2 ч при температуре 4-6оС. За критическую концентрацию гелеобразования при
44
4оС принимают концентрацию препарата, соответствующую пробе, в которой не происходит
разрушения геля под давлением свинцового шарика [88].
Сравнительная характеристика эмульгирующей способности
Установлено [89], что в процессе ферментативного гидролиза происходит расщепление
пептидных связей в гидрофильных участках цепей на поверхности молекул белка, т.е. при этом βцепи, расположенные во внутренней части молекул, не доступны для действия ферментов. В ходе
дальнейшего протеолиза начинает происходить гидролиз и гидрофобных β-цепей. Распад α-цепей
(гидрофильных) приводит к понижению молекулярной массы, но при этом в молекуле
присутствуют высокомолекулярные фрагменты, обладающие гидрофобностью. На этом этапе
протеолиза происходит снижение поверхностного натяжения и увеличивается эмульгирующая
способность белка.
Доказано, что наличие
высокомолекулярного продукта протеолиза, типа легумина–Т,
позволяет улучшать эмульгирующие свойства растительных белковых препаратов [90]. Однако в
ходе более глубокого протеолиза, по мере деградации легумина-Т, эмульгирующая способность
растительных белковых препаратов снижается [34].
Независимо от индивидуальных особенностей структуры высокомолекулярных продуктов,
полученных в процессе ограниченного гидролиза, их наличие в белковых препаратах повышает
функциональные свойства, по сравнению с исходным белковым препаратом. Аналогичные
результаты повышения эмульгирующих и пенообразующих свойств были получены при
ограниченном экзоферментативном протеолизе белков сои, подсолнечника и конских бобов [91].
Согласно результатам, полученным нами при исследовании изменения молекулярной
массы белков в процессе индуцированного автолиза, после трех суток автолиза наблюдается
увеличение содержания фракций белка с небольшим молекулярным весом, в результате
протеолиза белков, но при этом в белке присутствуют фрагменты, обладающие сравнительно
большой молекулярной массой. Эти данные позволяет нам предположить, что в ходе
индуцированного автолиза в белке протекают процессы изменения α- и β-цепей, оказывающие
существенное влияние на эмульгирующие свойства белков.
Способность продукта образовывать эмульсии определялась по принятой для белковых
препаратов методике (в четырехкратной повторности опыта), путем эмульгирования суспензии
препарата на гомогенизаторе с добавлением необходимого количества масла. Об эмульгирующей
способности судили по соотношению объемов эмульсии и отслоившихся фаз воды и масла.
Данные, полученные в результате исследования образцов муки, представлены в таблице 19. Для
45
представления полученных данных в графическом виде, было рассчитано усредненное значение
соотношения отслоившихся фаз и эмульсии (рис.13).
Таблица 19 – Эмульгирующая способность муки люпина и сои, соотношение эмульсии:воды:масла, %
Образец
1
60:25:15
90:10:0
52:18:30
Мука люпина немодифицированная
Мука люпина модифицированная
Соевая мука
№ пробы
2
3
61:24:15
61:25:14
89:10:1
91:9:0
49:18:33
49:19:32
4
60:24:16
89:11:0
51:17:32
Полученные результаты позволяют сказать, что наилучшей эмульгирующей способностью
среди
исследуемых
образцов
обладает
мука
люпина
модифицированная,
процент
не-
расслоившейся эмульсии которой составляет около 90%, что на 30% превышает аналогичный
показатель для муки люпина немодифицированной и на 40% для муки соевой. Также в образце
эмульсии с использованием модифицированной муки люпина не наблюдается отслоение масла, а
только некоторое (10%) отслоение воды, в остальных образцах процент несвязанного масла
составляет от 15 (мука люпина немодифицированная) до 30 (мука соевая). Столь существенные
различия между модифицированной и немодифицированной мукой люпина во многом
обусловлены
гидролитическими
изменениями,
индуцированного автолиза.
46
происходящими
в
белках
во
время
100
89,75±0,83
90
1-
Нерасслоившаяся эмульсия, %
2-
Отделившаяся вода, %
3-
Отделившееся масло, %
80
70
60,5±0,5
%
60
50,25±1,3
1
50
40
1
30
1
18,0±0,71
15,0±0,71
20
10
31,75±1,08
24,5±0,5
10,0±0,71
2
3
2
3
2
0
0
Мука люпина немодифицированная
Мука люпина модифицированная
Соевая мука необезжиренная
Рисунок 13 - Эмульгирующая способность исследуемых образцов муки люпина и сои,
соотношение эмульсии и отслоившихся фаз, %
Полученные результаты находят подтверждение и в литературе, так в исследованиях
Enujiugha с коллегами было показано, что в процессе проращивания в семенах бобовых происходит значительное повышение эмульгирующей способности [92].
Таким образом, в ходе индуцированного автолиза происходит повышение эмульгирующей
способности муки люпина модифицированной, по сравнению с соевой мукой, в среднем на 40,0%,
а по сравнению с нативной мукой люпина на 30%.
Сравнительная характеристика водоудерживающей способности
Водоудерживющая способность (ВУС) и эмульгирующая способность (ЭС) белков
определяются такими характеристиками белковых молекул, как поверхностное распределение
полярных и неполярных групп, гидрофобность, характер взаимодействия с полисахаридами и др.
[93]
Абсорбция воды в пищевых продуктах подразумевает наличие воды вокруг макромолекул,
подвергшихся действию силового взаимодействия, и удерживание воды в текстуре за счет
капиллярности, что приводит к увеличению объема воды, удерживаемой в пищевом продукте [94].
47
Эта абсорбированная вода играет важную роль в формировании консистенции комбинированных
продуктов, полученных с использованием белковых препаратов. От показателя ВУС зависит не
только консистенция и сочность, но и выход готовой продукции.
В соответствии с классификацией Осборна [79], белки бобовых в основном представлены
глобулинами (60-90%) и альбуминами (10-20%). По данным Боултера [95], некоторые сорта
бобовых содержат также глютелин (до 15%). Глобулины большинства бобовых состоят
преимущественно из двух фракций с константами седиментации 11S и 7S. У сои и люпина
содержание 7S-глобулинов обычно выше, чем 11S, их соотношение составляет 1,6.
Альбумины и глобулины способны к набуханию. Благодаря наличию полипептидных цепей
белков и их расположению, в белковых молекулах действуют силы водородных связей, образуя
сетку пептидных цепей. Гидрофильные белковые цепи, образующие гидрофильную поверхность
глобулы, обеспечивают водоудерживающую способность белков как растительного, так и
животного происхождения [96].
ВУС – одно из важнейших функциональных свойств, зная его значение, легко рассчитать
содержание ингредиентов и белковых препаратов в рецептуре, которая будет обеспечивать
необходимые реологические свойства и снижение потерь в процессе технологической обработке.
Значение влагоудерживающей способности исследуемых образцов определяли как
максимальное количество добавленной воды, при котором не наблюдается отделение водной фазы
при центрифугировании образцов, составляющих линейку гидромодулей с разным соотношением
муки и воды.
Для определения влагоудерживающей способности готовили восемь вариантов гидромодулей при соотношении мука:вода от 1:1,25 до 1:3,0, с шагом увеличения массы воды 0,25 г.
Выбор начального и конечного значения, а также шага гидромодуля был осуществлен на
основании анализа литературных данных, полученных при изучение ВУС семян зернобобовых
культур, в том числе сои [88].
В соответствии с имеющимися в литературе рекомендациями, при проведении эксперимента нами предусматривалось использование воды, нагретой до температуры 74-76 ºС, с
последующей выдержкой суспензии в течение 15 мин.
Как показали результаты исследований, мука люпина немодифицированная имеет
минимальный процент отделившейся воды (5,3) при гидромодуле 1:2,0. Мука люпина модифицированная имела минимальный процент отделившейся воды (7,1) при гидромодуле 1:2,25.
48
Мука соевая имела минимальный процент отделившейся воды (6,1) при гидромодуле 1:1,75
(табл.20).
Таблица 20 – Влияние значения гидромодуля на способность исследуемых образцов люпиновой и
соевой муки удерживать воду, % отделившейся воды
Образец муки
% отделившейся воды, при гидромодуле (мука:вода):
1:1,25 1:1,5 1:1,75 1:2,0 1:2,25 1:2,5 1:2,75 1:3,0
Мука люпиновая немодифицированная
Мука люпиновая модифицированная
Мука соевая
0
0
0
5,3
18,4
29,7
44,1
57,2
0
0
0
0
7,1
19,0
30,9
42,3
0
0
6,1
24,1
36,4
47,0
56,2
65,7
В таблице 20 указаны различные значения гидромодулей, для всех образцов после
достижения определенного гидромодуля происходит отделение воды. Для уточнения гидромодулей, при которых вода полностью поглотится мукой, нами был проведен пересчет полученных результатов, с учетом процента отделившейся воды, а также с целью выяснения изменения
ВУС при возрастании гидромодулей (табл. 21).
Таблица 21 - Водоудерживающая способность исследуемых образцов, г связанной воды/1 г
исследуемого образца, при различных значениях гидромодуля
Образец
Мука люпиновая немодифицированная
Мука люпиновая модифицированная
Мука соевая
Массовая доля воды, удерживаемая образцом, г воды/1 г
муки, при различных значениях гидромодуля (мука:вода)
1:1,25 1:1,5 1:1,75 1:2,0 1:2,25 1:2,5 1:2,75 1:3,0
1,25
1, 5
1,75
1,89
1,84
1,76
1,54
1,28
1,25
1,5
1,75
2,0
2,09
2,03
1,9
1,73
1,25
1,5
1,64
1,52
1,43
1,32
1,2
1,03
Уточненные расчетным путем значения массовой доли воды, обеспечивающей максимальную ВУС при различных гидромодулях, приведены также на рис. 14, 16, 18.
Математическое описание ВУС проведено с помощью линий тренда, представленных на
рис. 15, 17, 19. Линия тренда характеризует изменение показателя ВУС в зависимости от
используемого гидромодуля. Данную зависимость также можно описать при помощи различных
аналитических зависимостей, которые позволяют спрогнозировать дальнейшее изменении
водоудерживающей способности исследуемых образцов под влиянием изменения количества
49
вносимой
воды.
Соответствующие
зависимости,
характеризующие
показатель
ВУС
с
Массовая доля воды, связываемая
1 г муки, г
математической точки зрения, представлены на рис. 15, 17, 19.
2,2
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1,89
1,75
1,84
1,76
1,54
1,28
1:1,75
1:2,00
1:2,25
1:2,50
1:2,75
1:3,00
Гидромодуль
Рисунок 14 - Зависимость ВУС муки люпина немодифицированной от значения гидромодуля
Массовая доля воды, связываемая
1 г муки, г
суспензии (мука:вода), г связанной воды/1 г муки
2,2
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1,75
1,89
1,84
1,76
1,54
1,28
y = 0,0039x3 - 0,0887x2 + 0,3588x + 1,48
2
R = 0,996
1:1,75
1:2,00
1:2,25
1:2,50
1:2,75
1:3,00
Гидромодуль
Рисунок 15 - Математическое описание процесса поглощения немодифицированной мукой
люпина воды
Из представленных на рис. 14 и 15 данных, можно сделать вывод, что при увеличении
значений гидромодуля, более 1:2,0, водоудерживающая способность муки люпина немоди50
фицированной существенно снижается, обоснованность данной линии тренда и аналитической
зависимости подтверждается высоким значением показателя достоверности аппроксимации (R²),
выражающим точность отражения формулой и графиком эмпирических данных.
Массовая доля воды, связываемая
1 г муки, г
2,4
2,2
2,00
2,09
2,03
2
1,90
1,73
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1:2,00
1:2,25
1:2.5
1:2,75
1:3,00
Гидромодуль
Рисунок 16 - Зависимость ВУС муки люпина модифицированной от значения гидромодуля
суспензии (мука:вода), г связанной воды/1 г муки
Массовая доля воды, связываемая
1 г муки, г
2,4
2,2
2
2,00
2,09
2,03
1,90
1,73
1,8
1,6
1,4
y = 0,0092x3 - 0,1246x2 + 0,3962x + 1,72
2
R = 0,9996
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1:2,00
1:2,25
1:2.5
1:2,75
1:3,00
Гидромодуль
Рисунок 17 - Математическое описание процесса поглощения модифицированной мукой люпина
воды
51
Из представленных на рис. 16 и 17 данных, можно сказать, что при гидромодуле более
1:2,25 водоудерживающая способность муки люпина модифицированной существенно снижается.
Массовая доля воды, связываемая
1 г муки, г
1,8
1,64
1,52
1,50
1,6
1,43
1,32
1,4
1,20
1,2
1,03
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1:1,50
1:1,75
1:2,00
1:2,25
1:2,50
1:2,75
1:3,00
Гидромодуль
Рисунок 18 - Зависимость ВУС соевой муки от значения гидромодуля суспензии (мука:вода), г
связанной воды/1 г муки
Массовая доля воды, связываемая
1 г муки, г
1,8
1,6
1,64
1,50
1,52
1,43
1,4
1,32
1,20
1,2
1,03
1
0,8
y = 0,0047x3 - 0,0756x2 + 0,2561x + 1,3357
R2 = 0,9764
0,6
0,4
0,2
0
1:1,50
1:1,75
1:2,00
1:2,25
1:2,50
Гидромодуль
1:2,75
1:3,00
Рисунок 19 - Математическое описание процесса поглощения соевой мукой воды
Согласно данным, представленным на рис. 14, 16, 18, установлено, что при переходе через
определенное значение гидромодуля и при дальнейшем его увеличении ВУС существенно
52
снижается во всех исследуемых образцах. Для муки люпина немодифицированной таким
гидромодулем стал 1:2,0, для муки люпина модифицированной – 1:2,25, а для соевой муки 1:1,75.
Понижение
водоудерживающей
способности
исследуемых
образцов
при
увеличении
гидромодулей, по-видимому, связано с тем, что в процессе набухания при повышенной
температуре происходят более глубокие изменения белков и углеводов. Белковые молекулы при
нагреве подвергаются физико-химическим изменениям, в частности денатурации и коагуляции. В
процессе нагрева происходит развертывание глобул, образуются межмолекулярные связи,
происходит агрегация частиц и их осаждение. Это приводит к уменьшению растворимости белков
и снижению ВУС. Денатурация ослабляет гидрофильные и усиливает гидрофобные свойства
белковых молекул [79]. При возрастающих гидромодулях, вследствие большой атакуемости
белков водой, имеющей высокую теплопроводность, процессы денатурации и коагуляции идут
более интенсивно, поэтому ВУС значительно снижается.
Исходя из результатов эксперимента и дополнительных расчетов (табл.21), можно сказать,
что из трех исследуемых вариантов белковых препаратов самым высоким значением ВУС
обладает мука люпина модифицированная, для которой оптимальным соотношением мука:вода
является 1:2,09. При таком соотношение происходит полное поглощение мукой воды, при
дальнейшим увеличение количества добавляемой воды, начинает происходить отделение влаги.
Для муки люпина немодифицированной максимальной водоудерживающей способностью
является 1:1,89, а для соевой муки – 1:1,64.
Таким образом, полученное значение ВУС муки люпина модифицированной выше
значения ВУС соевой муки на 21,5%, а муки люпина нативной на 10 %.
Сравнительная характеристика жироудерживающей способности
Важным функционально-технологическим свойством исследуемых образцов белковых
препаратов люпина является жироудерживающая способность (ЖУС). Поскольку в состав
большинства
пищевых
продуктов
входит
жиросодержащее
сырье,
которое
влияет
на
технологические и пищевые свойства изделий, а также их консистенцию, представлялось целесообразным изучить ЖУС исследуемых образцов муки. Содержание собственных липидов в
семенах люпина невысокое и составляет в зависимости от сорта и вида от 2 до 10%. В целых
семенах липазы, как правило, не могут вызывать неограниченный гидролиз, в то время как в
тканях, разрушенных с применением механического воздействия, активизируется действие липаз.
Во время разрушения тканей часто наблюдается активация липолиза даже в условиях низкого
содержания воды. Поэтому липиды могут присутствовать в белковых препаратах в виде
53
продуктов гидролиза, а не в нативной форме. В зависимости от глубины процессов гидролиза и
окисления эндолипидов белковых препаратов их функциональные свойства будут изменяться.
Кроме того, установлено, что в процессе ферментативной модификации могут образовываться
комплексы липидов с белками, что, в свою очередь, приводит к изменению функциональных
свойств как липидов, так и белков [97].
В этой связи, необходимо установить влияние используемого способа модификации на
ЖУС муки люпина и сравнить два исследуемых источника белка – муку сои и люпина по
способности удерживать жир при использовании в технологии пищевых продуктов.
Для определения ЖУС готовили пять вариантов жиромодулей при соотношении
мука:масло от 1:0,25 до 1:1,25, с шагом увеличения массы масла 0,25 г. Выбор начального и
конечного значения, а также шага жиромодуля был осуществлен на основании анализа литературных данных, полученных при изучение ЖУС семян зернобобовых культур, в том числе сои
[88].
ЖУС белковых препаратов определяли как максимальное количество добавленного масла,
при котором не наблюдается отделение масляной фазы при центрифугировании. Результаты
исследования ЖУС представлены в таблице 22.
Таблица 22 – Влияние значения жиромодуля на способность исследуемых образцов люпиновой и
соевой муки удерживать масло, % отделившегося масла
Образец муки
Мука люпиновая немодифицированная
Мука люпиновая модифицированная
Мука соевая
% отделившегося масла, при жиромодуле (мука:масло):
1:0,25
1:0,5
1:0,75
1:1,0
1:1,25
0,00
0,00
8,00
32,50
46,30
0,00
0,00
6,70
30,70
44,30
0,00
0,00
10,20
34,90
48,20
Так как, согласно данным представленным в таблице 22, при жиромодуле 1:0,5
(мука:масло) во всех исследуемых образцах не происходит отделение масла, а при внесении масла
в количестве 0,75 г наблюдается определенный процент несвязанного масла, необходимо было
провести пересчет полученных результатов с учетом процента отделившегося масла (табл. 22), с
целью определения ЖУС (расчет произведен по формуле (10). Полученные результаты
представлены в таблице 23.
Таблица 23 - Жироудерживающая способность исследуемых образцов муки при различных
значениях жиромодуля, г масла/1 г исследуемого образца
54
Образец муки
Мука люпиновая немодифицированная
Мука люпиновая модифицированная
Мука соевая
Массовая доля масла, удерживаемого образцом, г
масла/1 г муки, при жиромодуле (мука:масло):
1:0,25
1:0,5
1:0,75
1:1,0
1:1,25
0,25
0,5
0,69
0,67
0,67
0,25
0,5
0,7
0,69
0,70
0,25
0,5
0,67
0,65
0,65
Уточненная расчетным путем массовая доля масла, обеспечивающая максимальную ЖУС
при различных жиромодулях, приведена на рис. 20,22,24.
Математическое описание ЖУС проведено при помощи линий тренда, представленных на
рис. 21,23,25. Линия тренда характеризует изменение показателя ЖУС в зависимости от
используемого жиромодуля. Данную зависимость также можно описать при помощи различных
аналитических
формул,
которые
позволяют
спрогнозировать
дальнейшее
изменении
жироудерживающей способности исследуемых образцов под влиянием изменения количества
вносимого масла. Соответствующие формулы, характеризующие изменение показателя ЖУС под
влиянием изменения жиромодуля, с математической точки зрения, представлены на рис. 21,23,25.
Массовая доля масла, связываемая
1 г муки, г
1,2
1
0,8
0,6
0,69
0,67
0,67
1:0,75
1:1,00
1:1,25
0,5
0,4
0,2
0
1:0,50
Жиромодуль
Рисунок 20 - Зависимость ЖУС муки люпина немодифицированной от значений жиромодуля
(мука:масло), г масла/1 г муки
55
Массовая доля масла, связываемая
1 г муки, г
1,2
y = 0,0383x3 - 0,335x2 + 0,9267x - 0,13
1
2
R =1
0,8
0,69
0,6
0,67
0,67
0,5
0,4
0,2
0
1:0,50
1:0,75
1:1,00
1:1,25
Жиромодуль
Рисунок 21 - Математическое описание процесса поглощения масла мукой люпина
Массовая доля масла, связываемая 1
г муки, г
немодифицированной
1,2
1
0,8
0,6
0,7
0,69
0,69
1:0,75
1:1,00
1:1,25
0,5
0,4
0,2
0
1:0,50
Жиромодуль
Рисунок 22 - Зависимость ЖУС муки люпина модифицированной от значений жиромодуля
(мука:масло), г масла/1 г муки
56
Массовая доля масла, связываемая
1 г муки, г
1,2
y = 0,0367x3 - 0,325x2 + 0,9183x - 0,13
R2 = 1
1
0,8
0,69
0,7
0,6
0,69
0,5
0,4
0,2
0
1:0,50
1:0,75
1:1,00
Жиромодуль
1:1,25
Рисунок 23 - Математическое описание процесса поглощения масла мукой люпина
модифицированной
Массовая доля масла, связываемая
1 г муки, г
1,2
1
0,8
0,6
0,67
0,65
0,65
1:0,75
1:1,00
1:1,25
0,5
0,4
0,2
0
1:0,50
Жиромодуль
Рисунок 24 - Зависимость ЖУС соевой муки от значений жиромодуля (мука:масло), г масла/1 г
муки
57
Массовая доля масла, связываемая
1 г муки, г
1,2
y = 0,035x3 - 0,305x2 + 0,84x - 0,07
R2 = 1
1
0,8
0,67
0,6
0,65
0,65
0,5
0,4
0,2
0
1:0,50
1:0,75
1:1,00
Жиромодуль
1:1,25
Рисунок 25 - Математическое описание процесса поглощения масла соевой мукой
Согласно представленным в табл. 23 и на рис. 20-25 данным, можно сказать, что при
жиромодуле более 1:0,75 не происходит дальнейшего увеличения ЖУС исследуемых образцов.
Оптимальными значениями ЖУС (г муки:г масла) являются: для муки люпина немодифицированной – 1:0,69, для муки люпина модифицированной – 1:0,7, для соевой муки - 1:0,67.
Исходя из полученных результатов, можно сказать, что нативная и модифицированная мука
люпина практически не отличаются по способности удерживать жир. ЖУС соевой муки несколько
меньше, в сравнении с люпиновой, в связи с тем, что соевая мука содержит около 20% жиров.
Сравнительная характеристика гелеобразующих свойств
Не менее важными в производстве пищевых продуктов являются гелеобразующие свойства
белковых препаратов. Способность образовывать гели зависит от множества факторов, таких как
pH, присутствие солей, полисахаридов и т.д. Для оценки гелеобразующих свойств необходимо
определить
концентрацию
белкового
препарата
в
растворе,
при
которой
наступает
гелеобразование. Чем ниже критическая концентрация гелеобразования (ККГ), тем более
эффективным гелеобразователем является исследуемый препарат.
Изменение заряда и гидрофобности белков, а также их пространственной конформации в
процессе модификации белковых препаратов приводят к изменению гелеобразующей способности
белков. В процессе модификации происходит изменение структуры белка, при этом может
происходить разворачивание молекул белков, образующиеся полипептидные цепи формируют
58
пространственную сетку геля легче, чем белки в глобулярной форме. С повышением степени
модификации белков прочность гелей может понижаться [98].
Для определения критической концентрации гелеобразования (ККГ) мука люпина и сои
исследовалась в соответствии со стандартной методикой определения ККТ. Полученные данные
представлены в таблице 24 и на рис.26.
Таблица 24 - Критическая концентрация гелеобразования муки люпина и сои, %
ККГ, %
40
35
34
33
32
31
Мука люпина немодифицированная
НР*
НР
НР
НР
Р*
Р
Мука люпина модифицированная
НР
НР
НР
НР
Р
Р
Соевая мука
НР
Р
Р
Р
Р
Р
* НР – не происходит разрушение геля под действием свинцового шарика; Р – происходит
Образец
разрушение геля под действием свинцового шарика
40,00
45
40
33,00
33,00
35
ККГ,%
30
25
20
15
10
5
0
Мука люпина
немодифицированная
Мука люпина
модифицированная
Соевая мука
необезжиренная
Рисунок 26 - Критическая концентрация гелеобразования исследуемых образцов муки люпина
модифицированной, муки люпина нативной и соевой муки, %
Из представленных на рис.26 данных видно, что мука люпина несколько превосходит муку
сои по способности к гелеобразованию, но модифицированная и немодифицированная мука
люпина по данному показателю не отличаются между собой, то есть процесс индуцированного
автолиза не повлиял на способность муки семян люпина к образованию гелей. В литературе есть
данные, показывающее, что в процессе проращивания семян гелеобразующиее свойства имеют
тенденцию к понижению [92].
59
Столь высокие показатели ККГ говорят о слабой гелеобразующей способности нефракционированных белковых продуктов с высоким содержанием жиров и углеводов, что
оказывает отрицательное влияние на значение этого показателя.
Функционально-технологические свойства являются важной характеристикой белковых
препаратов, позволяющих рекомендовать их в качестве добавки в производстве пищевых
продуктов. В таблице 25 показаны обобщенные данные по функционально-технологическим
свойствам исследуемых образцов.
Таблица 25 - Функционально-технологические свойства исследуемых белковых препаратов
Образец
ВУС, г воды/1 г
муки
не
1,89
Мука
люпина
модифицированная
Мука
люпина
модифицированная
Соевая мука
ЖУС, г масла/
1 г муки
0,69
ЭС, %
ККГ, %
60,50+0,50
33,0
2,09
0,70
89,75+0,83
33,0
1,64
0,67
50,25+1,30
40,0
На основании полученных данных, можно сделать заключение, что по функциональнотехнологическим свойствам образцы муки люпина превосходят соевую муку. Использование
биотехнологии индуцированного автолиза позволяет повысить функционально-технологические
свойства муки люпина, в том числе влагоудерживающую способность на 10,5%, по сравнению с
немодифицированной мукой люпина, и на 27,5%, по сравнению с мукой сои, а эмульгирующую
способность на 30,0 и 40,0 % соответственно.
Таким образом, сравнительный анализ представленных образцов муки по функциональнотехнологическим свойствам показал, что наиболее перспективной добавкой для использования в
производстве пищевых продуктов является мука люпина, подвергнутая в качестве обработки
индуцированному автолизу.
4.2.5 Сравнительная характеристика органолептических свойств исследуемых
белковых препаратов люпина и сои
Использование муки люпина нативной, а также соевой муки в пищевой технологии имеет
некоторые ограничения, связанные с их органолептическими свойствами, в первую очередь,
выраженным бобовым ароматом и привкусом. Представлялось целесообразным исследовать
влияние метода индуцированного автолиза на изменение органолептических характеристик муки
люпина. В таблице 26 и на рис.27 представлены результаты органолептической оценки
исследуемых образцов муки люпина нативной, муки люпина, модифицированной методом
60
индуцированного автолиза, проведенной с использованием пятибалловой шкалы. В качестве
эталона сравнения использовали соевую муку.
Таблица 26 - Органолептическая оценка исследуемых образцов муки люпина и сои
Показатели
Цвет
Запах
Вкус
Средняя оценка единичных показателей исследуемых образцов, баллы
Мука люпина
Мука люпина
Соевая мука
нативная
модифицированная
4,3±0,2
4,4±0,1
4,1±0,2
3,8±0,1
4,8±0,1
3,5±0,2
4,0±0,1
4,8±0,2
3,8±0,1
Согласно полученным данным, образец муки люпина, модифицированной методом
индуцированного автолиза, превосходит образцы муки люпина и сои по исследуемым органолептическим свойствам. Мука соевая отличалась более темным цветом, близким к кремовому,
во вкусе прослеживался ярко выраженный «бобовый» привкус. Несмотря на то, что исследуемый
образец соевой муки был дезодорированным, дегустаторами был отмечен сильный «бобовый»
запах. При дегустации муки люпина нативной дегустаторы также обратили внимание на
специфический «бобовый» привкус в муке люпина нативной. В ходе органолептической оценки
было отмечено существенное улучшение вкусо-ароматических характеристик муки люпина
модифицированной, что, согласно литературным данным, связано с увеличением содержания
высоколетучих органических соединений, определяющих нежные оттенки аромата продукта, при
этом содержание легколетучих альдегидов, ответственных за нежелательный бобовый аромат,
снижается. Уменьшение содержания легколетучих альдегидов, ответственных за «бобовый
аромат», по мнению ученых [1,99], происходит в результате инактивации липоксигиназ,
активизирующих перекисное окисление липидов, именно продукты перекисного окисления
придают бобовым специфический запах.
61
Мука люпина нативная
Мука люпина
модифицированная
Соевая мука
Цвет
5
4
3
2
1
0
Вкус
Запах
Рисунок 27 - Профилограмма (рабочий профиль)
органолептических свойств исследуемых образцов
По мнению японских ученых специфические привкус и запах соевых бобов, которые
выразительно проявляются в комбинированных продуктах, обусловлены влиянием рибоксидазы и
накоплением девяти видов спиртов [45].
Можно предположить, что в процессе ограниченного протеолиза и последующего автолиза
происходит инактивация рибоксидазы и гидролиз указанных выше спиртов. Следовательно,
обработка муки люпина методом индуцированного автолиза позволяет устранить дефекты вкуса и
аромата. Активизация окислительно-восстановительных ферментов вызывает изменение окраски
муки люпина от интенсивно желтого до светло-желтого. Мука люпина по комплексу
органолептических характеристик превосходит соевую (дезодорированную) муку и может
являться альтернативной белковой добавкой при производстве широкого ассортимента
комбинированных пищевых продуктов.
4.2.6 Определение степени потенциальной мутагенности белковых препаратов
люпина и сои
62
Для определение мутагенности исследуемых образцов использовали полуколичественный
тест Эймса с метаболической активацией in vitro. В данном тесте используются специальные
штаммы микроорганизмов, которые происходят от лабораторного штамма Salmonella typhimurium
LT2. Основная задача теста Эймса — выявление генетической активности у тестируемых агентов
[100].
Принципиальная схема метода заключается в смешивании в пробирке расплавленного 0,6%
агара, определенного количества бактериальных клеток (тестерный штамм), исследуемого
вещества, фракции S9 (препарат ферментов печени крыс, полученный после осаждения
митохондрий) и кофакторов. Полученная смесь выливается в качестве верхнего слоя на поверхность твердой среды, обеспечивающей селективный рост ревертантов His+. Через 2 дня
проводится учет колоний ревертантов на чашках.
Пробоподготовка образца осуществлялась следующим образом: 10 г образца экстрагировали многократно смесью ацетон/гексан 1:1, затем растворители выпаривались на роторном
испарителе, а экстракт растворялся в 1 мл ДМСО (растворитель диметилсульфоксид) с
концентрацией 5 мкг/мл. Использование вышеназванных растворителей позволяет максимально
перевести мутагенные соединения, содержащиеся в исследуемом образце, в растворимое
состояние. Этот способ экстракции является наиболее приемлемым для гидрофобных
ксенобиотиков, обладающих мутагенным эффектом.
Приготовление S9 фракции (фракция ферментов), бактериальной культуры - тестерных
штаммов сальмонеллы, микросомной активирующей смеси (МАС), агара осуществляли по
методике описанной в методических указаниях [101,102].
В пробирку к 2 мл жидкого агара верхнего слоя при 45°С добавляют 0,1 мл культуры
штамма (ТА98 или ТА100). К этим компонентам добавляют также 200 мкл испытываемого
вещества. Для того чтобы определиться необходима ли предварительная активация проводятся
испытания как в присутствии, так и в отсутствие микросомной активирующей смеси. Если опыт
ставится с метаболической активацией, то тогда в пробирку добавляется еще и 0,5 мл МАС. Для
приготовления проб без микросомной активации (МА) из смеси MAC исключают фракцию S9
(заменяют на равный объем 0,15 М КС1), а растворы НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат)
и
глюкозо-6-фосфата
заменяют
на
равные
объемы
дистиллированной
воды.
Получившуюся смесь сразу же перемешивают вращением пробирки между ладонями и выливают
на поверхность находящегося в чашке Петри минимального агара с глюкозой.
63
Дают агару застыть в темноте (несколько минут), затем переворачивают чашку вверх дном
и инкубируют в темноте при 37°С. Через 2 дня инкубации отмечают колонии гистидиновых
ревертантов во всех образцах. Благодаря присутствию небольшого количества гистидина,
добавленного к среде, бактериальные клетки, в которых возникли мутации к прототрофности под
действием присутствующих в пробе мутагенов, способны несколько раз поделиться, что усиливает мутагенный эффект исследуемых соединений.
В эксперименте помимо опытных вариантов ставили и контрольные, содержащие только
культуру бактерий с растворителем (ДМСО) в присутствии (+МА) или без S9 фракции (-МА), без
исследуемого вещества. Пробы без МА позволяют выявить прямую мутагенную активность,
пробы с МА - промутагенную [102,103].
Важным показателем безопасности исследуемых белковых препаратов является степень
мутагенности белковой добавки. В последние 20-25 лет постоянно возрастает внимание к
содержанию мутагенных соединений в пищевых продуктах, поэтому необходимо было проверить
исследуемые образцы по показателю мутагенной активности.
Для оценки степени мутагенности исследуемых образцов использовали тест Эймса
сальмонелла/микросомы, как с системой метаболической активацией, так и без нее, основанный на
использовании специальных штаммов сальмонеллы [100].
В таблице 27 представлены результаты подсчета колоний в опытных и контрольных
образцах. Для получения более точных результатов эксперимент был поставлен в четырех
повторностях.
Таблица 27 - Результаты оценки мутагенности исследуемых образцов муки люпина и сои (тест
Эймса)
Исследуемый
образец
Холостой опыт с
растворителем
ДМСО
Мука люпина не
модифицированная
Мука люпина модифицированная
Бактериальные культуры (штаммы Salmonella)
TA 98
TA 100
+ MA*
- MA*
+ MA
- MA
43
32
92
108
39
39
105
106
32
38
104
110
38
35
80
109
25
40
82
79
39
33
98
76
45
30
92
81
36
40
95
83
45
42
69
67
38
47
70
71
47
47
75
69
64
45
41
79
43
35
62
43
38
73
Соевая мука
36
41
70
38
37
75
+ MA* - опыт, поставленный с метаболической активацией (фракция
73
79
70
74
72
S9), - MA* - без
метаболической активации.
Оценка результатов производится, исходя из следующих критериев: если количество
колоний на опытных чашках превышает число колоний на контрольных чашках без мутагена (т.е.
без внесения пробы исследуемого образца) не более чем в 1,7 раза, делается заключение, что
мутагенная активность не выявлена. Если наблюдается превышение в 1,7-2 раза, делается вывод о
слабой, в 2-10 раз - о средней, более чем в 10 раз - о сильной мутагенной активности препарата
[101].
В представленных в таблице 27 данных не наблюдается увеличение количества числа
колоний his+-ревертантов сальмонеллы в исследуемых образцах, по сравнению с контролем
(холостой опыт с растворителем ДМСО), т.е. ни один из испытываемых образцов не отличается
мутагенным эффектом.
Для более точной характеристики был проведен математический анализ и абсолютные
значения количества колоний гистидиновых ревертантов во всех образцах пересчитаны в
относительные показатели (рассчитано отношение числа his+-ревертантов колоний сальмонеллы,
выросших в присутствии исследуемых веществ (мука люпина нативная, мука люпина
модифицированная и соевая мука), к числу his+-ревертантов в контрольных образцах).
Полученные расчетные данные представлены в таблице 28.
Таблица 28 - Результаты испытаний исследуемых образцов муки люпина и сои тест-системой
Эймса на выявление мутагенной активности (усредненные значении четырех испытаний,
отношение количества колоний в опыте к контролю)
Исследуемый образец
Холостой опыт с растворителем ДМСО
Мука люпина не модифицированная
Мука люпина модифицированная
Бактериальные культуры (штаммы Salmonella)
TA 98
TA 100
+ MA*
- MA*
+ MA
- MA
1,0
1,0
1,0
1,0
0,954
1,0
0,96
0,737
1,15
1,23
0,77
0,65
65
Соевая мука
1,05
1,05
0,735
0,68
+ MA* - опыт, поставленный с метаболической активацией (фракция S9) , - MA* - без
метаболической активации.
Из представленных в таблице 28 данных видно, что ни один из образцов не проявил
мутагенного эффекта ни на одном из штаммов сальмонеллы, как с использованием, так и без
метаболической активации.
4.3 Разработка биотехнологической схемы производства модифицированного белкового
препарата из муки семян люпина
Для удовлетворения физиологических потребностей организма человека необходим
«идеальный» белок. Данную проблему можно решить на основе комбинации и рационального
использования белковых ресурсов методом подбора и расчета. Весьма эффективны методы
математической оптимизации на базе имеющейся информации о биологической ценности
различных белков. При этом могут быть вовлечены и побочные продукты переработки вторичного
сырья. Такой подход ведет не только к обеспечению организма необходимыми компонентами, но
и к созданию реальных условий для эффективной работы пищевой индустрии и режиму экономии
пищевых ресурсов в широком смысле. Очевидно, реализация безотходных технологий во многом
решает и экологические проблемы пищевых производств. В настоящее время разработаны и
успешно используются полноценные белковые добавки и продукты, приготовленные на основе
растительного сырья из нетрадиционных источников. Увеличение потребности в белковых
продуктах на перспективу и необходимость обеспечения рационального питания привели к
возникновению и быстрому развитию качественно новых направлений в производстве пищи. Они
заключаются в получении комбинированных и искусственных продуктов на основе значительных
потенциальных ресурсов пищевого белка, не используемого совершенно или используемого
крайне нерационально, с учетом строжайшей экономии высокоценных животных белков, в том
числе модифицированных.
Белки составляют наиболее дорогостоящий и дефицитный компонент рационов питания.
Наряду с количественным недостатком белка все большую отрицательную роль играет качественная неполноценность. Мясо - ценнейший источник белков - относится к числу наиболее
трудновоспроизводимых и дорогостоящих продуктов питания. Это прежде всего связано с тем,
66
что из всех белоксодержащих организмов организм сельскохозяйственных животных дольше
всего усваивает белок и обладает самым низким коэффициентом конверсии пищевых субстратов в
животные белки. Учитывая установившуюся практику получения жизненно необходимых
животных белков и эволюционно сложившиеся вкусовые привычки людей разнообразить пищу,
интенсификация производства мяса в обозримом будущем останется главным способом
обеспечения людей белками высокой биологической ценности. Этим и объясняется явная
тенденция спроса на мясные продукты питания. Однако спрос на эти продукты растет быстрее,
чем само производство. В связи с этим совершенно очевидно стремление обосновать и найти
приемлемые реальные пути непосредственного использования в питании той части белка, которая
до последнего времени составляла пищевой дефицит с низкой эффективностью утилизации в
животноводстве. В настоящее время обоснованы пути и способы реализации данного
направления. Все известное многообразие форм пищевых продуктов можно условно разделить на
две основные группы: 1) продукты, основанные на использовании нативных белков различного
происхождения (природные
продукты,
концентраты, изоляты); 2) продукты, основанные на
белках с модифицированной структурой (текстураты, гидролизаты) для улучшения питательной
ценности и свойств конечного продукта [104].
Люпин относится к ценным однолетним бобовым культурам. В сельскохозяйственном
производстве возделываются в основном 4 вида люпина: жёлтый, узколистный, белый и
многолетний. Однако, в последние годы наибольшее распространение в АПК России и многих
зарубежных странах (Австралия, Германия, Польша и др.) получил узколистный люпин.
Узколистный люпин - высокотехнологичная культура, способная накапливать до 40% белка
в семенах и 20% сухом веществе зелёной массы, обеспечивающая сбор его с гектара до 1,5...2
тонн. Белок отличается высоким качеством, высокой переваримостью из-за низкого содержания
ингибиторов трипсина. Новые возможности открылись перед люпином после выведения
селекционным путём его безалкалоидных форм, что дало возможность в большем масштабе
использовать эту культуру во многих регионах нашей планеты. Этому способствуют и высокие
адаптивные свойства люпина по отношению к различным климатическим и почвенным условиям.
В России люпин известен давно. Он настойчиво рекомендовался для широкого использования,
особенно на бедных песчаных и супесчаных почвах ещё Д. Н. Прянишниковым, Е. К. Алексеевым,
Н. И. Шараповым и другими выдающимися отечественными учёными. Кроме того, обладая
наивысшей азотофиксирующей способностью среди однолетних бобовых культур, люпин
способен аккумулировать в биомассе (в зависимости от условий выращивания) от 100 до 300 кг/га
67
экологически чистого симбиотического азота. Эффективность запашки 300...450 ц/га зелёной
массы заменяет внесение 5-7 ц/га аммиачной селитры. В условиях кризисного состояния
сельскохозяйственного производства, при его слабом ресурсном обеспечении, высоких ценах на
энергоносители и другие материально-технические средства, повышение роли люпина в
земледелии
будет
способствовать
энерго-,
ресурсосбережению,
снижению
затрат
при
производстве продукции растениеводства и животноводства, повышению плодородия почвы и
охране окружающей среды.
Таким образом, люпин имеет огромный биологический и экономический потенциал,
который до настоящего времени полностью не используется. В настоящее время селекционерами
страны создается новое поколение российских сортов, обладающих высокой продуктивностью,
устойчивостью к болезням и скороспелостыо. Выводятся сорта, адаптивные к конкретным
почвенно-климатическим зонам с учётом их агро- и биоклиматических условий [105].
Люпин
узколистный
(Lupinus.
angustifolius.)
–
однолетнее
травянистое,
хорошо
облиственное растение. По своей биологии и требованиям к факторам жизни приспособлен к
возделыванию на обширной территории в различных почвенно-климатических зонах РФ. Это
наиболее скороспелый вид, семена которого устойчиво вызревают в регионах с суммой активных
температур 1900°С и выше, а детерминантные эпигональные (колосовидные) сорта - 1700...
1800°С.
Из всех видов люпина узколистный наименее требователен к факторам внешней среды.
Селекционная работа с люпином проводилась менее интенсивно, чем с другими
культурами. В связи с этим перед селекционерами стоит ряд специфических задач, определяемых
как биологическими особенностями выращиваемых видов, так и требованиями производства к
вновь создаваемым сортам.
Люпин узколистный является наиболее скороспелым и быстрорастущим, поэтому именно
ему принадлежит решающая роль в расширении посевных площадей и продвижении культуры в
северные регионы России.
В
соответствии
с
определяющимися
направлениями
в
селекции
люпина
перед
селекционерами стоят многочисленные задачи, при решении которых будут достигнуты
намеченные цели. Основной задачей при создании сортов всех видов люпина является селекция на
скороспелость. Этот признак имеет исключительно важное значение для всех зон люпиносеяния
(независимо от направления использования сортов), так как от него зависит успех в расширении
посевных площадей, увеличении валовой продукции люпина и решении проблемы белка. Кроме
68
этого, скороспелые сорта должны обладать к целым рядом других признаков, без которых
получение ежегодных высоких урожаев в любых люпинопригодных почвенно-климатических
условиях нельзя гарантировать. В последнее время в селекции узколистного люпина большое
внимание уделяется созданию сортов нового морфотипа - растений с полностью заблокированным
ветвлением, у которых репродуктивная сфера представлена только главным соцветием, такие
морфотипы называются колосовидными или детерминантными. Успехи в этом направлении
имеются – в МСХА совместно с НИИСХЦР НЗ созданы сорта Ладный и Дикаф 14. Такие формы
получены и во ВНИИ люпина, многие из них не уступают по семенной продуктивности лучшим
сортам обычного типа ветвления и значительно превосходят районированные детерминантные
формы.
Сортам узколистного люпина должен быть передан признак нерастрескиваемости бобов. С
помощью анатомических исследований найдены доноры, имеющие со спинной стороны боба
сплошную склеренхимную обкладку, препятствующую растрескиванию бобов при созревании.
Для получения необходимых сортов с нерастрескивающимися бобами необходимо добиться
сочетания этого признака с другими ценными качествами через внутривидовую гибридизацию с
последующим индивидуальным отбором наиболее удачных комбинационных форм. В настоящее
время существует сорт узколистного люпина, обладающий устойчивостью к растрескиванию
бобов - Кристалл.
Большие задачи перед селекционерами стоят по созданию сортов, устойчивых к болезням.
Особенно сильный вред наносят фузариозивирусное израстание. Самой радикальной и
эффективной
мерой
борьбы
с
этим
серьезным
заболеванием
является
создание
фузариозоустойчивых сортов. Такая работа усиленно и в широких масштабах проводится в
Беларуси, в Польше и Германии. В настоящее время в распоряжении селекционеров имеются
необходимые источники фузариозоустойчивости, которые служат донорами при работе в этом
направлении. Первостепенная задача состоит в том, чтобы совместить высокую урожайность и
скороспелость лучших отечественных сортов с устойчивостью к фузариозу. Итоговым
результатом при выполнении всех поставленных задач в зависимости от направления селекции
должно явиться создание сортов высокопродуктивных и устойчивых по урожаю семян и зеленой
массы, минимально низкоалкалоидных со стабильно высоким содержанием белка, с наилучшим
фракционным и аминокислотным составом белков, скороспелых с гарантированным обеспечением
высоких урожаев семян во всех зонах люпиносеяния, устойчивых к имеющимся грибным и
вирусным заболеваниям, устойчивых к полеганию в переувлажненные годы и к засухе в
69
засушливые
периоды
вегетации,
обладающих
высоким
коэффициентом
размножения,
неопадающими и нерастрескивающимися бобами и хорошей водопроницаемостью семенной
кожуры [106,107,108].
На
рис.
28
представлен
первый
этап
биотехнологической
схемы
производства
модифицированного белкового препарата из муки семян люпина. Более подробно этап
пробоподготовки семян люпина описан в предыдущем этапе исследования.
Подготовленную по вышепредставленной схеме муку люпина подвергали модификации с
целью улучшения функциональных свойств и снижения концентрации антиалиментарных
компонентов. Традиционно для модификации белкового сырья используются следующие методы:
Кислотный гидролизат является одним из модифицированных белковых продуктов,
полученных методом химической модификации. Процесс получения данных белковых препаратов
включает в себя несколько основных операций: гидролиз, нейтрализацию, фильтрация,
созревание, а в некоторых случаях - частичную или полную дегидратацию.
Гидролиз производится с помощью соляной кислоты в концентрации около 20 %. Условия
гидролиза (температура, давление, время гидролиза) зависят от типа сырья. Часто используют
температуру 105-120 ºС, при давлении 0,15-0,20 МПа, время гидролиза 8-12 ч. Гидролизат
нейтрализуют гидроксидом натрия до рН 4,5-7,0 (чаще всего до рН 5,3-5,5). При хранении в
течение 1-6 мес. происходит созревание гидролизата, при котором он приобретает более нежные
вкус и запах, а также более светлый цвет. При этом часть хлорида натрия и некоторые плохо
растворимые аминокислоты выпадают в осадок. Затем следует фильтрация гидролизата. Большая
часть белковых гидролизатов выпускается в виде сушеных гидролизатов. В настоящее время
применяют три способа сушки: сушка распылением (гидролизат в форме тонкоизмельченного
порошка), сушка в барабанных сушилках периодического действия (частицы порошкового
гидролизата по размеру больше, чем при первом способе) и гранулирование.
70
Рисунок 28 - Биотехнологическая схема производства модифицированного белкового препарата из
муки семян люпина (1 этап)
Белковые
гидролизаты
содержат
значительное
количество
летучих
и
нелетучих
компонентов (например, свободные аминокислоты), которые влияют на их химические свойства и
органолептические показатели. Некоторые аминокислоты в процессе гидролиза частично (серии,
71
треонин) или полностью (триптофан) разлагаются. Алифатические разветвленные аминокислоты
(изолейцин, лейцин, валин), стабильные при гидролизе, малорастворимы и после нейтрализация
переходят в фильтрационные остатки. Все гидролизаты содержат в значительном количестве
глютамовую, аспараговую кислоты, аргинин, аланин и лейцин [109].
Химически модифицированные белки с высокими функциональными свойствами можно
использовать в качестве эффективных функциональных добавок в пищевые системы. Необходимо
отметить, что данная модификация белка может быть обратимой.
Методы
химической
модификации
белка
не
получили
широкого
практического
применения, несмотря на их большие потенциальные возможности, по следующим причинам:
необходимость проведения тщательных медико-биологических исследований модифицированных
белков и разработки методов контроля процессов модификации и состава получаемых продуктов;
контроль процессов модификации очень сложен в связи с большим числом реакционноспособных
функциональных групп в молекуле белка и меньшей специфичности методов химической
модификации по сравнению с ферментативной; большое значение могут иметь возможные
примеси в препаратах белка и используемых химических реактивах, которые могут сорбироваться
и накапливаться в белке, а также образовывать токсичные продукты; не исключено и значительное
снижение биологической ценности белка при его модификации, так как не все образующиеся
химические связи гидролизуются в желудочно-кишечном тракте и не все новые продукты
модификации могут усваиваться организмом [110].
Кроме этого можно отметить следующие недостатки данной группы методов: химический
гидролиз - это в первую очередь изменение натуральных свойств и состава исходного сырья;
снижение биологической активности аминокислот и их эффективности; образование новых
веществ небезопасных для человека из-за побочных химических реакций; наличие большого
количества соли в конечном продукте; химический синтез – процесс длительный и экологически
небезопасный; возможно получение лишь одной аминокислоты из искусственного сырья; наличие
опасных для человека полупродуктов; потребность в дорогом химическом сырье высокой степени
очистки; необходимость удаления остатков сырья и полупродуктов незавершенного синтеза [111].
Наиболее широко используются физико-химические и ферментативные методы. Физикохимические приемы более просты в технологическом отношении и не требуют применения
непищевых веществ. При использовании этой группы методов у белков повышается
растворимость,
гелеобразующая,
жироэмульгирующая
текстурированию и прядению [79].
72
способность,
способность
к
Среди физико-химических приемов наибольшее значение имеют три группы методов:
термоденатурация белков, комплексообразование белков с другими пищевыми веществами, а
также
фазовое
расслоение
многокомпонентных
белоксодержащих
пищевых
систем.
Функциональные свойства белков улучшаются и за счет обработки их веществами липидной
(лецитин, стеароил-2-лактилат натрия) или иной природы (поливалентные металлы).
Термоденатурацию широко используют для регулирования функциональных свойств
белков, в первую очередь для снижения растворимости белков при их выделении и очистке. Этот
метод привлекает к себе внимание еще и потому что была обнаружена возможность получения
растворимых продуктов с новыми функциональными свойствами (поверхностные свойства,
способность белка стабилизировать эмульсии и пены, реологические свойства и способность к
гелеобразованию).
При термоденатурации белка в разбавленных растворах ниже критической концентрации
гелеобразования оказалось возможным получать растворимые денатурированные формы, которые
характеризуются более высокой гидрофобностью, чем нативные макромолекулы. В результате
повышаются эмульгирующая емкость, эмульгирующая и пеностабилизирующая способность
белков.
Путем тепловой обработки с последующим фракционированием получают такие продукты,
как соевое молоко и т.п.
Высокой эффективностью отличаются методы регулирования функциональных свойств
белка, основанные на его взаимодействии с полисахаридами. Эта технология позволяет
регулировать растворимость, реологические, поверхностные и другие физико-химические
свойства наряду с фазовым и агрегатным состоянием белоксодержащих пищевых систем [110].
Достижения современной энзимологии значительно расширили возможности применения
ферментативных методов для регулирования функциональных свойств белка. Методы связанные с
использованием ферментов давно и успешно применяются в ряде Европейских стран, США. За
рубежом уже давно существует крупнотоннажное производство ферментных препаратов.
Мировой рынок применения промышленных ферментов составляет около 1,5 млрд долл. США.
Ежегодный прирост этого рынка составляет 10 %, этот рост объясняется возможностью замены
ферментными препаратами различных химических веществ, вредных для человека и животных.
Ферменты сейчас используются практически во всех отраслях, в первую очередь в медицине и
пищевой
промышленности.
Объемы
мирового
производства
ферментов
распределяются
следующим образом: 33 % - для производства синтетических моющих средств, 26 % - для
73
производства фруктовых и овощных соков, 3 % - в кожевенной, 15 % - в хлебопекарной и 10 % пивоваренной промышленности. Такое активное использование ферментов обусловлено их
преимуществами по сравнению с химическими катализаторами, а именно избирательностью
действия,
возможностью
достижения
высоких
скоростей
превращения
субстратов
при
относительно мягких условиях процесса и безвредностью для окружающей среды и человека.
Ферменты используют для модификации протеинов уже более 20 лет [112,113].
Ферменты присущи всем живым объектам и находятся практически во всех растениях,
животных и микроорганизмах. Однако процесс биосинтеза ферментов в организме связан с
обеспечением метаболизма клеток, и количество синтезируемых ферментов строго определяется
жизненной потребностью организма; такие объекты не могут служить источником получения
ферментных препаратов. Для этого пригодны только некоторые растительные организмы или
отдельные органы растений и животных, способные накапливать значительное количество
ферментов.
Источником ферментов может быть пророщенное зерно различных злаков (солод). Оно
может либо использоваться непосредственно как технический ферментный препарат, либо
служить исходным материалом для получения очищенных ферментных препаратов. В
тропических и субтропических странах в качестве сырья для промышленного производства
протеиназ используют латекс дынного дерева, латекс растений, относящихся к виду фикусовых,
например листья, побеги инжира, сок зеленой массы ананаса.
Органы и ткани животных также могут являться сырьем для производства ферментов. На
всех мясоперерабатывающих комбинатах собирают сырье, содержащее ферменты, консервируют
его и используют для получения ферментных препаратов. Таким сырьем являются поджелудочная
железа, слизистые оболочки желудков и тонких кишок свиней, сычуги крупного рогатого скота,
сычужки молочных телят и ягнят, семенники половозрелых животных. Поджелудочная железа
содержит большое количество разнообразных ферментов: химотрипсин, коллагеназу, эластазу,
трипсин, амилазу, липазу и др. Слизистая оболочка желудков свиней и сычугов крупного рогатого
скота служит источником пепсина и липазы. Из сычужков молочных телят и ягнят получают
реннин (сычужный фермент). Семенники половозрелого скота содержат фермент гиалуронидазу.
Микроорганизмы.
В
специально
созданных
условиях
микроорганизмы
способны
синтезировать огромное количество разнообразных ферментов. Они неприхотливы к составу
питательной среды, легко переключаются с синтеза одного фермента на другой и имеют
сравнительно короткий цикл роста (16-100 ч). Для промышленного получения ферментных
74
препаратов используют как природные штаммы микроорганизмов, выделенные из естественных
объектов, так и мутантные штаммы. Продуцентами ферментов могут быть различные
микроорганизмы:
бактерии,
грибы,
дрожжи,
актиномицеты.
Микроорганизмы
могут
синтезировать одновременно целый комплекс ферментов, но есть и такие, особенно среди
мутантных штаммов, которые являются моноферментными и образуют в больших количествах
только один фермент [114].
Растительные протеиназы применяют для борьбы с белковым помутнением пива, для
производства белковых гидролизатов [115].
Микробиальная ферментация бобов сои с выработкой таких продуктов как соевый соус,
мисо, темпе является одним из самых древних способов обработки растительных белков [59].
Протеазы микроорганизмов применяются также при созревании сыров или мяса. Известна роль
протеолитических ферментов в формировании структуры мякиша хлеба и сохранении
его
свежести, а также влияние грибной протеазы на технологию производства крекеров и печенья
[115].
Ферментативная обработка протеазами (трипсином, микробной протеазой и др.)
значительно улучшает растворимость белков, увеличивает влагоудерживающую способность,
переваримость, консистенцию и другие показатели готовых изделий. Разработан способ
получения гидролизата подсолнечникового шрота, содержащий 10 % сухих веществ, а также технология получения гидролизованной картофельной мезги [104].
Преимуществами метода ферментативной модификации являются мягкие режимы
выделения белков, сохранение биологической ценности и возможность регулирования глубины
той или иной реакции.
К основным разновидностям данной группы методов относят протеолиз, пластеиновая
реакция, гликозилирование, фосфорилирование, дезамидирование, сшивание [113].
Для наиболее полного использования потенциальных возможностей белков растений
прекрасно зарекомендовал себя метод ферментативного гидролиза, глубоко затрагивающий
структуру белков. Он протекает в достаточно мягких условиях и дает смесь аминокислот и
пептидов. При этом степень рацемизации аминокислот более низкая и повышена биологическая
ценность исходного субстрата [58,113].
Из группы ферментативных методов наибольшее распространение получил метод
ограниченного ферментативного протеолиза. При нем, например, в легумине кормовых бобов под
75
влиянием трипсина расщепляются пептидные связи только α-цепей, тогда как β-цепи остаются
незатронутыми [79].
Использование этой технологии позволяет улучшить растворимость, эмульгирующие,
пенообразующие, гелеобразующие свойства исходного белкового материала. Модифицированные
протеины обеспечивают вязкость, текстуру и вкус [116,117].
В результате ферментативного воздействия увеличивается пищевая ценность, в частности,
повышается степень экстракции белка, идет частичный гидролиз белков и полисахаридов,
происходит
накопление
свободных
аминокислот
и
легкоусвояемых
сахаров.
При
протеолитическом распаде белков могут образовываться большое число абсорбируемых физиологически активных пептидов [60].
Различные ферментные препараты проявляют разную протолетическую активность,
которая зависит от многих факторов прежде всего рН и температуры, соотношения ферментсубстрат, степени гидролиза. Повышение температуры ускоряет ферментативные реакции, для
каждого протеолитического препарата характерна своя определенная температура максимальной
скорости реакции. При выборе ферментного препарата самое большое значение имеет его
специфичность к гидролизу исследуемого сырья [58,59,118].
В препаратах протеолитического действия обычно присутствуют сопутствующими
ферменты, как правило амилаза и β-глюканаза. Наличие таких сопутствующих ферментов, может
оказывать положительный эффект на выход конечного продукта, так как действие этих ферментов
проявляется в разрушении полисахаридов клеточных стенок сырья и улучшении экстракции в
целом [59].
Другим направлением регулирования функциональных свойств белка с помощью
ферментов является пластеиновый синтез, который основан на использовании протеолитических
ферментов для синтеза пептидных связей. Сначала идет частичный гидролиз белка до крупных
пептидов с молекулярной массой 3-20 кДа, затем концентрируют полученную систему (до 30-40%
массы) и вносят другой или тот же фермент, изменяя рН системы. В результате получают
продукты, существенно отличающиеся по функциональным свойствам от исходного белка и
пептидов.
Метод
пластеинового
синтеза
применяют
для
регулирования
растворимости,
аминокислотного состава, введения незаменимых аминокислот, в том числе эфиров аминокислот с
длинными углеводородными радикалами с целью повышения поверхностной активности
пластеинов [110].
76
Белковые продукты, полученные с применением ферментных препаратов практически не
отличаются от выделенных без фермента белковых продуктов по растворимости, но они имеют
более высокие значения жироэмульгирующей (ЖЭС), водосвязывающей (ВСС) и особенно
жиросвязывающей (ЖСС) способностей. Высокие функциональные свойства новых белковых
продуктов делают возможным их применение в качестве эмульгатора, влагопоглотителя и
абсорбента жира в хлебопекарной, мясной, кондитерской, масложировой и других отраслях
пищевой промышленности [58].
На рис.29 представлен второй и третий этап биотехнологической схемы производства
модифицированного белкового препарата из муки семян люпина.
Один из методов получения искусственных продуктов питания высокой биологической
ценности при переработке нетрадиционных видов белков, особенно растительных, заключается в
обогащении продуктов недостающими незаменимыми аминокислотами. Это особенно важно при
производстве искусственных продуктов, имитирующих продукты животного происхождения, так
как позволяет доводить их биологическую ценность до уровня натуральных аналогов и резко
увеличить объем производства полноценной белковой пищи. Помимо обогащения белкового
сырья и искусственных пищевых продуктов отдельными незаменимыми аминокислотами,
последние используются для питания также и в виде смесей. Смеси аминокислот могут быть
добавлены к продукту для повышения биологической ценности как за счет корректировки
аминокислотного состава, так и для повышения общего содержания аминокислот, а кроме того, и
для улучшения вкусовых свойств. Смеси аминокислот находят также применение в качестве
синтетических диет различного назначения, например для парэнтерального питания, в тех
случаях, когда прием и усвоение традиционной пищи нормальным путем невозможны. В качестве
вкусовых добавок, помимо смесей аминокислот и композиций на основе реакции Майара,
используют также и отдельные аминокислоты и пептиды [110].
Для повышения биологической ценности пищевых продуктов в производственной практике
добавляют отдельные кристаллические аминокислоты. Наиболее важные из них - лизин,
триптофан метионин, цистин и др.
77
Рисунок 29 – Биотехнологическая схема производства модифицированного белкового препарата
из муки семян люпина (2 и 3 этапы)
Некоторые аминокислоты и пептиды используют как вкусообразователи. Например,
глутаминовая и аспарагиновая кислоты, фенилаланин, тирозин при нагревании формируют
специфический, свойственный мясным продуктам вкус и запах [104].
78
При обогащении продуктов питания аминокислоты обычно добавляют в количествах от
долей процента до 1-1,5%. В результате стоимость продукта увеличивается незначительно,
биологическая же ценность может при этом возрастать в 1,5-3 раза.
Таким образом, в связи с проблемой переработки нетрадиционных белков в полноценные
искусственные продукты питания еще более возрастает значение задачи производства значительных количеств незаменимых аминокислот, смесей аминокислот, а также вкусовых и
ароматизирующих композиций на их основе
Смеси аминокислот могут быть получены кислотным пиролизом белков, прежде всего
белковых отходов пищевой промышленности, а также ферментативным гидролизом, в частности
автолизом дрожжей. Они могут быть очищены от посторонних примесей и выделены методом
ионообменной хроматографии. Состав таких смесей можно корректировать добавлением
отдельных аминокислот [110].
Индивидуальные аминокислоты обычно получают микробиологическим и химическим
синтезом или их комбинацией. Метод химического синтеза наиболее универсален и наиболее
рентабелен экономически при больших масштабах производства.
Незаменимые
аминокислоты
могут
получаться
микробиологическим
путем
более
эффективно, чем путем химического синтеза, так как при биологическом синтезе используемые
микроорганизмы образуют аминокислоты в биологически активной L-форме. Как продуценты
лизина изучаются Brevibacterium lactofermentum и бактерии рода Corynebacterium, также
предложены способы биотехнологического получения изолейцина, треонина при использовании
E.
coli.
Большинство
исследованных
штаммов
микроорганизмов
независимо
от
их
систематического положения преимущественно накапливают L-аланин и глутаминовую кислоту.
Значительно меньше штаммов и в меньшем количестве выделяют аспарагиновую кислоту, лейцин,
валин, изолейцин, лизин. За рубежом 60% мощностей по производству аминокислот занимают
глутаминовая кислота, далее идут метионин, лизин и глицин. Глутаминовая кислота производится
при участии в качестве продуцента штамма Corynebacterium [119].
Путем микробиологической ферментации получают основное количество глутаминовой
кислоты и весь лизин. У этого процесса свои преимущества и свои недостатки. С одной стороны, в
нем мало стадий и требуется относительно простая и универсальная аппаратура. С другой
стороны, живые микроорганизмы, с которыми приходится работать, очень чувствительны к
малейшему изменению условий, а концентрация целевого продукта получается низкой, что ведет
к увеличению размеров аппаратуры.
79
Микробиологический синтез аминокислот наиболее перспективен и экономически выгоден.
Более 60% всех производимых в настоящее время высокоочищенных препаратов аминокислот
получают этим способом. Главное преимущество которого состоит в возможности получения
аминокислот на основе возобновляемого сырья. Промышленное производство аминокислот стало
возможным после открытия способности некоторых микроорганизмов выделять в культуральную
среду значительных количеств какой-либо одной аминокислоты. При этом было выявлено, что
продуктивные штаммы можно улучшать посредством селекции мутантов с измененной
генетической программой. Это роды Brevibacterium, Micrococcus, Corinebacterium, Arthrobacter.
Почти все протеиногенные аминокислоты можно получать с помощью специфических
микроорганизмов. Принцип микробиологического метода заключается в аэробном выращивании
микроорганизмов в разбавленных питательных растворах, содержащих усвояемые источники
углерода и азота, как, например, углеводы, углеводороды, органические и неорганические
соединения азота, минеральные соли и ростовые вещества.
Можно использовать также полупродукты биосинтеза аминокислот. Например, изолейцин
и серии можно получать ферментацией культуры, содержащей треонин или глицин. В качестве
микроорганизмов применяются культуры дикого типа, например Cornynebacterium glutamicum и
Brevibacterium flavum, а также мутанты, которые производят большое количество специфических
аминокислот. В случае ауксотрофных мутантов микроорганизмы не располагают некоторыми
ферментами, необходимыми для биосинтеза определенных аминокислот. Синтез поэтому может
остановиться на одной из первых ступеней или пойти по другому пути. Если продуктом первой
ступени или продуктом такого побочного пути являются аминокислоты, то они производятся и
аккумулируются в большом количестве, например применение мутанта, дефицитного по
гомосерину
из
Eschrichia
coli,
обусловливает
накопление
лизина.
Отсутствие
гомосериндегидрогеназы блокирует гомосеринтреонин-метиониновый путь синтеза в пользу
побочного синтеза, приводящего к образованию лизина. В случае регуляторных мутантов,
применяемых для получения аргинина, метионина, изолейцина и триптофана, наработка
аминокислот осуществляется путем нарушения механизма обратной связи.
Культивируют бактерии в стерилизованных ферментерах при 35ºС, используя в качестве
источника углерода глюкозу или патоку и вводя в систему воздух и аммиак. Через 40 ч из
культуры можно изолировать глутаминовую кислоту. Выход составляет 50 кг аминокислоты на
100 кг введенной глюкозы [120].
80
Заключение.
Проведенное
исследование
влияния
технологии
индуцированного
автолиза
на
модификацию химического состава и технолого-функциональных свойств белковых препаратов
люпина позволило прийти к заключению, что в результате использования данной технологии в
муке семян люпина происходят процессы и изменения, сходные с процессами, протекающими при
проращивании семян.
Достоверно установлено, что в ходе автолиза происходит увеличение содержания белков с
меньшим молекулярным весом. Особенно заметно эта тенденция проявляется на 3 сутки автолиза
(72-х часовые пробы). Изменение молекулярного веса белков приводит к изменению технологофункциональных свойств белковых препаратов люпина.
Наиболее важную роль в формировании функционально-технологических свойств играют
водоудерживающая, жироудерживающая, эмульгирующая, гелеобразующая способность. Анализ
разработанных нами оптимальных режимов биотехнологии модификации белковых препаратов
муки люпина методом индуцированного автолиза позволяет предположить, что структурные
изменения химического состава, в том числе белков, углеводов, фитатов и других соединений,
приведут к улучшению функциональных свойств муки люпина.
Согласно результатам, полученным нами при исследовании изменения молекулярной
массы белков в процессе индуцированного автолиза, после трех суток автолиза наблюдается
увеличение содержания фракций белка с небольшим молекулярным весом, в результате
протеолиза белков, но при этом в белке присутствуют фрагменты, обладающие сравнительно
большой молекулярной массой. Эти данные позволяет нам предположить, что в ходе
индуцированного автолиза в белке протекают процессы изменения α- и β-цепей, оказывающие
существенное влияние на эмульгирующие свойства белков.
Полученные результаты позволяют сказать, что наилучшей эмульгирующей способностью
среди
исследуемых
образцов
обладает
мука
люпина
модифицированная,
процент
не-
расслоившейся эмульсии которой составляет около 90%, что на 30% превышает аналогичный
показатель для муки люпина немодифицированной и на 40% для муки соевой. Столь
существенные различия между модифицированной и немодифицированной мукой люпина во
многом обусловлены гидролитическими изменениями, происходящими в белках во время
индуцированного автолиза.
Таким образом, в ходе индуцированного автолиза происходит повышение эмульгирующей
способности муки люпина модифицированной.
81
Влагоудерживающая способность (ВУС) – одно из важнейших функциональных свойств,
зная его значение, можно рассчитать содержание ингредиентов и белковых препаратов в
рецептуре пищевых продуктов, которая будет обеспечивать необходимые реологические свойства
и снижение потерь в процессе технологической обработки.
Исходя из результатов эксперимента и дополнительных расчетов, можно сказать, что из
исследуемых вариантов белковых препаратов самым высоким значением ВУС обладает мука
люпина модифицированная. Полученное значение ВУС муки люпина модифицированной выше
значения ВУС соевой муки на 21,5%, а муки люпина нативной на 10 %.
Важным функционально-технологическим свойством исследуемых образцов белковых
препаратов люпина является жироудерживающая способность (ЖУС). Исходя из полученных
результатов, можно сказать, что технология индуцированного автолиза не оказала влияние на
изменение данного свойства, так как нативная и модифицированная мука люпина практически не
отличаются по способности удерживать жир.
Процесс индуцированного автолиза также не повлиял на способность муки семян люпина к
образованию гелей. В литературе есть данные, показывающее, что в процессе проращивания
семян гелеобразующиее свойства имеют тенденцию к понижению.
На основании полученных данных, можно сделать заключение, что по функциональнотехнологическим свойствам образцы муки люпина превосходят соевую муку. Использование
биотехнологии индуцированного автолиза позволяет повысить функционально-технологические
свойства муки люпина, в том числе влагоудерживающую способность на 10%, по сравнению с
немодифицированной мукой люпина, и на 21,5%, по сравнению с мукой сои, а эмульгирующую
способность на 30,0 и 40,0 % соответственно.
Таким образом, сравнительный анализ представленных образцов муки по функциональнотехнологическим свойствам показал, что наиболее перспективной добавкой для использования в
производстве пищевых продуктов является мука люпина, подвергнутая в качестве обработки
индуцированному автолизу.
Индуцированный автолиз также оказывает влияние на содержание антиалиментарных
компонентов в муке семян люпина. Содержание фитиновых кислот в пробе автолизата через 72
часа автолиза, по сравнению с контролем, уменьшилось. Полученные данные позволяют сказать,
что в процессе индуцированного автолиза происходит значительное снижение содержание фитатов на 34,7%. Необходимость измерения фитатов во многом связана с тем, что интенсивном
развитии сельского хозяйства активно используются удобрения, которые растения аккумулируют
82
из почвы, что значительным образом влияет на содержание фосфора в растениях. Полученные
результаты позволяют сказать, что содержание фитатов в люпине в два раза ниже, чем в сое.
Снижение содержания фитатов позволит повысить пищевую ценность продуктов с белковой
добавкой из муки люпина модифицированного.
Еще одной группой антиалиментарных веществ бобовых культур являются олигосахариды
рафинозной группы. В муке семян люпина узколистного содержится в среднем 4% рафинозных
олигосахаридов, что снижает их пищевую ценность и усвояемость, в связи с чем перед нами
стояла задача определить как будет влиять процесс индуцированного автолиза на содержание
данной группы углеводов.
Полученные данные показывают, что в процессе автолиза под действием собственных
ферментов муки семян люпина происходит гидролиз нередуцирующих сахаров, в результате
которого увеличивается содержание редуцирующих сахаров. В ходе проведения исследования
было выяснено, что максимальное наращивание оптической плотности в растворах пробы опыта
происходило после 40 часов автолиза, т.е. увеличение концентрации продуктов гидролиза сахаров
происходит к концу вторых суток, что коррелируют с литературными источниками.
Важное значение имеет не только количественное содержание белков и сбалансированность аминокислотного состава, но и степень атакуемости белков ферментами пищеварительного тракта, т.е. переваримость, которая является одним из основных показателей биологической ценности пищевого продукта.
Согласно полученным данным, степень переваримости белка люпина была выше, чем белка
сои, и составляла соответственно 89,6 и 83,5%. При этом переваримость муки люпина в процессе
индуцированного автолиза возрастала и составила 92,7 %, что превысило значение переваримости
нативной муки люпина и сои на 3,1 и 9,2 % соответственно.
Одной из причин повышения степени переваримости белков муки люпина в процессе
индуцированного автолиза является гидролиз соединений пептидов с целлюлозой и гемицеллюлозой, затрудняющих доступ пищеварительных ферментов к полипептидам.
На основании полученных данных была разработана схема биотехнологического процесса
производства модифицированного белкового препарата из семян люпина, включающая в себе
следующие основные этапы: селекция новых сортов люпина, обладающих следующими
характеристиками: высокая урожайность; минимально низкоалкалоидные; стабильно высокое
содержание белка; осуществление пробоподготовки муки люпина к модификации; ограниченный
протеолиз муки семян люпина с использованием экзофермента; автолиз муки семян люпина
83
эндогенными ферментами; использование микробиологического синтеза с целью получения
отдельных
аминокислот.
84
Список использованных источников.
1. Растительный
белок:
новые
перспективы:
Сборник
статей.
М.:
Пищепромиздат, 2000. – 179 с.
2. Effect of germination on chemical composition, biochemical constituents and
antinutritional factors of soya bean (Glycine max) seeds / Ming Bau H.,
Villaume Ch. et al. // J. Sci. Food Agric. – 1997. № 73. P. 1-9.
3. Wu Y. Effect of germination on oats and oat protein // Cereal Chemistry. –
1983. Vol. 60. № 6. P. 418-420.
4. Nutritional assessment of raw and germinated pea (Pisum sativum L.) protein
and carbohydrate by in vitro and in vivo techniques / Urbano
http://www.journals.elsevierhealth.com/periodicals/nut/article/PIIS089990070
4002655/abstract - article-footnote-1#article-footnote-1G., López-Jurado M.
et al. // J. Nutrition. – 2005. Vol. 21. Issue 2. P. 230-239.
5. Mostafa M., Rahma E., Rady A. Chemical and nutritional changes in soybean
during germination // Food Chem. – 1987. № 23. P. 257-275.
6. Bau H., Debry G. Germinated soybean protein products : chemical and
nutritional evaluation // Journal of the American Oil Chemists' Society. –
1979. Vol. 56. № 3. P. 160-162.
7. Colmenares de Ruiz A., Bressani R. Effect of germination on the chemical
composition and nutritive value of amaranth grain // Cereal Chemistry. –
1990. Vol. 67. № 6. P. 519-522.
8. Jaya T., Venkataraman L. Changes in carbohydrate constituents of chickpea
and greengram during germination // Food Chemistry. – 1981. Vol. 7. № 2. P.
95-104.
9. Effect of different treatments on phytate and soluble sugars in California small
white beans (Phaseolus vulgaris) / Kon S., Olson A. et al. // J.Food Sci. –
1973. Vol. 38. Issue 2. P. 215-217.
10. Alkaloid, α-galactoside and phytic acid changes in germinating lupin seeds /
Cuadra C., Muzquiz M. et al. // Journal of the Science of Food and
Agriculture. – 1994. Vol. 66. Issue 3. P. 357-364.
11. Petterson D., Sipsas S., Mackintosh J. The chemical composition and nutritive
value of Australian pulses. – Canberra: Grains research and development
corporation,
1997.
85
–
65
p.
12. Бенкен И.И., Томилина Т.Б. Антипитательные вещества белковой природы в
семенах сои // Науч.-техн. бюлл. ВИР. – С-Пб., 1985. – Вып. 149. – С. 3-10.
13. Костюковский П.В. Физиологическое состояние и мясная продуктивность
бычков
черно-пестрой
породы
при
включении
в
рацион
зерна
малоалкалоидного люпина: Автореф. дис. … канд. биол. наук. – Брянск, 2009.
– 19 с.
14. Itzhaki R., Gill D. A Micro–biuret method for estimating proteins // Anal. Biochem.
– 1964 (Dec.). № 9. P. 401–410.
15. Differential proteolysis of glycinin and β-conglycinin polypeptides during soybean
germination and seedling growth / Wilson K., Rightmire B. et al. // Plant physiology.
– 1986. Vol. 82. P. 71-76.
16. M.Swinkels J.J.M. Composition and properties of commercial native starches //
Starch. 1985. 37. 1-5.
17. Danilenko A.N., Grozav E.K., Bikbov T.M., Grinberg V.Y. Tolstoguzov V.B.,
Studies on the stability of 11S-globulin from soybeans by means of differential
scanning microcalorimetry // Int. J. Biol. Macromol. 1985. 7. 109-119.
18. Andreev N.R., Kalistratova E.N., Wasserman L. A. and Yuryev V.P. The influence
of heating rate and annealing on the melting thermodynamic parameters of some
cereal starches in excess water // Starch. 1999. 51. 422-429.
19. Li H. and Lelievre J. A model of starch gelatinization linking differencial scanning
calorimetry and birefringence measurements // Carbohydrate Polymers 1993. 20. 1 5,131.
20. Tester R.F., Debon S.J. J., Davies H.V. and Gidley M.J. Effect of temperature on
synthesis, composition and physical properties of potato starch // J. Sci. Food. Agric.
1999. 79.
21. Tester R.F. Influence of growth conditions on barley starch properties // Int. J. Biol.
Macromol. 1997. 21. 37-45.
22. Wang T.L., Bogracheva Т., Hedley C.L. Starch: as simple as А, В, С // J. Experim.
Botany. 1998. 49. 481-502.
23. Даниленко А.Н., Гринберг В.Я., Бикбов Т.М., Бурова Т.В., Толстогузов В.Б.
Конформационная стабильность 11S глобулина из семян подсолнечника по
данным
дифференциальной
сканирующей
калориметрии
биохимическая микробиология 1987. 23. 664-669.
//Прикладная
24. Shennon J.C. and Garwood D.L. Genetics and physiology of starch development /
In: Starch Chemistry and Technology. Eds. by Whistler R.L., Be Miller J.N. and
Pashall E.F. Academic Press, London, 1984, pp.25-86.
25. Radosta S., Kettlitz В., Schirbaum F. and Gernat Ch Studies on rye starch properties
and modification. Part II: Swelling and solubility behaviour of rye starch granyles //
Starch. 1992. 44. 8-14.
26. Kozhevnikov, G.O., A.N. Danilenko, N.E. Pavlovskaya, L.V. Golischkin, V.N.
Milyaev and V.P. Yuryev: DSC study of the thermodynamic properties and structure
of starches from wrinled peas. Starch. 1999, subm.
27. Schierbaum F., Radosia S., Richter M., Kettlitz B. and Gernat Ch. Studies of Rye
Starch Properties and Modification. Part I: Composition and Properties of Rye
Starch Granules // Starch. 1991.43. 331-339.
28. Gernat Ch., Radosta S., Damashun G. and Schiebaum F. Supramolecular structure of
legume starches revealed by X-ray scattering // Starch. 1990.42. 175-178.
29. Protserov V.A., Karpov V.G., Kozhevnikov G.O., Wasserman L.A. and Yuryev V.P.
Changes of thermodynamic and structural properties of potato starches (UDACHA
and ACROSIL) during biosynthesis // Starch. 2000. 52.
30. Schwenke K. Enzyme and chemical modification of proteins // Food proteins and
their applications / ed by S. Damodaran and A. Paraf. NewYork: Marcel Dekker,
1997. P. 393-423.
31. Imberty A., Chanzy H., Perez S., Buleon A. and Tran V. New three dimensional
structure for A-type starch // Macromol. 1987. 20. 2634-2636.
32. Imberty A., Chanzy H., Perez S., Buleon A. and Tran V. The double helical nature of
the crystalline part of A-starch//J. Molec. Biol. 1988. 201. 365-378.
33. Zobel H.F., Stephen A.M. Starch: structure, analysis and application / In: Food
Polysaccharides and their Application. Ed. by A.M. Stephen, Marcel Dekker, New
York 1995, pp. 19-55.
34. Даниленко А.Н. Дмитроченко А.П. Толстогузов В.Б. Исследование продуктов
ограниченного протеолиза легумина кормовых бобов (Vicia fava L.) трипсином
при высоких концентрациях субстрата // Прикладная биохимия и м/б. – 1990.
№ 26. С. 559-565.
35. Vanderstoep J. Effect of germination on the nutritive value of legumes // Food
Technology. – 1981. Vol. 35. № 3. P. 83-85.
36. Ring S.G., Miles M.J., Morris V.J., Turner R. and Colonna P. Spherullitic
crystalization of short chain amylose // Int. J. Biol. Macromol. 1987. 9. 158-160.
87
37. French D. Organization of starch granules in Starch / In: Chemistry and Technology.
Ed. by R.L. Whistler, J.N. BeMiller, E.F. Paschall. Academic Press, San Diego,
1984, pp. 183-247.
38. Остерман
Л.
А.
Хроматография
белков
и
нуклеиновых
кислот.
–
М.:Наука,1985. –536с.
39. ГОСТ Р 51417-99. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье Определение
массовой доли азота и вычисление массовой доли сырого протеина. Метод
Къельдаля. – М.: Изд-во стандартов, 2002. – 8 с.
40. Семена люпина - новый перспективный источник пищевого белка / Е.К.
Вовнянко, В.Н. Красильников, Н.Н. Фролова и др. – М.: АгроНИИТЭИПП,
1991. – 32 с.
41. Довбан К.И., Шутов Г.К., Шуканов А.С. Люпин - важнейший резерв
высококачественного белка. – Минск: БелНИИНТИ, 1987. – 47 с.
42. Люпин
-
перспективный
источник
пищевых
компонентов:
обзорная
информация / Е.И. Сизенко, А.Б. Лисицын, Л.С. Кудряшов и др. –
М.:ВНИИМП, 2004. – 35 с.
43. Томе Д., Вальдебуз П., Кремпф М. Основные проявления нежелательных
соединений, связанных с растительными белками // Растительный белок: Пер.
с фр. / Под ред. Т.П. Микулович. – М.: Агропромиздат, 1991. – С. 331-358.
44. Химия и биохимия бобовых растений: Пер. с англ. К. С. Спектрова / Под ред.
М.Н. Запрометова. – М.: Агропромиздат, 1986. – 336 с.
45. Пищевая ценность люпина и направления использования продуктов его
переработки / Сизенко Е.И., Лисицын А.Б. и др. // Все о мясе. – 2004. № 4. С.
34-40.
46. Phytic acid and phosphorus in crop seeds and fruits: a global estimate seed / Lott J.,
Ockenden I. et al. // Science Research. – 2000. № 10. P. 11–33.
47. Iron bioavailability in humans from breakfasts enriched with iron bis-glycine
chelate, phytates and polyphenols / Layrisse M., García-Casal M. et al. // The
Journal of nutrition. – 2000 (Sep.). № 130 (9). P. 2195-2199.
48. Hidvegi M., Lasztity R. Phytic acid content of cereals and legumes and
interaction with proteins //Periodica Polytechnica. Ser.Chem.Eng. – 2002. Vol. 46.
№ 1–2. P. 59–64.
49. Graf E., Dintzis F. High-performance liquid chromatographic method for the
determination of phytate // Analitical Biochemystry. – 1982. № 119. P. 413-417.
88
50. Layrisse M., García-Casal M., Solano L., Barón M., Arguello F. New property of
vitamin A and beta-carotene on human iron absorption: effect on phytate and
polyphenols as inhibitors of iron absorption. Archivos latinoamericanos de nutrición.
[Arch Latinoam Nutr] 2000 Sep; 50(3):243-8.
51. A modified method for the indirect quantitative analysis of phytate in foodstuff /
Fruhbeck G., Alonso R. // Analytical biochemistry. – 1995. № 225. P. 206-212.
52. Vaintraub I., Lapteva N. Colorimetric determination of phytate in unpurified extracts
of seeds and the products of their processing // Analytical biochemistry. – 1988. Vol.
175. Issue 1. P. 227-230.
53. Changes in phytase activity and phytate during the germination of six canola
cultivars / Lu S., Kim H. et al. // J. Food Sci. – 1987. Vol. 52. P. 173-175.
54. Germination alters the chemical composition and protein quality of lupin seeds /
Dagnia S., Petterson D. et al. // Journal of the Science of Food and Agriculture. –
1992. Vol. 60. Issue 4. P. 419-423.
55. Reddy N., Sathe S., Salunke D. 1982 Phytates in legumes and cereals. Advances in
Food Research. – 1982. Vol. 28 P. 1-93.
56. Trugo L., Farah A., Cabral L. Oligosaccharide distribution in Brazilian soya bean
cultivars // Food Chemistry. – 1995. Volume 52. Number 4. Pp. 385-387.
57. Наумов Д.Г. Молекулярный и генетический анализ некоторых семейств
гликозил-гидролаз микроорганизмов: Автореф. дис. … канд. биол. наук. –
Москва, 2001. – 23 с.
58. Получение белка из пшеничных отрубей с применением ферментных
препаратов / Колпакова В.В., Борисова О.Ю. и др. // Хранение и переработка
сельхозсырья. – 2001. № 6. С. 12-17.
59. Румянцева Г.Н., Осадько М.И. Роль микробных ферментов при получении
соевого белка // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2007. № 2. С. 53-54.
60. Ферментативный гидролиз как инструмент для повышения пищевой ценности
продуктов растениеводства / Траубенберг С.Е., Милорадова Е.В. // Хранение и
переработка сельхозсырья. – 2007. № 5. С. 62-65.
61. Шапиро Д.К. Практикум по биологической химии. 2-е изд., перераб. и доп. –
Минск: Изд-во «Вышэйшая школа», 1976 . – 288 с.
62. Scherz H., Bonn G. Analytical chemistry of carbohydrates. – Stuttgart: Thieme
Medical Publishers, 1998. – 354 p.
89
63. Ocheme O., Chinma C. Effects of soaking and germination on some
physicochemical properties of millet flour for porridge production // Journal of Food
Technology. – 2008. Vol. 6. № 5. P. 185-188.
64. East J., Nakayama T., Parkman S. Changes in stachyose, raffinose, sucrose and
monosaccharides during germination of soybean // Crop Sci. – 1970. Vol. 12. P. 7-9.
65. Kuo T., Doehlert D., Crawford C. Sugar metabolism in germinating soybean seeds //
Plant Physiology. – 1990. Vol. 93. P. 1514-1520.
66. Kim W., Smit C., Nakayama T. Removal of oligosaccharides from soybeans // LWT
- Food Science and Technology (Lebensmittel-Wissenschaft und -Technologie).–
1973.Vol.6.P.201-204.
67. Murphy E. The possible elimination of legume flatulence by genetic selection //
Proceedings of the symposium on nutritional improvement of food legumes by
breeding. Italy. July 3-5, 1972. New York: PAG, 1973. – Pp. 273-276.
68. Mansour E., Khalil A. Reduction of raffinose oligosaccharides in chickpea (Cicer
arietinum) flour by crude extracellular fungal α-galactosidase // J. Sci. Food Agric. –
1998. Vol. 78. P. 175-181.
69. Prodanov M., Sierra I. Effect of germination on the thiamine, riboflavin and niacin
contents in legumes // Z Lebensm Unters Forsch A. – 1997. № 205. Pp. 48-52.
70. Денисович Е.Ю., Полякова О.С., Юрова Е.А. Применение международного
опыта исследования при определении содержания массовой доли углеводов в
молочных и молокосодержащих продуктах // Научное обеспечение молочной
промышленности (ВНИМИ - 75 лет): сб. науч. тр. Рос. акад. с.-х. наук, Гос.
учреждение Всерос. науч.-исслед. ин-т молоч. пром-сти. М.: ГНУ ВНИМИ
пром-сти, 2004. – С. 80-84.
71. Химический состав пищевых продуктов. Кн. 2: Справочные таблицы
содержания
аминокислот,
жирных
кислот,
витаминов,
макро-
и
микроэлементов, органических кислот и углеводов/Под ред. Скурихина И.М. и
Волгарева М.Н. М.: Агропромиздат, 1987. – 360 с.
72. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков, В.В.
Арасимович, Н.П. Ярош и др. – Л.: Агропромиздат, 1987. – 430 с.
73. Zilic Z. Simple rapid method for the separation and quantitative analysis of
carbohydrates in biological fluids // J. Chromatogr. – 1979. № 164. P. 91-94.
74. Macrae R. Applications of high pressure liquid chromatography to food analysis // J.
Food Technol. – 1980. № 15. P. 93.
90
75. Separation of carbohydrates in dairy products by high performance liquid
chromatography / Richmond M., Barfuss D. // Journal of Dairy Science. – 1982. Vol.
65. № 8. P. 1394-1400.
76. Скурихин И.М., Нечаев А.П. Все о пище с точки зрения химии: справ. издание.
– М.: Высш. шк., 1991. – 288 с.
77. Методические указания к выполнению лабораторного практикума по курсу
«Пищевая химия» для студентов пищевых специальностей / Сост. Т.Ф.
Чиркина, Э.Б. Битуева – Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2000. – 40 с.
78. ГОСТ 24230-80. Корма растительные. Метод определения переваримости in
vitro. – М.: Изд-во стандартов, 1980. – 3 с.
79. Пищевая химия / Нечаев А. П., Траубенберг С. Е., Кочеткова А. А. и др. –
СПб.: ГИОРД, 2004. – 640 с.
80. Dev D., Mukherjee K. Functional properties of rapeseed protein products with
varying phytic acid contents // J.Agric.Food Chem. – 1986. Vol. 34. P. 780-785.
81. El Nockrashy A., Mukherjee K., Mangold H. Rapeseed protein isolates by
countercurrent extraction and isoelectric precipitation // J.Agric.Food Chem. – 1977.
Vol. 25 (1). Pp.193-197.
82. Конкурентоспособные технологии мясных продуктов с использованием соевой
муки нового поколения / А.Б. Лисицын, Б.Е. Гутник // Все о мясе. – 2002. № 2.
С. 3-8.
83. Anderson R., Wolf W. Compositional changes in trypsin inhibitors, phytic acid,
saponins and isoflavones related to soybean processing // J. Nutr. – 1995. Vol. 125.
P. 581-588.
84. Braudo E., Schwenke K. Some functional properties of technical protein isolates
from sunflower seed and soybean // Food / Nahrung. – 1982. Vol. 26. Issue 10.
P. 31-34
85. Kilara K., Sharkasi T. Effects of temperature on food proteins and its implications on
functional properties // Crit. Rev. Food Sci. & Nutr. – 1986. Vol. 23. P. 323-395.
86. Protein-containing multicomponent gels / E. Braudo, A. Gotlieb et al. // Food /
Nahrung. – 1986. Vol. 30. Issue 3. P. 355-364.
87. Tolstoguzov V. Functional properties of food proteins. Role of interactions in protein
systems / Food proteins structure and functionality / ed by K. Schwenke, R. Mothes.
– Weinheim: VCH, 1993. P. 203-215.
88. Методы определения функциональных свойств соевых белковых препаратов /
Н.В. Гурова, И.А. Попелло и др. // Мясная индустрия. – 2001. № 9. С. 30-32.
91
89. Dudek St., Horstmann Ch., Schwenke K. Limited tryptic hydrolysis of legumin from
faba bean (Vicia faba L.): formation of an «unequal» subunit pattern // Nahrung. –
1996. Vol. 40. P. 171-176.
90. Legumin-T from faba bean legumin: isolation, partial characterization and surface
functional properties / K. Schwenke, A. Staatz et al. // Nahrung. – 1995. Vol. 39. P.
193-202.
91. Chemical and Functional Properties of Food Proteins / ed. by Zdzislaw E. Sikorski.
Boca Raton: CRC, 2001. 415 p.
92. Effect of germination on the nutritional and functional properties of African oil bean
(Pentaclethra macrophylla Benth) seed flour / Enujiugha V., Adebanjo A. et al. //
Food agriculture and environmental. – 2003. Vol. 1. № 3-4. P. 72-75.
93. Damodaran S. Interrelationship of molecular and functional properties of food
proteins // Food Proteins / J. Kinsella, W. Soucie. Am. Oil Chemists' Soc., 1989. P.
21-51.
94. Гегэн Ж. Функциональные свойства белковых растительных продуктов.
Влияние тепловой обработки // Растительный белок: Пер. с фр. / Под ред. Т.П.
Микулович. – М.: Агропромиздат, 1991. – С. 509-526.
95. Boulter D. Quality problems, in «Protein plants» with special attention paid on the
protein of legumes // Protein quality from leguminous crops. Luxembourg:
Commission of European Communities, 1977. P. 11-47.
96. Заяс Ю. Ф. Качество мяса и мясопродуктов. – М.: Легкая промышленность,
1981. – 480 с.
97. Марион Д., Дуйяр Р. Взаимодействие белков и липидов в растительных
продуктах // Растительный белок: Пер. с фр. / Под ред. Т.П. Микулович. – М.:
Агропромиздат, 1991. – С. 284-331.
98. Schwenke K., Dahme A., Wolter Th. Heat-induced gelation of rapeseed proteins:
effect of protein interaction and acetylation // J. Am. Oil Chem. Soc. – 1998. Vol.
75. P. 83-87.
99. Wolf W. Lipoxygenase and flavor of soybean protein products // J. Agric Food
Chem. – 1975. Vol. 23. № 2. P. 136-141.
100.
Тест-система оценки мутагенной активности загрязнителей среды на
Salmonella (Методическое указание) / Л.М. Фонштейн, Л.М. Калинина, Г.Н.
Полухина и др. – М.: Наука, 1977. – 36 с.
92
101.
Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяных загрязнениях /
А.В. Кураков, В.В. Ильинский, С.В. Котелевцев и др. – М.: Изд-во
«Графикон», 2006. – 336 с.
102.
Биологический
контроль
окружающей
среды:
биоиндикация
и
биотестирование / Под ред. О.П.Мелеховой, Е.И. Егоровой. – М.: Издательский
центр «Академия», 2007. – 288 с.
103.
Методы общей бактериологии: В 3 т. Пер. с англ. / Под ред. Ф.
Герхардта и др. – М.: Мир, 1984. Т.2 – 472 с.
104.
Химия пищи. Книга 1: Белки: структура, функции, роль в питании/ И. А.
Рогов, Л. В. Антипова, Н. И. Дунченко и др. В 2 кн. Кн. 1. – М.: Колос, 2000. –
384 с.
105.
Купцов Н.С., Миронова Т.П., «Узколистный люпин – новая кормовая
культура», Симферополь, 1996 г.
106.
Жуков А.И., Жуков В.А., «Выращивание узколистных биотипов люпина
в условиях Центрального Черноземья», «Биология и экология культурных
растений», Тамбов, 1994 г., с.69-81.
107.
Коновалов
Ю.
Б.,
«Частная
селекция
полевых
культур»,
М.,
«Агропромиздат», 1990 г. – 538 с.
108.
Такунов И. П., «Люпин в земледелии России», Брянск, «Придесенье»,
1996 г. – 372 с.
109.
Молин Р., Панек Я., Миахара М. Белковые гидролизаты в пищевых
продуктах // Пищевые ингредиенты: сырье и добавки. – 2005. № 2. С. 74-76.
110.
Толстогузов В.Б. Новые формы белковой пищи (Технологические
проблемы и перспективы производства). – М.: Агропромиздат,1987. – 303 с.
111.
Кудряшева А.А. Новые направления научно-технического развития в
области питания, здоровья и экологии // Пищевая промышленность. – 2005. №
9. С. 110-113.
112.
Капрельянц Л.В. Ферменты в пищевых технологиях: вчера, сегодня,
завтра // Пищевые ингредиенты: сырье и добавки. – 2006. № 2. С. 48-51.
113.
Соколова Т.В. Применение ферментных препаратов в народном
хозяйстве // Пищевая промышленность. – 2001. № 11. С. 37-38.
114.
Грачева
И.М.
Технология
ферментных
препаратов.
–
М.:
Агропромиздат, 1987.— 335 с.
115.
Ксенз М.В. Применение протеиназ для повышения усвояемости
пищевых белков // Пищевая промышленность. – 2002. № 1. С. 52-55.
93
116.
Биршбах П., Фиш Н., Хендерсон У. Катализатор созидания: ферменты
для создания безопасной и здоровой пищи // Пищевые ингредиенты: сырье и
добавки. – 2005. № 1. С.24.
117.
Зорин С.Н., Баяржаргал М., Бурдза Е.А. Получение и характеристика
ферментативного гидролизата изолята соевых белков // Вопросы питания. –
2006. № 1. С.10-12.
118.
Осадько М.И., Румянцева Г.Н. Режимы ферментативной обработки
сырья при получении соевого белка // Хранение и переработка сельхозсярья. –
2007. № 3. С 46-48.
119.
Лодыгин А.Г., Рябцева А.Б. Анализ направлений развития пищевой
биотехнологии
//
Сборник
научных
трудов
СевКавГТУ.
Серия
«Продовольствие». 2005. №1.
120.
Якубке Х.-Д., Ешкайт Х. Аминокислоты, пептиды, белки. – М.: Мир,
1985. 82 с.
94
Приложение А. Программа дисциплины «Биотехнология».
1. Организационно-методический раздел
Цель дисциплины – усвоение теоретических знаний, приобретение умений и
навыков для обеспечения соответствия продовольственных товаров на этапах
производства и обращения требованиям безопасности, установленным в Федеральных
законах, национальных и международных нормативно-правовых документах.
Учебные задачи дисциплины
В задачи дисциплины входят:
- изучение основных нормативных документов в области системы пищевой
биотехнологии продукции;
- анализ современного состояния и перспективы развития биотехнологической науки;
- ознакомление с промышленной микробиологией и характеристикой основных
функциональных продуцентов пищи и выявление их влияния на жизнедеятельность
организма человека;
- изучение критериев, характеризующих продукты биотехнологического синтеза и
анализ степени риска, вызванного употреблением пищевых продуктов;
- освоение классификации направлений пищевой биотехнологии и ассортимента
продуктов питания;
- ознакомление с возможными продуктами микробной ферментации их пищевые
сырье, с механизмами биосинтеза, канцерогенного, мутагенного и другими
неблагоприятными воздействиями отдельных токсикантов на организм человека;
- овладение навыками проведения контроля за безопасностью пищевых продуктов и
правилами оформления результатов испытаний;
- освоение основных принципов и механизмов функционирования Системы
менеджмента безопасности пищевой продукции.
Методы преподавания дисциплины и исследования
 лекции;
 лабораторно-практические занятия на которых формируются навыки осуществления
контроля за безопасностью пищевых продуктов и правилами оформления результатов
испытаний;
 самостоятельная работа студентов, в которую входит освоение теоретического
материала, подготовка к практическим занятиям;
 написание эссе и рефератов по темам для самостоятельного изучения;
 обсуждение подготовленных студентами рефератов и докладов;
 проведение деловых игр;
 консультации преподавателей;
 контроль за самостоятельной работой студентов (тестирование и коллоквиумы).
Методы обучения и проведение занятий с использованием интерактивных и др.
инновационных образовательных технологий
 итерактивные лекции;
 обсуждение и подготовка студентами эссе;
 тренинги;
обсуждение результатов работы студенческих исследовательских групп.
2. Место дисциплины в структуре ООП ВПО
95
Дисциплина входит в базовую часть профессионального цикла дисциплин ООП
ВПО. Она имеет предшествующие логические и содержательно-методические связи с
дисциплиной гуманитарного и социального и экономического цикла – правовым
регулированием коммерческой деятельности, дисциплинами математического и
естественно-научного цикла – химией, физикой, основами микробиологии, физикохимическими методами исследования, а также дисциплинами профессионального цикла –
теоретические основы товароведения и экспертизы, стандартизация, подтверждение
соответствия и метрология, товароведение однородных групп продовольственных
товаров, сопутствующие связи с дисциплинами вариативной части профессионального
цикла, которые создают необходимую теоретическую базу и формируют достаточные
практические навыки для понимания и осмысления информации, излагаемой в новом
курсе. Для освоения дисциплины необходимо знание правовых документов,
регулирующих коммерческую деятельность, освоение научно-методических основ
стандартизации, метрологии и подтверждения соответствия, научных основ физических,
химических, физико-химических и биологических методов для инструментальной оценки
показателей безопасности продовольственных товаров. Студент должен обладать
умениями и навыками, связанными с проведением оценки и осуществлением контроля за
безопасностью продовольственных товаров.
3. Требования к результатам освоения содержания дисциплины
В результате освоения дисциплины студент должен:
1) Знать: основные понятия, термины и их определения в области, биотехнологии
пищевой биотехнологии; промышленной микробиологии в пищевых производствах и
продуцентов; основные положения современной теории генетического строения клеток
метаболизм и процессы биосинтеза пищи, их влияние на активность физиологических
процессов и ферментативные процессы, связанные с биосинтезом фотосинтезом пищи;
основные требования и критерии оценки безопасности пищевых продуктов; нормативную
документацию, регламентирующую безопасность продовольственного сырья и продуктов
питания (ПК-3.1, ПК-14.1);
2) Уметь: работать с нормативной и технической документацией в области
биотехнологии: регламентами, стандартами, классификаторами, сертификатами соответствия
и др.; использовать справочные материалы (ПК-3.1, ПК-5.1, ПК-14.1);
3) Владеть: навыками организации проведения экспертизы биотехнологических
пищевых продуктов; принципами и методами идентификации и оценки и анализа основных
показателей качества (ПК-3.1, ПК-5.1, ПК-14.1).
Формы контроля
1. Текущий контроль (осуществляется лектором и преподавателем, ведущим семинарские
(лабораторно-практические) занятия):
 микроконтрольные работы;
 письменные домашние задания;
 написание эссе, в том числе по первоисточникам на иностранных языках;
 подготовка докладов, рефератов, выступлений;
 промежуточное тестирование по отдельным разделам дисциплины.
2. Промежуточный и итоговый контроль знаний по дисциплине:
 экзамен в устной форме.
Формирование оценки по текущему и итоговому контролю уровня знаний по
дисциплине осуществляется с использованием балльно-рейтинговой оценки работы
студента, приведенной в таблице 1, и системы перевода оценок (таблица 2).
96
Таблица А1 – Балльно-рейтинговая оценка знаний студентов по дисциплине «Биотехнология»
Цифровое
выражение
5
Словесное
выражение
Отлично
(зачтено)
4
Хорошо
(зачтено)
3
Удовлетворительно
(зачтено)
2
Неудовлетворительно
(незачтено)
Описание
Выполнен полный объем работы, ответ студента
полный и правильный. Студент способен обобщить
материал, сделать собственные выводы, выразить
свое мнение, привести иллюстрирующие примеры
Выполнено 75% работы, ответ студента правильный,
но неполный. Не приведены иллюстрирующие
примеры, обобщающее мнение студента
недостаточно четко выражено
Выполнено 50% работы, ответ правилен в основных
моментах, нет иллюстрирующих примеров, нет
собственного мнения студента, есть ошибки в
деталях и/или они просто отсутствуют
Выполнено менее 50% работы, в ответе
существенные ошибки в основных аспектах темы.
Таблица А2 – Перевод российских оценок в европейскую систему оценок (ECTS)
Российская система
100% шкала
Европейская система оценок (ECTS)
оценок
оценок
5 - отлично
90-100
A – отлично
81-89
B – очень хорошо
4 – хорошо
65-80
C – хорошо
3 – удовлетворительно
56-64
D – удовлетворительно
50-55
E – посредственно
2 - неудовлетворительно
<50
FX- неудовлетворительно (с правом
пересдачи)
<50
F – неудовлетворительно (без права
пересдачи, необходимо повторить курс)
97
4. Содержание программы учебной дисциплины «Биотехнология»
№п/п
Наименование
Содержание
раздела
дисциплины
(темы)
Тема 1.
Предмет и
задачи курса,
ключевые
понятия
Предмет, цели и задачи учебной дисциплины.
Межпредметные связи с дисциплинами товароведного
цикла, а также микробиологией, химией, физикой.
Цель изучения дисциплины, ее место в
образовательной программе студентов специальности
«Товароведение и экспертиза товаров».
Современное состояние и перспективы развития
биотехнологии. Важнейшие проблемы биосинтеза
продуктов Основные направления в биотехнологии.
Формируемые
компетенции
Результаты освоения
(знать, уметь, владеть)
ПК-3.1,
ПК-14.1
Знать: цели, задачи и принципы
науки нутрициологии и концепцию
обеспечения
безопасности
продовольственных товаров.
Основные термины и определения в
области биотехнологии пищевых
продуктов.
Требования
к
биотехнологии пищевых продуктов.
Основные термины и определения в области
биотехнологии. Основные термины и определения в
области промышленной микробиологии пищевых
продуктов.
Биосинтез в пищевых продуктах . Требования
предъявляемые к микроорганизмам продуцентам.
Тема 2.
Теоретические основы
биотехнологии
Основные стадии и кинетика роста микроорганизмов.
Продукты микробной ферментации
метаболизма.
Сырье
и
состав
питательных
сред
для
биотехнологического
производства.
Способы
культивирования микроорганизмов. Культивирование
растительных и животных клеток
ПК-3.1,
ПК-5.1,
ПК-14.1,
Образовательные
технологии
Лекции,
тренинги,
консультации
преподавателей;
самостоятельная
уметь: работать с литературными работа
источниками, используемыми для студентов
описания
биотехнологических
процессов
синтеза
пищевых
продуктов.
владеть: методологией химических
формул,
описывающих
процесс
биосинтеза продуктов
Знать: Основные стадии роста и
кинетику развития микроорганизмов.
Основные продукты, получаемые
путем
микробной
ферментации.
Сырье используемое для создания
питательных сред. Поверхностные и
глубинные способы культивирования
микроорганизмов
Отличительные
особенности
культивирования
растительных и животных клеток.
Лекции,
Тренинги,
ситуациионные
задачи,
консультации
преподавателей;
самостоя-
№п/п
Тема 3.
Наименование
раздела
дисциплины
(темы)
Общая
биотехнологическая
схема
производства
продуктов
микробного
синтеза.
Формируемые
компетенции
Содержание
Принципы
составления
питательных
сред.
Соблюдение правил асептики. Получение посевного
материала (инокулята). Технология получения чистых
культур
микроорганизмов.
Ферментация
и
культивирование. Выделение целевого продукта путем
фильтрации, флотирования. сепарирования и другими
способами. Очистка целевого продукта.
99
ПК-3.1,
ПК-14.1
Результаты освоения
(знать, уметь, владеть)
уметь:
работать
атласами
микроогранизмов, отличать основные
схемы аэробного и анаэробного
культивирования микроогранизмов.
Уметь составлять питательные среды
для микроорганизмов
владеть:
методологией
биотехнологических
процессов,
происходящих
в
результате
микробной ферментации, методиками
анализа ферментативной активности,
способами
культивирования
микроорганизмов.
Знать: основные схемы получения
продуктов
микробного
синтеза.
Определять
физиологические
потребности
микроорганизмов
в
питательных веществах. Основные
стадии выделения целевого продукта.
уметь: работать с методами
обеззараживания питательных сред,
конструкциями
ферментеров,
определять
последовательность
получения посевного материала.
владеть: навыками применения
отделения биомассы от целевого
Образовательные
технологии
тельная
работа
студентов
Лекции,
Тренинги,
ситуациионные
задачи;
консультации
преподавателей;
самостоятельная
работа
студентов
№п/п
Наименование
раздела
дисциплины
(темы)
Формируемые
компетенции
Содержание
Результаты освоения
(знать, уметь, владеть)
Образовательные
технологии
продукта. Стадиями очистки целевого
продукта.
Тема 4. Биотехнологическое
производство веществ
и соединений, используемых в
пищевой
промышленности.
Получение
пищевых
кислот
с
помощью
микроорганизмов в т.ч. 4 органические кислоты
лимонную, молочную, уксусную и винную. Получение
лимонной кислоты. Получение молочной кислоты.
Получение уксусной кислоты.
Получение и
использование аминокислот. Получение липидов с
помощью микроорганизмов. Получение витаминов и
их применение.
ПК-5.1,
ПК-14.1
Знать: какие основные этапы
включает схема получения лимонной
кислоты. Какие микроорганизмы
применяются для получения молочной
кислоты Состав питательных сред для
производства
уксусной
кислоты.
Какие аминокислоты получают путем
микробного синтеза и каковы их
основные продуценты.
уметь:
распознавать
механизм
синтеза
лимонной
кислоты.
Использовать
иммобилизованные
клетки при производстве уксусной
кислоты.
владеть: навыками культивирования
микроорганизмов при производстве
молочной кислоты, аминокислот и
липидов микробного происхождения.
100
Лекции,
тренинги,
ситуациионные
задачи,
мастеркласс,
консультации
преподавателей;
самостоятельная
работа
студентов
№п/п
Наименование
раздела
дисциплины
(темы)
Содержание
Формируемые
компетенции
Результаты освоения
(знать, уметь, владеть)
Знать: В чем отличие ферментов от
ферментных препаратов. По какому
принципу
составляется
название
ферментного препарата микробного
происхождения. В каких отраслях
пищевой
промышленности
используются ферментные препараты.
Образовательные
технологии
Тема 5. Получение
ферментных
препаратов и
их применение при
производстве
продуктов
питания
Понятие ферменты и ферментные препараты.
Характеристика активности ферментных препаратов.
Получение ферментных препаратов из сырья
растительного
происхождения.
Получение
ферментных препаратов из сырья животного
происхождения.
Номенклатура
микробных
ферментных препаратов. Номенклатура ферментных
препаратов микробного происхождения. Применение
ферментных препаратов в пищевой промышленности
ПК-3.1,
ПК-5.1,
ПК-14.1
Лекции,
тренинги,
консультации
преподавателей;
самостояуметь:
определять
основные тельная
источники
получения
ферментов работа
растительного и животного происхо- студентов
ждения.
владеть: способами культивирования
микроорганизмов
при
производстве ферментных препаратов
Тема 6. Получение
биомассы
микроорганизмов
Получение биомассы микроорганизмов в качестве
источника белка. Промышленное производство
микробного белка. Выделение белковых изолятов.
Производство хлебопекарных
дрожжей и их
экспертиза. Особенности производства хлебопекарных
дрожжей
ПК-5.1,
ПК-14.1,
Знать:
преимущества
белка
микробного происхождения перед
другими источниками. Какие способы
культивирования, используются при
производстве
хлебопекарных
дрожжей.
уметь: определять достоинства и
недостатки
получения
белка
с
помощью
дрожжей,
микроскопического
грибка,
бактерий
и
водорослей;
владеть:
методами
определения
101
Лекции,
тренинги,
ситуациионные
задачи,
мастеркласс,
консультации
преподавателей;
самостоя-
№п/п
Наименование
раздела
дисциплины
(темы)
Тема 7. Современное
состояние
пищевой
биотехнологии
Формируемые
компетенции
Содержание
Использование продукции биотехнологии в пищевой
промышленности. Применение пищевых добавок и
ингредиентов,
полученных
биотехнологическим
путем. Микроорганизмы, используемые в пищевой
промышленности. Генетически модифицированные
источники пищи. Пищевая биотехнология продуктов
из сырья животного происхождения. Получение
молочных продуктов. Биотехнологические процессы
при производстве мясных и рыбных продуктов.
Пищевая биотехнология продуктов из сырья
растительного
происхождения.
Бродильные
производства, хлебопечение, соковое производство,
продукты гидролиза крахмала.
ПК-5.1,
ПК-14.1,
Результаты освоения
(знать, уметь, владеть)
Образовательные
технологии
основных
стадий
процесса
производства микробных белковых
препаратов
Знать: какая биотехнологическая
продукция используется в пищевой
промышленности. Как классифицируют кисломолочные продукты в
зависимости от состава микрофлоры
заквасок.
уметь:
использовать
методы
применения пищевых добавок
и
ингредиентов,
полученных
биотехнологическим путем.
тельная
работа
студентов
Лекции,
тренинги,
ситуациионные
задачи,
мастеркласс,
консультации
преподавателей;
самостоятельная
работа
студентов
владеть: практическим навыками
получения заквасок для получения
кисломолочных продуктов и какие
виды микроорганизмов используют
при
производстве
алкогольных
напитков.
Экзамен
102
Литература:
по теме 1:
Базовый учебник: с.6-13, 32
Основная литература:
[1] - c. 15-17;
[2] – с. 29-33;
Дополнительная литература:
[1] с.7 – 9
Интернет-ресурсы - по рекомендованному списку.
по теме 2
Базовый учебник: с.14-40, с111-177;
Основная литература:
[1] - c. 11-100;
[3] – с. 22-156, с.214-226, с.227-244;
Дополнительная литература:
[1] с.93-290;
[2] , [3], [5], [6], [8], [13], [14], [15], [16],–полный текст
[19] – все журналы
Интернет-ресурсы - по рекомендованному списку.
по теме 3
Базовый учебник: с.41-65;
Дополнительная литература:
[3], [4], [5], [6],[7],[8], [9],[14], [15], [16], [17],[18].
Интернет-ресурсы - по рекомендованному списку.
по теме 4
Базовый учебник: с.182 – 284;
Основная литература:
[1] c. 149 – 202;
[2] с.33-44;
[3] с.299-327;
Дополнительная литература
[2],[5,][14],[15],[17],[18] – полный текст;
[19] - все журналы
по теме 5
Базовый учебник с. 75 – 107;
Основная литература:
[1] с. 126 – 141;
[2] с. 45-51
[3] с. 245-284;
Дополнительная литература:
[4],[5],[14],[17],[18] - полный текст;
[19] – все журналы;
Интернет-ресурсы - по рекомендованному списку.
по теме 6
Базовый учебник: с.327 – 351;
Основная литература:
[1] с. 141-148;
103
[3] с. 284 – 298;
Дополнительная литература:
[19] – все журналы;
Интернет-ресурсы - по рекомендованному списку.
по теме 7
Базовый учебник с. 287 - 324
Основная литература:
[1] с. 273-284;
[2] с. 51-54;
Дополнительная литература:
[2] с. 228-256;
[7], [8], [9], [10], [11], [12], [14] - полный текст
[19] – все журналы;
Интернет-ресурсы - по рекомендованному списку.
Вопросы для самопроверки:
по теме 1:
1. Что такое биотехнология.
2. Какие пищевые продукты .
3. В чем заключается важность биотехнологии для специалистов в области товароведения и
экспертизы товаров.
по теме 2:
1. Назовите основные стадии роста микроорганизмов.
2. Какие продукты микробной ферментации и метаболизма вы знаете.
3. Назовите компоненты, которые обязательно должны присутствовать в питательной среде.
4. Что такое ферментация.
по теме 3:
1. Перечислите основные стадии биотехнологической схемы получения продуктов микробного
синтеза.
2. Опишите последовательность получения посевного материала для промышленного
производства целевого продукта.
3. Что такое дезинтеграция и в каких случаях ее осуществляют
по теме 4:
1.Какие основные этапы включает схема получения лимонной кислоты?
2.Какие микроорганизмы применяют для получения молочной и уксусной кислот.
3.В чем преимущества получения аминокислот с помощью микроорганизмов.
4.Расскажите о способах получения липидов микробного происхождения.
5. Какие витамины получают с помощью микроорганизмов.
по теме 5:
1. В чем отличие ферментов от ферментных препаратов.
104
2. Что такое активность ферментного препарата.
3. Какие способы культивирования микроорганизмов используют при производстве ферментных
препаратов
4. Область применения амилолитических ферментов
5. По какому принципу составляется название ферментного препарата микробного
происхождения
по теме 6:
1. Какие преимущества микробного белка перед другими источниками.
2. Основные стадии процессов производства микробных белковых препаратов.
3. Какие способы культивирования используются при производстве хлебопекарных дрожжей.
4. Способы отделения хлебопекарных дрожжей от культуральной жидкости.
5 Что такое биологическая чистота дрожжей?
по теме 7:
1.
Какая биотехнологическая продукция используется в пищевой промышленности.
2.
Что такое трансгенные продукты?
3.
Какие трансгенные продукты считают безвредными для здоровья потребителей.
4.
Что такое закваски и как их готовят для получения кисломолочных продуктов.
5.
Ассортимент бифидопродуктов
6.
Перечислите требования, которые применяют для производства мясных продуктов.
7.
Какие виды микроорганизмов используют в производстве алкогольных напитков
8.
Биотехнологические процессы в хлебопечении.
9.
На каких стадиях производства фруктовых соков применяют ферментные препараты.
Вопросы и задания для самостоятельной работы:
по теме 2:
1. Какие составляющие необходимы для выращивания любой клеточной культуры
2. Какие продуты микробной ферментации и метаболизма вы знаете.
3. Перечислите отходы пищевой промышленности, широко используемые для
биотехнологического производства
4. В чем преимущества непрерывного способа культивирования.
по теме 3:
1. Основное назначение ферментера и его устройство.
2. Что такое сорбция
по теме 4:
1. Опишите механизм синтеза лимонной кислоты.
2. Условия культивирования микроорганизмов при производстве молочной кислоты
3. Применение органических кислот в пищевой промышленности.
4. Применение витаминов в пищевой промышленности.
по теме 5:
1.
2.
3.
4.
Каковы преимущества микробного белка перед другими источниками.
Использование молочной сыворотки в качестве питательной среды
Состав питательной среды при промышленном производстве хлебопекарных дрожжей.
Способы отделения хлебопекарных дрожжей.
105
по теме 6:
1. Перечислите основные источники получения ферментов растительного происхождения
2. Перечислите, какие микроорганизмы применяют для промышленного использования
ферментных препаратов.
3. Какие способы культивирования микроорганизмов применяют для промышленного
производства ферментных препаратов.
4. Что такое иммобилизованные ферменты, в чем их преимущества.
по теме 7:
1. Какая биотехнологическая продукция используется в пищевой промышленности
2. В чем преимущества и недостатки использования трансгенных сельскохозяйственных
животных и птицы
3. Состав заквасок для получения таких продуктов как йогурт, сметана, пахта, кефир.
4. Какие требования микроорганизмам, используемыми при получении спиртопродуктов.
5. Какие преимущества имеет ферментативное переработка крахмала.
Эссе, рефераты или доклады по теме:
по теме 1:
1. Значение биотехнологии в формировании современного рынка продуктов..
2. Микроорганизмы используемые в биотехнологии пищевых продуктов.
по теме 2:
1. Теоретические и практические вопросы выращивания микроорганизмов.
2. Ферментация животных и растительных клеток микроорганизмов.
3. Ферментация с помощью иммобилизованных клеток.
4. Создание питательных сред для выращивания микроогранизмов.
по теме 3:
1. Процессы, протекающие при получении продуктов микробного синтеза.
2. Получение посевного материала для промышленного микробного синтеза.
3. Отделение и очистка целевого продукта.
по теме 4:
1. Способы и схемы получения лимонной кислоты.
2. Способы и схемы получения молочной кислоты.
3. Способы и схемы получения аминокислот.
4. Способы и схемы получения липидов.
5. Способы и схемы получения витаминов.
по теме 5:
1. Способы и схемы получения ферментных препаратов растительного происхождения.
2. Способы и схемы получения ферментных препаратов животного происхождения.
3. Применение ферментных препаратов в пищевой промышленности.
по теме 6:
1. Способы и схемы получения микробного белка.
2. Способы и схемы получения хлебопекарных дрожжей
3. Оценка качества и экспертиза хлебопекарных дрожжей.
по теме 7:
1.Основные направления пищевой биотехнологии.
106
2.Способы и схемы получения пищевых добавок и ингредиентов.
3.Методы генной инженерии при получении модифицированных растений.
4. Методы генной инженерии при получении трансгенных сельскохозяйственных животных и
птицы
5.Способы и схемы получения кисломолочных продуктов.
6. Способы и схемы получения коровьего масла.
7. Биотехнологические процессы при производстве виноградных вин.
8. Биотехнологические процессы при производстве пива.
9. Биотехнологические процессы при производстве соков.
5. Образовательные технологии
При реализации различных видов учебной работы по дисциплине «Идентификация и
обнаружение фальсификации продовольственных товаров» используются следующие
образовательные технологии:
1) лекции с использованием методов проблемного изложения материала;
2) тренинги, направленные на овладение методами идентификации и обнаружения
фальсификации продовольственных товаров с использованием современных инструментальных
средств;
3) ситуационные задачи по темам 6 и 7;
4) мастер-классы экспертов по товарной экспертизе биотехнологической продукции.
6. Учебно-методическое, информационное и материально-техническое обеспечение
дисциплины
6.1 Литература
Базовый учебник
1. Грачева И.М., Иванова Л.А. Биотехнология биологически активных веществ. – М.: Издво НПО «Элевар», 2006. – 453 с.
Основная литература по дисциплине:
1. Грачева И.М, Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. – 3-е изд.М.: Изд-во
«Элевар», 2000. – 512с.
Дополнительная литература
1. Биотехнология: В 8 кн/ Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова – М: Высшая школа.,
1987. – 1-8 кн.: Кн.1 – 159 с.; Кн. 2 – 206с.; Кн. 3 – 127 с.; Кн. 4 – 112 с.; Кн. 5 – 140с.; Кн.
6 – 142с.; Кн. 7 – 158с.; Кн. 8 – 142с.
2. Биотехнология. Принципы и применение: Пер. с англ./Под ред. И.Хиггинса, Д. Беста,
Дж. Джонса. – М.Мир, 1988. – 480с.
3. Голубев В.Н., Жиганов И.Н. Пищевая биотехнология. – М.: Делпринт, 2001. – 123 с.
107
6.3.
Перечень
рекомендуемых
обучающих,
справочно-информационных,
контролирующих и прочих компьютерных программ, используемых при изучении
дисциплины(табл. А3):
Таблица А3. Технические и компьютерные средства обучения.
№ п/п
1
Название рекомендуемых технических и
компьютерных средств обучения
Тестирующая программа для итогового
контроля качества усвоения дисциплины
Номера тем
1-6
6.4. Материально-техническое обеспечение дисциплины
Материально-техническое обеспечение дисциплины включает:
1) библиотечный фонд
2) компьютерный класс с выходом в Интернет;
3) мультимедийное оборудование для чтения лекций-презентаций;
4) натуральные образцы продовольственных товаров;
5) приборы, установленные в национальных стандартах на методы определения токсичных
соединений, ксенобиотиков химической и биологической природы;
6) микробиологическая лаборатория
6) наборы реактивов для реализации методик определения безопасности
продовольственных товаров;
7) стандарты на методы определения безопасности продовольственных товаров;
8) национальные и международные стандарты, регламентирующие безопасность пищевых
продуктов.
7. Оценочные средства.
7.1. Тематика курсовых работ:
Написание курсовых работ по дисциплине не предусмотрено учебным планом.
7.2. Вопросы к экзамену:
1. Предмет «Пищевая биотехнология», его значение для специалистов в области
товароведения и экспертизы продовольственных товаров.
2. Этапы развития биотехнологии.
3. Основные направления в биотехнологии.
4. Требования, предъявляемые в микроорганизмам-продуцентам. Способы создания
высокоэффективных штаммов-продуцентов.
5. Стадии и кинетика роста микроорганизмов.
6. Сырье и состав питательных сред для биотехнологического производства.
7. Способы культивирования микроорганизмов.
8. Культивирование животных и растительных клеток.
108
9. Общая биотехнологическая схема производства продуктов микробного синтеза.
10. Получение посевного материала. Микроорганизмы, используемые в биотехнологии.
11.
Сырье для питательных сред. Принципы составления питательных сред..
12.
Состав питательной среды для биотехнологического производства (источ- ники
углерода и других питательных веществ).
13.
Приготовление питательной среды, инокуляция и культивирование.
14.
Способы ферментации: аэробная и анаэробная, глубинная и поверхностная,
периодическая и непрерывная, с иммобилизованным продуцентом.
15.
Особенности стадии выделения и очистки в зависимости от целевого продукта.
Продукты микробного брожения и метаболизма.
16.
Направленный синтез лимонной кислоты.
17.
Получение молочной кислоты биотехнологическим способом.
18.
Получение уксусной кислоты биотехнологическим способом.
19.
Получение и использование аминокислот.
20.
Получение липидов с помощью микроорганизмов.
21.
Производство и применение витаминов.
22.
Получение ферментных препаратов из сырья растительного и
происхождения, их использование в пищевой промышленности.
23.
Получение ферментных препаратов с помощью микроорганизмов. Номенклатура
ферментных препаратов.
24.
Применение ферментных препаратов в пищевой промышленности.
25.
Получение биомассы микроорганизмов в качестве источника белка.
26.
Производство хлебопекарных дрожжей и их экспертиза.
27.
Современное состояние и перспективы развития пищевой биотехнологии.
28.
Применение пищевых добавок и ингредиентов, полученных биотехнологическим
путем.
29.
Микроорганизмы, используемые в пищевой промышленности.
30.
Генетически модифицированные источники пищи.
31.
Съедобные водоросли.
32.
Применение заквасок в производстве молочных продуктов. Пороки заквасок.
33.
Классификация кисломолочных продуктов в зависимости от используемой закваски.
Микроорганизмы, входящие в состав заквасок.
34.
Получение молочных продуктов (йогурт, сметана, коровье масло).
35.
Биотехнологические процессы в сыроделии.
36.
Диетические свойства кисломолочных продуктов. Классификация бифидопродуктов.
37.
Биотехнологические процессы в производстве мясных и рыбных продуктов.
38.
Биотехнологические процессы в пивоварении.
39.
Биотехнологические процессы в виноделии.
109
животного
40.
Получение спиртопродуктов.
41.
Биотехнологические процессы в хлебопечении.
42.
Применение ферментов при выработке фруктовых соков.
43.
Консервированные овощи и другие продукты.
44.
Продукты из сои. Микромицеты в питании человека.
45.
Продукты гидролиза крахмала.
7.3. Примеры тестов для контроля знаний.
1. Какие микроскопические грибы используют в настоящее время для получения лимонной
кислоты?
1) Aspergillius niger.(v)
2) Penicillium;
3) Мucor;
4) Ustina.
2. Для каких целей используются ферменты при производстве соков:
1) – для увеличения сладости.
2) – для повышения кислотности;
3) – для разрушения пектина; (v)
4) – для увеличения выхода сока;
3. Какие углеводы можно использовать для получения молочной кислоты:
1) – глюкозу;
2) – мальтозу;
3) – сахарозу;
4) – все перечисленные сахара (v).
4. Что такое ГМИ:
1) Генетически модифицированное сырье для производства пищевых продуктов. (v)
2) Генная микроинженерия.
3) Главный механический источник.
4) Государственная и международная информация.
5. Какая из аминокислот является приправой к пищевым блюдам:
1) Лизин.
2) Триптофан.
3) Аланин.
4) Глутаминовая кислота. (v)
6. Витамин В2 называется:
1) аскорбиновая кислота;
2) карагиноид;
3) рибофлавин; (v)
4) никотин амид.
7 . Какие ферментные препараты применяются в пивоварении для осахаривания заторов ?
1) протеолитические
110
2) цитолитические.
3) амилолитические.(v)
4) гидролитические.
8. Какие микроорганизмы используют для получения микробного белка:
1) дрожжи;
2) бактерии;
3) грибы;
4) водоросли;
5) все.(v)
111
Приложение Б. Программа НИР для студентов, обучающихся по направлению 100800
«Товароведение» на период с 2013 по 2015 год.
(проект)
Научно-исследовательская работа студентов
является неотъемлемой частью учебновоспитательного процесса и включает систему методов, средств и организационно-экономических
мероприятий, обеспечивающих в процессе подготовки кадров с высшим образованием освоение
различных этапов организации и выполнения фундаментальных, экспериментальных поисковых
научно-исследовательских работ и инновационных проектов, направленных на решение научных
задач для различных отраслей экономики. Научно-исследовательская работа является основой для
формирования исследовательского мировоззрения студентов. Отказ от узкой специализации в
ходе введения бакалавриата требует увеличения доли универсальных знаний и навыков в
образовательных программах. Полноправное участие студентов в научной работе университета
позволит не только сформировать особые компетенции у обучающихся, но и обеспечить
образовательное учреждение новыми научно-педагогическими кадрами.
Цели и задачи проведения научно-исследовательской работы студентов:
Повышение учебной мотивации
Повышение самооценки обучающихся
Овладение обучающихся научным методом познания
Формирование профессиональной мотивации
Ознакомление студентов с методологией и культурой научного труда
Формирование современной научной картины миры
Повышение степени ответственности студента за выполняемую работу
Предоставление студентам возможности самостоятельно решать актуальные научнотехнические проблемы в отдельных областях знаний
9. Приобретение навыков организационной работы
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.




1.
2.
3.
4.
5.
6.
Средства вовлечения студентов выполнение НИР:
Включение научной работы в учебный процесс в форме учебно-исследовательских работ
студентов
Введение проблемно-ориентированного подхода при преподавании всех учебных
дисциплин
Выделение именных научных стипендий
Привлечение студентов к выполнению хозрасчетных НИР
Индикаторные показатели НИРС и их плановые значения нарастающим итогом:
Количество студентов, постоянно вовлеченных в выполнение НИР во внеучебное время: не
менее 50
Количество студентов, вовлеченных в выполнение учебно-исследовательской работы: не
менее 75
Доля наукоемких курсовых работ: не менее 25 % за каждый год программы
Доля наукоемких выпускных квалификационных работ: не менее 50 % за каждый год
программы
Количество подготовленных докладов на конференциях по результатам НИР: не менее 15
Количество опубликованных научных статей: не менее 5
112
В результате проведения НИРС у студентов должны быть сформированы следующие
компетенции (табл. Б1):
Общекультурные компетенции (общенаучные, инструментальные, социальноличностные)
ОК-1
- владеет культурой мышления, способен к восприятию информации, обобщению,
анализу, постановке цели и выбору путей её достижения;
ОК-3
- умеет критически оценивать свои достоинства и недостатки, намечать пути и
выбирать средства развития достоинств и устранения недостатков;
ОК-6
- владеет основными методами, способами и средствами получения, хранения,
переработки информации, имеет навыки работы с компьютером как средством
управления информацией;
ОК-7
- способен работать с информацией в глобальных компьютерных сетях;
Профессиональные компетенции (общепрофессиональные, профессиональноспециализированные)
ПК-1
- осознает социальную значимость своей будущей профессии, стремится к
саморазвитию и повышению квалификации;
ПК-2
- способен находить организационно-управленческие решения в стандартных и
нестандартных ситуациях;
ПК-3
- умеет использовать нормативные и правовые документы в своей
профессиональной деятельности;
ПК-5
- использует знания основных законов естественнонаучных дисциплин для
обеспечения качества и безопасности потребительских товаров
ПК-6
- способен применять знания в области естественнонаучных и прикладных
инженерных дисциплин для организации торгово-технологических процессов;
ПК-8
- умеет анализировать рекламации и претензии к качеству товаров, готовить
заключения по результатам их рассмотрения;
ПК-9
- имеет системное представление об основных организационных и
управленческих функциях, связанных с закупкой, поставкой,
транспортированием, хранением, приемкой и реализацией товаров;
ПК-11
- разрабатывает и внедряет стандарты организации по материально-техническому
обеспечению, сбыту и контролю качества продукции;
ПК-12
- умеет работать с информационными базами данных, обеспечивающими
оперативный торговый, складской и производственный учет товаров;
ПК-14
- знает методы идентификации, оценки качества и безопасности товаров и
использует их для диагностики дефектов, выявления опасной, некачественной,
фальсифицированной и контрафактной продукции;
ПК-16
- умеет оценивать соответствие товарной информации требованиям нормативной
документации;
113
ПК-19
- готов осуществлять контроль за соблюдением требований к упаковке и
маркировке, правил и сроков хранения, транспортирования и реализации товаров,
правил их выкладки в местах продаж согласно стандартам мерчандайзинга,
принятым на предприятии;
Таблица Б1. Компетенции, формируемые у студентов при выполнении НИРС.
Тематический план научно-исследовательской работы студентов на 2013-2015 годы:
№
п\
п
Наименование
научной темы
1
Перспективные
источники пищевого
белка в РФ
2
Вид
исследования
теоретическое
Организационные
формы НИРС
Научные кружки,
курсовые работы.
Средства
выполнения
НИРС
Целев
ая
аудит
ория
студе
нтов
Анализ
литературных
источников
1-2
курс
Технологические
Теоретическое Научные кружки,
особенности
УИРС, подготовка
производства
реферативных
белковых препаратов
докладов на научных
из муки бобов люпина
конференциях
узколистного.
Анализ
литературных
источников
2-3
курс
3
Антиалиментарные
теоретическое
факторы белковых
препаратов люпина
узколистного и
методы их устранения
Курсовые работы,
подготовка
реферативных
докладов на научных
конференциях
Анализ
литературных
источников
3 курс
4
Управляемый
протеолиз белкового
сырья для получения
белковых препаратов
теоретическое
УИРС,подготовка
реферативных
докладов на научных
конференциях
Анализ
литературных
источников
4 курс
5
Формирование
функциональнотехнологических
свойств белковых
препаратов
теоретическое
Подготовка
реферативных
докладов на научных
конференциях
Анализ
литературных
источников
3-4
курс
114
6
Аналитический обзор теоретическое
биологически
активного
растительного сырья
для производства
функциональных
продуктов в РФ
Научные кружки,
курсовые работы
Анализ
литературных
источников
2-3
курс
7
Аналитический обзор теоретическое
биологически
активного животного
сырья для
производства
функциональных
продуктов в РФ
Научные кружки,
курсовые работы
Анализ
литературных
источников
2-3
курс
8
Сравнительное
практическое
исследование пищевой
ценности семян
люпина узколистного
и сои
Научные кружки,
выпускные
квалификационные
работы
Анализ
литературных
источников,
проведение
экспериментов
2-3
курс
9
Изучение
практическое
минерального состава
семян бобовых
культур
Научные кружки,
выпускные
квалификационные
работы
Анализ
литературных
источников,
проведение
экспериментов
3-4
курс
Научные кружки,
курсовые работы
Анализ
литературных
источников,
проведение
экспериментов
3 курс
11 Исследование
Практическое
содержания
алкалоидов в бобах
люпина различных
ботанических сортов с
последующей
апробацией различных
методов удаления
алкалоидов.
Хоздоговорные
работы, выпускные
квалификационные
работы
Анализ
литературных
источников,
проведение
экспериментов
3-4
курс
12 Исследование
кинетики протеолиза
белков семян люпина
узколистного
Научные кружки,
выпускные
квалификационные
работы
Анализ
литературных
источников,
проведение
экспериментов
3-4
курс
10 Анализ
аминокислотного
состава белковых
препаратов люпина и
сои
практическое
практическое
115
13 Исследование
практическое
содержания основных
витаминов в
продовольственных
товарах растительного
происхождения
Научные кружки,
выпускные
квалификационные
работы
Анализ
литературных
источников,
проведение
экспериментов
3-4
курс
14 Исследование
практическое
содержания основных
витаминов в
продовольственных
товарах животного
происхождения
Научные кружки,
выпускные
квалификационные
работы
Анализ
литературных
источников,
проведение
экспериментов
3-4
курс
15 Исследование состава практическое
микро- и
макроэлементов в
продовольственных
товарах растительного
происхождения
Научные кружки,
выпускные
квалификационные
работы
Анализ
литературных
источников,
проведение
экспериментов
3-4
курс
16 Исследование состава практическое
микро- и
макроэлементов в
продовольственных
товарах животного
происхождения
Научные кружки,
выпускные
квалификационные
работы
Анализ
литературных
источников,
проведение
экспериментов
3-4
курс
Ожидаемые результаты реализации программы:






Повышение учебной мотивации студентов
Формирование профессиональных компетенций
Повышение успеваемости студентов и уровня усвояемости знаний
Приобретение обучающимися практических навыков производства эксперимента и
обработки экспериментальных данных.
Приобретение обучающимися навыками работы с литературными источниками
Рост вовлеченности студентов в выполнение научно-исследовательской работы на
кафедре
116