крысы, подвергшиеся сочетанному воздействию R

РЕАКЦИЯ ГЕМОПОЭЗА НА ФИЗИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ
И БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ИНТЕРЛЕЙКИНА – 1
(экспериментальное исследование)
Климкович Н. Н., Козарезова Т. И.
Введение. В настоящее время известно, что одним из следствий воздействия радиационного фактора на организм является риск канцерогенеза. Излучение может вызвать рак в почти любой ткани или любом
органе, хотя некоторые участки тела более подвержены индукции, чем другие [7]. Уже при малых дозах
радиация может воздействовать как мутационный инициатор онкогенеза. Наиболее радиочувствительными
по сравнению с другими типами клеток являются костномозговые предшественники [1, 2]. Даже малые
дозы ионизирующего излучения усиливают апоптоз этих клеток. Исследователи предполагают связь между
индукцией цитокинов и процессами апоптоза. Так при облучении периферической крови в эксперименте и в
группе ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС было выявлено увеличение числа клеток, синтезирующих
ИЛ-4, ИЛ-6 и снижение числа клеток, синтезирующих ИЛ -1β [5].
Установлено, что пострадиационное восстановление гемопоэтических клеток костного мозга определяется процессами пролиферации и дифференцировки малоповрежденных или неповрежденных клеток –
предшественниц. Регуляцию системы гемопоэза определяют гемопоэтические ростовые факторы. В последние годы в ряде исследований был продемонстрирован радиозащитный эффект гемопоэтических ростовых
факторов, в частности таких рекомбинантных цитокинов, как интерлейкин - 1 (ИЛ-1), ИЛ-2, ИЛ-3, гранулоцитарно - макрофагального колониестимулирующего фактора (КСФ-ГМ). Предполагают, что радиозащитное
действие цитокинов связано с индукцией белков острой фазы за счет перехвата радикалов и некоторой активации пострадиационного восстановления гемопоэза и гормональной активности [4, 8, 15]. Существенную
роль в радиозащитном эффекте клеток миелоидного ряда и лимфоидных предшественников играет ИЛ-1,
действуя путем активации стромы костного мозга. ИЛ-1 является мультифункциональным медиатором. Иммунный и гемопоэтический спектр активности ИЛ-1 определяется усилением комитогенной пролиферации,
индукцией экспрессии рецептора к ИЛ-2, увеличением синтеза и продукции ИЛ-4, 5, 6, активацией функции
естественных киллеров (NK). При действии ИЛ-1 преактивированные В-клетки обнаруживают усиление
пролиферации, у макрофагов активируется фагоцитоз, синтез различных радикалов и фактор некроза опухоли –α (TNF - α), повышается уровень молекул MCH II класса [6, 10, 12, 13]. Важно отметить, что ИЛ-1 по
своим биологическим эффектам близок к ИЛ-6 и TNF – α и тандем этих цитокинов действует неразрывно в
процессах иммунной регуляции и апоптоза [6, 11, 14]. Учитывая огромную биологическую и защитную роль
системы ИЛ-1, снижение при облучении количества клеток, синтезирующих этот цитокин, для изучения
пострадиационного восстановления гемопоэза в эксперименте был выбран ИЛ-1, как медиатор гемопоэтической активности. Целью настоящего исследования явилось изучение реакции гемопоэза на различные физические воздействия (ионизирующее излучение, температура) и биологической роли ИЛ-1.
Материалы и методы исследования. В работе использовали 48 крыс - самцов линии Вистар
массой 170-220 грамм. Эксперимент включал 3 этапа.
I этап - 16 крыс в течение 36 дней получали 25 сеансов общего R-облучения по 2 R/сутки или 0, 5
мКл/кг на сеанс, из них 8 животных дополнительно подвержены нагреванию при температуре 37,5 о С 4 часа
в сутки. Изолированному воздействию тепла в таком же режиме подвергались ещё 8 животных.
24 крысы составили контрольные группы.
II этап - через 6 месяцев после проведения I этапа вводили человеческий ИЛ-1 (Dainippon) в суточной дозе 500 ЕД/кг массы тела внутрибрюшинно (всего 5 инъекций) 8 крысам опытной группы и 8 крысам
одной из контрольных серий. Оставшимся 8 животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор (0,85%) NaCl с такой же периодичностью и дозой, как и ИЛ – 1.
III этап - через 2 недели после последней инъекции ИЛ-1 или физиологического раствора крыс забивали для морфологических и физико-химических исследований клеток крови и костного мозга.
Забой животных контрольных и опытных групп проводили одновременно через 6 месяцев от начала
радиационного воздействия.
В работе использовано 6 групп животных.
I группа - контрольная группа животных без физического и фармакологического воздействия для сравнения
морфологического состояния костного мозга (n= 8).
II группа – крысы, подвергшиеся воздействию R-облучения (n=8).
III группа – крысы, подвергшиеся воздействию тепла (n=8).
IV группа – крысы, подвергшиеся сочетанному воздействию R-облучения и тепла (n=8).
V группа – крысы, получившие на фоне сочетанного действия R-облучения и температуры инъекции ИЛ-1
(n=8).
VI группа – крысы контрольной группы, получившие инъекции ИЛ-1 (n= 8).
VII группа - крысы контрольной группы, получившие инъекции физиологического раствора (n= 8).
2
Источником костного мозга служили бедренные кости. Суспензию костно-мозговых клеток готовили механическим способом в среде, для чего суспензию пропускали через шприц с последовательно убывающими иглами, фильтровали через 4-хслойный капроновый фильтр. Костный мозг окрашивали гематоксилин-эозином, подсчитывали ядросодержащие клетки. Данные обрабатывали статистически. Экспериментальные исследования на животных выполнялись в институте физиологии НАН Беларуси (директор академик НАН Беларуси Гурин В. Н., зав. лабораторией д.б.н., профессор Мурзенок П. П.). Забор и лабораторная
обработка костного мозга, морфо – цитологический анализ проводился лично авторами.
Результаты и обсуждение. Преобладающее число экспериментальных работ касается воздействия
какого – либо одного экзогенного фактора, тогда как в реальной жизни на живой организм одновременно
действует их множество. Коллективом сотрудников Института физиологии НАН Беларуси установлены значительные изменения функционирования эндокринной и иммунной систем, энергообеспечения тканей, достоверное снижение массы тела и угнетение поведенческих реакций животных, подвергшихся сочетанному
воздействию ионизирующего излучения и тепла [4, 9]. В связи с этим проведено изучение отдаленных гемопоэтических эффектов R-облучения, а так же сочетанного действия облучения и температуры. Показатели
морфологического состава костного мозга крыс отражены в таблице 1. Как видно, в группе животных, получивших облучение в суммарной дозе 50 R, через 6 месяцев отмечено достоверное снижение количества мегакариоцитов (МГКЦ) по отношению к контролю и тенденция к увеличению общей клеточности (p<0,1).
Остальные показатели морфологического состава костного мозга не претерпели достоверных изменений. В
группе животных, подвергшихся сочетанному воздействию радиации и температуры, установлено достоверное увеличение по отношению к контролю количества бластов и снижение общей клеточности, количества
МГКЦ и клеток эритроидного ряда. Костный мозг опытной группы животных, подвергшихся воздействию
только температуры, не имел достоверных различий по отношению к контролю ни по одному параметру.
Установлено снижение количества миелокариоцитов (МЛКЦ) и угнетение эритроидного ростка в группе
крыс, подвергшихся сочетанному воздействию облучения и температуры, по отношению к животным, получившим только сеансы облучения (p<0,05). Кроме того снижение числа МГКЦ сочеталось с нарушениями в
их структуре, характеризующимся наличием анизоцитоза этих клеток (появление микро- и в большей степени и макроформ МГКЦ в костном мозге, детерминацией их ядра). Имеется нарушение созревания клеток
красного ростка, о чем свидетельствует достоверное уменьшение зрелых и созревающих клеток (полихрохроматофильных и оксифильныхе нормоцитов, проэритробластов и базофильных нормоцитов). Фактор деления красного ростка (ФДКР) - митотический индекс клеток эритроидного ряда – снижен, что говорит о
нарушении процессов пролиферации. Несмотря на отсутствие количественных изменений нейтрофильного
ростка через 6 месяцев после воздействия радиации и температуры следует отметить, что морфологический
анализ миелоидного ростка показал достоверное снижение зрелых нейтрофильных гранулоцитов по сравнению с молодыми и созревающими клетками этого ряда. Это свидетельствует, что процессы пролиферации
клеток миелоидного ряда после воздействия физических факторов (ионизирующее облучение и температура)
проходят интенсивно, но с нарушением (замедлением) процессов дифференцировки нейтрофилов.
Таблица 1
Морфологический состав костного мозга крыс, подвергшихся
различным физическим воздействиям
Показатели костГруппы животных
ного мозга
I
II
III
IV
МЛКЦ, ·109/л
371,0 ± 20,1
486,2 ± 20,2
414,0 ± 24,5
МГКЦ, ·109/л
0,14 ± 0,03
0,070 ± 0,002 *
0,19 ± 0,07
140,9 ± 26,8 *
**
0,063 ± 0,001*
1,8 ± 0,4
2,6 ± 0,3
2,0 ± 0,3
3,0 ± 1,4 *
33,6 ± 3,1
30,8 ± 2,4
31,3 ± 3,0
33,5 ± 4,5
17,9 ± 1,6
16,3 ± 2,0
16,0 ± 1,4
16,0 ± 4,0
бласты, %
нейтрофильный
росток, %
лимфоциты, %
моноциты, %
2,6 ± 0,6
3,1 ± 0,5
3,8 ± 0,3
4,5 ± 0,5
эритроидный ро14,4 ± 2,2 *
27,3 ± 2,4
31,5 ± 2,0
29,5 ± 1,9
сток, %
**
Примечание: * - достоверность различий по отношению к контролю; ** - достоверность различий между II
и IVгруппами животных.
Таким образом, наиболее выраженные изменения морфологического состава костного мозга отмечены в группе животных, подвергшихся сочетанному воздействию малых доз радиации и температуры, и
характеризуются снижением количества МЛКЦ, МГКЦ, повышением количества бластных клеток и угнетением эритроидного ростка. Количественные изменения морфологического состава костного мозга сопро-
3
вождались нарушением процессов дифференцировки всех гемопоэтических ростков с преобладанием молодых форм.
С целью коррекции выявленных нарушений животным опытной группы, в которой были обнаружены наиболее выраженные изменения морфологического состава костного мозга (IV группа), вводили рекомбинантный ИЛ-1 (V группа). Результаты исследования клеточного состава костного мозга после сочетанного
воздействия физических факторов и введения ИЛ-1 представлены в табл. 2.
Таблица 2
Показатели морфологического состава костного мозга крыс,
подвергшихся различным воздействиям
Показатели
Группы животных
костного мозга
I
IV
V
VI
VII
МЛКЦ, ·109/л
371,0 ± 20,1
140,9 ± 26,8
187,0 ± 24,0
429,0 ± 16,0
360,0 ± 22,0
МГКЦ, ·109/л
0,140 ± 0,03
0,063 ± 0,001
0,098± 0,008
Р1
0,170± 0,035
0,121± 0,013
1,8 ± 0,4
3,0 ± 1,4
2,2 ± 0,3
1,7 ± 1,2
2,3 ± 0,8
нейтрофильный
росток, %
33,6 ± 3,1
33,5 ± 4,5
35,2 ± 4,4
35,4 ± 6,5
35,2 ± 4,0
лимфоциты, %
17,9 ± 1,6
16,0 ± 4,0
28,6 ± 3,6
Р1
19,3 ± 3,9
15,0 ± 2,8
моноциты, %
2,6 ± 0,6
4,5 ± 0,5
2,8 ± 0,6
2,8 ± 0,1
2,3 ± 0,2
бласты, %
эозинофильный
16,0 ± 2,2
10,0 ± 3,2
9,2 ± 2,9
14,9 ± 3,8
12,0 ± 2,0
росток, %
Р1
эритроидный
27,3 ± 2,4
14,7 ± 2,2
14,3 ± 1,9
24,6 ± 2,3
29,5 ± 2,1
росток, %
Примечание: Р1 - достоверность различий анализируемых показателей между IV и Vгруппами; P 2 - достоверность различий анализируемых показателей между V и VI группами; Р 3 - достоверность различий анализируемых показателей между I и VI группами; Р4 - достоверность различий анализируемых показателей
между VI и VII группами.
На фоне введения цитокина в группе животных, подвергшихся сочетанному воздействию радиации
и температуры, обнаружено достоверное увеличение количества МГКЦ, лимфоцитов и клеток эозинофильного ростка. Стимулирующий эффект рекомбинантного ИЛ-1 подтверждается сопоставлением данных животных I и VI, а так же VI и VII групп. Достоверных различий между относительными показателями клеточного состава костного мозга в этих группах не отмечено, но при сопоставлении контрольных групп выявлена тенденция к повышению активности всех гемопоэтических линий у животных, получавших инъекции
ИЛ-1, что подтверждает стимулирующее действие цитокина на клетки костного мозга. В то же время уровень и качество восстановления костного мозга определяется степенью зрелости клеток. Несмотря на одинаковую общую клеточность в I, VI и VII группах, имеются выраженные отличия в качественном морфологическом составе. Так, в VI группе обнаружено достоверное увеличение числа зрелых нейтрофилов (палочкоядерных и сегментоядерных элементов) по отношению к аналогичным показателям в I и VII группе животных, что свидетельствует в пользу усиления процессов дифференцировки клеток миелоидного ростка кроветворения под влиянием ИЛ-1.
Анализ показателей эритроидного ростка костного мозга выявил у IV группы животных, получивших малые дозы радиации и тепла, угнетение общего количества всех эритроидных клеток и нарушение
созревания клеток красного ростка (табл.1, табл. 3). Так, в IV экспериментальной группе отмечено достоверное снижение по отношению к контролю общего количества клеток эритроидного ряда, а так же оксифильных и полихроматофильных нормоцитов на фоне повышения количества незрелых форм – эритробластов и
проэритробластов, что обуславливает низкий фактор деления красного ростка (ФДКР). При сравнении показателей V и VI групп не уставновлено достоверных различий ни по одному анализируемому параметру (табл.
3). Под действием ИЛ-1 на фоне радиации и тепла не происходит активации эритропоэза и индекс созревания эритробластов остается низкий, из чего можно сделать вывод, что ИЛ-1 самостоятельно не участвует в
процессе пролиферации и созревания клеток эритроидного ростка. Полученные результаты не противоречат
известным литературным данным об отсутствии стимулирущего влияния данного цитокина на эритропоэз
[10, 11, 13]. Наличие достоверных различий между показателями V и VI связано не с повышенным стимулирующим действием ИЛ-1 на эритроидный росток здорового костного мозга, а изначальной разницей в показателях контрольной группы и группы животных, подвергшихся сочетанному воздействию радиации и температуры. Это подтверждается отсутствием достоверных различий между показателями VI и VII групп.
Таблица 3
Показатели эритропоэза в костном мозге крыс, подвергшихся различным воздействиям
4
Показатели
Общее количество, %
Эритробласты,
%
Проэритробласты, %
Базофильные
нормоциты, %
Полихроматофильные
нормоциты, %
Оксифильные
нормоциты, %
Группы животных
I
IV
14,7 ± 2,2
Р1
2,0 ± 0,15
Р1
1,5 ± 0,09
Р1
V
14,3 ± 2,0
P2
1,35 ± 0,12
P2
1,1± 0,11
0,8 ± 0,12
0,9 ± 0,1
7,25 ± 0,9
4,8 ± 0,2
4, 8 ± 0,2
5,3 ± 1,2
8,5 ± 1,6
10,3 ± 2,0
4,9 ± 0,3
Р1
5,3 ± 0,3
P2
9,0 ± 1,3
P3
10,9 ± 0,7
27,3 ± 2,4
0,50 ± 0,06
0,70 ± 0,04
VI
24,6 ± 2,3
P3
0,7 ± 0,17
VII
29,5 ± 2,1
1,18 ± 0,15
1,5 ± 0,1
8,8 ± 0,2
1,8 ± 0,09
8,1 ± 0,2
Р1
P3
0,31 ± 0,01
0,4 ± 0,012
0,64 ± 0,012
ФДКР
0,58 ± 0,03
0,53 ± 0,017
Р1
P2
P3
Примечание: Р1 - достоверность различий анализируемых показателей между I и IVгруппами; P2 достоверность различий анализируемых показателей между I и V группами; P 3 - достоверность различий
анализируемых показателей между V и VI группами.
8,5 ± 1,2
Выводы. Таким образом, у животных, подвергшихся комбинированному действию малых доз радиации и тепла, через 6 месяцев выявлены нарушения процессов кроветворения, характеризующиеся снижением общей клеточности и МГКЦ, повышением количества бластных клеток и угнетением эритроидного
ростка. Особый интерес представляют качественные пострадиационные изменения гемопоэза, проявляющиеся замедлением процессов дифференцировки всех гемопоэтических ростков с преобладанием молодых
форм. Под влиянием интерлейкина – 1, введенного через 6 месяцев после сочетанного воздействия радиации
и температуры, установлена тенденция к увеличению общей клеточности, достоверное повышение количества МГКЦ, лимфоцитов и клеток эозинофильного ростка, а так же усиления процессов дифференцировки
клеток миелоидного ростка кроветворения. В процессе пролиферации и созревания клеток эритроидного
ростка ИЛ-1 не участвует.
Summary. At the animals, small dozes of radiation undergone to combined influence and heat, in 6 months
infringements of hematopoietic processes are revealed: decrease general bone marrow cellularity and megakaryocyts,
increase of quantity blasts and oppression erythropoesis. Qualitative postradiating modifications of hemopoiesis
were showed by delay of processes of a differentiation of all hematopoietic lineages with prevalence of young forms.
Under influence interleukin - 1 the tendency to increase general cellularity, authentic increase of quantity megakaryocyts, lymphocyts and cells eosinophylic lines, and as amplification of processes of a differentiation of myeloid
cells is established. In proliferation process and maturing of cells erythroid lines interleukin – 1 does not participate.
Литература:
1. Арчакова Л. И., Бокуть Т. Б., Житкевич Т. И. //Фундаментальные и прикладные аспекты радиобиологии: биологические эффекты малых доз и радиоактивное загрязнение среды: Тезисы докладов международной конференции. – Мн., 1998. – с. 8.
2. Базыка Д. А. , Беляева Н. В., Бебешко В. Г. и др. // Международный журнал радиационнй медицины. –
2001. – т. 3, № 1 – 2. – с. 155.
3. Викентьева Н. К., Цыхун Г. Ф., Бокуть Т. Б. // Фундаментальные и прикладные аспекты радиобиологии:
биологические эффекты малых доз и радиоактивное загрязнение среды: Тезисы докладов международной
конференции. – Мн., 1998. – с. 39.
4. Житкевич Т. И., Мурзенок П. П. // Радиационная биология. радиоэкология. – 1996. – Т. 36, вып. 3. – с.
338 – 434.
5. Калинина Н. М., Солнцева О. С., Бычкова Н. В. // Сб. мат. 2-ой международной конференции «Отдаленные медицинские последствия Чернобыльской катастрофы». – Киев, 1998. – с. 246.
6. Ковальчук Л. В., Соболев Б. Н., Ганковская Л.В и др.// Иммунология. – 2001. - № 1. – с. 6- 10.
7. Отчет научного комитета по действию атомной радиации генеральной Ассамблее ООН.// Медицинская
радиология и радиационная медицина. – 2001. - № 1, том 46. – с. 28 – 47.
8. Румянцев А. Г. // Сб. трудов «Медицинскиеаспекты влияния малых доз радиации на организм детей и
подростков». – 1991. – вып. 2. – с. 26- 31.
9. Чура Н. А. // Экологическая антропология. – 1998. - с. 285 – 287.
5
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Dinarello Ch. G. // Cytokine and Growth Factor. – 1997. – vol.8. – P. 253 – 265.
Dinarello C. A. // Eur Cytokine Netw. – 1994. - vol. 5. – P. 517 – 531.
Hoshino T., Winkler – Picketl R. T., Mason A. T. et al. // Ibid. – 1999. – vol. 162, № 1. – P. 51 – 59.
Loppnow H. // Internist. – 2001. – vol. 42. – P. 13 – 27.
Loppnow H., Werdan K., Reuter G. et al. // Eur Cytokine Netw. – 1998. - vol. 9. – P. 670 – 675.
Neta R., Oppenheim J. J., Douches S. D.// J. Immunol. – 1988. – Vol. 140, № 1. – P. 108 – 111.