Защита диссертации состоится “20 марта” 2012 г. в 13.00 часов
advertisement
На правах рукописи Щетинина Наталья Сергеевна ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОГРАММЫ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ПУТЕМ ПРИМЕНЕНИЯ СЕЛЕКТИВНОГО ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНА В ПОЛОСТЬ МАТКИ 14.01.01 – Акушерство и гинекология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва-2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор Кузьмичев Леонид Николаевич Бурлев Владимир Алексеевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Манухин Игорь Борисович (Московский государственный медико-стоматологический университет) доктор медицинских наук Мишиева Нона Годовна (ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России) Ведущая организация: ГУЗ «Московский областной исследовательский институт акушерства и гинекологии» научно- Защита диссертации состоится “20 марта” 2012 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.125.01 при ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Министерства здравоохранения и социального развития РФ по адресу 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д.4. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Автореферат разослан «20 февраля»2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Е.А.Калинина ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Последние десятилетия ознаменованы широким распространением в лечении бесплодия вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Бурное развитие технологий и применение новых медицинских препаратов привели к тому, что не осталось практически диагнозов, при которых было бы невозможно получить потомство у супружеских пар (освобождение эмбрионов с бесплодием: ИКСИ, эмбриона от прозрачной до стадии бластоцисты, вспомогательный хэтчинг оболочки), культивирование криоконсервация эмбрионов, преимплантационная генетическая диагностика, донация ооцитов, спермы, суррогатное материнство и др [Кулаков В.И., Леонов Б.В., Кузьмичев Л.Н.., 2005]. Применение этих технологий позволило повысить имплантации и как следствие частоту наступления уровень беременности [Назаренко Т.А., 2008]. Повышение эффективности программы ЭКО на первых этапах достигалось большим количеством переносимых эмбрионов, что сопровождалось увеличением частоты многоплодной беременности. В связи с этим во многих Эко центрах Европы, стандартной стала политика переноса 2-х эмбрионов. Это привело к снижению многоплодия, однако частота двоен остается около 20-35% [Andersen N.A. 2004]. Вынашивание беременности при многоплодии сопряжено со значительным увеличением осложнений со стороны матери, а высокий уровень преждевременных родов у этой группы пациенток приводит к увеличению перинатальной и ранней детской заболеваемости и смертности. Это позволяет считать многоплодную беременность патологической, а также ятрогенным осложнением ВРТ [Scotland G., 2007]. Возможным путем выхода из сложившейся ситуации является селективный перенос одного эмбриона в полость матки [Van Montfoort A., 2005]. Обязательным условием в данном случае является выбор эмбриона с наилучшим имплантационным потенциалом, что требует четких критериев отбора эмбриона “хорошего качества”. 4 Эмбриологический этап программы ЭКО является одним из важнейших, поскольку оценка качества ооцитов, их оплодотворение и культивирование in vitro до стадии преимплантационных эмбрионов во многом определяют ее успех. Создание последовательных сред продленного культивирования позволило развитие эмбриона до стадии бластоцисты. Это предполагает “естественную” их селекцию и синхронизацию с эндометрием, что является более физиологичным, а также существенно увеличивает процент наступления беременности [Criniti A., 2005]. Повышение результативности и разработка новых методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) невозможны без изучения механизмов регуляции имплантации. Наступление беременности во многом зависит от двух составляющих – функционально полноценного эмбриона и рецептивности эндометрия [Светлаков А.В., 2002]. Имплантация клеточных эмбриона взаимодействий, представляет регулируемых комплекс пара - молекулярных и и аутокринными факторами. Многие механизмы, вовлеченные в этот процесс, остаются недоступными для исследования по очевидным причинам. Следовательно, прогресс в поиске стратегии, позволившей уменьшить число неудач в программе ЭКО, развивается небольшими темпами. Однако в последние годы отмечается значительный прогресс в создании новых технологий. Но для дальнейшего совершенствования этого направления необходим поиск, как молекулярных механизмов поэтапного развития бластоцисты, так и оптимальных маркеров, которые позволили бы оценить имплантационный потенциал эмбриона. Цель исследования: Повышение эффективности программы ЭКО путем разработки и применения селективного переноса эмбриона в полость матки. Задачи исследования: 1. Оценить эффективность программы ЭКО у женщин с ТПБ на основании морфологической оценки качества эмбриона. 5 2. Провести сравнительный анализ эффективности программы ЭКО при различных вариантах переноса эмбрионов у данной категории больных. 3. Определить клинические и эмбриологические критерии отбора женщин с ТПБ для проведения пролонгированного культивирования эмбрионов и последующим переносом их в полость матки в программе ЭКО. 4. Исследовать наличие селектинов в среде культивирования эмбрионов. Определить прогностическую значимость селектинов, содержащихся в среде культивирования, для успешной имплантации эмбриона. Научная новизна. По данным проведен анализ стандартной системы оценки качества эмбрионов в программе ЭКО у женщин с ТПБ, анализ эффективности программы при различных вариантах переноса эмбрионов у данной категории больных. Выявлена высокая частота наступления беременности в случаях с преносом эмбрионов на стадии бластоцисты и определены критерии отбора пациенток для пролонгированного культивирования до стадии бластоцисты. исследования Впервые культуральной доказана среды возможность эмбриона. проведения Установлено, что целесообразно использование измерения содержания селектинов (L,P,E) как дополнительного критерия в селекции эмбриона для переноса в полость матки. Прослежена взаимосвязь между уровнем селектинов и наступлением беременности. Определен значимый уровень P-селектина для селекции эмбриона с высоким имплантационным потенциалом. На основе изучения экспрессии селектинов выявлены патогенетические аспекты возможных причин неудач программы ЭКО. Практическая значимость. На основании изучения клинико- патогенетических аспектов сформулированы предложения по оптимизации тактики лечения женщин с ТПБ в программе ЭКО. Доказана целесообразность проведения селективного переноса у женщин моложе 35 лет и при наличии не менее 3-х эмбрионов «хорошей» морфологической 6 оценки на 3-и сутки. Разработан алгоритм ведения пациенток с селективным переносом эмбрионов в полость матки. Положения, выносимые на защиту: 1. У женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в программе ЭКО при переносе эмбрионов в полость матки на 3 или 5 день культивирования частота наступления беременности возрастает с 28% до 48% (на число эмбрионов) и с 43% до 62% (на 1 цикл стимуляции) и не связано с клиникоанамнестическими данными. 2. У женщин с бесплодием в возрасте, не превышающем 35 лет, и с числом эмбрионов на 3-и сутки не менее 3-х пролонгированное культивирование эмбрионов до 5-х суток с последующим переносом их в полость матки повышает эффективность программы ЭКО. 3. Растворимые селектины L, P, E культуральной среды эмбрионов являются продуктами процессах их жизнедеятельности, принимают участие в имплантации плодного яйца и отражают их состояние к дальнейшему развитию в полости матки. Апробация работы Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседании апробационной комиссии ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Министерства здравоохранения и социального развития РФ (05.09.11). Внедрение в практику Разработанные принципы ведения пациенток в программе ЭКО внедрены в практику отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Министерства здравоохранения и социального развития РФ. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 работы в журналах, рекомендованных перечнем ВАК Минобнауки РФ. 7 Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Библиографический указатель включает 170 источников, из них 42 отечественных и 128 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами, 14 рисунками. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Отбор пациенток для проведения данного исследования проводился в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ «Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И.Кулакова» в период с декабря 2007 года по октябрь 2010 года. Всего в период выполнения настоящей работы под нашим наблюдением находилось 315 пациенток в возрасте от 20 до 38 лет, страдающих бесплодием трубноперитониального генеза, находившихся в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия для проведения программы ЭКО. Проведен анализ клинико-анамнестических особенностей женщин с трубно- перитонеальным бесплодием в программе ЭКО в случаях с наступившей и ненаступившей беременностью. Критериями исключения явились: СПКЯ, тератозооспермия III и IV ст. у мужа, патология эндометрия (исключалась по данным биопсии эндометрия на 20-21 день менструального цикла), развитие синдрома гиперстимуляции средней и тяжелой степени, неудовлетворительная морфологическая “оценка” эмбрионов для переноса в полость матки. Согласно критериям включения и исключения в группу исследования вошли 90 женщин, которым проводили индивидуальное культивирование эмбрионов с последующим забором среды культивирования для исследования, и 20 женщин с селективным переносом эмбриона в полость матки. 8 Всем женщинам, включенным в данное исследование, были полностью разъяснены все аспекты лечения и необходимого обследования. Информированное согласие получено от всех женщин, участвующих в исследовании. Данное исследование проводилось в два этапа. На первом этапе, в зависимости от дня переноса эмбрионов в полость матки в программе ЭКО все пациенты были разделены на три группы: Первую группу составили 30 женщин с переносом эмбрионов третьего дня культивирования после ТВП. Вторую группу составили 26 женщиы с переносом эмбрионов пятого дня культивирования после ТВП. Третью группу составили 34 женщин с переносом эмбрионов третьего и пятого дня культивирования после ТВП. На данном этапе проведен сравнительный анализ программы ЭКО при различных вариантах переноса исследуемых женщин. Определены эффективности эмбрионов у клинические и эмбриологические критерии отбора женщин, участвующих в программе ЭКО, с целью проведения пролонгированного культивирования эмбрионов и последующим переносом их в полость матки. На втором этапе нами была набрана четвертая группа (N=20). Дополнительными критериями включения явились: Возраст пациенток не более 35 лет 1-2-ая попытка ЭКО и ПЭ Наличие более 3-х эмбрионов на 3-и сутки культивирования Наличие более 1-го эмбриона «хорошей» морфологической оценки на 5-е сутки В данной группе пациенток производили перенос одного эмбриона на стадии бластоцисты, селекция которого основывалась на морфологической оценке и измерении P-селектина в культуральной среде. Проведена оценка 9 эффективности реализации программы ЭКО и разработан алгоритм выбора тактики переноса эмбриона в полость матки. Предварительное обследование пациенток проводили по месту жительства женщины и/или амбулаторно в лабораториях и отделениях ФГБУ «НЦ АГиП им.В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России в соответствии с разработанной в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия схемой (приказ №67 МЗ РФ от 23 февраля 2003 года). Всем женщинам проводили стимуляцию по длинному протоколу. Для десенситизации гонадотропной функции гипофиза применяли аналог гонадолиберина («Трипторелин») с 19-22-го дня менструального цикла по 0,1 мг. Со 2-3-го дня следующего менструального цикла на фоне снижения дозы аналога гонадолиберина суперовуляции с до 0,05 помощью мг проводили препаратов стимуляцию рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека (р-чФСГ) в дозе 150-225 МЕ фоллитропин альфа. Культивирование эмбрионов и оценка их качества, все манипуляции с половыми клетками и эмбрионами человека проводили на средах фирмы «COOK» (Австралия). Оплодотворение проходило в среде Fertilization medium (Sydney IVF), COOK, R-SIFM-20. На стадии пронуклеусов зиготы помещали в среду Cleavage medium (Sydney IVF) K-SIFM-20 и культивировали индивидуально. На 3-и сутки культивирования эмбрионы переносили в среду Blastocyst medium (Sydney IVF) K-SIBM-20, в которой их культивировали до стадии бластоцисты. Качество эмбрионов оценивали перед каждым переносом. Перенос эмбрионов осуществляли на 3-и, 5-е сутки культивирования и в два этапа. Выбор дня переноса определялся общим состоянием пациентки (отсутствие синдрома гиперстимуляции яичников средней и тяжелой степени) и эмбриологическими характеристиками (количеством эмбрионов на 3-и сутки культивирования) [Racowsky C. et al.,2000]. 10 Эмбрионы переносили в полость матки под контролем трансабдоминального эхографического исследования («Bluer & Kier» (Дания)) c помощью двух типов катетеров Wallace («Smiths Medical International Ltd.», UK) и Cook-K-Jet («Сook Ireland Ltd.», Ireland). В большинстве случаев перенос эмбрионов в полость матки осуществляли с помощью мягкого катетера Wallace. В работе использованы следующие методы: клинико- анамнестическое обследование пациенток перед проведением программы ЭКО; лабораторное исследование — определение гормонов в плазме крови с использованием иммуноферментных тест систем (ЛГ, ФСГ, эстрадиол, Т, пролактин, ТТГ, Т4 свободный, Прогестерон); ультразвуковое исследование органов малого таза; УЗ и гормональное мониторирование индуцированных циклов). Результаты исследования обрабатывали с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и стандартного пакета программ для обработки статистической информации "SPSS 11.0. Количественные показатели исследования описаны в терминах среднего арифметического значения (М) и стандартного среднеквадратичного отклонения (SD. При сравнении средних значений в изучаемых группах использовали метод дисперсионного анализа [37]. Сравнение независимых групп по количественным признакам с нормальным распределением значений проводилось с использованием t-критерия Стьюдента. Для непараметрических данных применяли U-критерий Манна-Уитни. Для нахождения различий между качественными показателями использовали метод χ2 с поправкой Йетса на непрерывность, для вычисления, которого прибегали к построению «сетки 2х2» и «3х2», а также точный критерий Фишера для небольших выборок. Связь между изучаемыми показателями оценивали по результатам корреляционного анализа с вычислением коэффициента корреляции Пирсона (r) и последующим установлением его значимости по критерию t. Проведен 11 плотерный анализ данных. Для оценки информационной ценности предикторов пролонгированного культивирования эмбриона использовали ROC-кривые. Результаты исследований и их обсуждение Проведен анализ 315 циклов экстракорпорального оплодотворения у пациенток репродуктивного возраста. Проанализированы перенесенных наследственность заболеваний, оперативных пациенток, вмешательств, характер становления менструальной функции, акушерский и гинекологический анамнез. На амбулаторном этапе всем пациенткам было проведено обследование состояния органов малого таза, состояния эндометрия с помощью УЗИ. Женщины изучаемых групп по основным клинико-анамнестическим данным не имели отличий. При анализе показателей контролируемой индукции овуляции, выявлено, что количество ооцитов, пронуклеусов, эмбрионов 3-х и 5-х суток достоверно выше в группах с переносом эмбрионов в два этапа и только на 5ый день после пункции яичников. Количество ооцитов, полученных в ходе трансвагинальной пункции, количество пронуклеусов, количество эмбрионов 3-их и 5–х суток в первой группе составило 3,8±2,6, 3,1±2,1, 2,5±1,9, 0,1±0,4 соответственно, что достоверно ниже, чем в третьей и во второй группах. Данные по количеству ооцитов, количеству пронуклеусов, количеству эмбрионов 3-их и 5–х суток во второй и третьей группах достоверно не различались и составили 9,6 ± 3,9 и 7,4 ± 3,1, 7,5 ± 3,4 и 6,7 ± 3,0, 6,2 ± 2,4 и 5,8 ± 2,3, 2,8 ± 1,3 и 2,1 ± 1,1 соответственно. Что, связано с большей вероятностью развития эмбрионов до стадии бластоцисты при большем количестве ооцитов, пронуклеусов и эмбрионов 3-х суток. Учитывая достоверные различия между группами по пронуклеусов и эмбрионов 3-х и 5-х суток корреляционный анализ. количеству ооцитов, нами был проведен 12 На рисунке 1 представлено графическое отображение корреляционного анализа. Нами была выявлена достоверная прямая умеренная зависимость между количеством ооцитов, пронуклеусов, эмбрионов на 3-и сутки и 6 6 5 5 количество эмбрионов на 5-е сутки количество эмбрионов на 5-е сутки количеством эмбрионов на 5-е сутки культивирования (рис.1). 4 3 2 1 0 4 3 2 1 0 -1 -1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 2 4 6 8 10 12 14 16 количеств о пронуклеусов M II 6 количество эмбрионов на 5-е сутки 5 4 3 2 1 0 -1 0 2 4 6 8 10 12 количеств о эмбрионов на 3-и сутки Рисунок 1. Корреляционная зависимость между количеством эмбрионов на стадии бластоцисты и количеством ооцитов , MII (p<0,005, r = 0,54, ДИ95%), количеством пронуклеусов (p<0,005, r = 0,5, ДИ 95%) и количеством эмбрионов на стадии бластомеров (p<0,001, r = 0,61, ДИ 95%) При анализе результатов лечения получены достоверные различия по частоте имплантации и клинической беременности в исследуемых группах пациенток (рисунок 2). 13 70 61,5 60 47,6 50 42,8 43,3 41,2 40 % 1 группа 2 группа 3 группа 27,7 24,3 30 24,3 23,4 Перенос/дни 20 10 0 IR PR ЧНБ % Рис.2. Сравнение показателей эффективности программы ЭКО при переносе эмбрионов на 3, 5 и 3-5 дни культивирования. У пациенток с тактикой переноса эмбрионов в полость на стадии бластоцисты (5-е сутки) IR и PR составил 47,6% и 42,8%. В первой группе IR составил 27,7%, PR 23,4%, а во второй 24,3%. Достоверно выше был показатель наступления беременности на цикл стимуляции у женщин во второй группе и составил 61,5%. Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности программы ЭКО при переносе эмбрионов на стадии бластоцисты, без переноса на 3-и сутки, и о важности продленного культивирования эмбрионов. Нами был использован ROC-анализ с целью определения показателей, ниже /выше которых возможно развитие эмбриона до стадии бластоцисты (5е сутки) и наступление беременности. В результате проведенного ROC анализа для показателя развития эмбриона до стадии бластоцисты нами была получена характеристическая ROC- кривая (рисунок 3). 14 ROC-кривая Рисунок 3. Зависимость наличия эмбрионов на 5-е сутки от количества эмбрионов на 3-и сутки. Согласно рисунку 3, площадь под кривой AUC = 0,887±0,053, что свидетельствует об очень хорошем качестве полученной модели для прогнозирования дробления эмбрионов до 5 дня in vitro в зависимости от числа эмбрионов на 3 день. Максимальная чувствительность и специфичность теста выявлена при показателе числа эмбрионов на 3 день ≥ 3. Относительный риск развития эмбрионов до стадии бластоцисты при наличии ≥ 3-х эмбрионов на 3-и сутки составляет 15,16 (ОР= 15,16; 95%, д.и. 2,25 - 102,34). Получение данной модели побудило нас к поиску маркеров получения более 3-х эмбрионов на 3-и сутки культивации. Нами был проведен ROC анализ для соответствующего показателя в зависимости от возраста пациентки. Максимальная чувствительность и специфичность теста выявлена 15 при показателе возраста ≤ 35 лет. Относительный риск составил ОР =3,18 (95% д.и. 1,14-8,85). ROC- кривая Рисунок 4. Зависимость наличия 3-х эмбрионов и более на 3-и сутки от возраста пациентки. Нами был проведен анализ сред культивирования 88-и эмбрионов, согласно группам исследования. Как следует из результатов исследования, концентрация P-селектина в среде культивирования эмбрионов значительно превышает концентрации селектинов L и Е. Выявлены статистически значимые различия 1-ой группы от 2-ой и третьей, уровни селектинов в которых были достоверно ниже и между собой не имели отличий. Мы предположили, что это может быть связано с различной характеристикой эмбрионов в этих группах, т.е. стадией развития и, соответственно, метаболической активностью. 16 На втором этапе нами проведен детальный анализ результатов исследования показатели сред эмбрионов одной стадии развития. Мы сравнили одной группы в случае наступления и ненаступления беременности. Так как эмбрионы 3-х суток культивированя имели разную морфологическую характеристику, мы провели сравнительный анализ уровня селектина в расчете на один бластомер эмбриона. Мы получили, что данные первой группы имеют статистические значимые различия в случаях с наступлением и ненаступлением беременности. Так, уровни всех типов селектинов ниже в средах эмбрионов с успешной имплантацией. При проведении корреляционного анализа была выявлена достоверная обратная связь между уровнем селектинов и наступлением беременности (рис. 5). Correlation: r = -,4214 95% confidence 95% confidence Correlation: r = -0,4169 8 900 7 800 700 Р-selectin на бластомер 5 4 600 500 400 3 300 2 200 1 100 небеременные женщины беременные женщины Correlation: r = -0,4833 небеременные женщины беременные женщины 95% confidence 280 260 240 220 Е-selectin на бластомер L-selectin на бластомер 6 200 180 160 140 120 100 80 60 40 небеременные женщины беременные женщины Рисунок 5. Корреляционная зависимость наступления беременности от уровня L-, P-, E-селектина (r=-0,42-0,48, р<0,005) 17 На пятые сутки культивирования уровни селектинов в средах эмбрионов с успешной имплантации достоверно не отличались от таковых не результировавших беременность, за исключением P селектина, который составил в случаях с наступившей беременностью 1298,1±625,4пмоль/мл и 994,2±164,8пмоль/л при отрицательном результате ( p<0,05). Так как нами была установлена корреляционная связь между уровнем селектинов и наступлением беременности, был проделан ROC анализ и получена характеристическая ROC-кривая. Рисунок 6. Зависимость наступления беременности от уровня P-селектина в среде культивирования бластоцист (p<0,005). 18 Полученные достоверные различия уровня P-селектина на 5-е сутки в группах с наступившей и ненаступившей беременностью побудили к проведению соответствующего ROC-анализа. Согласно рисунку 6, площадь под ROC-кривой AUC = 0,818±0,106, что свидетельствует об очень хорошем качестве полученной беременности модели для прогнозирования в зависимости от уровня наступления P-селектина. Максимальная чувствительность и специфичность теста выявлена при показателе P селектина = 1040,50 нг/мл. Приведенные характеристические кривые доказывают важную прогностическую значимость для развития эмбриона до стадии бластоцисты in vitro таких показателей, как возраст пациентки и количество эмбрионов на 3-х сутках культивирования. Уровень Р-селектина в культуральной среде является значимым для наступления беременности, и может быть использован в дополнение к существующим шкалам оценки качества эмбрионов при проведении селективного переноса одного эмбриона в полость матки. На рисунке приведен плотерный анализ содержания селектинов на разных этапах культивирования в случаях с имплантацией и без нее. Box Plot (L-selectin) Box Plot (P-Selectin) Mean; Box: Mean±SE; Whisker: Mean±SD Mean; Box: Mean±SE; Whisker: Mean±SD 30 3200 28 3000 26 2800 24 2600 2400 22 2200 20 2000 18 1800 16 1600 14 1400 12 1200 10 1000 8 800 6 600 4 3 4 сутки 5 беременные небеременные 400 3 4 сутки 5 беременные небеременные 19 Box Plot ( E-selectin) Mean; Box: Mean±SE; Whisker: Mean±SD 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 3 4 5 беременные небеременные сутки Рисунок 6. Содержание уровня L-,P-,E-селектина в среде культивирования эмбрионов в случаях с наступившей и ненаступившей беременностью. Отмечается статистически значимое низкое содержание всех типов селектинов в средах 5-го дня по сравнению с 3-им днем культивирования эмбриона. Кроме того, в случаях, когда имплантации не происходит, содержание селектинов на третьи сутки статистически значимо выше чем в случаях наступления беременности и имеется более значимые отличия с 5-м днем. Согласно полученным результатам нами была набрана проспективная группа (N=20), соответствующая следующим критериям: У пациенток четвертой группы производили перенос одного эмбриона на стадии бластоцисты, селекция которого основывалась на морфологической оценке и измерении P-селектина в культуральной среде ([Pселектин]> 1040,5 пг/мл). 20 80 75 IR, % PR,% Рис.7 Эффективность программы ЭКО при селективном переносе эмбрионов в полость матки. Как видно из приведенных данных частота имплантации составила 80%, частота наступления беременности 75%. Уровень репродуктивных потерь в этой группе достигал 6,25%, а показатель ”take home baby” составил 93,8%. На основании полученных результатов нами разработан алгоритм терапии бесплодия методом ЭКО с использованием селективного переноса эмбриона в полость матки (Рисунок 8). Нами разработан алгоритм выбора тактики переноса эмбрионов в полость матки: 21 Алгоритм выбора тактики переноса эмбриона в полость матки Обследование пациенток в программе ЭКО Отбор пациенток • возраст до 35 лет Возраст 35 лет и старше Стимуляция овуляции, ЭКО более 3-х эмбрионов «хорошего» качества на 3-и сутки культивирования менее 3-х эмбрионов «хорошего» качества на 3-и сутки культивирования Индивидуальное пролонгированное культивирование Завершение цикла ВРТ с проведение переноса 2-х эмбрионов на з-и сутки культивирования Более 1-го эмбриона на стадии бластоцисты топ-качества P-селектин > 1040 пг/мл в среде культивирования Завершение цикла ВРТ с проведение переноса 2-х эмбрионов на 5-е сутки культивирования eSET 21 22 ВЫВОДЫ 1. Частота наступления беременности у женщин с ТПБ в программе ЭКО при использовании стандартной системы оценки качества эмбрионов не превышает 48%, что вероятно связано с функциональным состоянием эмбриона. 2. Эффективность программы ЭКО у женщин с ТПБ не старше 35-и лет при «хорошей» морфологической оценке переносимых эмбрионов на 3-ий день культивирования составляет 28% и возрастает до 48% к 5-му дню культивирования. 3. Пролонгированное культивирование эмбрионов (до 5-х суток) целесообразно проводить женщинам в возрасте до 35-и лет, при наличии более 3-х эмбрионов «хорошего» качества на третьи сутки культивирования. 4. Выявлено наличие всех типов селектинов (L, P, E) в среде культивирования. Показана обратная корреляционная зависимость между уровнем селектинов (L, P, E) в среде 3-го дня культивирования эмбрионов и наступлением беременности (r=-0,42-0,48, p<0,005), что отражает более низкую метаболическую активность эмбрионов с высоким имплантационным потенциалом. 5. Выявлено значимое снижение уровня селектинов в среде культивирования 5-го дня по сравнению с 3-м днем (p<0,005), что может быть связано с активацией генома на данной стадии развития эмбриона. Прогностическим критерием наступления беременности является уровень Pселектина > 1050 пг/мл в среде 5-го дня культивирования эмбрионов. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Женщинам моложе 35-и лет с ТПБ и при условии наличия более 3-х эмбрионов на 3-и сутки целесообразно проводить пролонгированное культивирование эмбрионов до стадии бластоцисты с целью дельнейшей селекции для переноса в полость матки. 2. Селективный перенос эмбриона в полость матки показано проводить пациенткам при наличии более 1-го эмбриона «хорошей» морфологической оценки на стадии бластоцисты. 3. При выборе тактики о селективном переносе эмбриона в полость матки возможно определить содержание селектинов в среде культивирования и производить перенос эмбриона при уровене Р-селектина в среде культивирования более 1050 пг/мл. 24 СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ MII – стадия метафазы второго деления мейоза ТПБ – трубно-перитонеальное бесплодие ТВП - трансвагинальная пункция яичников ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Бурлев В.А., Кузьмичев Л.Н., Щетинина Н.С., Ильясова Н.А., Онищенко А.С. Состояние молекулярного имплантационного окна: роль в исходах ЭКО (обзор литературы) // Пробл. репродукции. – 2009. – Том 6. – С. 24– 28. 2. Бурлев В.А., Кузьмичев Л.Н., Онищенко А.С., Ильясова Н.А., Щетинина Н.С. Функциональная активность эндометрия влияет на результаты ЭКО и перенос эмбрионов: молекулярные механизмы регуляции фертильности // Пробл. репродукции. – 2010. – Том 2. – С. 41– 52. 3. Щетинина Н.С., Кузьмичев Л.Н., Бурлев В.А., Ильясова Н.А., Онищенко А.С. Оценка эффективности программы ЭКО и ПЭ: день переноса эмбрионов в полость матки и показатели контролируемой индукции овуляции // Пробл. репродукции. – 2011. – Том 3. – С. 24– 28. 4. Бурлев В.А., Шорохова М.А., Кулакова Е.В., Ильясова Н.А., Щетинина Н.С. System-based changes of angiogenic growth factors in patients with external genital endometriosis against the combined treatment // 14 world congress gynесology and endocrynology – 2009. 5. Щетинина Н.С., Кузьмичев Л.Н., Глинкина Ж.И., Лебедева О.Е., Калинина Е.А. Селективный перенос одного эмбриона в полость матки решение вопроса снижения частоты многоплодной беременности в программе ВРТ: акушерские и морально-этические стороны // Российский форум «Мать и дитя»: Материалы форума.- Москва, 2010.