Nanog - Институт цитологии и генетики СО РАН
advertisement
На правах рукописи КРУГЛОВА АННА АЛЕКСАНДРОВНА ПРОЯВЛЕНИЕ РОДИТЕЛЬСКИХ ГЕНОМОВ В ГИБРИДНЫХ КЛЕТКАХ, ПОЛУЧЕННЫХ СЛИЯНИЕМ ДИПЛОИДНЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК С ДИ- И ТЕТРАПЛОИДНЫМИ ФИБРОБЛАСТАМИ 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2009 1 Работа выполнена в лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель: доктор биологических наук, Серов Олег Леонидович Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Кикнадзе Ия Ивановна кандидат биологических наук, Сукоян Марина Александровна Ведущее учреждение: Институт биологии гена РАН, г. Москва Защита диссертации состоится «___»_________ 2009 года на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева 10, тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан «___» _________ 200 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев 2 ВВЕДЕНИЕ Актуальность. Изучение природы такого свойства генома эмбриональных клеток, как плюрипотентность, является одной из важнейших задач современной биологии развития. Остаются не выясненными механизмы контроля над поддержанием или утратой плюрипотентности в ходе эмбрионального развития. Кроме этого, мало изучены масштабы изменения генома плюрипотентной клетки при дифференцировке и возможность обратимости данных изменений. К настоящему времени разработано несколько экспериментальных подходов к репрограммированию дифференцированного генома до плюрипотентного уровня. Например, с помощью переноса ядер соматических клеток в энуклеированный ооцит или оплодотворенную яйцеклетку (Di Berardino, 1997; Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998), или путем слияния эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) c соматическими клетками взрослого животного (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001; Serov et al., 2001; Ambrosi, Rasmussen, 2005). Такие гибридные клетки обладают всеми свойствами эмбриональных стволовых клеток, не зависимо от того, какие соматические клетки участвовали в слиянии (Tada et al., 2001; 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002; Cowan et al., 2005; Vasilkova et al., 2007). Высокий потенциал гибридных клеток типа ЭСК-соматическая клетка подразумевает доминирование плюрипотентности – ключевого свойства ЭСК. В основе доминирования лежит репрограммирование генома соматического партнера. Свидетельства репрограммирования аллелей соматического партнера для целого ряда генов были найдены в гибридах, полученных от слияния ЭСК Mus musculus domesticus и тимоцитов M. musculus molossinus (Tada et al., 2001; 2003;). Прямые доказательства масштабного репрограммирования генома соматического партнера (фибробласта) и связанного с этим изменения профиля экспрессирующихся генов (свыше 99%) по типу ЭСК были получены с помощью микрочиповой технологии при анализе гибридов от слияния ЭСК человека с фибробластами (Cowan et al., 2005). Сохранение стабильного кариотипа при длительном культивировании ЭСК и их плюрипотентный потенциал делает модель гибридных клеток, полученных при участии ЭСК и соматических клеток, привлекательной для изучения репрограммирования и свойств полученных гибридных клеток. Причины доминирования свойств ЭСК на данный момент не выяснены, поэтому крайне важно установить факторы, влияющие на доминирование плюрипотентности в гибридных клетках. Следует отметить, что для изучения молекулярных механизмов поддержания плюрипотентности в гибридном геноме, и репрограммирования генома соматического партнера, необходимо знать хромосомный состав гибридных клеток. Однако данные о хромосомном составе гибридных клеток носят противоречивый характер. Согласно данным одних авторов (Tada et al., 2001; 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002), гибридные клетки мыши типа ЭСК-дифференцированные клетки сохраняют тетраплоидный набор хромосом, появившийся в результате слияния двух диплоидных клеток, то есть признаки сегрегации хромосом отсутствуют. По данным других авторов, полученным при цитогенетическом анализе гибридных клеток типа ЭСК-спленоциты, имеет место отчетливая 3 преимущественная элиминация хромосом спленоцитов (Matveeva et al., 1998; Матвеева и др., 2001; Серов и др., 2003; Пристяжнюк и др., 2005). В связи с этим, актуальность полноценного анализа хромосомного состава гибридных клеток, который позволит избежать ошибок в интерпретации масштабов репрограммирования, трудно переоценить. Одним из наиболее адекватных способов оценки потенциала плюрипотентных клеток является получение химерных животных при введении клеток в полость бластоцисты. Однако на данный момент имеется очень мало сведений о получении химерных животных, полученных при введении околотетраплоидных плюрипотентных клеток (Tada et al., 2001; Ying et al., 2002; Pells et al., 2002). Кроме этого, в данных работах нет доказательств сохранения исходного около-тетраплоидного кариотипа клеток при развитии химерного животного. Таким образом, в данной работе впервые проведен анализ хромосомного состава потомков около-тетраплоидных гибридных клеток, давших вклад в органы и ткани химерного животного, что позволит однозначно ответить на вопрос, связан ли плюрипотентный потенциал вводимых гибридных клеток с репрограммированием хромосом дифференцированной родительской клетки или с их потерей. Цели и задачи исследования. При выполнении работы преследовалась следующая цель: исследовать влияние плоидности соматического партнера на морфологию и свойства гибридных клеток, полученных при слиянии эмбриональных стволовых клеток мыши с ди- и тетраплоидными фибробластами. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Получить гибридные клетки между ЭСК Mus musculus линии 129/Ola и диплоидными фибробластами Mus musculus линии DD/c; 2. Получить гибридные клетки между ЭСК M. musculus линии 129/Ola и тетраплоидными фибробластами M. musculus линии DD/c; 3. Сравнить уровень экспрессии генов Oct4 и Nanog (экспрессия которых типична для ЭСК), коллагена I-го типа и фибронектина (экспрессия которых типична для фибробластов) в полученных клонах гибридных клеток методом ПЦР в реальном времени; 4. Провести анализ хромосомного состава гибридных клеток типа ЭСКдиплоидные фибробласты и ЭСК-тетраплоидные фибробласты цитогенетическими методами, а также используя микросателлитные маркеры для идентификации родительских хромосом; 5. Исследовать хромосомный состав потомков гибридных клеток с околотетраплоидным набором хромосом, полученных слиянием ЭСК и диплоидных фибробластов, давших вклад в органы и ткани химерных животных. 4 Научная новизна и практическая значимость. 1. Впервые показано доминирование фенотипа соматического партнера в гибридных клетках, полученных при слиянии ЭСК и тетраплоидных фибробластов. 2. Впервые показано сохранение исходного кариотипа у потомков гибридных клеток с около-тетраплоидным набором хромосом в химерных животных при in vivo оценке их плюрипотентных свойств. Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на II конгрессе общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), IV International Meeting Stem Cell Network North Rhine-Westphalia (Дюссельдорф, 2007), 3rd International Conference Basic Science for Medicine (Новосибирск, 2007), LXXIII Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology (Колд Спринг Харбор, 2008). Материалы диссертации изложены в трех статьях, опубликованных в отечественных и международном журналах. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, списка литературы и 3-х приложений. Работа изложена на 102-х страницах, иллюстрирована 12-ю рисунками и содержит 8 таблиц МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В работе использованы культуры клеток: - линию ЭСК E14Tg2aSc4TP6.3 из линии мышей 129/Ola (“зеленый белок”, ГФРТ-, устойчива к пуромицину. Линия была любезно предоставлена доктором Остином Смитом (University of Edinburgh); - первичные культуры эмбриональных фибробластов (линия мышей DD/c M. musculus); первичные культуры фибробластов из взрослой мыши (линия мышей DD/c M. musculus); линия тетраплоидных эмбриональных фибробластов (линия мышей DD/c M. musculus); - четыре независимых клона гибридных клеток, полученных при слиянии ЭСК линии E14Tg2aSc4TP6.3 и эмбриональных фибробластов мышей линии DD/c M. musculus: tef3, tef4, tef6, tef9; - одиннадцать независимых клонов гибридных клеток, полученных при слиянии ЭСК линии E14Tg2aSc4TP6.3 и фибробластов, выделенных из взрослой мыши линии DD/c M. musculus: taf2, taf4, taf5, taf8, taf10, taf15, taf16, taf20, taf22, taf23, taf31; - одиннадцать независимых клонов гибридных клеток, полученных при слиянии ЭСК линии E14Tg2aSc4TP6.3 и тетраплоидных фибробластов мышей линии DD/c M. musculus: tef-t1, tef-t3, tef-t4, tef-t7, tef-t8, tef-t9, tef-t10, tef-t12, teft18, tef-t22, tef-t27; - пять культур первичных эмбриональных фибробластов из пяти химерных эмбрионов, полученных при инъецировании гибридных клеток клона taf5 в бластоцисты мышей C57BL/6J; - культуры первичных фибробластов из кожи двух взрослых химерных мышей, полученных при инъецировании гибридных клеток клона tef4 и taf2 в бластоцисты мышей C57BL/6J: 5 Культивирование эмбриональных стволовых и гибридных клеток, проводили по методу, описанному ранее (Matveeva et al., 1998; 2005). Условия культивирования фибробластов, слияния клеток описаны в работе Кругловой с соавторами (Круглова и др., 2008). Активность щелочной фосфатазы выявляли стандартным способом (Vasilkova et al., 2007). Для иммунофлуоресцентного анализа экспрессии генов Nanog, Oct4, коллагена I-го типа (Col-1) и фибронектина (Fbn), клетки фиксировали и окрашивали по методике, описанной ранее (Kruglova et al., 2008). Использовали следующие разведения антител (Abcam, Великобритания): против NANOG (1:200); OCT4 (1:500); COL-1 (1:1000); FBN (1:500); фаллоидин, конъюгированный с флуорохромом Alexa Fluor 546 – 1:100; антитела, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 546 (goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 546; Molecular Probes, США) – 1:300. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope-2 (Carl Zeiss, Germany) и программного обеспечения WinView software (Rooper Scientific Photometrix). Количественный анализ экспрессии генов Oct4, Nanog, Col-1 и Fbn проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Суммарную РНК из клеточных линий и клонов гибридных клеток выделяли с помощью Trizol Reagent (Invitrogene, США) согласно рекомендациям производителя. Для синтеза кДНК использовали набор реактивов ImProm II Reverse Transcription System (Promega, США) по методу производителя. Концентрацию полученной кДНК доводили до 100 нг/мкл. Для проведения ПЦР-РВ в объеме 50 мкл использовали: 1х реакционную смесь (KCl, Tris-HCl (pH 8.8), 7.5 мM MgCl2, дезоксинуклеотидтрифосфаты, глицерин, Tween 20, Taq ДНК-полимеразу и пассивный референсный краситель ROX) (Синтол, Россия), 900 нМ прямого и обратного праймеров, 250 нМ зонда, меченого по 5’-концу флуорохромом (карбоксифлуоресцеин, FAM) и несущего на 3’-конце поглотитель флуоресценции BHQ (Black Hole Quancher), 20 нг кДНК и воду. В качестве эндогенного контроля использовали набор праймеров и зонд для анализа уровня экспрессии гена 18s рРНК (TagMan Endogenous Controls; Applied Biosystems, США). Для каждого образца реакция была проведена 3 раза. Готовую реакционную смесь по 50 мкл наносили на 96-луночное плато (ABI PRISM 96-Well Optical Reaction Plate With Barcode; Applied Biosystems, США), лунки закрывали оптически прозрачными крышками (ABI PRISM Optical Caps, 8 caps/strip; Applied Biosystems, США) и помещали в амплификатор (ABI Prism 7000 Sequence Detection System; Applied Biosystems, США). Условия проведения реакции: 10 мин 95ºС, затем - 40 циклов 95ºС – 15 с. и Тотж.ºС (Табл. 1) – 60 с. Результаты ПЦР реакции анализировали с помощью программного обеспечения ABI Prism 7000 v1.1 SDS сравнительным методом (2-ΔΔСt) относительного количественного анализа. Выделение ДНК проводили с помощью DNAzol согласно рекомендациям производителя (Life Technology, США). Для дискриминации хромосом линия мышей 129/Ola M. musculus и линия мышей DD/c M. musculus в гибридных 6 клетках использовали метод ПЦР-анализа аллельных вариантов микросателлитов (Круглова и др., 2008). Препараты метафазных хромосом готовили по стандартному протоколу, следуя методу, описанному Фантес с соавторами (Fantes et al., 1995) в модификации (Nesterova et al., 1998) и окрашивали DAPI. Для идентификации хромосомных перестроек использовали метод гибридизации in situ с дигоксигенин- или ФИТЦ- мечеными зондами, специфичными для хромосом Х, 4, 6 и 17. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope-2 (Carl Zeiss, Germany), пакета прикладных программ ISIS3 (In Situ Imaging System) компании MetaSystems GmbH. Таблица 1. Последовательность нуклеотидов праймеров и зондов, использованных при проведении ПЦР-РВ Название гена Последовательность 5’-3’ Тотж. Oct4 Прямой праймер CCACCATCTGTCGCTTCGA Обратный праймер GGCCGCAGCTTACACATGTT 56ºC TagMan зонд FAM-TGCAGCTCAGCCTTA-BHQ Nanog Прямой праймер GCAGCTATCCCCAGGGCTAT Обратный праймер CTGCCCCACATGGAAAGG 56ºC TagMan зонд FAM-TGGTGAATGCATCTGG-BHQ Col-1 Прямой праймер GCACGAGTCACACCGGAACT Обратный праймер CCAAGGGAGCCACATCGAT 58ºC TagMan зонд FAM-CACCAAGACCTCCCGCCTGCC-BHQ Fbn Прямой праймер TGGAATCCGGGAGCTTTTC Обратный праймер TGCAAGGCAACCACACTGA 58ºC TagMan зонд FAM-AGCTGCAGGGCCTCAGGCCG-BHQ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение гибридных клеток между ЭСК и диплоидными фибробластами Было проведено два независимых эксперимента по слиянию ЭСК с эмбриональными фибробластами и с фибробластами, полученными из взрослых животных (“взрослыми” фибробластами). На 8-10 день после слияния клеток мы наблюдали появление 19-ти ГАТ- и пуромицин-резистентных колоний клеток в экспериментах по слиянию ЭСК с эмбриональными фибробластами и 31-й колонии в опытах по слиянию ЭСК со “взрослыми” фибробластами. Все 50 колоний были морфологически сходными с колониями ЭСК. На 15-18 день после слияния для дальнейшего культивирования были пересажены 19 колоний гибридных клеток типа ЭСК-эмбриональные фибробласты (серия tef) и 24 колонии типа ЭСК-“взрослые” фибробласты (серия taf). В процессе культивирования многие первичные клоны гибридных клеток спонтанно дифференцировались, в результате чего удалось получить 4 стабильные клеточные линии из 19 клонов серии tef и 11 линий из 31 первичного клона серии taf. Гибридные клетки всех клонов, полученных от слияния диплоидных эмбриональных или “взрослых” фибробластов с ЭСК, имели фенотип, типичный для ЭСК: формировали компактные колонии с четкими границами, состоящие из небольших по размеру округлых клеток с малым объемом цитоплазмы (рис. 1А, 7 Г). Важно отметить, что во всех полученных клонах гибридных клетках серий tef и taf был обнаружен зеленый белок – маркер родительской линии ЭСК (рис. 1Б, Д). Рис. 1. Морфология ЭСК, фибробластов и гибридных клеток типа ЭСКдиплоидные фибробласты. Культура ЭСК, линия E14Tg2aSc4TP6.3 (А) (фазовый контраст), иммунофлуоресцентное свечение зеленого белка и ядер, окрашенных DAPI в родительской линии ЭСК (Б); иммунофлуоресцентное выявление цитоскелета ЭСК с помощью фаллоидина, меченного флуорохромом Alexa Fluor 546 и ядер, окрашенных DAPI (В); культура гибридных клеток типа ЭСКдиплоидные фибробласты, клон tef4 (Г) (фазовый контраст), иммунофлуоресцентное свечение зеленого белка и ядер, окрашенных DAPI в гибридных клетках клона tef4 (Д), иммунофлуоресцентное выявление цитоскелета клеток клона tef4 с помощью фаллоидина, меченного флуорохромом Alexa Fluor 546 и ядер, окрашенных DAPI (Е); иммунофлуоресцентное выявление цитоскелета фибробластов с помощью фаллоидина, меченного флуорохромом Alexa Fluor 546 и ядер, окрашенных DAPI (Ж); Хромосомный состав гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты В гибридных клетках часто наблюдается потеря хромосом (сегрегация) одного из партнеров по слиянию. Потенциально потеря хромосом одного из родителей может быть причиной преимущественного проявления в гибридной клетке свойств того родительского генома, который сохраняет полный набор хромосом. После слияния двух диплоидных клеток (2n=40) ожидается, что кариотип гибридной клетки будет представлять собой сумму двух родительских наборов хромосом. В случае потери родительских хромосом следует ожидать отклонение от ожидаемого числа хромосом (80-ти). Подсчет хромосом в 15-ти клонах гибридных клеток серий tef и taf показал, что в 9-ти из них клетки содержали 80 и менее хромосом (рис. 2А, Б), а в шести клонах (tef6, taf4, taf15, taf16, taf20, taf23) клетки имели около-гексаплоидный набор хромосом (рис. 2В, Г). Среди 9-ти около-тетраплиодных клонов первой категории в 5-ти клонах 42-85% клеток содержали 76 - 80 хромосом, а в 4-х клонах многие клетки содержали 70 – 76 хромосом. Гибридные клетки с около-гексаплоидным набором хромосом, предположительно, возникли в результате слияния двух ЭСК с одним фибробластом или, наоборот, одной ЭСК с двумя фибробластами. Возможность слияния двух ЭСК с одним фибробластом может объясняться 8 высокой склонностью ЭСК в суспензии образовывать ассоциации из двух и более клеток из-за своих высоких адгезивных свойств. А Б N=55 N=53 40 35 30 25 20 15 10 5 0 40 35 30 25 20 15 10 5 0 60 70 80 90 100 110 60 120 В 70 80 90 100 110 120 Г N=53 N=55 14 12 10 8 6 4 2 0 20 15 10 5 0 60 70 80 90 100 110 120 60 70 80 90 100 110 120 Рис. 2. Числа хромосом в гибридных клетках серий tef и taf: tef4 (А), taf2 (Б); tef6 (В), taf15 (Г). По оси абсцисс показано число хромосом, по оси ординат – процент клеток, содержащих данное число хромосом, N – число анализированных метафазных пластинок. Таким образом, большинство клеток клонов серий tef и taf содержит около-тетраплоидный или около-гексаплоидный набор хромосом, что говорит об отсутствии заметной сегрегации хромосом в клетках. Методы цитогенетического анализа не позволяют идентифицировать родительскую принадлежность хромосом в полученных гибридных клетках, поскольку родительские клетки происходили из мыши линий DD/c (донор фибробластов) и 129/Ola (донор ЭСК), принадлежащих к одному виду M. musculus. В связи с этим, для дискриминации родительских хромосом в гибридных клетках использовали ПЦР-анализ длин молекулярных маркеров – микросателлитов. Для проведения ПЦР анализа гибридных клеток серий tef и taf была подобрана группа микросателлитов, надежно дискриминирующих гомологичные хромосомы линий мышей 129 и DD, за исключением хромосом 11 и Х. Вывод о наличии той или иной родительской хромосомы в гибридных клетках был основан на присутствии или отсутствии микросателлита, специфичного для того или иного гомолога. Результаты микросателлитного анализа показали, что в гибридных клетках всех клонов серий tef и taf 9 присутствуют микросателлиты, маркирующие все родительские хромосомы, за исключением микросателлита D14Mit38 хромосомы 14 соматического партнера в клонах tef3 и taf4. При цитогенетическом анализе не было обнаружено видимых хромосомных перестроек ни в одном из полученных клонов гибридных клеток. Для более надежной идентификации хромосомных перестроек в клонах, мы провели эксперименты по гибридизации in situ с использованием меченых дигоксигенин- или ФИТЦ- зондов, специфичных для хромосом Х, 4, 6 и 17. Хромосомных фрагментов анализированных хромосом ни в одном исследованном клоне гибридных клеток обнаружено не было. Характеристика гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты Гибридные клетки серий taf и tef имеют выраженное морфологическое сходство с ЭСК. Это сходство проявляется также в организации f-актинового цитоскелета (рис. 1В, Е, Ж). Высокая активность фермента щелочной фосфатазы (ЩФ) является наиболее характерной особенностью недифференцированных плюрипотентных клеток. Процент позитивных по активности фермента колоний в клонах гибридных клеток, в среднем, составил 70-90%. Важнейшей характеристикой ЭСК является их плюрипотентность, поддерживаемая активностью двух ключевых генов: Oct4 и Nanog. Экспрессия этих генов в гибридных клетках серий taf и tef была исследована двумя способами – иммунофлуоресцетным анализом белковых продуктов в клетках и количественной оценкой экспрессии с использованием метода ПЦР-РВ. Oct4 (RQ) Nanog (RQ) 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 tef3 tef4 tef6 tef9 taf2 taf4 taf5 taf8 taf10 taf15 taf16 taf20 taf22 taf23 taf31 ESC Рис. 3. Количественная оценка экспрессии генов Oct4 и Nanog в клонах гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты с помощью метода ПЦРРВ. По оси абсцисс указаны названия клонов гибридных клеток, по оси ординат – уровень экспрессии анализированных генов в клонах по отношению к уровню экспрессии в родительской линии ЭСК (ESC) (Relative Quantification RQ). 10 По результатам иммунофлуоресцентного анализа, в полученных гибридных клетках присутствуют белковые продукты генов Oct4 и Nanog. Во всех клонах гибридных клеток, полученных при слиянии ЭСК и диплоидных фибробластов, обнаружена экспрессия генов Oct4 и Nanog. Уровень экспрессии Oct4 во всех клонах гибридных клеток сопоставим с уровнем экспрессии в ЭСК (рис. 3). Суммируя приведенные выше данные, можно сделать вывод о том, что все проанализированные гибридные клетки серий taf и tef имеют характеристики, по многим параметрам сходные с ЭСК, но значительно отличаются по своим фенотипическим свойствам от эмбриональных и “взрослых” фибробластов. Анализ хромосомного состава клеточных культур, полученных из тканей химерных эмбрионов или взрослых химер Наиболее полным и адекватным методом in vivo оценки потенциала ЭСК является их введение в бластоцисту и получение химерных животных, с последующим анализом вклада исследованных клеток в органы и ткани животного. Наличие в гибридных клетках серий taf и tef цитоплазматического маркера, зеленого белка, значительно упрощает анализ вклада гибридных клеток в ткани химер. Однако при использовании теста на химеризм для оценки уровня плюрипотентности гибридных клеток возникает вопрос: сохраняется ли исходный кариотип тестируемых гибридных клеток в ходе развития химерных животных? Можно предположить, что вклад гибридных клеток в ткани химерного животного является результатом потери хромосом соматического партнера из генома гибридных клеток после их инъекций в реципиентную бластоцисту. Работы по получению химерных животных были проведены сотрудниками лаборатории генетики развития ИЦиГ СО РАН: Кизиловой Еленой Александровной, Железовой Антониной Ивановной и Голубицей Алевтиной Николаевной. Для экспериментов по микроинъекциям было отобрано пять клонов гибридных клеток: tef4, tef9, taf2, taf5, taf31, содержащих 76-80 хромосом в 85%, 70%, 80%, 82% и 46% клеток соответственно. В этих экспериментах были взяты в анализ 21 взрослое химерное животное и 5 химерных эмбрионов (на 11-й день внутриутробного развития). В задачу эксперимента входило: 1) получение клеточных культур из химерных эмбрионов и взрослых химер; 2) проведение цитогенетического анализа полученных клеточных культур; 3) проведение анализа микросателлитов, маркирующих хромосомы мышей линий: 129 (донор ЭСК), DD (донор фибробластов) и С57BL (донор реципиентных бластоцист) в клетках полученных культур; 4) анализ микросателлитов, маркирующих родительские хромосомы гибридных клеток, в популяции “зеленых” клеток (потомков гибридных клеток), отсортированных из селезенки химерного животного. Было исследовано два взрослых химерных животных, полученных после введения клеток клона tef4 в бластоцисты, одно животное, полученное после введения клеток клона taf2, и пять 11-дневных эмбрионов, полученных при введении клеток клона taf5. Таким образом, мы исследовали хромосомный состав клеточных потомков 3-х тестированных плюрипотентных клонов гибридных клеток, способных давать развитие химерам. В качестве источника материала для получения препаратов метафазных хромосом, а также проведения 11 ПЦР анализа использовали культуры клеток, полученных из кожи взрослых животных или целых эмбрионов. Для некоторых химер (tef4#7-38) было возможно получение клеточного материала из селезенки, а анализ клеточной суспензии проводился после сортировки клеток по наличию зеленого белка на проточном цитофлуориметре. Процент клеток, позитивных по зеленому белку, составил 5.6% от общего числа клеток. Однако, применение данного метода оказалось ограниченным из-за очень малого вклада гибридных клеток в селезенку других химерных животных, менее 2% позитивных по “зеленому белку” клеток (химера taf2#7-35). Для проведения ПЦР анализа хромосомного состава клеточных культур, полученных из тканей химерных животных, была подобрана группа микросателлитов, достоверно маркирующих три генома: два генома, присутствующих в вводимой в бластоцисту гибридной клетке–линии DD/c и 129/Ola, и геном реципиентной бластоцисты – линия мышей C57Bl. Из-за отсутствия значительного полиморфизма длин ПЦР продуктов хромосомоспецифичных микросателлитов не удалось маркировать хромосомы 8, 11, 14, 19, Х. По результатам анализа, в селезенке химерного животного (tef4#7-38), полученного при введении в реципиентную бластоцисту клеток клона tef4, присутствуют ПЦР продукты всех хромосомо-специфичных микросателлитов обоих родительских линий, кроме ПЦР продукта 18-й хромосомы 129/Ola. Подсчет хромосом в культуре клеток, полученных из кожи данного животного (не менее 50% клеток, позитивных по зеленому белку), показал наличие 72-76 хромосом в 59% клеток (рис. 4А). А Б tef4#7-38, N=12 taf5#6, N=45 30 30 25 25 20 20 15 15 10 10 5 5 0 0 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 Рис. 4. Распределение хромосом в культурах клеток, полученных из химерных животных tef4#7-38 (А), taf5#6 (Б). По оси абсцисс отложено число хромосом, по оси ординат – процент клеток, содержащих данное число хромосом, N-число анализированных метафазных пластинок В клетках культур (не менее 50% клеток, позитивных по зеленому белку) из кожи взрослого химерного животного (taf2#7-35), полученного при введении в бластоцисту гибридных клеток клона taf2, так же присутствуют микросателлитные маркеры всех хромосом обоих родительских линий. Кроме этого, источником для клеточных культур были пять 11-дневных химерных эмбрионов (50-70% клеток культуры, позитивных по зеленому белку), полученных при введении в бластоцисту клеток гибридного клона taf5. По 12 результатам анализа хромосомного состава культур клеток, выявлены маркеры практически всех хромосом обеих родительских клеток, участвовавших в слиянии – линии DD/c и 129/Ola. Исключение составляют: в химере #1 – хромосома 18 (129/Ola), в химере #3 – хромосомы 4 и 12 (DD/c), в химере #5 – хромосома 18 (129/Ola) и в химере #6 – хромосома 12 (DD/c) и хромосома 18 (129/Ola) (Таблица 2). Подсчет хромосом в клетках культур эмбриональных фибробластов показал, что около 50% клеток содержит 74-78 хромосом (рис. 3Б). Таблица 2. Распределение хромосомо-специфичных микросателлитов в культурах клеток, полученных из эмбрионов или взрослых химерных животных Взрослые химерные животные и химерные эмбрионы, доноры клеточных культур Маркер tef4#7-38 taf2#7-35 taf5#1 taf5#3 taf5#4 taf5#5 taf5#6 129 DD 129 DD 129 DD 129 DD 129 DD 129 DD 129 DD D11Mit2002 + + + + + + + + + + + + + + D2Mit9 + + + + + + + + + + + + + + D3Mit257 + + + + + + + + + + + + + + D4Mit11 + + + + + + + - + + + + + + D5Mit346 + + + + + + + + + + + + + + D6Mit201 + + + + + + + + + + + + + + D7Mit309 + + + + + + + + + + + + + + D9Mit181 + + + + + + + + + + + + + + D10Mit109 + + + + + + + + + + + + + + D12Mit270 + + + + + + + - + + + + + - D13Mit78 + + + + + + + + + + + + + + D15Mit14 + + + + + + + + + + + + + + D16Mit4 + + + + + + + + + + + + + + D17Mit66 + + + + + + + + + + + + + + D18Mit36 - + + + - + + + + + - + - + 1 – номер хромосомы, на которой локализован микросателлит; 2 – индивидуальный номер микросателлита; 129 – линия мышей 129/Ola (источник ЭСК); DD – линия мышей DD/c (источник фибробластов); tef4, taf2, taf5 – гибридные клоны, из клеток которых получены химерные животные; #7-35, #7-38, #1, #3, #4, #5, #6 – индивидуальные номера химерных животных; (+) – присутствие хромосомо-специфичного микросателлита; (-) – отсутствие хромосомо-специфичного микросателлита; 13 Таким образом, полученные около-тетраплоидные гибридные клетки обладают свойствами ЭСК, включая способность давать вклад в ткани химерных животных, сохраняя при этом хромосомный состав, сходный с кариотипом тестированных гибридных клеток. Фенотип гибридных клеток типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты При слиянии тетраплоидных фибробластов с диплоидными ЭСК было получено 11 клонов гибридных клеток. Все гибридные клетки данного типа имели фенотип, типичный для фибробластов (рис. 5А, Г). Полученные гибридные клетки, в отличие от ЭСК, растущих компактными колониями, не образовывали подобных клеточных островков. Рис. 5. Морфология клеток линии тетраплоидных фибробластов и гибридных клеток типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты. Культура растущих тетраплоидных фибробластов (А) (фазовый контраст), отсутствие флуоресцентного свечения зеленого белка в линии тетраплоидных фибробластов (Б), иммунофлуоресцентное выявление цитоскелета тетраплоидных фибробластов с помощью фаллоидина, меченного флуорохромом FITS и ядер, окрашенных DAPI (В); Культура растущих гибридных клеток типа ЭСКтетраплоидные фибробласты, клон tef-t8 (Г) (фазовый контраст), флуоресцентное свечение зеленого белка в цитоплазме гибридных клеток tef-t8 (Д), иммунофлуоресцентное выявление цитоскелета клеток клона tef-t8 с помощью фаллоидина, меченого флуорохромом Alexa Fluor 546 и ядер, окрашенных DAPI (Е). Во всех клетках наблюдали флуоресцентное свечение зеленого белка (рис. 5Б, Д) и отсутствие активности фермента ЩФ. Кроме этого, стоит отметить схожую организацию f-актинового цитоскелета у гибридных клеток типа ЭСКтетраплоидные фибробласты и фибробластов (рис. 4В, Е). Как в исходных фибробластах, так и в гибридных клетках этого типа, каждая отдельная клетка обладает хорошо организованным каркасом, состоящим из пучков ориентированных нитей f-актина (рис. 4В, Е). Таким образом, гибридные клетки, полученные при слиянии ЭСК с тетраплоидными фибробластами, имели морфологию фибробласта. 14 Хромосомный состав клонов типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты При слиянии диплоидных ЭСК (40 хромосом) с тетраплоидными фибробластами (80 хромосом), ожидаемое количество хромосом в гибридной клетке – 120. Подсчет числа хромосом показал присутствие от 105 до 120 хромосом во всех клонах гибридных клеток, причем доля таких клеток в большинстве гибридных клонов составила от 72% до 94% (рис. 6). Цитогенетический анализ не выявил видимых хромосомных перестроек ни в одном из полученных клонов. ПЦР анализ полиморфных микросателлитов, маркирующих родительские хромосомы, показал присутствие маркеров всех хромосом обоих партнеров во всех гибридных клонах серии tef-t, за исключением хромосомы 18 плюрипотентного партнера в клоне tef-t4. А Б N=50 N=50 35 30 25 20 15 10 5 0 30 25 20 15 10 5 0 70 80 90 100 110 120 130 70 80 90 100 110 120 130 Рис. 6. Распределение чисел хромосом в клонах гибридных клеток tef-t1 (А) и tef-t10 (Б). По оси абсцисс отложено число хромосом, по оси ординат – процент клеток, содержащих данное число хромосом, N – число анализированных метафазных пластинок Анализ экспрессии маркерных генов ЭСК и фибробластов в гибридных клетках типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты Во всех клонах гибридных клеток, полученных при слиянии ЭСК и тетраплоидных фибробластов, обнаружена экспрессия генов коллагена и фибронектина (рис. 7), при этом экспрессия генов Oct4 и Nanog не обнаружена ни в одном из полученных клонов гибридных клеток. В заключении хотелось бы отметить, что гибридные клетки типа ЭСКдиплоидные фибробласты не только имеют схожую с ЭСК морфологию, но обладают и другими свойствами, характерными для плюрипотентных клеток: высоким уровнем активности ЩФ, экспрессией транскрипционных факторов Oct4 и Nanog, способность давать вклад в органы и ткани химерных животных. Гибридные клетки типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты имеют морфологию и свойства, типичные для линии родительских фибробластов, и экспрессируют гены-маркеры фибробластов – коллаген I-го типа и фибронектин. Кроме этого, хотелось бы отметить, что клоны гибридных клеток обладают свойствами, типичными для исходной линии тетраплоидных фибробластов или ЭСК на фоне присутствия всех хромосом соответственно плюрипотентного или соматического партнеров. Уровни экспрессии генов-маркеров в большинстве 15 клонов гибридных клеток сопоставимы или выше уровня экспрессии в родительских клетках. Межклональную вариабельность в экспрессии геновмаркеров можно объяснить как разным числом копий анализируемых генов, так и разным уровнем экспрессии генов в клетках клонов. Например, уровень экспрессии может различаться из-за разного уровня метилирования промоторов анализируемых генов. Изменение числа копий генов, и, как следствие, разный уровень экспрессии, может происходить при сегрегации хромосом, на которых гены-маркеры расположены. Fbn_1 Col_1 14 12 10 8 6 4 2 0 1 3 4 7 8 9 10 12 18 22 27 tDD Рис. 7. Экспрессия генов фибронектина (Fbn_1) и коллагена I–го типа (Col_1) в тетраплоидных фибробластах (tDD) и клонах гибридных клеток типа ЭСКтетраплоидные фибробласты с помощью метода ПЦР-РВ. На оси абсцисс обозначены номера клонов гибридных клеток серии tef-t и линия тетраплоидных фибробластов tDD, на оси ординат – уровень экспрессии анализированных генов в клонах по отношению к уровню экспрессии в родительской линии тетраплоидных фибробластов (Relative Quantification - RQ). В данной работе впервые показано доминирование фенотипа соматического партнера в гибридных клетках, полученных при слиянии ЭСК и соматических клеток. Решающим фактором, влияющим на альтернативное проявление свойств фибробласта или ЭСК в гибридных клетках, является плоидность соматического партнера, однако причины альтернативного доминирования на данный момент остаются неизвестными. Для выявления регуляторных механизмов, приводящих к альтернативному проявлению родительских геномов необходимо дальнейшее более детальное исследование генома полученных гибридных клеток. 16 ВЫВОДЫ 1. При слиянии диплоидных эмбриональных стволовых клеток мыши с диплоидными эмбриональными фибробластами получено 4 клона гибридных клеток, при слиянии диплоидных ЭСК с диплоидными фибробластами, полученными из взрослой мыши – 11 клонов гибридных клеток. Цитогенетический анализ и анализ микросателлитов, маркирующих родительские хромосомы, показали, что в большинстве клонов гибридных клеток сохраняются хромосомные наборы обеих линий родительских клеток. 2. Гибридные клетки, полученные при слиянии эмбриональных стволовых клеток мыши с диплоидными фибробластами, имели морфологию и свойства, типичные для эмбриональных стволовых клеток: высокую активность щелочной фосфатазы, сопоставимый с эмбриональными стволовыми клетками уровень экспрессии генов Oct4 и Nanog, и сходную с эмбриональными стволовыми клетками организацию f-актинового цитоскелета. 3. Впервые показано сохранение около-тетрапоидного кариотипа гибридных клеток, полученных при слиянии диплоидных эмбриональных стволовых клеток с диплоидными фибробластами, при тестировании их потенциала через получение химерных животных. 4. При слиянии тетраплоидных фибробластов с диплоидными эмбриональными стволовыми клетками было получено 11 независимых клонов гибридных клеток. Цитогенетический анализ показал, что все клоны содержали около-гексаплоидный набор хромосом и микросателлиты, маркирующие большинство хромосом обеих линий родительских клеток. 5. Все клоны гибридных клеток, полученных при слиянии тетраплоидных фибробластов с диплоидными эмбриональными стволовыми клетками, имели морфологию и свойства, типичные для фибробластов: сходную организацию f-актинового цитоскелета, отсутствие активности щелочной фосфатазы, высокий уровень экспрессии генов коллагена I-го типа и фибронектина и полное отсутствие экспрессии генов Oct4 и Nanog. 6. Впервые описано альтернативное проявление родительских геномов в гибридных клетках: доминирование генома ЭСК в клетках типа диплоидные ЭСК-диплоидные фибробласты и, наоборот, доминирование генома фибробласта в клетках типа диплоидные ЭСК-тетраплоидные фибробласты. Таким образом, альтернативное проявление родительских геномов в исследованных гибридных клетках определялось плоидностью соматического партнера. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Пристяжнюк И.Е., Темирова С.А., Мензоров А.Г., Круглова А.А., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Видимая и «скрытая» сегрегация родительских хромосом в эмбриональных стволовых гибридных клетках // Онтогенез. 2005. Т. 36, № 2. С. 151-158. 2. Круглова А.А., Гридина М.М., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Гибридные клетки, полученные слиянием эмбриональных стволовых клеток с ди- и 17 тетраплоидными фибробластами, имеют альтернативные родительские фенотипы // Докл. Акад. Наук. 2008. Т. 422. №1. С. 125-127. 3. Kruglova A.A., Kizilova E.A., Zhelezova A.I., Gridina M.M., Golubitsa A.N.,Serov O.L. Embryonic stem cell-fibroblast hybrid cells with near-tetraploid karyotype provide high yield of chimeras // Cell Tissue Res. 2008. DOI10.1007/s00441008-0702-9 4. Kruglova A.A., Gridina M.M., Matveeva N.M., Serov O.L. Phenotype and chromosome segregation in hybrid cells generated by fusion embryonic stem cells and tetraploid fibroblasts // IV International Meetings Stem Cells Network North RhineWestphalia. Düsseldorf. 8-9 October. Germany. J. Regenerative Medicine. Nov. 2007. Vol.2. No. 6. Р.S8. 5. Gridina M.M., Kruglova A.A., Matveeva N.M., Serov O.L. Alternative dominance of parental genomes in embryonic stem cell-fibroblast cell hybrids // Abstracts of papers presented at the LXXIII Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. Control and regulation of stem cell. 28 May- 2 June. Cold Spring Harbor, USA. P.71 6. Матвеева Н.М., Круглова А.А., Гридина М.М., Кизилова Е.А., Баттулин Н.Р., Пузаков М.В., Серов О.Л. Доминантность и рецессивность родительских геномов в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных эмбриональных стволовых клеток с ди- и тетраплоидными фибробластами // 3rd International Conference Basic Science for Medicine. Новосибирск. 2007. С. 66. 7. Круглова А.А., Гридина М.М., Мензоров А.Г., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Фенотип гибридных клеток, полученных при слиянии эмбриональных стволовых клеток и тетраплоидных фибробластов // Цитология. Тезисы докладов. Санкт-Петербург. 2007. Т. 49, № 9. С. 762. 8. Круглова А.А., Гридина М.М., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Влияние плоидности соматического партнера на фенотип гибридных клеток, полученных при слиянии с эмбриональными столовыми клетками. Тезисы международной научной конференции молодых ученых “Проблемы молекулярной и клеточной биологии”. Томск. 10-12 мая. 2007. С. 106-107. 9. Мензоров А.Г., Круглова А.А., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Сегрегация хромосом и митохондрий в межвидовых эмбриональных гибридных клетках мыши. Труды 3-го съезда ВОГиС. Москва. 6-12 июня 2004. Т. 2. С. 403. 10. Мензоров А.Г., Круглова А.А., Темирова С.А., Серов О.Л. Характеристика ядерного и митохондриального геномов во внутри- и межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках мыши // VI Международная конференция по молекулярной генетике соматических клеток. Звенигород. Москва. 2005. С. 99-100. 18
