Соснина Анна Евгеньевна

На правах рукописи
Соснина Анна Евгеньевна
РОЛЬ КЛЕТОК ФАГОЦИТАРНОГО РЯДА В ПАТОГЕНЕЗЕ
МИОМЫ МАТКИ
14.00.36. – аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2008
3
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский
научно-исследовательский институт материнства и детства имени
В.Н.Городкова
Федерального
агентства
по
высокотехнологичной
медицинской помощи»
Научный руководитель:
Заслуженный врач РФ,
доктор медицинских наук, профессор
Наталья Юрьевна Сотникова
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Марина Александровна Стенина
Российский государственный медицинский университет
доктор медицинских наук, профессор
Людмила Ивановна Краснопрошина
ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН
Ведущая организация:
ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени
В.И.Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской
помощи»
Защита диссертации состоится «15» декабря 2008 г. в 14.00 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО «Российский
государственный медицинский университет Федерального агентства по
здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 117997, Москва, ул.
Островитянова, д.1.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО РГМУ
Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.
Автореферат разослан «14» ноября 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат медицинских наук, доцент
3
Т.Е. Кузнецова
Актуальность темы исследования
Миома матки – доброкачественная гормонально-зависимая опухоль,
развивающаяся в миометрии в результате гипертрофии и пролиферации
элементов
мышечной и
соединительной ткани
[Вихляева Е.М., 1997;
Савицкий Г. А., Савицкий А. Г., 2000; Сидорова И.С., 2002]. Миома матки
традиционно
считается
наиболее
распространенным
гинекологическим
заболеванием, частота встречаемости которого среди женщин старше 35 лет
колеблется по данным разных авторов от 25% до 50% [Савицкий Г. А.,
Савицкий А. Г., 2000; Тихомиров А.Л., 2006; Sozen I., е.а., 2002; Flake G.P.,
е.а., 2003; Miura S., е.а., 2006]. Миома матки оказывает отрицательное влияние
на менструальную и репродуктивную функции, общее состояние здоровья
женщины [Flake G.P., е.а., 2003; Miura S., е.а., 2006].
Патогенез миомы матки до конца не установлен. Исследованиями
последних лет показано, что развитие миомы матки ассоциировано со
значительными иммунными нарушениями [Колганова И.А., 2006; Малышкина
А.И., 2006; Корниенко Е.Б., с соавт., 2007; Сотникова Н.Ю., 2008; Hrycek A.,
е.а., 2000]. Установлено, что развитие миомы матки и ее рост сопровождаются
выраженным повышением уровня ряда провоспалительных цитокинов и
факторов роста в ткани самой миомы [Sozen I., е.а., 2002; Dixon D., е.а., 2002;
Wolanska M., е.а., 2004]. Фагоциты являются основными продуцентами
провоспалительных цитокинов [Ковальчук Л.В. с соавт, 2001]. Однако нет
данных о том, в какой мере меняется продукция цитокинов фагоцитами при
миоме матки в зависимости от темпа и типа роста опухоли.
Известно, что фагоцитарные клетки играют важную роль в поддержании
клеточного гомеостаза и противоопухолевой защите, участвуя в регуляции
процессов
ангиогенеза,
регенерации,
дифференцировки
и
клеточной
пролиферации [Wu R., е.а., 2004; Gordon I.O., 2006; Van Ginderachter J.A.,
2008]. Имеющиеся работы свидетельствуют о значительных нарушениях
экспрессии различного рода рецепторов и цитокинового профиля фагоцитов
3
при опухолевом росте [Sica A., e.a., 2007; Van Ginderachter J.A., 2008; Allavena
P., e.a., 2008; Ono M., 2008; Marconi C., e.a., 2008]. Получены данные,
свидетельствующие о вовлечении toll-like рецепторов (TLR) в регуляцию
фагоцитарными клетками опухолевого роста [West J., e.a., 2007; Allhorn S.,
e.a., 2008]. Так, по литературным данным экспрессия TLR3 и TLR4 связана с
ростом аденокарциномы [Allhorn S., e.a., 2008]. Известно, что этот класс
рецепторов является мощным индуктором адаптивного иммунитета, проводит
сигнал в клетку, запуская цитокиновый каскад при взаимодействии со своими
специфическими лигандами [Симбирцев А.С., 2004; Ковальчук Л.В., с соавт.,
2005; Akira S., 2003]. Однако отсутствуют данные о взаимосвязи между
характером экспрессии TLRs, продукции цитокинов фагоцитарными клетками
и ростом миомы матки.
Таким образом, определение роли фагоцитов в механизмах развития
доброкачественного опухолевого роста у женщин с миомой матки является
актуальной задачей современной клинической иммунологии, так как позволит
уточнить
иммунные
механизмы,
участвующие
в
развитии
противоопухолевого ответа.
Цель исследования
На основании определения особенностей фенотипа и цитокинового
профиля фагоцитов на системном и локальном уровне у женщин с миомой
матки стабильно малых размеров и с быстрорастущей миомой матки,
уточнить роль клеток фагоцитарного ряда в иммунных механизмах,
определяющих темп и тип роста опухоли.
Задачи исследования
1. Установить закономерности изменения фенотипа клеток фагоцитарного
ряда на системном и локальном уровне при миоме матки в зависимости от
темпа и морфологического типа роста опухоли.
4
2. Определить особенности экспрессии сигнальных молекул TLR-2 и TLR-4
на поверхности клеток фагоцитарного ряда у женщин с миомой матки с
различным темпом и типом роста опухоли.
3. Выявить особенности синтеза и продукции синтеза цитокинов (IL-1β, IL12, INF, IL-8, IL-10) фагоцитами периферической крови и эндометрия у
женщин с миомой матки, в зависимости от темпа и типа роста опухоли.
4. Определить особенности содержания ряда цитокинов и уровень экспрессии
генов цитокинов в миоматозных узлах у женщин с быстрорастущей
миомой матки, в зависимости от типа роста опухоли.
5. На основании выявленных особенностей клеток фагоцитарного ряда
женщин с миомой матки разработать иммунологические критерии темпа
роста опухоли.
Научная новизна
Установлено, что миома матки вне зависимости от темпа роста опухоли
характеризуются повышенным содержанием IL-10+ моноцитов/макрофагов и
TLR4+ фагоцитов, как в периферической крови, так и в эндометрии и
сниженным уровнем моноцитов, экспрессирующих HLA-DR, CD11b и CD16
молекулы.
Показано, что быстрый рост миомы матки происходит на фоне
снижения уровня CD11b+ макрофагов в эндометрии, увеличении количества
фагоцитов
крови
и
эндометрия,
продуцирующих
внутриклеточно
провоспалительные цитокины, и повышенной экспрессии мРНК IL-8 в ткани
эндометрия.
Установлено, что нерастущая миома матки характеризуется высоким
уровнем CD16+ и низким - HLA-DR+ макрофагов в эндометрии, а также
снижением уровня IL-1β+ и IL-8+ фагоцитов как на системном, так и на
локальном уровне.
Показано, что отличительной чертой «истинного» типа роста миомы
матки за счет усиления пролиферации является высокое содержание CD105+
5
нейтрофилов в периферической крови, а «ложного» типа роста за счет отека –
низкое
содержание
CD105+
моноцитов,
а
также
высокий
уровень
эндометриальных INFγ+ и IL-12+ макрофагов, повышенное содержание IL-8 и
МСР-1 в экстрактах эндометрия при усиленной экспрессии мРНК IL-8 в
эндометрии.
Установлено, что в миоматозных узлах больших размеров отмечается
высокое содержание IL-1β и IL-8 и усиленная экспрессия мРНК IL-8 по
сравнению с неизмененным миометрием; при «истинном» типе роста миомы
матки характерно высокое содержание IL-1β, IL-8, MCP-1 в миоматозном узле
и высокий уровень экспрессии мРНК IL-8 в ткани опухоли, а при «ложном» –
низкое содержание IL-8 и м-РНК IL-8 в ткани миоматозного узла.
Выявлены
закономерности
изменения
содержания
моноцитов,
продуцирующих IL-8, в зависимости от темпа роста миомы матки, на
основании чего предложен новый прогностический критерий быстрого роста
миомы матки.
Практическая значимость
Установлены новые патогенетические механизмы развития миомы
матки, определяющие темп и тип ее роста.
Установлены новые иммунологические критерии, позволяющие оценить
темп и тип роста миомы матки.
Разработан новый способ прогнозирования быстрого темпа роста
опухоли, основанный на определении в периферической венозной крови
содержания IL8+ моноцитов (положительное решение о выдаче патента РФ от
15.05.2008 г.).
Реализация результатов работы
Результаты
диссертационной
работы
внедрены
в
практику
гинекологической клиники и консультативно-диагностической поликлиники
ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства
6
им.
В.Н.Городкова
Федерального
агентства
по
высокотехнологичной
медицинской помощи».
Апробация работы
Диссертация
прошла
апробацию
на
совместной
конференции
сотрудников ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н.
Городкова Росмедтехнологий» 23 июня 2008 года. Материалы диссертации
доложены и обсуждены на научно-практической конференции молодых ученых
«Неделя науки – 2006» (Иваново, 2006), на Х Всероссийской научной
конференции с международным участием «Дни иммунологии в СанктПетербурге» (Санкт-Петербург, 2006), на научно-практической конференции
молодых ученых «Неделя науки – 2007» в рамках областного фестиваля
«Молодая наука – развитию Ивановской области (Иваново, 2007), на 2-й
Российской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и
клинические аспекты» (Сочи, 2007), в областном конкурсе научных работ
среди молодых ученых в номинации «Естественные науки» (Иваново, 2007); на
ХI Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни
иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007); в научных
чтениях, посвященных памяти академика В.И. Кулакова (Москва, 2008), на
конференции
ФГУ
«Ивановский
научно-исследовательский
институт
материнства и детства имени В.Н. Городкова Росмедтехнологий» (Иваново,
2008), на Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008).
Основные положения, выносимые на защиту
Развитие доброкачественной опухоли в миометрии ассоциировано с
увеличением
периферического
и
эндометриального
пула
М2
моноцитов/макрофагов при нарушении экспрессии на поверхности фагоцитов
функциональных и сигнальных молекул. Быстрый рост миомы матки связан с
усилением
продукции
определяющим
цитокинов
фагоцитами
крови
и
эндометрия,
повышение содержания провоспалительных цитокинов в
7
ткани опухоли. Пролиферативный тип роста миомы матки определяется
высоким уровнем периферических нейтрофилов, экспрессирующих эндоглин,
и
высокой
локальной
продукцией
провоспалительных
цитокинов
в
миоматозных узлах.
Повышение количества IL8+ моноцитов в периферической крови
ассоциируется с быстрым ростом миомы матки.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 13 печатных работ
Структура и объем диссертации
Материалы диссертации изложены на 105 страницах, состоит из
введения, обзора литературы, методов исследования, 3 глав результатов
исследования,
обсуждения
результатов,
выводов
и
практических
рекомендаций. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 22 таблицами. Список
литературы включает 43 работы отечественных и 87 публикаций иностранных
авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на базе ФГУ «Ивановский НИИ материнства и
детства им. В.Н.Городкова Росмедтехнологий» (директор – Заслуженный
деятель науки РФ, д.м.н., проф. Л.В. Посисеева). Обследование больных
осуществлялось в 1 гинекологическом отделении (зав. отделением – к.м.н.
И.А.Колганова), исследования проводились в лаборатории клинической
иммунологии (зав. лабораторией – Заслуженный врач РФ, д.м.н., проф. Н.Ю.
Сотникова).
Всего было обследовано 110 женщин:
1. 25 женщин имели миому матки стабильно малых размеров (общие размеры
матки не превышали 9-недельного срока беременности и в течение
предшествующего года наблюдения не было отмечено роста опухоли) –
первая клиническая группа;
8
2. 50 женщин имели быстрорастущую миому (общие размеры матки 12
недель и более и темпом роста 4-5 недель беременности и более за год
наблюдения) – вторая клиническая группа;
3. 35 женщин, не имеющих гинекологической патологии на момент
обследования, обратившихся в клинику для введения внутриматочных
спиралей – контрольная группа.
В зависимости от типа опухолевого роста были сформированы 2
подгруппы:
1) 25 женщин с «истинным» типом роста опухоли (увеличение
размеров миомы матки происходило преимущественно за счет
усиления процессов клеточной пролиферации);
2) 21 женщина с «ложным» типом роста опухоли (увеличение размеров
миомы матки происходило преимущественно за счет отека
миоматозных узлов).
Материалом для исследования служили: периферическая венозная
кровь, биоптаты эндометрия, миометрия и миоматозных узлов.
Выделение
гранулоцитарных
обогащенный
клеток
из
популяций
мононуклеарных
периферической
крови
и
осуществляли
стандартным методом скоростного центрифугирования в двойном градиенте
плотности
фиколл-урографина
(d=1,078,
d=1,114)
(Upsala,
Sweden).
Мононуклеарные клетки из эндометрия выделяли безферментативным
механическим методом [Сhemyshov V.P., 1993].
Поверхностный
фенотип
и
цитокиновый
профиль
моноцитов,
нейтрофилов периферической крови и макрофагов эндометрия определяли с
помощью
моноклональных
антител
методом
двухцветной
проточной
цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickincon, USA) с
использованием программы «LYSYS II». При определении внутриклеточной
продукции
цитокинов
фагоцитами
9
предварительно
проводили
пермеабилизацию их клеточной мембраны с помощью набора FIX  PERM
(CALTAG Laboratories, USA).
Таблица 1.
Панель мАТ, использованных в исследовании
№
п/п
мАТ
Фирма-производитель
1.
анти-CD16
ООО «Сорбент», Москва
2.
анти-CD11b
ООО «Сорбент», Москва
3.
анти-HLA-DR
ООО «Сорбент», Москва
4.
анти-CD45
ООО «Сорбент», Москва
5.
анти-CD14
ООО «Сорбент», Москва
6.
анти-TLR2
CALTAG Laboratories, USA
7.
анти-TLR4
CALTAG Laboratories, USA
8.
анти-CD105
CALTAG Laboratories, USA
9.
CALTAG Laboratories, USA
aнти-IFN
10. aнти-IL-10
CALTAG Laboratories, USA
11. aнти-IL-12
CALTAG Laboratories, USA
12. aнти-IL-1
R&D, USA
13. aнти-IL-8
R&D, USA
14. Мышиные IgG1
Becton Dickinson, USA
15. Мышиные IgG2a
Becton Dickinson, USA
FITC – флюоресцеинизотоицианат
PE – фикоэритрин
Флюорохромная
метка
FITC
FITC
PE
FITC
PE
FITC
FITC
PE
FITC
PE
PE
PE
PE
FIFC
PE
В экстрактах эндометрия, миометрия, миоматозных узлов определяли
концентрацию провоспалительных цитокинов IL-1β, MCP-1, IL-8 методом
ИФА на микроплашетном ридере «Multiscan ЕХ» (Labsystetems, Finland).
Тканевые экстракты получали путем 3-х кратного замораживания и
размораживания измельченных образцов ткани в равном объеме фосфатного
буфера [Фримель Г., 1987]. Концентрацию цитокинов определяли с помощью
тест-систем, характеристика которых представлена в таблице 2.
Таблица 2.
Характеристика тест-систем для ИФА, использованных в работе
Исследуемый
Фирма-производитель
Чувствительность
показатель
системы
ООО «Цитокин», Россия
> 6,3 пг/мл
IL-1
IL-8
ООО «Цитокин», Россия
> 9,8 пг/мл
МСР-1
BioSource International, США
> 1,7 пг/мл
10
Для количественной оценки экспрессии мРНК в ткани эндометрия,
миометрия и миоматозных узлов использовали метод RT-PCR в режиме
реального времени. Процедуру выделения тотальной РНК из ткани
эндометрия
проводили
стандартным
гуанидин-тиоцианат-фенол-
хлороформным методом [Velden van V.H.J., е.а., 2003]. РНК переводили в
комплементарную
кДНК,
используя
коммерческий
набор
реагентов
Онкоскрин RT (OOO «Генотехнология», Гематологический научный центр
РАМН, лаборатория генной инженерии, Москва, Россия). Для оценки
экспрессии
в
ткани
эндометрия
мРНК
β2-микроглобулина
и
IL-8
использовались наборы праймеров, зондов и реагентов производства OOO
«Генотехнология».
ПЦР-амплификацию
в
режиме
реального
времени
проводили на амплификаторе с оптической насадкой iCycler iQ (BIO RAD,
USA). Для определения количества копий пар кДНК в исследуемых образцах
строили
калибровочную
кривую
для
2-микроглобулина
и
IL-8
с
использованием серии десятикратных разведений образцов контрольной
кДНК и рассчитывали нормализованного значения количества копий гена IL8. Полученные результаты представлены как нормализованное количество
копий в образце х 104 на мкл.
Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего
арифметического и ошибки среднего арифметического с использование
программных компонентов пакета MS Office 2005. Достоверность различий
показателей женщин с миомой матки по сравнению с контрольной группой
определялась по t-критерию Стьюдента.
Результаты работы и их обсуждение
Для
определения
роли
фагоцитарных
клеток
в
механизмах,
определяющих темп и тип роста миомы матки, нами была проведена оценка
особенностей фенотипа и цитокинового профиля фагоцитарных клеток на
системном и локальном уровнях в периферической крови и эндометрии
пациенток с данным заболеванием.
11
Анализ данных, характеризующих экспрессию функциональных молекул
фагоцитами, показал, что, независимо от темпа и типа роста опухоли, в
периферической крови женщин с миомой матки отмечалось достоверное
снижение уровня HLA-DR+, CD11b+ и CD16+ моноцитов по сравнению с
аналогичными показателями у здоровых женщин (р<0,001 во всех случаях)
(см. приложение).
Известно, что эти функциональные молекулы определяют участие
фагоцитов в осуществлении цитотоксических реакций и фагоцитоза.
Имеющиеся литературные данные свидетельствуют о непосредственном
вовлечении этих рецепторов в осуществление противоопухолевого ответа
фагоцитами. Показано, что опухолевая инвазия ассоциируется со снижением
экспрессии МНС АГ II класса клетками иммунной системы [Foukas P.G., e.a.,
2001]
и
с
угнетением
реакций
антитело-зависимой
клеточной
цитотоксичности, опосредованной CD16+ моноцитами/макрофагами [Gordon
I.O., Freedman R.S., 2006]. Вероятно, снижение экспрессии функциональных
молекул периферическими моноцитами является одним из механизмов,
определяющих нарушение противоопухолевой защиты и способствующих
формирования доброкачественной опухоли в миометрии.
Изменения экспрессии сигнальных молекул TLR2 и TLR4, независимо
от темпа роста опухоли, имели одинаковую направленность как у женщин с
миомой матки стабильно малых размеров, так и у женщин с быстрорастущей
миомой матки. Уровень периферических моноцитов и нейтрофилов, а также
эндометриальных макрофагов, экспрессирующих на своей поверхности TLR4
молекулы был значительно повышен относительно показателей контрольной
группы как у женщин со стабильно малой миомой (р<0,02, р<0,005 и р<0,001
соответственно), так и у женщин с быстрорастущей миомой матки (р<0,01,
р<0,01 и р<0,05 соответственно). При этом мы не выявили каких-либо
изменений экспрессии TLR2 молекул фагоцитами крови и эндометрия у
женщин с миомой матки (р>0,05 во всех случаях).
12
Известно, что TLR4 молекулы определяют ответ фагоцитов на
бактериальные токсины [Jiang D., e.a., 2006]. В последнее время было
выдвинуто предположение, что в развитии миомы матки важную роль играет
инфекционный фактор [Малышкина А.И., 2006]. Вероятно, выявленное нами
увеличение уровня TLR4+
фагоцитов у всех женщин с миомой матки
отражает вовлечение системы фагоцитарных клеток в ответ на инфекционные
антигены.
Состояние фагоцитов эндометрия было ассоциировано с темпом роста
миомы матки. Нами было установлено, что у женщин с нерастущей миомой
матки стабильно малых размеров в эндометрии снижено содержание HLADR-позитивных макрофагов, но повышен уровень CD16+ фагоцитов (р<0,05 и
р<0,02
соответственно).
сопровождалось
Быстрое
снижением
увеличение
содержания
размеров
опухоли
эндометриальных
CD11b+
макрофагов (р<0,001).
CD16-позитивным фагоцитам принадлежит важная роль в развитии
цитотоксических реакций в отношении трансформированных клеток [Ancuta
P., e.a., 2006], поэтому повышение содержания этой функционально активной
популяции эндометриальных макрофагов у женщин с нерастущей миомой
матки
может
свидетельствовать
о
достаточно
высоком
уровне
цитотоксической активности макрофагов, определяющем отсутствие роста
уже сформировавшейся миомы матки. CD11b молекулы, относящиеся к
классу
β2-интегринов,
участвуют
в
осуществлении
межклеточных
взаимодействий по типу клетка-клетка и клетка-внеклеточный матрикс [Wu
R., e.a., 2006], а интегрины, в свою очередь, играют важную роль в регуляции
межклеточных взаимодействий при опухолевом росте [Brakebusch C., e.a.,
2002].
По-видимому,
макрофагов
с
другими
нарушение
взаимодействия
клетками
может
эндометриальных
приводить
к
снижению
противоопухолевой защиты в ткани, непосредственно прилегающей к
миометрию, провоцируя быстрый рост миомы матки.
13
При
дифференцированном
анализе
данных,
характеризующих
экспрессию на поверхности фагоцитов функциональных и сигнальных
молекул в зависимости от типа быстрого роста миомы нами было
установлено,
что
повышение
в
периферической
крови
содержания
нейтрофилов, экспрессирующих на своей поверхности рецептор к TGFβ1 –
эндоглин (CD105), было ассоциировано с «истинным» типом роста опухоли за
счет усиления пролиферативных процессов в миометрии (р<0,002). В то же
время для подгруппы женщин с «ложным» типом роста миомы матки было
характерно
сниженное содержание периферического пула моноцитов,
экспрессирующих молекулы эндоглина (р<0,05).
Эндоглин является вспомогательным рецептором TGF1 [Wipff J., е.а.,
2007] и регулирует ангиогенез [Hayrabedyan S., e.a., 2005; Duwel A., е.а., 2007],
определяя реализацию биологического действия этого фактора роста при
опухолевом росте. Известно, что TGF ингибируют многие функции
фагоцитарных клеток [Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. и соавт. 2007; Kuo Y.
e.a.,
2001].
Поэтому
повышение
уровня
экспрессии
эндоглина
периферическими нейтрофилами может вести к угнетению функциональной
активности данной клеточной популяции, что, по-видимому, связано с
усилением процессов опухолевого роста у пациенток с миомой матки.
Известно, что в ткани миоматозных узлов значительно изменяется по
сравнению с неизмененным миометрием содержание ряда провоспалительных
цитокинов и факторов роста [Nowak R.A., е.а., 2000; Sozen I., е.а., 2002].
Принимая во внимание тот факт, что фагоциты являются одними из основных
продуцентов цитокинов в организме, можно предположить, что изменения
локального цитокинового фона в миоме матке связано с нарушением
секреторной активности фагоцитов крови и эндометрия. В связи с этим мы
оценили характер внутриклеточной продукции ряда провоспалительных
цитокинов мононуклеарными и гранулоцитарными фагоцитами при миоме
матки (см. приложение).
14
Независимо от темпа роста миомы матки в периферической крови и
эндометрии
было
выявлено
значительное
повышение
содержания
мононуклеарных фагоцитов, продуцирующих внутриклеточно IL-10 (см
приложение). В последние годы получила широкое распространение теория о
различной роли М1 и М2 макрофагов в регуляции опухолевого роста [Van
Ginderachter J.A.,е.а.; 2006, Mantovani A., е.а., 2004]. Считают, что М1 или
«классически» активированные макрофаги продуцируют цитокины Th1 типа и
при активации участвуют в защите организма от опухолевых клеток. М2
клетки или «альтернативно» активированные макрофаги, активируются под
воздействием Th2 цитокинов Th2 типа и могут влиять на поведение
опухолевых клеток, изменяя опухолевое микроокружение и изменяя
направленность противоопухолевого иммунного ответа, участвуя таким
образом в росте и прогрессии опухоли [Van Ginderachter J.A., 2006].
Принадлежность к М2 популяции является высокая продукция IL-10 и низкая
– IL-12 [Mantovani A., е.а., 2004]. Складывается впечатление, что в основе
нарушений регуляции противоопухолевого ответа, ведущих к формированию
миомы матки, является увеличение пула М2 фагоцитов как на системном, так
и на локальном уровнях.
Темп роста опухоли, по нашим данным, был ассоциирован с различной
направленностью изменений продукции
провоспалительных цитокинов
фагоцитарными клетками. У женщин с миомой матки стабильно малых
размеров отмечалось достоверное снижение уровня моноцитов, нейтрофилов
крови и эндометриальных макрофагов, экспрессирующих внутриклеточно IL1β (р<0,05, р<0,05 и р<0,001 соответственно) и IL-8 (р<0,01, р<0,05 и р<0,05
соответственно). Быстрый рост миомы матки, напротив, сопровождался
резким увеличением уровня IL-1β+ (р<0,01, р<0,02 и р<0,001 соответственно),
IL12+ (р<0,01, р<0,02 и р<0,001 соответственно), IL-8+ (р<0,001 во всех
случаях) и IFNγ+ клеток (р<0,05, р<0,001 и р<0,001 соответственно) в
популяциях моноцитов и нейтрофилов периферической крови, а также в
15
популяции
эндометриальных
макрофагов.
На
основании
выявленных
закономерностей изменения содержания моноцитов, продуцирующих IL-8, в
зависимости от темпа роста миомы матки, был предложен новый
диагностический критерий быстрого роста миомы матки.
Связь между воспалением и канцерогенезом была установлена
достаточно давно [Lin W.W.,е.а., 2007; Balkwill F., е.а., 2007]. На сегодня
можно
считать
доказанным,
что
хроническое
воспаление
усиливает
опухолевую прогрессию [Allavena P., е.а., 2008]. В связи с этим, выявленное
нами усиление продукции провоспалительных цитокинов периферическим и
эндометриальными макрофагами только у женщин с быстрорастущей миомой
матки представляется вполне логичным.
Характер продукции провоспалительных цитокинов также был связан и
с типом быстрого роста миомы матки. Так, при «истинном» типе роста в
эндометрии отмечалось более низкое содержание IL12+ и IFNγ+ клеток, чем
при «ложном» типе роста (р<0,05 и р<0,005 соответственно) . Известно, что
IL-12 может усиливать процессы элиминации опухолевых клеток в
экспериментальных моделях, а экзогенное введение IL-12 приводило к
уменьшению количества внутриопухолевых макрофагов, поддерживающих
злокачественный
рост,
при
одновременном
повышении
содержания
макрофагов с выраженной противоопухолевой активностью [Watkins S.K.,
.e.a., 2007]. Можно предположить, что снижение уровня IL-12-позитивных
макрофагов в эндометрии, ассоциированное с усилением пролиферативной
активности в миометрии, отражает снижение функционально активных
фагоцитов в эндометрии при «истинном» типе быстрого роста опухоли.
Изменение цитокинового профиля периферических и эндометриальных
макрофагов, по нашим данным, было сопряжено с изменением содержания
провоспалительных цитокинов непосредственно в опухолевой ткани. Так, мы
выявили повышение концентрации IL-1β и IL-8 в экстрактах миоматозных
узлов больших размеров по сравнению с аналогичными показателями в
16
неизмененном миометрии и в миоматозных узлах малых размеров (р<0,05 во
всех случаях). Причем в резкое повышение провоспалительных цитокинов IL1β и IL-8, а также MCP-1 было выявлено в опухолевых узлах, увеличение
которых происходило за счет пролиферации (р<0,05 во всех случаях).
Известно, что МСР-1 способствует развитию опухоли, регулируя количество
и распределение макрофагов, ассоциированных с ней [Bailey C., e.a., 2007].
Следует также отметить, что в ткани миоматозных узлов с «истинным» типом
опухолевого роста в максимальной степени было выражено повышение
содержания IL-8 при одновременном усилении и экспрессии мРНК IL-8
(р<0,05 в обоих случаях). Как известно, IL-8 может способствовать
опухолевому росту, являясь мощным ангиогенным фактором [Фрейдлин И.С.,
Тотолян А.А., 2001]. Можно предположить, что усиление продукции
провоспалительных цитокинов фагоцитами лежит в основе механизмов,
определяющих развитие быстрого роста миомы за счет пролиферации.
Таким образом, суммируя полученные нами данные можно заключить,
что в основе механизмов, приводящих к формированию миомы матки лежат
нарушения
экспрессии
функциональных
и
сигнальных
молекул
на
поверхности фагоцитов при повышении в периферической крови и
эндометрии пула М2 моноцитов/макрофагов. Темп роста опухоли связан
преимущественно
с
функциональным
состоянием
эндометриальных
макрофагов и уровнем продукции провоспалительных цитокинов фагоцитами
крови и эндометрия. Тип быстрого роста миомы матки определяется
характером рецепции TGFβ периферическими нейтрофилами и моноцитами и
уровнем продукции INFγ+ и IL12+. Изменение цитокинового профиля
периферических и эндометриальных фагоцитов может лежать в основе
механизмов, регулирующих содержание цитокинов в ткани миоматозного
узла.
17
Выводы
1.
Развитие миомы матки независимо от темпа роста опухоли ассоциируется
с выраженным снижением по сравнению с показателями здоровых
женщин количества моноцитов, экспрессирующих функциональные
молекулы (HLA-DR, CD11b, CD16), и повышением уровня TLR4+
фагоцитов, как в периферической крови, так и в эндометрии.
2.
Увеличение уровня CD105+ нейтрофилов в периферической крови и
снижение количества CD11b+ макрофагов в эндометрии относительно
аналогичных параметров здоровых женщин сочетается с быстрым ростом
миомы матки, тогда как снижение содержания HLA-DR+ макрофагов и
повышение количества CD16-макрофагов в эндометрии характерно для
женщин с миомой матки стабильно малых размеров.
3.
«Истинный» тип быстрого роста миомы матки ассоциируется с
повышенным
количеством
нейтрофилов
периферической
крови,
экспрессирующих эндоглин, а «ложный» тип быстрого роста – со
сниженным уровнем CD105-позитивных моноцитов.
4.
Независимо от темпа и типа роста для миомы матки характерно усиление
внутриклеточного синтеза
IL-10 моноцитами. При миоме матки
стабильно малых размеров отмечается снижение продукции IL-1β и IL-8
фагоцитами крови и эндометрия, тогда как при быстром росте миомы
матки -
повышение спонтанной продукции провоспалительных
цитокинов IL-1β, IL-8, INF и IL-12 периферическими фагоцитарными
клетками. Отличительной чертой «ложного» типа быстрого роста
опухоли является высокий уровень INFγ+ и IL12+ макрофагов в
эндометрии.
5.
В экстрактах эндометрия женщин с миомой матки стабильно малых
размеров снижено по сравнению с показателями эндометрия здоровых
женщин содержание IL-1β, а при быстрорастущей миоме матки
содержание провоспалительных цитокинов в тканевых экстрактах
18
эндометриальной ткани не отличается от контрольных значений, но
повышена экспрессия мРНК IL-8. «Ложный» тип быстрого роста миомы
матки ассоциируется с высоким содержанием IL-8 и MCP-1 и
повышенной экспрессией мРНК IL-8 в эндометрии.
6.
В экстрактах опухолевых узлов больших размеров по сравнению с
показателями неизмененного миометрия и миоматозных узлов малых
размеров повышено содержание IL-1β и IL-8 и усилена экспрессия мРНК
IL-8. Высокое содержание IL-1β, IL-8 и MCP-1
в экстрактах
миоматозных узлов и повышенная экспрессия мРНК IL-8 в ткани опухоли
сочетаются с «истинным» типом быстрого роста миомы, а сниженный
уровень IL-8 и мРНК IL-8 в тканевых экстрактах узлов - с «ложным»
типом роста опухоли.
7.
Высокие
значения
показателя
периферических
моноцитов,
экспрессирующих внутриклеточно IL-8, являются прогностическим
критерием развития быстрого роста миомы матки в течение года.
Практические рекомендации
Женщинам с миомой матки рекомендуется определять показатели
функциональной активности периферических моноцитов и нейтрофилов с
целью уточнения темпа и типа роста опухоли.
Женщинам с быстрорастущей миомой матки рекомендуется определять
количество периферических моноцитов и нейтрофилов, экспрессирующих
эндоглин, для дифференцировки «истинного» и «ложного» типа роста
опухоли.
Для прогнозирования быстрого роста миомы матки рекомендуется
определять относительный уровень IL-8+ моноцитов, и при значении этого
показателя равных или более 63%
прогнозировать быстрый рост миомы
матки в течение года с точностью 91,7%.
19
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации
1.
Соснина А.Е. Цитокиновый профиль лимфоцитов и макрофагов
эндометрия у женщин с миомой матки различных темпов роста /
Соснина А.Е., Малышкина А.И., Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю.,
Бойко О.М., Анциферова Ю.С. // Медицинская иммунология.- 2006. –
Т. 8. - № 2-3. – С.314.
2.
Соснина А.Е. Роль фагоцитов периферической крови в процессах,
определяющих темп роста миомы матки / Соснина А.Е., Анциферова
Ю.С., Сотникова Н.Ю., Бойко О.М., Малышкина А.И. // Сборник
материалов VIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя».2006.- С.520.
3.
Соснина А.Е., Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Малышкина А.И.
Взаимосвязь
изменений
цитокинового
профиля
моноцитов
периферической крови с темпом роста миомы матки / Соснина А.Е.,
Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Малышкина А.И. // Ж.
Физиология и патология иммунной системы.- 2006.- №10 (приложение
1). – С. 58-59.
4.
Соснина А.Е. Изменения цитокинового профиля эндометриальных
макрофагов у женщин с лейомиомой матки в зависимости от темпов
роста опухоли / Соснина А.Е. // Сборник материалов научнопрактической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА
«Неделя науки – 2006» в рамках областного фестиваля «Молодая
наука – развитию Ивановской области». - 2006. – С.81-83.
5.
Соснина А.Е. Особенности цитокинового профиля мононуклеарных
клеток эндометрия женщин с быстрорастущей миомой матки /
Соснина А.Е., Сотникова Н.Ю., Малышкина А.И., Посисеева Л.В.,
Сотникова Н.Ю., Бойко О.М. // Сборник материалов международного
конгресса «Практическая гинекология: от новых возможностей к
новой стратегии». - 2006. - С.110-111.
6.
Соснина А.Е. Особенности экспрессии TLR2 и TLR4 на клетках
фагоцитарного ряда периферической крови и эндометрия у женщин с
лейомиомой матки / Соснина А.Е., Сотникова Н.Ю., Анциферова
Ю.С., Бойко О.М., Малышкина А.И. // Russian Journal of Immunology.2007.-V. 9, Suppl.4.- P.137-138.
7.
Соснина А.Е. Взаимосвязь особенностей цитокинового профиля
фагоцитарных клеток при миоме матки с темпом и типом роста
опухоли / Соснина А.Е., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Бойко
О.М., Перетятко Л.П. // Медицинская иммунология.- 2007. – Т 9. - №
2-3. – С.263.
20
8.
Соснина А.Е. Изменение экспрессии м-РНК TGF и IL-1 в ткани
лейомиомы матки при быстром темпе роста опухоли / Соснина А.Е.,
Сотникова Н.Ю., Бойко О.М., Анциферова Ю.С., Малышкина А.И.//
Сборник материалов VIII конгресса «Современные проблемы
аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии».- 2007.-№3,
приложение 1.- С.257.
9.
Соснина А.Е. Изменение экспрессии молекул TLR-2 и TLR-4 на
клетках фагоцитарного ряда у женщин с лейомиомой матки / Соснина
А.Е. // Сборник материалов научно-практической конференции
студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки – 2007». - 2007. –
С.80.
10.
Соснина А. Е. Взаимосвязь активности пролиферативных процессов в
миоматозном узле с системной и локальной продукцией IL-8 и TGFβ /
Соснина А. Е., Сотникова Н. Ю., Посисеева Л.В., Бойко О.М.,
Малышкина А.И., Анциферова Ю.С., Перетятко Л.П. // Сборник
материалов IX Всероссийского научного форума «Мать и Дитя». –
2007. - С. 523-524.
11.
Соснина А. Е. Роль IL-8 в патогенезе быстрого роста лейомиомы
матки / Соснина А. Е., Сотникова Н. Ю., Посисеева Л.В., Бойко О.М.,
Малышкина А.И., Анциферова Ю.С., Перетятко Л.П. // Ж. Бюллетень
Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук. –
2008. - Приложение 1. – С. 64-68.
12.
Соснина А.Е. Особенности экспрессии м-РНК IL-8 в эндометрии
женщин с миомой матки / Соснина А.Е., Сотникова Н.Ю., Анциферова
Ю.С., Бойко О.М., Малышкина А.И. // Russian Journal of Immunology.2008.-Т 2(11) №2-3- P.297.
13.
Соснина А. Е. Роль IL-1 в механизмах, определяющих различный
темп и тип роста лейомиомы матки / Соснина А. Е., Сотникова Н. Ю.,
Анциферова Ю.С., Бойко О.М. // Ж. «Проблемы репродукции». – 2008.
– Специальный выпуск: Технологии XXI века в гинекологии. – С.7577.
21
Приложение.
Особенности фенотипа и цитокинового профиля фагоцитов периферической
крови и эндометрия женщин с миомой матки
Показатель, %
Контрольная группа
(n= 35)
Миома матки
стабильно
малых размеров
(n=25)
Быстрорастущая миома матки
«истинный» тип
«ложный» тип
роста опухоли
роста опухоли
(n=25)
(n=21)
Моноциты периферической крови
CD 11b+
CD16+
HLADR+
CD105+
TLR2+
TLR4+
IL1β+
IL12+
INF+
IL8+
IL10+
63,63±1,73
64,19±1,66
71,92±1,61
34,11±4,04
60,69±2,28
45,91±1,89
48,79±3,19
55,17±2,88
39,08±2,07
45,86±3,37
38,31±1,88
40,47±2,69,
45,03±3,47,
57,92±3,04,
37,19±3,21,
59,11±3,24,
60,31±5,16,
39,23±2,03,
51,43±3,58,
41,07±2,47,
33,98±2,04,
44,82±1,28,
р<0,001
р<0,001
р<0,001
р>0,05
р>0,05
р<0,02
р<0,05
р>0,05
р>0,05
р<0,01
р<0,01
47,63±3,58,
50,25±2,61,
63,76±3,17,
32,93±3,01,
61,15±2,38,
69,85±1,28,
59,66±2,73,
69,26±3,14,
47,71±3,69,
75,09±2,63,
58,01±1,99,
р<0,002
р<0,001
р<0,01
р>0,05
р>0,05
р<0,001
р<0,01
р<0,01
р<0,05
р<0,001
р<0,05
48,25±5,01,
50,88±3,61,
58,24±3,97,
24,22±2,65,
65,46±2,57,
71,51±3,51,
57,09±2,50,
67,93±3,15,
48,71±3,19,
71,66±4,66,
61,90±2,24,
р<0,02
р<0,01
р<0,01
р<0,05
р>0,05
р<0,001
р<0,01
р<0,01
р<0,05
р<0,001
р<0,001
65,53±7,33,
75,36±4,39,
27,09±3,95,
77,34±4,31,
78,94±2,18,
55,14±2,90,
58,20±3,64,
57,50±2,16,
p<0,001
71,21±5,23,
p<0,001
50,51±3,73,
p<0,001
р>0,05
р>0,05
р>0,05
р>0,05
р<0,01
p<0,02
p<0,02
Нейтрофилы периферической крови
р>0,05
р>0,05
р>0,05
р>0,05
р<0,005
р<0,05
р>0,05
р>0,05
69,65±2,87, р>0,05
82,88±2,44, р>0,05
42,25±2,92, р<0,002
71,02±3,40, р>0,05
73,74±0,92, р<0,01
57,64±3,74, р<0,02
57,24±6,68, р<0,05
57,27±3,93, p<0,001
CD 11b+
CD16+
CD105+
TLR2+
TLR4+
IL1β+
IL12+
INF+
64,28±3,14
74,95±2,92
26,39±2,68
68,73±3,08
53,29±6,03
44,12±2,88
46,79±2,51
39,33±2,08
58,97±3,09,
71,93±3,04,
30,50±4,07,
77,11±4,12,
81,62±3,63,
32,97±3,01,
39,45±3,35,
33,10±3,17,
IL8+
45,05±1,47
35,68±3,46, р<0,05
70,14±2,30, p<0,001
IL10+
32,54±1,73
35,09±3,25, р>0,05
53,37±4,32, p<0,001
Макрофаги эндометрия
CD 11b+
CD16+
HLADR+
CD105+
TLR2+
TLR4+
IL1β+
IL12+
INF+
IL8+
64,48±2,00
63,87±1,82
61,83±1,88
38,47±5,05
66,71±1,90
52,69±2,64
40,62±1,56
53,36±4,55
35,33±1,60
43,66±3,98
58,8±3,28, р>0,05
70,44±1,89, р<0,02
55,99±2,09, р<0,05
43,48±2,34, р>0,05
70,39±3,09, р>0,05
70,32±3,12, р<0,001
31,59±1,97, p<0,001
42,08±3,64, р>0,05
35,41±2,91, р>0,05
30,59±3,39, p<0,05
22
52,00±1,57,
59,76±2,58,
61,99±3,02,
38,28±2,09,
63,36±1,24,
72,14±2,58,
63,56±6,29,
66,73±1,78,
43,72±2,68,
66,91±3,31,
р<0,001
р>0,05
р>0,05
р>0,05
р>0,05
р<0,005
p<0,01
p<0,02
p<0,02
p<0,001
46,94±5,89, р<0,02
64,97±4,00, р>0,05
59,64±1,81, р>0,05
36,39±2,39, р>0,05
66,36±4,12, р>0,05
75,63±3,85, р<0,005
64,69±2,60, p<0,001
74,88±2,62, p<0,001
62,33±4,25, p<0,001
70,38±2,94, p<0,001
IL10+
31,73±4,79 43,67±1,75, p<0,001 54,27±3,93, p<0,001 57,08±3,67, p<0,001
р – различия достоверны относительно показателя контрольной группы.
23