На правах рукописи Специальность 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения РОБЕР Марина Юрьевна
advertisement
На правах рукописи РОБЕР Марина Юрьевна ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО АНАЛИЗА БЕЛКОВ Специальность 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2009 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте высокомолекулярных соединений РАН. Научный руководитель: доктор химических наук Т. Б. Тенникова Официальные оппоненты: доктор химических наук А. Ю. Меньшикова доктор химических наук, профессор Л. А. Карцова Ведущая организация: Санкт-Петербургский политехнический университет Защита диссертации состоится «18» июня 2009 года в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 002.229.01 при Учреждении Российской академии наук Институте высокомолекулярных соединений по адресу: 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О. д. 31, конференц-зал. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Института высокомолекулярных соединений РАН. Автореферат разослан «15» мая 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета Д 002.229.01 кандидат физ.-мат. наук Н. А. Долотова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Создание новых высокочувствительных методов анализа белков имеет огромное значение для современной медицины и биологии, поскольку диагностика многих патологических состояний основана на детектировании маркерных белков в сложных биологических жидкостях. Развитие биотехнологии также требует разработки быстрых и чувствительных методов анализа белковых молекул, ответственных за протекание биотехнологических процессов (рекомбинантная технология, тканевая инженерия). Макропористые носители на основе синтетических полимеров на протяжении последних десятилетий успешно используются в проведении широкого ряда динамических сепарационных и биоконверсионных процессов. Применение носителей данного типа для создания биораспознающих систем в формате биочипов, предназначенных для комплексного аналитического скрининга сложных биологических объектов, позволяет повысить чувствительность и сократить время выполнения анализа. При этом эффективность анализа существенно зависит от свойств используемой твердой матрицы. Так, присутствие на поверхности носителя тех или иных функциональных групп определяет способ иммобилизации адсорбционно-активного лиганда, а реакционная способность и количество этих групп – биоспецифическую адсорбционную емкость твердой фазы. Морфологические особенности используемой матрицы также играют важную роль в обеспечении высокой адсорбционной емкости и возможности создания для молекулы белка условий, максимально близких к ее существованию в растворе. Таким образом, развитие биологических микрочипов тесно связано с внедрением новых типов носителей, обладающих улучшенными физическими и химическими характеристиками, которые позволили бы повысить их биоаналитическую эффективность. Сополимер глицидилметакрилата (ГМА) и этиленгликольдиметакрилата (ЭДМА) является наиболее известным и широко используемым представителем макропористых сорбентов. Наличие в химической структуре сополимера эпоксидных групп позволяет проводить одностадийное ковалентное связывание молекул белка с поверхностью данного сорбента. Тем не менее, существенным недостатком ГМА-ЭДМА сорбентов является длительность процесса иммобилизации белка с участием оксирановых циклов, а также недостаточно высокая аффинная емкость носителя. В связи с этим, создание общего алгоритма конструирования трехмерных платформ для биочипов различного назначения и разработка носителей монолитного типа на основе сополимеров, содержащих функциональные группы, обеспечивающие быстрое связывание лиганда с поверхностью, представляется актуальной задачей. Цель исследования. Целью настоящей работы являлась разработка принципов создания полимерных микроаналитических платформ, включающих полимерные слои монолитного типа, содержащие реакционно-способные функциональные группы и обладающие поровыми характеристиками, удовлетворяющими условиям проведения анализа в статических условиях, а именно, обеспечивающими свободное и достаточно быстрое проникновение макромолекул белка (или более крупных объектов, например, вирусов) внутрь порового пространства, а также высокую адсорбционную емкость носителя. В связи с этим, были поставлены и решались следующие задачи: поиск мономеров, содержащих функциональные группы, способные к быстрому взаимодействию с аминогруппой молекулы белка; оценка способности выбранных мономеров к сополимеризации с дивинильным соединением с образованием монолитного макропористого материала и анализ полученных жестко сшитых сополимеров; 4 оптимизация условий синтеза сополимеров для получения материала с заданным размером пор; исследование на примере модельного белка закономерностей иммобилизации лигандов на поверхности полученных носителей; оптимизация технологии изготовления микроаналитических устройств на основе стеклянной поддерживающей среды и синтезированных полимерных слоев; выбор оптимальных условий проведения микроанализа с использованием модельной аффинной пары белков; оценка эффективности разработанных микроаналитических устройств на примере решения реальных биомедицинских и биотехнологических задач. Объектами представленного исследования являлись синтетические сополимеры на основе метакрилатных и акрилатных мономеров, несущие на своей поверхности функциональные группы, способные взаимодействовать с аминогруппой молекулы белка. При выполнении работы были использованы следующие методы исследования: свободно-радикальная фотоинициируемая полимеризация для синтеза сополимеров; элементный анализ и ИК-спектроскопия для характеристики полученных сополимеров; интрузионная ртутная порометрия для определения среднего размера пор полимерных носителей и распределения их по размерам; сканирующая электронная микроскопия для качественной оценки поровой структуры полученных материалов; тонкослойная хроматография (ТСХ), обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), масс-спектрометрия и спектроскопии в видимой области поглощения для исследования закономерностей иммобилизации модельного белка на поверхности полученных полимерных носителей; люминесцентная микроскопия для осуществления микроанализа на поверхности разработанных полимерно-неорганических платформ с целью оценки эффективности их практического использования. Научная новизна работы. Впервые осуществлен синтез двух макропористых материалов на основе сополимеров N–гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата и 2-цианоэтилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата. Разработан принцип конструирования полимер-содержащих платформ, составляющих функциональную основу биочипа, включающий изготовление на поверхности стекла операционных ячеек, силанизацию полученных ячеек и осуществление фотоинициируемой полимеризации непосредственно в изготовленных ячейках. Впервые показана возможность высокочувствительного детектирования белка в формате биочипов с использованием макропористых монолитных полимерных носителей. Практическая значимость работы. Разработаны методы синтеза макропористых полимерных материалов монолитного типа, обладающих функциональными группами и воспроизводимой поровой структурой, пригодной для использования в конструкции биочипа, предназначенного для биологического микроанализа. Разработаны и апробированы методы определения пикомолярных количеств маркерного белка остеопонтина в клеточном супернатанте при тканево-инженерном производстве костной ткани, а также антител против антигена T. Pallidum в сыворотке крови человека. 5 Основные положения, выносимые на защиту: Синтезированные материалы на основе сшитых жесткоцепных сополимеров Nгидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата и 2-цианоэтилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата содержат функциональные группы, позволяющие осуществлять быструю модификацию их поверхности белком; Поровая структура полученных материалов удовлетворяет требованиям проведения биоанализа в статических условиях, а именно, обеспечивает проникновение молекул белка внутрь порового пространства и высокую адсорбционную носителя; Макропористые носители на основе синтезированных полимеров являются перспективными материалами для осуществления анализа белка в микроформате. Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены в виде устных и стендовых сообщений на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах: Санкт-Петербургская конференция молодых ученых “Современные проблемы науки о полимерах” (Санкт-Петербург, Россия, 2005, 2007, 2008); International Symposium “Molecular Mobility and Order in Polymer Systems” (Санкт-Петербург, Россия, 2005, 2008); Monolith Summer School (Порторож, Словения, 2006, 2008); International Congress on Analytical Sciences (ICAS-2006). (Москва, Россия, 2006); The Young Scientists’ and Students’ International Scientific Conference “Modern Problems of Microbiology and Biotechnology” (Одесса, Украина, 2007); European Congress and Exhibition on Advanced Materials and Processes (Euromat 2007) (Нюрнберг, Германия, 2007); Baltic Polymer Symposium 2007 (Друскининкай, Литва) и 2008 (Отепа, Эстония). Результаты работы также обсуждались на научно-практическом семинаре в Институте технической химии Университета Ганновера (Ганновер, Германия, 2007). Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемнадцать печатных работ, включая две статьи в Журнале прикладной химии и Journal of Applied Polymer Science, две статьи в трудах международных конференций «3rd International and 28th European Peptide Symposium» и «Измерительные и информационные технологии в охране здоровья. Метромед 2007», а также 14 тезисов устных и стендовых докладов. Вклад автора состоял в осуществлении всех представленных в работе экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций и докладов. Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Обсуждения результатов, Выводов и Списка использованной литературы. Материалы диссертации изложены на 148 страницах, проиллюстрированы 12 таблицами и 49 рисунками, список цитируемой литературы включает 135 источников. Данная работа выполнялась в соответствии с планом НИР ИВС РАН по теме «Создание материалов биомедицинского назначения на основе синтетических и природных полимеров», а также в рамках научной кооперации между Институтом высокомолекулярных соединений РАН и Институтом технической химии Университета Ганновера (Германия) (грант DFG KA 1784/4-1 и стипендия Немецкого Академического Общества по международному обмену DAAD 325 А/06/70831), при участии Военно- медицинской академии им. С. М. Кирова и технической поддержке фирмы BIA Separations GmbH (Любляна, Словения). 6 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении обоснована актуальность работы, обозначена научная новизна и практическая значимость, сформулированы цели и задачи исследования. Глава 1. Обзор литературы состоит из трех разделов. В первом разделе рассмотрены особенности синтеза, методы исследования, а также химия поверхности полимерных макропористых сорбентов монолитного типа. Второй раздел посвящен способам создания биоаффинных разделительных фаз (нековалентная, ковалентная и ориентационная иммобилизация, прямой твердофазный синтез пептидов на поверхности носителя). В третьем разделе обсуждаются основы микроанализа, материалы, используемые для создания операционных слоев биочипов, методы детектирования целевого белка в исследуемом образце. Глава 2. Экспериментальная часть содержит описание использованных в работе материалов, оборудования, а также методов синтеза и исследования получаемых полимерных материалов. Глава 3. Результаты и обсуждение. К несомненным достоинствам монолитных сорбентов на основе сополимера глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ГМА-ЭДМА) можно отнести механическую и химическую стабильность, а также наличие в структуре сополимера реакционноспособных эпоксидных групп, позволяющих проводить одностадийную ковалентную поверхностную иммобилизацию макромолекул белка. Однако существенным недостатком данного материала является длительность процесса связывания лиганда с участием эпоксидных групп, а также недостаточно высокая адсорбционная емкость носителя. Поэтому в представляемой работе синтезированы два новых макропористых монолитных сорбента на основе тройного сополимера N-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ГФИАК-ГМАЭДМА), а также сополимера 2-цианоэтилметакрилата с этиленгликольдиметакрилатом (ЦЭМА-ЭДМА). Полученные полимерные материалы, наряду с известным ГМА-ЭДМА твердым сополимером, в дальнейшем были использованы в качестве разделительной фазы в конструируемых микроаналитических устройствах (биочипах). Важной особенностью динамических процессов, основанных на межфазовом распределении вещества, с использованием макропористых монолитных носителей является возможность полного протекания подвижной фазы сквозь слой сорбента, что исключает диффузионные ограничения нормальному массопереносу, характерные для колонок, упакованных дисперсным сорбентом. Однако при реализации биоспецифических (аффинных) взаимодействий в непроточном формате, необходимо учитывать, что в данном случае молекулы анализируемого вещества достигают специфических адсорбционных сайтов без участия потока жидкости, т. е. исключительно за счет собственной диффузии. Поэтому определяющим этапом представляемого исследования являлась оптимизация процессов синтеза обсуждаемых сополимеров, которые должны обладать необходимыми поровыми характеристиками. При этом подразумевается гомогенность поровой структуры, а также размер пор, обеспечивающий, с одной стороны, свободное проникновение крупных молекул белка внутрь трехмерного порового пространства как в процессе иммобилизации, так и при последующем аффинном взаимодействии растворимого и связанного с поверхностью комплементов, а с другой, достаточную поверхность для достижения оптимальной адсорбционной емкости носителя. 7 3.1. Синтез и исследование свойств сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА. Синтез сополимеров осуществляли методом фотоинициируемой свободнорадикальной полимеризации в присутствии порогенных растворителей. В качестве инициатора использовали 2-гидрокси-2,2-диметилацетофенон (Дарокур-1173). Наличие в структуре полимерных продуктов функциональных групп основного мономера подтверждали методом ИК-спектроскопии. Так, о присутствии гидроксифталимидного фрагмента в структуре сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА свидетельствуют характеристические полосы при 1788 и 1817 см-1, которые можно отнести к валентным колебаниям карбонильной связи эфирной и имидной групп. Детектируемая в ИК-спектре сополимера ЦЭМА-ЭДМА характеристическая полоса при 2260 см-1 отвечает валентным колебаниям связи углеродазот нитрильной группы. Для решения задачи направленного формирования поровой структуры, оптимальной для проведения биологического микроанализа, было исследовано влияние параметров фотоинициируемой полимеризации на поровую структуру получаемого полимерного продукта. Синтез сополимеров осуществляли в условиях вариации концентрации инициатора, времени облучения, а также природы и соотношения порогенных растворителей. Как видно из графика, представленного на Рис. 1 а, максимальный выход для всех трех сополимеров достигается при концентрации инициатора 0.8-1.0 масс%. Дальнейшее увеличение концентрации Дарокура-1173 не оказывало влияния на выход продуктов реакции, но при этом сопровождалось появлением более плотных участков на поверхности монолитного слоя. Причина этого явления заключается в формировании высокосшитых участков сополимера, практически лишенных пор или содержащих поры очень маленького размера. С целью определения оптимального времени облучения была исследована зависимость выхода сополимеров от времени фотоинициируемой полимеризации (Рис. 1 б). Максимальный выход для сополимеров ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА достигался через 20 минут облучения, тогда как для тройного сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА этот параметр составлял 30 минут. ГМА-ЭДМА ГФИАК-ГМА-ЭДМА ЦЭМА-ЭДМА 100 а) б) Выход сополимера, % Выход сополимера, % 90 ГМА-ЭДМА ГФИАК-ГМА-ЭДМА ЦЭМА-ЭДМА 80 70 60 50 100 90 80 70 60 50 40 30 20 40 10 0 30 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Концентрация инициатора, % 1,6 1,8 5 10 15 20 25 30 Время реакции, мин Рис. 1. Зависимость выхода сополимеров от концентрации инициатора (а) и времени реакции (б). 8 3.1.1. Зависимость поровых характеристик сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА от природы порогенных растворителей. С целью получения монолитных макропористых носителей со средним размером пор (не менее 1 мкм), обеспечивающим свободное проникновение молекул белка внутрь порового пространства и высокую адсорбционную емкость носителя, было изучено влияние различных порообразующих агентов и их комбинаций на поровые характеристики получаемого полимерного материала. При синтезе сополимера ГМА-ЭДМА, по аналогии с опубликованными данными для процессов термоинициируемой полимеризации, в качестве порообразующих веществ были использованы циклогексанол и додеканол. Однако в нашем случае проведенные исследования показали отсутствие существенного влияния соотношения циклогексанола и додеканола как на скорость фотоинициируемого процесса, так и на средний размер пор полученных полимерных образцов (Табл. 1). Таблица 1 Данные интрузионной ртутной порометрии для сополимера ГМА-ЭДМА Соотношение порогенов (%, об/об) Образец циклогексанол додеканол Соотношение порогены/ мономеры (%, об/об) Средний размер пор, нм Площадь поверхности, м2/г Э1 100 60/40 1500 29 Э2 90 10 60/40 1600 28 Э3 70 30 60/40 1660 22 Условия: время облучения 20 мин, концентрация Дарокур-1173 1 масс%, соотношение ГМА/ЭДМА = 60/40 об% (68/32 мол%). N-гидроксифталимидный эфир акриловой кислоты (ГФИАК) был выбран для синтеза функциональной полимерной подложки, предназначенной для микроанализа белков, вследствие наличия в его структуре активированной сложноэфирной группы. При этом выбранный сомономер представляет собой кристаллическое вещество, требующее растворения для введения его в органическую реакционную смесь. Используемый для этого растворитель, а именно, 1,4-диоксан, автоматически становится компонентом системы порогенных растворителей и вносит свой вклад в формирование поровой структуры материала. Поскольку 1,4-диоксан растворяет ГФИАК, образующийся полимер, содержащий звенья данного мономера, будет сольватирован присутствующими в реакционной смеси молекулами растворителя. Это может затруднить процесс разделения фаз и, соответственно, образование твердого полимерного макропористого продукта. Поэтому получение двойного сополимера ГФИАК-ЭДМА, пригодного для применения в качестве основы биочипа, не представляется возможным. Для получения полимерного материала, имеющего поровые характеристики, близкие к таковым сополимера ГМА-ЭДМА, часть ГМА в исходной полимеризационной смеси заменяли на ГФИАК. Таким образом, конечный полимерный продукт содержал два типа функциональных групп, способных к взаимодействию с аминогруппой молекулы белка, а именно, эпоксидные и сложноэфирные. Однако, в силу различной реакционной способности этих групп в выбранных условиях связывания молекул белка, иммобилизация лиганда имела место преимущественно с участием сложноэфирной группы ГФИАК, тогда как лишь незначительное количество эпоксидных групп могло принимать участия в реакции. В Таблице 2 представлены результаты интрузионной ртутной порометрии для 18 образцов, полученных с использованием следующих порогенов в разных комбинациях и соотношениях: циклогексанол, додеканол, ПЭГ-400 и ПЭГ-600. 1,4-диоксан являлся постоянным компонентом реакционной смеси во всех экспериментах. Использование додеканола в качестве сопорогена приводило к увеличению среднего размера пор как в случае 9 циклогексанола, так и ПЭГ. Кроме того, наблюдалась ожидаемая пропорциональность между количеством додеканола в реакционной смеси и средним размером пор полимерного продукта. В соответствии с полученными результатами по определению размера пор сополимеров при использовании данных порогенов, можно утверждать, что термодинамическая несовместимость использованных порообразующих агентов и сополимера ГФИАКГМА-ЭДМА увеличивается в ряду: 1,4-диоксан < ПЭГ < циклогексанол < додеканол Использование соотношения порогены/мономеры = 60/40 приводило к образованию сшитого полимерного материала со средним размером пор 15-170 нм (образцы Г1-Г4 и Г6Г12), неудовлетворительным для использования данных материалов при конструировании биочипа. Приемлемый размер пор был получен для образца Г5, а также для образцов Г13Г18, при синтезе которых соотношение порогены/мономеры составило 75/25, а в качестве порогенов была использована смесь ПЭГ/додеканол. Однако большинство данных образцов (образцы Г5, Г14, Г15, Г17, Г18) имели чрезвычайно малую величину площади поверхности (2-5 м2/г). Исключение составили образцы Г13 и Г16, для которых площадь поверхности была определена равной 14 и 44 м2/г, соответственно. Различия в величине поверхности внутрипорового пространства обсуждаемых образцов можно объяснить особенностями их поровой структуры. По данным интрузионной ртутной порометрии, образцы Г13 и Г16 имеют бимодальное распределение пор по размерам. В частности, образец Г16 содержит мезопоры размером 15-30 нм, доля которых составляет 15% от общего объема пор; для образца Г13 размер мезопор и занимаемый ими объем составляют 15 нм и 4.5%, соответственно. Образцы Г14, Г15, Г17 и Г18 не содержат мезопор, что отражается на величине площади поверхности внутрипорового пространства. Согласно данным интрузионной ртутной порометрии (Табл. 2) и сканирующей электронной микроскопии (Рис. 2), образец Г13 представляется наиболее оптимальным с точки зрения среднего размера пор, площади поверхности и гомогенности поровой структуры. Поэтому именно данный образец был выбран для дальнейших исследований. Рис. 2. Микрофотографии образцов, полученные методом СЭМ: (а) поверхность образца Г1, (б) скол образца Г1, (в) поверхность образца Г13, (г) скол образца Г13, (д) поверхность образца Г16, (е) скол образца Г16. 10 Таблица 2 Данные интрузионной ртутной порометрии, полученные для сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА Соотношение порогенов (%, об/об) Средний размер пор, нм Площадь поверхности, м2/г 60/40 30 78 58.0 60/40 15 - 52.2 60/40 15 - Образец 1,4-диоксан циклогексанол додеканол ПЭГ-400 Соотношение порогены/ мономеры (%, об/об) ПЭГ-600 Г1 42 Г2 42 Г3 42 5.8 Г4 42 40.6 17.4 60/40 60 138 Г5 42 29.0 29.0 60/40 1800 2 Г6 42 17.4 40.6 60/40 20 155 Г7 29.0 29.0 60/40 20 30 Г8 42 42 34.8 23.2 60/40 170 21 Г9 42 29.0 29.0 60/40 130 24 Г10 42 23.2 34.8 60/40 70 85 Г11 42 23.2 60/40 60 52 Г12 42 17.4 40.6 60/40 60 58 Г13 42 29.0 29.0 75/25 1900 14 Г14 42 23.2 34.8 75/25 1350 5 Г15 42 34.8 23.2 75/25 1570 4 Г16 42 17.4 40.6 75/25 1160 44 Г17 42 29.0 29.0 75/25 1600 4 Г18 42 23.2 75/25 1450 5 58.0 34.8 34.8 Условия: время облучения 30 мин, концентрация Дарокур-1173 1 масс%, соотношение ГФИАК/ГМА/ЭДМА=13.3/53.3/33.3 мол%. Обозначения: ПЭГ – полиэтиленгликоль. 11 В ряду сополимеров ЦЭМА-ЭДМА в условиях вариации системы порогенных растворителей было синтезировано и исследовано 9 образцов. Размер пор, распределение пор по размерам и площадь поверхности полученных образцов представлены в Таблице 3. Таблица 3 Данные интрузионной ртутной порометрии для сополимера ЦЭМА-ЭДМА Соотношение порогены/ мономеры (%, об/об) Средний размер пор, нм Площадь поверхности, м2/г 60/40 950 33 100 60/40 830 36 Соотношение порогенов (%, об/об) Образец циклогексанол Ц1 додеканол ПЭГ200 ПЭГ400 ПЭГ600 100 Ц2 Ц3 50 50 60/40 800 33 Ц4 70 30 60/40 950 26 100 60/40 680 27 Ц5 Ц6 50 50 60/40 1050 36 Ц7 30 70 60/40 920 24 Ц8 50 60/40 850 32 Ц9 50 60/40 710 34 50 50 Условия: время облучения 20 мин, концентрация Дарокур-1173 1 масс%, соотношение ЦЭМА/ЭДМА=60/40 об% (68/32 мол%). Обозначения: ПЭГ – полиэтиленгликоль. Все образцы, для синтеза которых использовали циклогексанол и додеканол, имели удовлетворительные размер пор и значение площади поверхности. Совместное использование этих веществ, взятых в различном соотношении, не влияло на поровые характеристики полученных полимерных образцов. а) б) в) г) Рис. 3. Микрофотографии образцов, полученные методом СЭМ: (а) поверхность образца Ц5, (б) скол образца Ц5, (в) поверхность образца Ц6, (г) скол образца Ц6. 12 ПЭГ-200, используемый в качестве самостоятельного порогена, также демонстрировал удовлетворительные порообразующие свойства, хотя и несколько уступал циклогексанолу и додеканолу. Использование смеси ПЭГ-200 с додеканолом в качестве порогенной системы позволило получить сополимеры с наиболее оптимальным размером пор и общей площадью поверхности. Исследования, проведенные методами интрузионной ртутной порометрии и сканирующей электронной микроскопии показали (Рис.3), что образец Ц6 обладает подходящими для использования в микроаналитических платформах характеристиками, включая средний размер пор около 1 мкм, высокое значение площади поверхности (36 м2/г), узкое распределение пор по размерам и гомогенную морфологию поверхности. 3.2. Исследование закономерностей иммобилизации белка на поверхности макропористых монолитных носителей на основе синтезированных сополимеров. Сополимер ГМА-ЭДМА представляет собой хорошо изученный материал монолитного типа, и условия иммобилизации белка на его поверхности были оптимизированы ранее. В частности, было показано, что максимальное количество белка (200 нмоль/г сорбента) связывается с поверхностью полимерной матрицы через 16 часов проведения реакции при 37ºС, pH 9.3 и концентрации белка в исходном растворе не менее 5 мг/мл. Реакция одностадийного ковалентного связывания аминосодержащего лиганда протекает в данном случае по следующей схеме: O pH 9.3 C O CH 2 CH CH 2 + NH2 O C O O CH2 CH CH 2 NH OH 3.2.1. Оптимизация условий иммобилизации белка на поверхности сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА. С целью оптимизации условий иммобилизации модельного белка бычьего сывороточного альбумина (БСА) на поверхности сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА было исследовано влияние параметров процесса, таких как время реакции, pH и концентрация исходного раствора, на количество лиганда, связывающееся с поверхностью полимерной матрицы. В случае сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА связывание белка с поверхностью матрицы осуществляется за счет взаимодействия активированной сложноэфирной группы полимера и ε-аминогруппы лизина по схеме: O C N O O O C O O + NH2 NH + C HO N C O Было изучено влияние условий процесса, а именно, времени реакции (Рис. 4 а), концентрации белка в реакционном растворе (Рис. 4 б) и рН раствора (Табл. 4), на количество БСА, связывающееся с поверхностью полимера. 260 б) 240 220 200 180 160 140 120 100 0 50 100 150 200 250 Количество БСА, нмоль/г сорбента а) Количество БСА, нмоль/г сорбента 13 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 1 2 3 4 5 6 7 Концентрация БСА в исходном растворе, мг/мл Время реакции, мин Рис. 4. Зависимость количества БСА, связанного с поверхностью сополимера ГФИАКГМА-ЭДМА от времени реакции (а) и концетрации БСА в исходном растворе (б). Условия: (а) концентрация БСА 5 мг/мл, рН 9.4; (б) время реакции 2 часа, рН 9.4. Таблица 4 Зависимость количества связанного с сополимером ГФИАК-ГМА-ЭДМА белка от pH реакционной среды Количество иммобилизованного БСА, нмоль/г сорбента 62 ± 7 142 ± 14 190 ± 15 225 ± 17 250 ± 20 pH 7.0 7.6 8.1 8.7 9.4 Условия: концентрация раствора белка 5 мг/мл, время реакции 2 ч, температура 37°С. Очевидно, что реакционная способность активированных сложноэфирных групп носителя оказалась достаточной для того, чтобы сократить время иммобилизации белка по сравнению с сополимером ГМА-ЭДМА с 17 до 2 часов. При этом количество БСА, связывающееся за данное время с поверхностью сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА, составляет 250 нмоль/г сорбента или 17.8 нмоль/м2 (41% поверхности порового пространства), тогда как в случае ГМА-ЭДМА монолита за 16-18 часов связывается 200 нмоль/г сорбента. 3.2.2. Иммобилизация модельного белка на поверхности сополимера ЦЭМА-ЭДМА. Реакция взаимодействия аминогруппы молекулы белка и сложноэфирной группы носителя протекает по схеме: O O N O + NH NH2 Для определения оптимального времени функционализации сополимера ЦЭМАЭДМА была изучена зависимость количества иммобилизованного белка от времени реакции (Рис. 5 а). Как видно из представленной кинетической кривой, через 4 часа значение количество связанного с поверхностью сорбента белка достигает максимума, после чего остается практически неизменным. При этом максимальная величина связывания белка, обнаруживаемая в случае ГМА-ЭДМА сополимера через 16-18 часов реакции и равная 200 нмоль/г сорбента, в случае сополимера ЦЭМА-ЭДМА достигается менее чем за 1 час. Концентрация исходного раствора белка, необходимая для достижения максимальной адсорбционной емкости, как и в случае двух других сополимеров, составила 5 мг/мл (Рис. 5 б). 14 В Таблице 5 представлены значения максимального количества связанного с сополимером ЦЭМА-ЭДМА лиганда, полученные при различных pH. Очевидно, что при повышении pH количество связанного с матрицей белка возрастает, однако эта зависимость не столь существенна, как в случае сополимеров ГМА-ЭДМА и ГФИАК-ГМА-ЭДМА. а) б) 400 Количество БСА, нмоль/г сорбента Количество БСА,нмоль/г сорбента 350 300 250 200 150 350 300 250 200 150 0 200 400 600 800 Время реакции, мин 1000 0 2 4 6 8 Концентрация БСА, мг/мл Рис. 5. Зависимость количества связанного с сополимером ЦЭМА-ЭДМА модельного белка БСА от времени реакции (а) и концетрации БСА в исходном растворе (б). Условия: (а) концентрация БСА 5 мг/мл, рН 9.4; (б) время реакции 4 часа, рН 9.4. Таблица 5 Зависимость количества связанного с сополимером ЦЭМА-ЭДМА белка от pH среды 7.0 Количество иммобилизованного БСА, нмоль/г сорбента 306 ± 15 8.0 327 ± 17 9.4 350 ± 19 pH Условия: концентрация раствора белка 5 мг/мл, время реакции 4 ч, температура 37°С. Таким образом, максимальная емкость сополимера ЦЭМА-ЭДМА составляет 350 нмоль лиганда/г сорбента или 9.7 нмоль/м2, что соответствует 22% занятости площади поверхности порового пространства используемого материала. 3.3. Полимерные платформы биочипов на основе макропористых метакрилатных слоев. 3.3.1. Изготовление платформы биочипа. Процедура создания микроаналитических платформ осуществлялась в несколько стадий, включающих процессы химической или механической обработки стекла (кислотное травление или фрезерование) с целью изготовления операционных ячеек на его поверхности, силанизацию поверхности Рис. 6. Схема создания основы (платформы) биочипа. 10 15 полученных ячеек и, наконец, реакцию сополимеризации соответствующих сомономеров непосредственно в изготовленных ячейках (Рис. 6). Эксперименты по оптимизации глубины операционной ячейки проводили с использованием 11 н. плавиковой кислоты. Длительность реакции определялась целевой глубиной ячейки и составляла от 10 мин (глубина ячейки 0.08 мм) до 30 мин (глубина ячейки 0.2 мм). Образовавшиеся в результате взаимодействия с плавиковой кислотой фторидные группы превращали в гидроксильные кипячением в гидроксиде натрия. Поверхность полученных ячеек обрабатывали силанизирующим агентом 3-(триметоксисилил) пропилметакрилатом. Выбор данного силана обусловлен его способностью вступать в реакцию сополимеризации с метакриловыми мономерами, обеспечивая тем самым прочное связывание полимера с поверхностью стеклянной подложки. 3.3.2. Биологический анализ с использованием модельной биоспецифической пары мышиный IgG - антитела против мышиного IgG. 3.3.2.1. Оптимизация условий иммобилизации аффинного лиганда на поверхности полимерной составляющей платформы биочипа. Разработка метода анализа белка на биочипе, в первую очередь, подразумевает поиск оптимальных условий иммобилизации аффинного комплемента к анализируемому белку (аффинного лиганда) на поверхности операционной матрицы. В Разделе 3.2 были представлены данные по иммобилизации модельного белка на поверхности синтезированных сополимеров. Следует отметить, что в данном случае были определены условия реакции, при которых с матрицей связывалось максимальное количество БСА. Однако максимальное количество прививаемого лиганда не всегда является оптимальным с точки зрения эффективности биологического анализа, построенного на образовании специфических комплексов. Поэтому оптимальные условия иммобилизации лиганда могут быть установлены лишь по результатам проведенного аналитического теста. В данной серии экспериментов была использована модельная аффинная пара мышиный иммуноглобулин G - антитела против мышиного иммуноглобулина G, полученные иммунизацией коз. При этом мышиный иммуноглобулин G использовали в качестве аффинного лиганда, а растворенный коньюгат козьих антител против мышиного иммуноглобулина G с флуоресцентной меткой Alexa Fluor 555 рассматривался как анализируемый объект. С целью определения оптимального количества аффинного лиганда, иммобилизованного на поверхности носителя, было исследовано влияние условий реакции иммобилизации, включая температуру, концентрацию и pH раствора, на результаты анализа, а именно, на количество детектируемого растворенного белка, комплементарного к иммобилизованному лиганду. Для сополимера ЦЭМА-ЭДМА также варьировали время реакции иммобилизации, поскольку предварительно было установлено, что в случае данного носителя за 1 час с поверхностью связывается приблизительно такое же количество белка, как и для сополимеров ГМА-ЭДМА и ГФИАК-ГМА-ЭДМА, в то время как максимально возможное количество связанного лиганда достигается через 4 часа. Поскольку осуществление ковалентного связывания лиганда с поверхностью макропористого носителя в течение 4 ч выражается в существенно более интенсивном флуоресцентном сигнале, в последующих экспериментах с использованием сополимера ЦЭМА-ЭДМА иммобилизацию белка проводили в течение данного времени. При использовании в качестве полимерной матрицы сополимеров ГМА-ЭДМА и ГФИАК-ГМА-ЭДМА реакцию иммобилизации проводили в течение 17 и 2 часов, соответственно. В целях оптимизации концентрации и pH раствора белка были использованы две буферные системы, а именно, 0.01 М натрий-боратный буфер (pH 9.5) и 0.01 М фосфатносолевой буфер (pH 7.5). На Рис. 7 представлены зависимости интенсивности флуоресцен- 16 ции регистрируемого сигнала меченого козьего IgG от pH иммобилизации лиганда (мышиного IgG), установленные для сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА. Из представленного рисунка очевидно, что осуществление реакции иммобилизации при pH 7.5 выражается в более интенсивном сигнале, регистрируемом после образования аффинной пары с анализируемым компонентом, а, следовательно, повышает чувствительность анализа. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что pH 9.5, при котором с поверхностью матрицы связывается наибольшее количество белка, в условиях биоанализа оказался неоптимальным, что, скорее всего, связано со стерическими препятствиями аффинному взаимодействию за счет экранирования значительного числа сайтов связывания лиганда при его высокой поверхностной плотности. б) 34000 32000 30000 28000 26000 24000 22000 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 в) Интенсивность флуоресценции, отн. ед. Концентрация мышиного иммуноглобулина G, мг/мл Интенсивность флуоресценции, отн. ед. а) Интенсивность флуоресценции, отн. ед. pH 9.5 pH 7.5 pH 9.5 pH 7.5 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Концентрация мышиного иммуноглобулина G, мг/мл pH 9.5 pH 7.5 26000 24000 22000 Условия: реакцию иммобилизации лиганда осуществляли при 37°С, время реакции составляло 17 ч для ГМА-ЭДМА, 2 ч для ГФИАК-ГМА-ЭДМА, 4 ч для ЦЭМА-ЭДМА. Погрешность измерения интенсивности флуоресценции составляла 5-7 %. 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Концентрация мышиного иммуноглобулина G, мг/мл Рис. 7. Зависимости интенсивности флуоресценции анализируемого белка от pH и концентрации раствора лиганда при его иммобилизации, установленные для сополимеровносителей ГМА-ЭДМА (а), ГФИАК-ГМА-ЭДМА (б) и ЦЭМА-ЭДМА (в). На Рис. 7 также представлена зависимость интенсивности флуоресцентного сигнала от концентрации мышиного иммуноглобулина G в растворе при его иммобилизации. Монотонное увеличение интенсивности сигнала с увеличением концентрации лиганда наблюдается лишь в случае сополимера ГМА-ЭДМА. Использование матрицы на основе сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА позволяет получать достаточно интенсивный сигнал адсорбированного белка уже при концентрации лиганда 0.2 мг/мл, что, по-видимому, связано с меньшей плотностью адсорбционных сайтов сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА по сравнению с двумя другими материалами, а, следовательно, более быстрым их насыщением аффинным лигандом. В случае сополимера ЦЭМА-ЭДМА, интенсивность сигнала возрастала 17 Соотношение сигнал/шум при увеличении концентрации лиганда в растворе при его иммобилизации от 0.2 до 0.8 мг/мл, однако при использовании концентрации 1 мг/мл интенсивность флуоресценции адсорбированного комплемента снижалась, причиной чего, вероятно, является чрезмерно высокая плотность лиганда на единицу поверхности, вызывающая серьезные стерические препятствия образованию аффинного комплекса. Для определения оптимальной температуры реакции иммобилизации полимернонеорганические пластины инкубировали с раствором мышиного иммуноглобулина G при 4°С и 37°С. Было показано, что проведение реакции иммобилизации при температуре 37°С выражается в более интенсивном флуоресцентном сигнале. Для оценки необходимости поверхность не блокировали проведения процедуры блокирования поверхность блокировали поверхностных реакционных групп 120 носителя после иммобилизации ли100 ганда, был осуществлен эксперимент 80 с использованием двух слайдов, поверхность одного из которых после 60 иммобилизации лиганда блокировали 40 с использованием 1% раствора БСА в фосфатно-солевом буфере, в то время 20 как поверхность второго оставляли 0 неблокированной. Представленные на 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Концентрация мышиного иммуноглобулина G, мг/мл Рис. 8 результаты демонстрируют значительное увеличение соотноРис. 8. Влияние процедуры блокирования по- шения сигнал/шум, являющееся хаверхности монолита на качество спотов: изме- рактеристикой качества светящихся нение соотношения сигнал/шум. зон (спотов), при блокировании поУсловия: температура реакции иммобилизации 37°С, рН 7.5. верхности. Погрешность измерения составляла 5-7 %. 3.3.2.2. Сравнение эффективности разработанных трехмерных микроаналитических устройств на основе метакрилатных монолитов и стандартных двумерных стеклянных чипов. Биологические микрочипы на основе стекла, поверхность которого модифицирована реакционно-способными группами, достаточно широко используются в настоящее время для проведения обсуждаемого биологического анализа. В качестве сравнения, нами были использованы стеклянные чипы с поверхностью, активированной альдегидными группами. Основное отличие разработанных нами полимерных носителей от стеклянных заключается в том, что в первом случае реакция специфического связывания лиганда и анализируемого объекта протекает в порах трехмерного носителя, в то время как во втором реакция аффинного комплексообразования имеет место лишь на двумерной поверхности стекла. Из представленных на Рис. 9 диаграмм видно, что полимерные трехмерные матрицы демонстрируют более высокое соотношение сигнал/шум по сравнению со стеклянным носителем. Такой результат обусловлен более высокой адсорбционной емкостью пористого носителя по сравнению с планарным. Для оценки воспроизводимости результатов микроанализа, полученных с использованием той или иной поверхности, обычно используют коэффициент изменчивости (К), который представляет собой отношение стандартного отклонения значения интенсивности флуоресценции анализируемой зоны к значению интенсивности флуоресценции этой зоны. При этом различают коэффициент изменчивости сигналов, полученных в одном экспери- 18 ГМА-ЭДМА ГФИАК-ГМА-ЭДМА ЦЭМА-ЭДМА стекло 600 500 400 300 200 100 0 0,2 0,4 0,6 0,8 ГМА-ЭДМА ГФИАК-ГМА-ЭДМА ЦЭМА-ЭДМА б) Максимальное соотношение сигнал/шум а) Максимальное соотношение сигнал/шум менте на одном носителе (К1) и коэффициент изменчивости сигналов, полученных при исследовании ряда носителей данного типа (К2). В Таблице 6 представлены коэффициенты изменчивости, полученные для синтезированных сополимеров и альдегид-содержащих стеклянных слайдов. 120 100 1,0 80 60 40 20 0 0,2 Концентрация мышиного иммуноглобулина G, мг/мл 0,4 0,6 0,8 1,0 Концентрация мышиного иммуноглобулина G, мг/мл Рис. 9. Сравнительная диаграмма зависимости максимального соотношения сигнал/шум, полученного для разных материалов, от концентрации лиганда в растворе при иммобилизации: (а) концентрация анализируемого белка 200 нг/мл, (б) концентрация анализируемого белка 20 нг/мл. Таблица 6 Коэффициенты изменчивости и пределы детектирования, полученные для исследуемых носителей Носитель Стекло К1, % 17 К2, % 14 Предел детектирования, нг/мл 200 ± 20 ГМА-ЭДМА 8 8 20 ± 2 ГФИАК-ГМА-ЭДМА 17 19 20 ± 2 ЦЭМА-ЭДМА 10 11 10 ± 1 Таким образом, сополимеры ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА демонстрируют достаточно высокую воспроизводимость флуоресцентного сигнала. Коэффициенты изменчивости, полученные для сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА близки к коэффициентам изменчивости стеклянных слайдов. Скорее всего, это обусловлено недостаточно высокой воспроизводимостью синтеза данного сополимера, обладающего более дефектной поверхностью по сравнению с сополимерами ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА. Однако можно заключить, что применение всех полученных полимерных материалов позволяет детектировать, как минимум, в 10 раз меньшее количество анализируемого белка по сравнению с планарными стеклянными слайдами. 3.3.3. Применение разработанных аналитических устройств на основе сополимера ГМА-ЭДМА для детектирования антител к антигену T. Pallidum в сыворотке крови человека. Разработанная основа биочипа на основе макропористого монолита ГМА-ЭДМА была использована для создания тест-системы, предназначенной для обнаружения в сыворотке крови человека антител к антигену Treponema pallidum, являющемуся возбудителем 19 тяжелого инфекционного заболевания – сифилиса. В качестве одного из решений задачи высокоэффективного серологического скрининга населения может быть предложено сочетание использования высокоспецифичного антигена T. pallidum с технологией биочипов. В данной работе был использован антиген T. pallidum с молекулярной массой 17 kDa, полученный генно-инженерным способом в культуре E. сoli. Концентрацию предназначенного для иммобилизации раствора антигена варьировали от 0.2 до 1 мг/мл. На Рис. 10 представлены флуоресцирующие зоны, полученные после точечного нанесения образцов положительных и отрицательных сывороток крови на поверхность биочипа с последующей обработкой тест-системы поликлональными антителами против человеческих антител к антигену T. pallidum, мечеными ФИТЦ. Как видно из Рис. 10, концентрация антигена 0.4 мг/мл может быть рекомендована в качестве оптимальной, так как ее использование обеспечивало достаточный флуоресцентный сигнал после обработки тест-системы положительной сывороткой, в то время как при использовании отрицательной сыворотки сигнал регистрировался как незначительный. При увеличении концентрации лиганда от 0.4 до 1 мг/мл флуоресценция зон, полученных с использованием отрицательной сыворотки, увеличивалась, что может быть следствием неспецифического взаимодействия других сывороточных белков с антигеном T. pallidum. Чувствительность и специфичность тест-системы на основе сополимера ГМАЭДМА с ковалентно связанным рекомбинантным антигеном T. pallidum составили 92 и 80%, соответственно. Полученное значение чувствительности является удовлетворительным и близким к значению того же параметра для стандартного иммуноферментного метода (93.5%). Значение специфичности является ниже принятых величин, что можно объяснить необходимостью дальнейшей оптимизации разработанного метода. 0.2 мг/мл 0.2 мг/мл 0.4 мг/мл 0.6 мг/мл 0.8 мг/мл 1.0 мг/мл 0.4 мг/мл 0.6 мг/мл 0.8 мг/мл 1.0 мг/мл Рис. 10. Изображение флуоресцирующих зон, полученных с использованием люминесцентной микроскопии. Верхний ряд спотов получен при использовании положительных сывороток, нижний – при использовании отрицательных сывороток. 3.3.4. Детектирование остеопонтина в клеточном супернатанте с использованием разработанных наноаналитических устройств. Разработанные прототипы биочипа были использованы для детектирования остеопонтина (белка, являющегося одним из основных маркеров костеобразования) с целью контроля за ростом клеточной массы в процессе инженерии костной ткани. Для определения предела детектирования тест-системы концентрацию модельных растворов остеопонтина варьировали от 0.001 до 1 мкг/мл. Изображения флуоресцирующих зон (спотов), полученных при разных концентрациях, представлены на Рис. 11. Предел детектирования составил 0.01 мкг/мл (или 0.3 пмоль/мл). 20 0.001 мкг/мл 0.01 мкг/мл 0.1 мкг/мл 1 мкг/мл Рис. 11. Изображение флуоресцирующих зон, полученных при использовании различных концентраций остеопонтина. Максимальное соотношение сигнал/шум Для оценки возможности детектирования остеопонтина в ре160 альной биологической жидкости с 140 помощью разработанной тест120 системы были использованы 2 су100 пернатанта, один из которых был 80 получен после культивации клеточ60 ной линии, берущей начало от клеток первичной остеосаркомы, а, 40 следовательно, данный образец 20 должен содержать определенное 0 ГМА-ЭДМА ГФИАК-ГМА-ЭДМА ЦЭМА-ЭДМА количество остеопонтина. Второй образец, apriori не содержащий Рис. 12. Соотношение сигнал/шум, полученное для остеопонтин, был получен в резульисследуемых носителей при детектировании остео- тате культивации первичных мезенхимальных стволовых клеток, полупонтина в клеточном супернатанте. ченных из жировой ткани. Данные Погрешность измерения составляла 5-6 %. образцы сложных жидкостей подвергались анализу с использованием всех трех разработанных сополимеров. Все материалы позволили детектировать присутствие остеопонтина в первом образце и его отсутствие во втором. На Рис. 12 представлены значения соотношения сугнал/шум, полученные при детектировании остеопонтина с использованием исследуемых носителей. Выводы 1. Впервые осуществлен синтез сшитых жесткоцепных сополимеров N – гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ГФИАК-ГМА-ЭДМА) и 2-цианоэтилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ЦЭМА-ЭДМА). Установлены оптимальные условия получения методом фотоинициируемой полимеризации сополимеров глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ГМА-ЭДМА), ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА, обеспечивающие получение материалов с заданными поровыми характеристиками. 2. Исследовано влияние условий ковалентного связывания модельного белка (бычьего сывороточного альбумина) с поверхностью синтезированных сополимеров (время реакции, pH, концентрация раствора белка) на степень модификации носителя белком. Показано, что максимальная степень модификации сорбента лигандом в случае сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА достигается за 2 часа и составляет 250 нмоль/г, 21 тогда как для сополимера ЦЭМА-ЭДМА эта величина достигает 350 нмоль/г сорбента при проведении реакции в течение 4 часов. 3. Разработан принцип конструирования полимерно-неорганической основы биочипа на основе стеклянной поддерживающей среды и макропористых полимерных носителей, включающий изготовление на поверхности стекла операционных ячеек, обработку полученных ячеек ненасыщенным силанизирующим агентом и синтез привитого сополимера непосредственно в изготовленных ячейках. 4. С использованием модельной пары комплементарных белков мышиный иммуноглобулин G – козьи антитела против мышиного иммуноглобулина G оптимизированы основные условия осуществления биоанализа, обеспечивающие максимальную эффективность сконструированных микроустройств. Показано, что чувствительность анализа, проводимого на чипе с монолитным полимерным слоем на порядок превышает таковую для планарных стеклянных чипов. 5. На примере выявления антител к антигену бледной трепонемы в сыворотке крови человека, а также детектирования остеопонтина в клеточном супернатанте продемонстрирована перспективность применения полученных прототипов микроаналитических систем для медицинских и биотехнологических целей. Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях: 1. Г. Н. Химич, Е. Н. Рахматуллина, М. Ю. Слабоспицкая, Т. Б. Тенникова. Синтез и исследование поровой структуры полимерных монолитных сорбентов.// Журнал прикладной химии. 2005. Т. 78. 4. С. 623-628. 2. M. Yu. Slabospitskaya, E. G. Vlakh, N. N. Saprykina, T. B. Tennikova. Synthesis and investigation of a new macroporous monolithic material based on an N-hydroxyphthalimide ester of acrylic acid-co-glycidyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate terpolymer. // J. Appl. Polym. Sci. 2009. V. 111. P. 692-700. 3. E. G. Vlakh, M. Yu. Slabospitskaya, T. B. Tennikova. Solid phase peptide synthesis on macroporous methacrylate monolithic layers, in book: M. Flegel, M. Fridkin, C. Gilon, J. Slaninova (Eds.). Peptides 2004. Proceedings of the 3rd International and 28th European Peptide Symposium. Lausanne: Kenes International (2004). P. 5-6. 4. М. Ю. Слабоспицкая, Е. Г. Влах, Н. В. Раздольская, М. В. Сердюцкая, А. М. Иванов, Т. Б. Тенникова. Прототип биологического микрочипа на основе макропористых монолитных носителей для диагностики сифилиса. В сб. «Измерительные и информационные технологии в охране здоровья. Метромед 2007». Сборник трудов международной научной конференции. Санкт-Петербург. 17-19 апреля, 2005. С. 191-196. 5. М. Ю. Слабоспицкая, Г. Н. Химич, Т. Б. Тенникова. Получение макропористых монолитных ГМА-ЭДМА сополимеров методом фотоинициируемой радикальной полимеризации. Санкт-Петербургская конференция молодых ученых “Современные проблемы науки о полимерах”. Санкт-Петербург, 1-3 февраля, 2005. Ч. 1, С. 84. 6. М. Ю. Слабоспицкая, Е. Г. Влах, Т. Б. Тенникова. Макропористые полимерные слои для создания биологических микрочипов. Санкт-Петербургская конференция молодых ученых “Современные проблемы науки о полимерах”. Санкт-Петербург, 1-3 февраля, 2005. Ч. 2. С. 86. 22 7. M. Slabospitskaya, E. Vlakh, T. Tennikova. New polymer monolithic materials for protein microarrays. 5th International Symposium “Molecular Mobility and Order in Polymer Systems”. Saint-Petersburg, Russia, June 20-24, 2005. Book of Abstracts. P-166. 8. I. Kalashnikova, N. Ivanova, M. Slabospitskaya, T. Tennikova. Use of microarray approach for quantitative detection of virus-like particles. Monolith Summer School (MSS 2006) “Application in biochromatography, bioconversion and solid phase synthesis”, Portoroz, Slovenia, May 28-31, 2006. www.monoliths.com/ SummerShcool. 9. M. Yu. Slabospitskaya, E. S. Sinitsyna, E. G. Vlakh, T. B. Tennikova. Bioanalytical testsystems based on polymer monolithic materials. International Congress on Analytical Sciences (ICAS-2006). Moscow, Russia, 25-30 June, 2006. Book of Absracts. P 248. 10. M. Yu. Slabospitskaya, E. G. Vlakh, N.V. Razdolskaya, M.V. Serdyutskaya, A. M. Ivanov, T. B. Tennikova. 3-D biochips based on macroporous monolithic polymers for diagnostics of syphilis. European Congress and Exhibition on Advanced Materials and Procesess (Euromat 2007). Nuremberg, Germany, September 10-13, 2007. www.euromat2007.fems.org, X42-1944. 11. М. Ю. Слабоспицкая, Е. Г. Влах, Т. Б. Тенникова. Синтез тройного метакрилатного сополимера для создания белковых микрочипов. 3-я Санкт-Петербургская конференция молодых ученых “Современные проблемы науки о полимерах”. СанктПетербург, Россия, 17-19 апреля, 2007. С. 36. 12. M. Slabospitskaya, E. Vlakh, N. Rasdolskaya, A. Ivanov, T. B. Tennikova. Microanalytical platform based on macroporous methacrylate copolymers for serum diagnostics of syphilis. The Young Scientists’ and Students’ International Scientific Conference “Modern Problems of Microbiology and Biotechnology”, Odessa, Ukraine, May 28-31, 2007. Book of Abstracts. P. 91. 13. E. Vlakh, M. Yu. Slabospitskaya, E. S. Sinitsyna, T. Tennikova. Rigid macroporous methacrylate-based copolymers for 3-D protein microarray. Baltic Polymer Symposium 2007 (BPS 2007). Druskinikai, Lithuania, September 19-21, 2007. Book of Abstracts, P. 38. 14. E. Maksimova, M. Slabospitskaya, E. Vlakh, T. Tennikova. Synthesis of rigid macroporous polymer supports based on 2-cyanoethyl methacrylate and ethylene glycol dimethacrylate. 4-th Saint-Petersburg Young Scientists Conference “Modern Problems of Polymeric Science”, April 15-17, 2008. Book of Abstracts, P. 48. 15. E. Vlakh, E. Maksimova, M. Slabospitskaya, T. Tennikova. Development of cyanobearing macroporous materials for bioaffinity based processes. Baltic Polymer Symposium 2008 (BPS 2008). Otepaa, Estonia, May 13-16, 2008. Book of Abstract, P. 69. 16. E. Maksimova, M. Slabospitskaya, E. Vlakh, T. Tennikova. Novel functional methacrylate monoliths with reactive cyano-groups. Monolith Summer School and Symposium for Biochromatography, Bioconversion, and Solid Phase Synthesis (MSS 2008). Portoroz, Slovenia, 30 May -4 June, 2008. Book of Abstracts, P. 36. 17. Marina Slabospitskaya, Elena Maksimova, Evgenia Vlakh, N. Saprykina, C. Kasper, Tatiana Tennikova. Comparison of different functional macroporous monolithic polymers for 3-D protein nanoarray. 6th International Symposium “Molecular Order and Mobility in Polymer Systems”. Saint-Petersburg, Russia, June 2-6, 2008. Book of Abstracts. P. 219. 18. M. Slabospitskaya, J. Walter, E. Vlakh, F. Stahl, C. Kasper, T. Tennikova. New format of monoliths applications: 3D–protein nanoarrays. Monolith Summer School and Symposium for Biochromatography, Bioconversion, and Solid Phase Synthesis (MSS 2008). Portoroz, Slovenia, 30 May -4 June, 2008. Book of Abstracts, P. 32.