Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол

На правах рукописи
Золотарева Наталья Владимировна
Регуляция каталитической активности
алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами
Пирацетам, Зорекс и Унитиол
03.01.04 – биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Тверь – 2011
Работа выполнена на кафедре физико-химической экспертизы
биоорганических соединений Тверского государственного университета
Научный руководитель
доктор химических наук, профессор
Лапина Галина Петровна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Рабинович Галина Юрьевна
кандидат биологических наук, доцент
Карцова Софья Владимировна
Ведущая организация
Самарский государственный
медицинский университет
Защита диссертации состоится « 12 » мая 2011 года в 14 00 часов на
заседании диссертационного совета ДМ 212.263.08 при Тверском
государственном университете по адресу:
170002,
г. Тверь,
пр. Чайковского, 70/1Б, корп. 5, ауд. 318.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского
государственного университета по адресу: 170100, г. Тверь,
ул. Володарского, 44 а.
Автореферат разослан «___» апреля 2011 года
Ученый секретарь
диссертационного совета
Н. В. Костюк
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Одна из наиболее актуальных в физикохимическом аспекте проблем биохимии алкоголизма – регуляция активности
алкогольдегидрогеназы (АДГ). В ряде исследований (Островский Ю.М.,
Сатановская В.И., Садовник М.Н., 1969; White, A.M., 1998; Нужный В.П.,
2002 и др.) установлено, что в качестве субстрата фермента наиболее часто
используется этанол. Достаточно полно изучен физиологический аспект
действия этанола на организм человека (Бурков Ю.В., Иванова Н.Н., 2008), а
также исследован ферментативный механизм утилизации этанола в организме
человека (Груздева К. Н., 2001 и др.) при участии фермента
алкогольдегидрогеназы. Однако вопросы регуляции ферментативной
активности алкогольдегидрогеназы изучены недостаточно.
Алкогольдегидрогеназа – фермент класса оксидоредуктаз (1.1.1.1),
катализирующий процессы окисления никотинамидадениндинуклеотидом
(НАД) первичных алифатических спиртов в соответствующие альдегиды
(Диксон М., Уэбб Э., 2005). Алкогольдегидрогеназы найдены в тканях
животных (печени лошади) (Xie P., 2005), растениях (томатах и картофеле),
грибах, дрожжах, бактериях (Авилова Т.В., 2001) и др. Наиболее изученными
ферментами являются алкогольдегидрогеназы, выделенные из дрожжей, а
также печени лошади (Сапожников Г.П., Лозитнова А.Б., 2004; Лапина Г.П.,
Золотарева Н.В., 2006 – 2008).
Алкогольдегидрогеназы
являются
недостаточно
исследованными
биокатализаторами
c
точки
зрения
использования
различных
фармпрепаратов, применяемых для лечения больных хроническим
алкоголизмом (Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н., 2002). До настоящего времени
актуальным является поиск специфических эффекторов фермента
алкогольдегидрогеназы, окисляющих этанол, с целью регулирования
концентрации этанола и ацетальдегида в организме, что важно в изучении
молекулярных основ биохимии алкоголизма (Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н.,
1984; Марри Р., Греннер Д., 1993; Goldberg L., Rudberg U., 2004).
Вопросы изучения и установления молекулярных механизмов такого рода
эффекторов (активаторов или ингибиторов фермента) относятся к
перспективным направлениям современной энзимологии и обсуждались на
Symposium of A.I. Oparin: «Biochemistry of the twenty-first century: problems
and frontiers», 1994; а также в работах (Бонитенко Е.Ю., 2003; Zidoni Е., Кrеter
M., 2004 и др.). Поиск решения поставленной задачи и определяет
актуальность данной работы.
В практической медицине довольно широко используются фармпрепараты
Пирацетам и Зорекс (Wyllie M. G., Paciorec P. M., 2001; Waterfall J. F., 2003).
Физиологические основы действия данных регуляторов известны: Пирацетам,
являясь ноотропным фармпрепаратом, изменяет метаболические и
биоэнергетические процессы в нервной клетке, улучшает функции головного
мозга, усиливая кровоток (Руденко Г. М., 1996; Benzi G., Pastoris O., 1997);
Унитиол, в свою очередь, в составе Зорекса способствует восстановлению
3
обмена веществ в нервных клетках и выведению продуктов распада этанола
из органов и тканей (Ostrovskaja R. U., Hoffmann W., Molodawkin G. M., 1993;
Roglev M., 2001).
Эффективное использование этих фармпрепаратов базируется на
информации о молекулярно-кинетическом характере их действия на фермент
АДГ, который в полной мере не изучен.
Цель работы: исследование молекулярно-кинетического механизма
действия фармакологических препаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола
(составной
части
Зорекса)
на
каталитическую
активность
алкогольдегидрогеназы в условиях in vitro.
Задачи исследования:
1. Выделить и очистить алкогольдегидрогеназу из пекарских дрожжей по
методу Г.А. Кочетова. Определить субстратную специфичность фермента
в группе этанол-бутанол-изопропанол и
рассчитать его основные
ферментативные параметры и выявить оптимальную концентрацию
специфичного субстрата. Сравнить ферментативные показателей
алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей и алкогольдегидрогеназы
печени лошади.
2. Разработать многоэтапный научно-методический подход по изучению
каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади в
присутствии регуляторов и оптимизировать его:
- рассчитать значения важнейших ферментативных параметров
каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади для
системы контроля;
- выявить влияние Пирацетама и никотинамидадениндинуклеотида на
каталитическую
активность
алкогольдегидрогеназы.
Найти
их
оптимальные концентрации;
- определить действие Зорекса и Унитиола на активность биокатализатора.
3. Установить тип регулирования (активации или ингибирования)
алкогольдегидрогеназы в присутствии Пирацетама, Зорекса и Унитиола.
4. Для изученных ферментативных систем построить геометрический
«портрет» в трехмерной Kм' V' – системе координат и на этой основе

рассчитать дополнительный ферментативный параметр (длину pI a(1) -,


pI a ( 2 ) -, pI a(3) - векторов).
Научная новизна результатов исследования
Разработан многоэтапный научно-методический подход по изучению
влияния фармакологических препаратов Пирацетам, Зорекс и Унитиол на
каталитическую активность АДГ.
Впервые выявлены типы активации АДГ при действии на фермент
фармпрепаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола и установлена
эффективность функционирования биокатализатора на основе векторных
построений данных ферментативной кинетики в трехмерной Kм'V' – системе
координат,
позволивших
впервые
получить
визуализацию
хода
ферментативного процесса с участием АДГ в присутствии Пирацетама,
4
Зорекса и Унитиола и рассчитать новый ферментативный параметр – длину
вектора, характеризующего интенсивность активации фермента и
отражающего
суммарную
эффективность
функционирования
биокатализатора.
Теоретическая и практическая значимость работы. Работа носит
фундаментальный характер и направлена на изучение молекулярнокинетического поведения алкогольдегидрогеназы.
Полученные данные в рамках разработанного в данной работе
многоэтапного научно-методического подхода расширяют и развивают
теоретические представления об эффективности регулирования биокатализа в
присутствии различных добавок.
Разработанная схема изучения типа регулирования (активации или
ингибирования) АДГ для фармакологических препаратов (Пирацетам, Зорекс
и Унитиол), направленная на поиск оптимальных условий течения
ферментативной реакции, может служить моделью для изучения других
фармпрепаратов, действующих на фермент утилизации этанола –
алкогольдегидрогеназу – с целью устранения последствий интоксикации
организма.
Часть полученных данных и сделанные выводы использованы при
выполнении проекта № 2.1.1/1897 «Исследование взаимосвязи структурнодинамических свойств ферментов с их функциональной активностью и
разработка новых биокатализаторов на основе иммобилизованных
окислительно-восстановительных ферментов для биомедицинской и пищевой
промышленности», выполняемого по аналитической ведомственной целевой
программе «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011
годы)». (Заказчик проекта – Министерство образования и науки Российской
федерации, Федеральное агентство по образованию).
Научные результаты, выносимые на защиту:
1. Максимальная субстратная специфичность выделенной и очищенной из
пекарских дрожжей алкогольдегидрогеназы среди спиртов различного
строения наблюдается к этиловому спирту. Рассчитаны значения важнейших
ферментативных параметров биокатализатора (Кm, Vmax и Kкат). Выявлена
оптимальная концентрация специфичного субстрата – этанола, равная
1,5·10-2М.
2. Разработанный многоэтапный научно-методический подход по
изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы позволил
установить,
что
фармпрепарат
Пирацетам
как
активатор
алкогольдегидрогеназы обладает большей эффективностью в сравнении с
Зорексом и Унитиолом.
3.
Пирацетам,
Зорекс
и
Унитиол
по-разному
активируют
алкогольдегидрогеназу, а именно в случае Пирацетама – двухпараметрически
рассогласованный тип активации (IIa-тип, Крупянко В.И., 1994), для Зорекса
и Унитиола – двухпараметрически согласованный тип активации (Ia-тип,
Крупянко В.И., 1994) фермента.
5
4. Расчет дополнительного ферментативного параметра – значения длины
вектора – на основе векторного построения геометрического «портрета»
алкогольдегидрогеназной реакции подтвердил наибольшую эффективность
фармпрепарата Пирацетама в сравнении с Зорексом и Унитиолом.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Полученные результаты соответствуют пункту 4 паспорта специальности
03.01.04 «Биохимия (биологические науки)».
Апробация и реализация результатов диссертации
Основные положения и выводы диссертации апробированы в
выступлениях на научных конференциях. Материалы диссертации
докладывались и обсуждались на V и VII научных конференциях аспирантов
и студентов химического факультета (Тверской государственный
университет, Тверь, 2006 и 2008); на XVI и XVII Региональных Каргинских
чтениях «Физика, химия и новые технологии» (Тверской государственный
университет, Тверь, 2009 и 2010); на Международной конференции
«Состояние воды в биологических и модельных системах» (Тверская
государственная медицинская академия, Тверь, 2007); Всероссийской
научной школе для молодежи «Приборное и научно-методическое
обеспечение исследований и разработок в области каталитического
превращения бифункциональных органических соединений» (Тверская
государственная сельскохозяйственная академия, Тверь, 2010), а также на
научных
семинарах
кафедры
физико-химической
экспертизы
биоорганических соединений ТвГУ и при выполнении дипломных работ, в
которых соискатель был научным руководителем дипломников.
Полученные результаты по выявлению особенностей ферментативного
поведения алкогольдегидрогеназы печени лошади и оптимизации метода
выделения
фермента
из
пекарских
дрожжей
используются
в
исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре физикохимической экспертизы биоорганической экспертизы ТвГУ: в курсе лекций,
при подготовке курсовых и дипломных работ студентов.
Публикации. Результаты исследования отражены в 9 публикациях, 3 из
которых в рецензируемых научных журналах, включенных в перечень ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131
страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,
экспериментальной части, методов исследований, результатов собственных
исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы,
включающего 182 источника, из которых 70 иностранных авторов. Работа
иллюстрирована 17 таблицами и 68 рисунками.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
– Алкогольдегидрогеназа печени лошади – очищенный гомогенный
коммерческий препарат фирмы «Reanal» (Венгрия).
– Алкогольдегидрогеназа пекарских дрожжей (выделен по методу Г.А.
Кочетова).
6
– Фармакологический коммерческий препарат Пирацетам (2-оксо-1пирролидинилацетамид) фирмы ОАО «Фармстандарт – УфаВита» (Россия) (в
ампулах).
– Фармакологические коммерческие препараты Зорекс (Унитиол–2,3димеркаптопропансульфонат натрия и кальция пантотената) (в капсулах) и
Унитиол – фармпрепараты фирмы «Valenta» (Россия) (в ампулах).
– Сывороточный альбумин человека (САЧ) коммерческий препарат,
лиофилизованный из человеческой сыворотки, фирмы «Reanal» (Венгрия).
В работе использованы следующие методы:
– Метод выделения и очистки АДГ (метод Г.А. Кочетова, 1998) с
некоторыми собственными изменениями методики (с использованием
буферных растворов рН 6,0 и 7,5; тепловой обработки при 35ºC). Схема
выделения и очистки АДГ дана на рис.1. Выделение фермента АДГ из
пекарских дрожжей вели в течение трех недель.
Рис.1. Схема выделения и очистки АДГ из пекарских дрожжей по методу
Г.А. Кочетова с собственными модификациями
– Метод калибровочного графика, построенного по белку-стандарту –
коммерческому препарату сывороточный альбумин человека (рис.2),
применяли для оценки и расчета концентрации ферментативно-активного
белка.
– Метод определения ферментативной кинетической активности АДГ.
При окислении этилового спирта образуется восстановленный НАД,
количество которого определяли фотометрически.
АДГ
С2Н5ОН+НАД
→ СН3СНО + НАД·Н + Н+
Измеряли увеличение значения оптической плотности (D) при длине
волны 340 нм во времени (t). Контрольная кювета не содержала субстрата.
Активность рассчитывали исходя из данных, полученных в течение 15—45
с хода ферментативной реакции.
– Метод Лайнуивера–Берка для обработки данных ферментативной
кинетики и расчета важнейших ферментативных параметров: Km –
константы Михаэлиса, Vmax – максимальной скорости реакции и Kкат –
+
7
константы каталитической. В ходе ферментативной реакции
рассчитывали начальные скорости реакций по зависимостям оптической
плотности (D) во времени (t), строили прямые в координатах Лайнуивера–
Берка (1/V и 1/[S]) и вели расчет важнейших ферментативных параметров –
Кm, Vmax и Kкат.
– Метод векторных диаграммных построений. В трехмерной Kм'V'системе прямоугольных координат каждая ингибируемая или активируемая
ферментативная реакция получает свое векторное представление –
конкретный трехмерный вектор L этой реакции. При этом длина данного
вектора характеризует интенсивность протекания ферментативной реакции:
положение L вектора в системе координат – тип изучаемой реакции,
направление смещения – тенденцию к смене типа реакции, а траектория,
описываемая подвижным концом вектора, – геометрический «портрет»
изучаемой реакции.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изученные ферментативные системы:
Ферментативная система-1 (система контроля): АДГ печени лошади
(2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), НАД различных концентраций (5,0; 4,5; 4,0;
3,5; 2,5; 1,5)(10-2М).
Ферментативная система-2 состоит из АДГ печени лошади (2,41·10-4М),
этанола С2Н5ОН (1,510-2М), НАД (1,510-2М) при различных концентрациях
Пирацетама (0,5–4,5)(10-2М).
Ферментативная система-3, включающая фермент АДГ печени лошади
(2,41·10-4М), этанол С2Н5ОН (1,510-2М), Пирацетам (1,510-2) при
варьировании концентрации НАД (0,5–4,5)(10-2М).
Ферментативная система-4 состоит из АДГ печени лошади (2,41·10-4М),
этанола С2Н5ОН (1,510-2М), Зорекса (5·10-2М) при варьировании
концентрации НАД (1,5–5,0)(10-2М).
Ферментативная система-5: фермент АДГ печени лошади (2,41·10-4М),
этанол С2Н5ОН (1,510-2М), Унитиол (5·10-2М) (как составная часть Зорекса)
при варьировании концентраций НАД (1,5–5,0)(10-2М).
Первый этап работы, изложенный в пункте 4.1 диссертации, посвящен
выделению и очистке АДГ из пекарских дрожжей (рис. 1) по методу Г.А.
Кочетова с собственными изменениями. Изучена субстратная специфичность
АДГ в группе различных субстратов (этиловый, бутиловый и изопропиловый
спирты). Определены важнейшие ферментативные параметры – Кm, Vmax и
Kкат, найдена оптимальная концентрация этанола.
По калибровочной зависимости (рис. 2) рассчитали содержание
ферментативно активного белка в полученных экстрактах. Для значения
величины оптической плотности (D), равной 0,50 опт. ед., по калибровочной
кривой нашли значение концентрации фермента, составившее 8,42·10-5 г
белка /г сырой массы дрожжей или 2,41·10-4М.
8
Рис.
2.
Калибровочная
зависимость
оптической
плотности
(D)
от
концентрации белка (С)
сывороточного
альбумина
человека («Reanal», Венгрия)
Для изучения субстратной специфичности использовали водные
растворы различных субстратов: этанола, изопропанола и бутанола-1,
концентрации которых меняли в интервале (1,5–6,0)·10-2М.
Далее
определяли кинетику течения биокаталитической реакции по изменению
величины оптической плотности (D) во времени (t). В качестве примера на
рис. 3 представлены зависимости D~t для водного раствора субстрата
этанола концентраций и (·10-2М) 6,0 и 1,5.
Рис. 3. 3асимости оптической плотности (D) во времени (t) окисления
субстрата-этанола водным раствором АДГ (2,41·10-4М) печени лошади
для концентраций (·10-2М) субстрата: a – 6,0 и b –1,5
На основе кинетических зависимостей (рис. 3) рассчитывали начальные
скорости АДГ-зависимых ферментативных реакций (V0), которые спрямляли
в координатах двойных обратных величин (координатах Лайнуивера–Берка)
(рис. 4).
9
Рис.
4.
Зависимость
обратных
величин
начальных скоростей от
обратных
величин
концентраций
субстратов
этанола – (·) и НАД – ( ) для
водного
раствора
АДГ
-4
дрожжевой (2,41·10 М)
На основе рис. 4 провели расчет значений Km, Ккат и Vmax для водного
раствора фермента (2,41·10-4М), которые составили, соответственно, (2,85 ±
0,19)·10-5М; (9,23 ± 0,18)·10-2с-1 и (3,86 ± 0,18)·10-5опт.ед./с. Полученные
характеристики корректно согласуются с данными литературы (Xie P.,
Parsons S.H., Speckhard D.C., 1997), что указывает на достоверность
полученных данных.
По вышеприведенной схеме определены ферментативные параметры для
двух других субстратов: бутанола-1 и изопропанола (табл.1). В ряду
субстратов-спиртов (этанол, бутанол-1 и изопропанол) численные значения
Km возрастают в 3,2 раза и уменьшаются в 1,6 раза значения Vmax. Это
означает, что в изученной группе субстратов АДГ: этанол – бутанол-1 –
изопропанол, – сродство их к ферменту постепенно снижается. Для этанола
найдена максимальная активность АДГ дрожжевой (Vmаx), минимальная –
для изопропанола.
Таблица 1
Рассчитанные параметры ферментативной активности АДГ дрожжевой
для водных растворов различных спиртов – субстратов
Vmax,·10-5
Субстрат
Кm,·10-5 М
Ккат,·10-2 с-1
опт.ед./с
Этиловый спирт
2,85±0,19
3,86±0,18
9,23±0,18
Бутиловый спирт
6,67±0,21
2,47±0,21
6,19±0,21
Изопропиловый
9,09±0,20
1,49±0,20
3,47±0,20
спирт
Активность (Ккат) по бутанолу-1 и изопропанолу уменьшается в 1,5 и 2,5
раза по сравнению со скоростью окисления этанола. Таким образом,
обнаружено, что с различными субстратами биокатализ идет по-разному, что
свидетельствует о наличии субстратной специфичности АДГ дрожжевой.
Выявлен наиболее оптимальный субстрат – этанол, для которого значение
Ккат максимально и составляет (9,23±0,19)·10-2с-1.
Следует
отметить,
что
изучение
ферментативного
процесса,
катализируемого АДГ, при варьировании концентрации второго компонента
10
субстрата – НАД – позволило получить значения Km и Vmax близкие к тем,
что были рассчитаны для ферментативной системы при варьировании
второго компонента субстрата-этанола.
Полученные данные согласуются с (Hurley T.D., Bosron W.F., Stone C.L.,
1994), где определена субстратная специфичность для АДГ, выделенной из
других природных источников (растений и грибов), что подтверждает
универсальность полученных результатов.
На первом этапе исследовательской работы разработаны собственные
эффективные модификации метода выделения и очистки фермента. Освоен и
применен кинетический метод определения ферментативных параметров
алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей, а также изучена и установлена
субстратная специфичность АДГ дрожжевой, т.е. оптимизированы условия
для выполнения последующих этапов дальнейшей работы.
На втором этапе работы определены кинетические параметры
каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади в системе
контроля (сравнения), включающей АДГ печени лошади (2,41·10-4М),
С2Н5ОН (1,510-2М), но при варьировании концентрации НАД (0,5–5,5)10-2М
(ферментативная система-1). В ходе определения активности АДГ печени
лошади построены кинетические зависимости изменения оптической
плотности (D) во времени (t) в системе контроля для следующих
концентраций НАД (0,5–5,5)10-2М. Кинетические зависимости имели
стандартный вид кривых с насыщением. По освоенной схеме построены
спрямленные кинетические зависимости в координатах Лайнуивера–Берка и
рассчитаны параметры Кm, Ккат и Vmax для ферментативной системы-1,
включающей АДГ печени лошади (табл. 2).
Таблица 2
Показатели ферментативной активности АДГ пекарских дрожжей и
АДГ печени лошади при использовании водного раствора
субстрата – этилового спирта
Vmax,·10-5
-5
Km,·10 М
Ккат, ·10-1с-1
опт.ед./с
АДГ
пекарских
2,85±0,19
3,86±0,18
9,23±0,18
дрожжей
АДГ печени
2,51±0,17
3,51±0,17
8,94±0,17
лошади
По особенностям построения первичной, вторичной, третичной и
четвертичной структур (Forsht A.., 1995) а также по механизму
каталитического действия (Курганов Б.И., 2008) эти два фермента (АДГ
дрожжевая и АДГ печени лошади) практически идентичны. Близкие значения
ферментативных параметров АДГ дрожжевой и АДГ печени лошади
позволили провести исследование по влиянию эффекторов (Пирацетама,
Зорекса и Унитиола) на АДГ печени лошади (коммерческий препарат) в
модельных системах.
11
На третьем этапе исследовано влияние фармакологического препарата
Пирацетама на каталитические параметры АДГ печени лошади в
ферментативной системе-2, содержащей АДГ печени лошади (2,41·10-4М),
С2Н5ОН (1,510-2М), Пирацетам (1,510-2М) при варьировании концентрации
НАД (0,5–4,5)10-2М и в ферментативной системе-3, включающей АДГ
печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), НАД (1,510-2М) при
различных концентрациях Пирацетама (0,5–4,5)10-2М. Для сравнения
кинетических параметров в ферментативной системе-2 и ферментативной
системе-3 применили три способа изучения ферментативных характеристик
биокатализатора:
1. Оценочный по выявлению возможного влияния и Пирацетама, и НАД (при
варьировании их концентраций) на каталитическую активность АДГ печени
лошади посредством анализа кинетических кривых D~t. На кривых D~t
определяли Vmаx и строили зависимости в координатах Vmаx –
концентрация Пирацетама.
2. В рамках классической энзимологии строили кинетические зависимости
D~t. К начальным участкам полученных кривых проводили касательные и
определяли начальные скорости (V0). Экспериментальные данные
обрабатывали, используя способ, предложенный Лайнуивером–Берком, и
рассчитывали важнейшие ферментативные параметры Vmаx, Km и Kкат.
3.
Построение
геометрического
«портрета» изучаемой реакции,
катализируемой АДГ, в трехмерной Kм'V' – системе прямоугольных
координат для расчета дополнительных ферментативных параметров (длин



pI a(1) -, pI a ( 2 ) -, pI a(3) - векторов).
Для ферментативной системы-2 в рамках 1-го способа находили
концентрацию Пирацетама, при которой активность АДГ максимальная. Для
этого посредством изучения кривых D~t рассчитали значение Vmаx и
строили экспериментально полученную зависимость в координатах Vmаx –
концентрация Пирацетама (рис. 5).
Рис.
5.
Влияние
концентрации Пирацетама
на
скорость
ферментативной реакции (Vmаx),
катализируемой
АДГ
-4
(2,41·10 М),
кинетика
которой
описывается
уравнением
Михаэлиса –
Ментена
Обнаружили, что концентрация Пирацетама влияет на активность АДГ
печени лошади, причем оптимальной является концентрация эффектора,
12
равная 1,5·10-2М, при которой значение Vmаx составляет (19,80±0,32)
10-5опт.ед./с.
Обработка экспериментальных данных по 2-му способу с использованием
координат Лайнуивера–Берка позволила получить следующие значения
биокаталитических характеристик для ферментативной системы-2: Кm =
(8,47 ± 0,37)·10-5 моль/л; Vmах = (20,01 ± 0,37)·10-5 опт.ед./с; Ккат = (8,71 ±
0,37)·10-5с-1.
Таким образом, обнаружена корреляция значений ферментативных
параметров Vmax, рассчитанных при использовании 1-го и 2-го способов, а
именно значение Vmax по 1-му способу равно (19,80±0,32)·10-5 опт.ед./с, а
по 2-му – (20,01±0,37) ·10-5 опт.ед./с (табл.3).
Итак, введение Пирацетама ухудшает связывание фермента с субстратом
(значение Km на 71 % больше, чем в системе контроля), но улучшает течение
каталитической реакции, а именно в 5,7 раз возрастает значение Vmax при
использовании 1-го и 2-го способов.
Таблица 3
Рассчитанные каталитические характеристики фермента АДГ печени
лошади (2,41·10-4М) для концентрации Пирацетама 1,5·10-2М при рН 6,0
Ферментативные
Система
1-й способ 2-й способ
параметры
контроля
-5
Кm, ·10 М
8,47±0,37
2,51±0,17
-5
Vmах, ·10
19,80±0,32 20,01±0,37 3,51±0,17
опт.ед./с
В результате введения в ферментативную систему Пирацетама (1,5·10 -2М)
повышается активность АДГ, что, возможно, может привести к усиленному
окислению этанола в организме человека и, следовательно, к уменьшению его
интоксикации (Consalvi V., 1998; Gough W.H., 2001).
В связи с тем, что важная роль в биокаталитической реакции принадлежит
НАД, необходимо определить оптимальную концентрацию этого компонента
в модельной ферментативной системе. Для этого изучали возможное влияние
различных концентраций НАД на активность АДГ печени лошади
посредством анализа кинетических кривых D~t. Это позволило построить
зависимость начальной скорости реакции (Vо) от концентрации НАД (рис.6).
Рис
6.
Зависимость
максимальной
скорости
реакции от концентрации НАД
для ферментативной системы-3
13
Значение концентрации НАД, составляющей 1,5·10-2М, является
оптимальным для ферментативной системы-2, поскольку зависимость имеет
вид кривой с насыщением (рис. 6).
Рассчитали следующие значения Кm, Ккат и Vmах для ферментативной
системы-3 (рН 6,0), содержащей АДГ печени лошади (2,41·10-4М), Пирацетам
(1,5·10-2М), С2Н5ОН (1,5·10-2М) и НАД (0,5–4,5)10-2М и сравнили с
полученными кинетическими параметрами для ферментативной системы-2
(табл. 4).
Таблица 4
Кинетические параметры ферментативной реакции (Km и Vmax)
для водных растворов АДГ, рассчитанные по двум способам (1-й и 2-й)
для ферментативной системы-2 и ферментативной системы-3
Кm,·10-5 моль/л
Ферментативная
система-2
Ферментативная
система-3
Система контроля
Vmax, 10-5 опт.ед./с
1-й способ
2-й способ
1-й способ
2-й способ
-
8,47±0,39
19,80±0,32
20,01±0,39
5,89±0,39
5,03±0,39
11,78±0,38
12,01±0,38
2,51±0,17
3,51±0,17
Обнаружена корреляция ферментативных параметров Кm и Vmах,
рассчитанных 2-мя способами. Значения Km, полученные при использовании
2-го способа, в ферментативной системе-3 ниже в 1,5 раза в сравнении с
ферментативной системой-2. В случае параметра Vmax наблюдали так же,
как и в предыдущем случае, снижение этой характеристики в 1,7 раза при
применении и 1-го, и 2-го способов. Кроме того, выявлено, что кинетические
параметры активности АДГ печени лошади (Кm и Vmax) зависят от
концентрации и Пирацетама, и НАД.
Обращает на себя внимание, что для концентраций и Пирацетама, и НАД,
равных 1,5·10-2М, скорости ферментативного процесса максимальны и в
случае ферментативной системы-2, и для ферментативной системы-3.
Таким образом, изучив ферментативную систему-2 и ферментативную
систему-3, нашли оптимальные условия окисления этилового спирта
(1,5·10-2М) при концентрациях компонентов модельной системы: АДГ печени
лошади – 2,41·10-4М, Пирацетама – 1,5·10-2М и НАД – 1,5·10-2М в условиях
рН 6,0.
Используя найденные изменения параметров Km и V в ферментативной
системе-3 при сравнении с системой контроля, выявили тип активации.
Прямая 2 располагается ниже прямой 1 системы контроля
(ферментативная система-1), что, согласно классификации В. И. Крупянко,
соответствует двухпараметрически рассогласованной активации, т.е. IIaтипу активации АДГ.
14
Рис. 7. Зависимости обратных величин начальных скоростей от
обратных величин концентраций субстрата НАД для водного
раствора АДГ (2,41·10-4 М) в ферментативной системе-1 (прямая 1) и
ферментативной системе-3 (прямая 2)
На четвертом этапе определяли влияние фармакологических добавок
Зорекса и Унитиола на каталитическую активность АДГ печени лошади при
изучении влияния различных концентраций НАД, осуществляющих
биокатализ в ферментативной системе-4 и ферментативной системе-5.
Ферментативная система-4 включала следующие компоненты: АДГ печени
лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), Унитиол (5,0·10-4М). Кинетические
зависимости D~t строили при варьировании концентрации НАД (1,5–5,0)
10-2М. Ферментативная система-5 состояла из АДГ печени лошади
(2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), Зорекса (5,0·10-4М) и включала различные
концентрации НАД (1,5–5,0) 10-2М.
При построении экспериментальных кинетических зависимостей в
координатах Лайнуивера–Берка определили важнейшие кинетические
параметры для изучаемых систем (табл. 5).
Таблица 5
Рассчитанные данные по ферментативной кинетике для ферментативной
системы-1, ферментативной системы-4 и ферментативной системы-5
Km,
Vmаx,·10-5
Kкат,
Тип
-5
-2 -1
·10 М
опт.ед./с
·10 с
активации
Система контроля
(ферментативная
2,51±0,17 3,51±0,17
8,94±0,17
система-1)
Зорекс
(ферментативная 2,03±0,17
6,62±0,17
1,63±0,17
Ia
система-4)
Унитиол
(ферментативная
2,42±0,16 6,34±0,16
1,48 ±0,16
Ia
система-5)
15
Видно, что введение в ферментативную систему фармпрепаратов Зорекса
и Унитиола (табл. 5) приводит к снижению значения Km на 16 – 20 %, и
следовательно, улучшается взаимодействие фермента (АДГ печени лошади)
и субстрата (C2H5OH) в сорбционном участке активного центра фермента.
Этому могут способствовать особенности строения активного центра АДГ
печени лошади (Крупянко В.И., 1994).
Наблюдали значительное уменьшение значений константы Kкат (табл. 5)
и в ферментативной системе-4, и в ферментативной системе-5. Это
свидетельствует о том, что в фармпрепарате Зорекс составляющая часть –
Унитиол
(ферментативная
система-5)
–
действительно
играет
доминирующую роль в регуляции каталитического поведения АДГ, усиливая
практически в 2 раза каталитическое действие фермента. На основе
полученных закономерностей в изменении важнейших ферментативных
параметров АДГ по классификации В. И. Крупянко установили тип
активации – двухпараметрически согласованная активация – Iа-тип
активации АДГ.
В условиях оптимального соотношения концентраций всех компонентов
реакционной среды, а именно АДГ, этанола, НАД, Пирацетама, Зорекса и
Унитиола, рассчитаны ферментативные параметры (табл. 6).
Таблица 6
Значения каталитических характеристик АДГ при введении
фармпрепаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола
ФерментаМолекуТип
Km,
Vmax, ·10-4
тивные
Эффекторы лярная
акти·10-5М
опт.ед./с
системы
масса
вации
1
Контроль
2,51±0,17 3,51±0,17
3
Пирацетам
142,16 5,03±0,39
20,01±0,39
IIa
4
Зорекс
630,09
2,03±0,17 6,62±0,17
Ia
5
Унитиол
124,23
2,12±0,16 6,34±0,16
Ia
Пирацетам в большей степени влияет на образование ферментсубстратного комплекса. Суммарный наблюдаемый эффект – ослабление
взаимодействия фермента и субстрата при введении Пирацетама. Именно в
этих
условиях
активность
алкогольдегидрогеназы
максимальна.
Следовательно, при добавлении Пирацетама этанол с участием АДГ
утилизируется наиболее эффективно.
Рассчитанные ферментативные параметры и соответственно типы
активации фермента для фармпрепаратов Пирацетам, Зорекс и Унитиол в
ферментативных системах имеют разнонаправленный характер изменений: в
случае Пирацетама – тип активации IIa, а в случае Зорекса и Унитиола – тип
активации Ia. Это не позволило провести сопоставление найденных значений
ферментативных параметров АДГ, так как типы активации различны.
Поэтому наряду с первым и вторым способами определения ферментативных
параметров был применен ещё один способ анализа значений
16
ферментативных параметров – это метод векторного построения полученных
экспериментальных данных в Kм' V'– системе координат.
На основе данных табл. 6 построили кривую течения – геометрический
«портрет» ферментативной реакции, катализируемой АДГ печени лошади
(рис. 8).
Рис.8. Пространственная кривая АДГ-реакции в трехмерной Kм' V' –
системе координат, активируемой фармпрепаратами Зорекс (3),
Унитиол (1) и Пирацетам (2)
На основе рис.8. рассчитали дополнительный ферментативный параметр –
интенсивность активации для трех обсуждаемых ферментативных систем и



сравнили длины pI a(1) -, pI a ( 2 ) -, pI a(3) -векторов (табл. 7). Именно этот
интегральный параметр несет обобщенную количественную информацию об
интенсивности активации фермента.
Таблица 7



Значения длин pI a(1) -, pI a ( 2 ) -, pI a(3) -векторов

Ферментативные Длины p - векторов,
системы
Пирацетам
Зорекс
Унитиол
у.е.
2,50
0,48
0,39
3
4
5
Самым действенным для АДГ среди изученных фармпрепаратов является
Пирацетам (2,50 у.е.). Эффективность фармпрепаратов Зорекс и Унитиол в
сравнении с Пирацетамом в 5,2 раз ниже. Кроме того, данные табл. 7
указывают на преобладающий вклад компонента Зорекса в сравнении с
Унитиолом. Обращает на себя внимание то, что при введении в
ферментативную систему изученных фармпрепаратов (Пирацетама, Зорекса и
Унитиола) меняются не только тип активации, но и механизм изучаемой
каталитической реакции, а также её интенсивность.
17
Таким образом, впервые разработанный и апробированный многоэтапный
научно-методический подход позволил детально изучить ферментативное
поведение АДГ при добавлении Пирацетама, Зорекса и Унитиола и может
служить основой для изучения других фармпрепаратов.
ВЫВОДЫ
1. Выделена и очищена алкогольдегидрогеназа из пекарских дрожжей.
Рассчитано содержание фермента, изучена субстратная специфичность и
исследованы важнейшие ферментативные параметры биокатализатора.
Выявлена максимальная субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы
дрожжевой к этанолу.
2. Разработан многоэтапный научно-методический подход по изучению
каталитической
активности
алкогольдегидрогеназы
в
модельной
ферментативной системе в присутствии регуляторов каталитической
активности:
 для системы контроля определены значения важнейших ферментативных
параметров каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени
лошади: Кm = (2,51 ± 0,17)·10-5 моль/л; Vmax = (3,51 ± 0,17)·10-5 опт.ед./с;
Ккат = (8,94 ± 0,17)·10-2 с-1. Найдено удовлетворительное соответствие
ферментативных показателей алкогольдегидрогеназы печени лошади и
алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей;
 введение Пирацетама ухудшает связывание фермента с субстратом
(значения Km больше на 71 %, чем в системе контроля), но улучшает
течение каталитической реакции (в 5,7 раз возрастает значение Vmax) при
использовании 1-го и 2-го способов. Наибольшее влияние на
алкогольдегидрогеназу
найдено
для
концентрации
Пирацетама,
-2
составляющей 1,5·10 М;
 наиболее эффективное течение ферментативного процесса наблюдается для
концентрации никотинамидадениндинуклеотида равной 1,5·10-2М;
 каталитическая активность алкогольдегидрогеназы возрастает в 2,6 раза при
добавлении Зорекса в модельную систему, а в случае с Унитиолом найдено
двукратное возрастание активности биокатализатора. Введение в
ферментативную систему Зорекса и Унитиола на 16 – 20 % улучшает
взаимодействие фермента (алкогольдегидрогеназы печени лошади) и
субстрата (C2H5OH) в сравнении с системой контроля.
3. При введении в модельную ферментативную систему Пирацетама
установлен тип активации – IIа-тип (двухпараметрически рассогласованная
активация). При использовании Зорекса и Унитиола алкогольдегидрогеназа
активируется по Iа-типу (двухпараметрически согласованная активация).
4. Построена и проанализирована пространственная кривая течения
кинетической реакции для алкогольдегидрогеназы, её геометрический
«портрет», при добавлении в ферментативную систему Пирацетама, Зорекса
и Унитиола. Установлено, что введение изученных фармпрепаратов в
18
модельную систему с алкогольдегидрогеназой меняет не только
интенсивность, но и тип и механизм изученной ферментативной реакции.
Рассчитан дополнительный ферментативный параметр – длина вектора,
показавший,
что
наиболее
эффективным
для
активации
алкогольдегидрогеназы является фармпрепарат Пирацетам.
Список опубликованных работ по теме диссертации
1. Сметанникова Н.В. Ферментативные характеристики алкогольдегидрогеназы
// Сб. тез. V научной конференции аспирантов и студентов химического
факультета, посвященной 35-летию Тверского государственного университета. –
Тверь: Твер. гос. ун-т, 2006. – С. 30.
2. Лапина
Г.П.,
Сметанникова
Н.В.
Регуляция
активности
алкогольдегидрогеназы печени лошади Пирацетамом // Тез. докл. I Междунар.
конф. «Состояние воды в биологических и модельных системах» Тверская гос.
мед. академия. – Тверь, 2007. – С. 173.
3. Лапина Г.П. Золотарева Н.В. Регуляция активности алкогольдегидрогеназы
печени лошади Пирацетамом // Тез. докл. VII науч. конф. аспирантов и
студентов химического факультета Тверского государственного университета. –
Тверь: Твер. гос. ун-т, 2008. – С. 25.
4. Золотарева Н.В. Воздействие Пирацетама на каталитическую активность
алкогольдегидрогеназы печени лошади // Тез. докл. XVI Региональные
Каргинские чтения «Физика, химия и новые технологии». – Тверь: Твер. гос. унт, 2009. – С.39.
5. Золотарева Н.В. Геометрический «портрет» ферментативной реакции,
катализируемой алкогольдегидрогеназой, в присутствии различных эффекторов
// Тез. докл. XVII Региональные Каргинские чтения «Физика, химия и новые
технологии». – Тверь: Твер. гос. ун-т, 2010. – С.34.
6. Золотарева Н.В. Создание научно-методических основ исследования влияния
фармакологических
препаратов
на
каталитическую
активность
алкогольдегидрогеназы печени лошади // Материалы конференции.
Всероссийская научная школа для молодежи «Приборное и научнометодическое обеспечение исследований и разработок в области
каталитического
превращения
бифункциональных
каталитических
превращений». – Тверь: ТГСХА, 2010. – С. 5–7.
Рецензируемые научные журналы, включенные в перечень ВАК:
7. Лапина Г.П., Золотарева Н.В. Пирацетам – регулятор каталитической
активности алкогольдегидрогеназы печени лошади // Вестник ТвГУ. Сер.
Биология и экология. – 2009. – Вып.11, №2. – С.56–62.
8. Лапина Г.П., Золотарева Н.В. Оптимизация течения ферментативной реакции
с участием алкогольдегидрогеназы печени лошади при варьировании
концентрации никотинамидадениндинуклеотида // Вестник ТвГУ. Сер. Биология
и экология. – 2009. Вып.13, №14. – С.85–90.
9. Лапина Г.П., Золотарева Н.В. Анализ данных ферментативной кинетики с
использованием трехмерной Kм'V' – системы координат // Вестник ТвГУ. Сер.
Биология и экология. – 2010. – Вып.17, №.16. – С.71–76.
19