Измерение каталитической активности единичных молекул

Измерение каталитической активности единичных молекул фермента P450 BM3
Н.С. БУХАРИНА, Ю.Д. ИВАНОВ, Т.О. ПЛЕШАКОВА, А.И. АРЧАКОВ
НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, Москва
ИЗМЕРЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ЕДИНИЧНЫХ МОЛЕКУЛ ФЕРМЕНТА P450 BM3
С помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) было проведено измерение каталитической активности единичных молекул фермента цитохрома P450 BM3 (BM3) в реакции гидроксилирования по наблюдению за изменением конформации фермента во время каталитической реакции. На основании полученных результатов предложен новый подход
определения каталитической активности единичной молекулы фермента по амплитуде ее флуктуаций.
Возможность проведения АСМ-измерений в жидкой среде и его высокое вертикальное разрешение открывает возможность мониторинга за функционированием единичной молекулы фермента. Ранее такой подход использовался в работах [1–3], где проводились наблюдения за флуктуациями высоты белков во время их функционирования. В нашей работе этот подход был развит
для проведения мониторинга флуктуации высоты белковой глобулы гемсодержащего фермента
BM3 в процессе реакции гидроксилирования лауриловой кислоты.
Цитохром BM3 является уникальным самодостаточным ферментом, состоящим из гемсодержащего домена P450 и флавопротеина, который катализирует гидроксилирование жирных
кислот, и был любезно предоставлен проф. А. Мунро (Манчестерский университет, Великобритания), экспрессирован согласно [4].
Иммобилизация белков осуществлялась за счет нековалентной адсорбции молекул на АСМчипе. Для этого 2 мкл 3,6 мкМ раствора BM3 в 50 мМ PBS буфере (Реахим), pH 7,4 наносились на
поверхность АСМ-чипа на 3 мин. После этого образец промывали деионизонанной водой. Влажную подложку с BM3 сразу помещали в жидкостную ячейку атомно-силового микроскопа, содержащую буфер.
АСМ-измерения амплитуды флуктуаций высоты единичных молекул BM3 были проведены
на АСМ Nanoscope IVa (Veeco) в жидкости кантилеверами DNP-S10 (Veeco) с константой жесткости 0,32-0,58 Н/м в полуконтактном режиме по методу, описанному в [1]. Амплитуды флуктуаций
высоты молекулы фермента BM3 были получены последовательно в буфере 25мМ PBS, pH 7,4, в
присутствии 500 мкМ лауриловой кислоты (субстрат), в присутствии субстрата и
200 мкМ
NADPH (реакция гидроксилирования), в присутствии ингибитора фермента 5 мМ
1фенилимидазола.
Изолированный фермент BM3 может существовать в растворе в виде мономеров и агрегатов, причем мономеры обладают слабой активностью по гидроксилированию жирных кислот по
сравнению с агрегатами (каталитическая константа скорости для мономеров 10 с1, для димеров
50 с1) [4]. Поэтому перед измерениями был проведен анализ АСМ-распределения BM3 по высотам, показавший наличие на АСМ-чипе мономеров с высотами (1,5 ÷ 2,0) ± 0,2 нм и агрегатов с
высотами (2,5 ÷ 5,0) ± 0,2 нм.
АСМ-измерения флуктуации высоты молекул фермента проводились следующим образом.
Область сканирования, на которой были единичные молекулы фермента, уменьшалась до 0,5 мкм.
Затем, выбрав целевую молекулу, отключалось сканирование по медленной оси. Таким образом,
получалось изображение с контурами одной и той же части молекулы белка по x-направлению. На
рис. 1 приведен пример получаемых изображений. Чтобы улучшить временное разрешение, шаг
сканирования увеличивали до 4 нм. Частота сканирования подбиралась максимально возможной
(1–1,3 Гц). Полученные изображения обрабатывались с помощью программного обеспечения
Nanoscope. На каждом кадре вычислялись среднеквадратичные значения шума (RMS roughness) по
линии вдоль y-направления на вершине молекулы и рядом на поверхности АСМ-чипа. Чтобы получить амплитуду флуктуаций высоты молекулы фермента, эти значения усреднялись с учетом
высоты молекул.
Таким образом, были получены зависимости флуктуаций высоты иммобилизованных агрегатов BM3 в различных условиях. Было показано, что присутствие субстрата не влияет на флуктуацию высоты BM3, среднеквадратичное значение амплитуды которой с учетом фона от АСМ-чипа
составило 0,6 ± 0,1 Å. В условиях гидкроксилирования, при добавлении донора электронов
NADPH в инкубационную среду, наблюдалось увеличение амплитуды флуктуаций до значения 1,4
± 0,1 Å. При последующем добавлении в инкубационную среду ингибитора BM3 амплитуда флуктуаций уменьшилась до исходного значения 0,6 ± 0,1 Å.
Измерение каталитической активности единичных молекул фермента P450 BM3
t, c
30
Высота, нм
3
0
72 нм
Рис. 1. Временная зависимость АСМ-сечения молекулы BM3. По таким изображениям возможно вести
мониторинг динамики молекул фермента, сравнивая амплитуды флуктуаций высоты между АСМ-чипом
и вершиной полученной структуры
Для мономеров BM3 амплитуда флуктуаций не изменялась ни при добавлении субстрата, ни
при добавлении NADPH, ни при добавлении ингибитора.
Исходя из полученных данных, можно предположить, что мерой каталитической активности
фермента может быть амплитуда флуктуаций высоты, которая представляется в виде зависимости:
V    A ,
где V – скорость образования продукта реакции; α – тангенс угла наклона прямой; ΔA – амплитуда
флуктуаций высоты молекулы. Учитывая, что V = 50 ÷ 86 с1 [4, 5], а ΔA = 0,8 ± 0,1 Å (разность
1,4 ± 0,1 и 0,6 ± 0,1 Å), можно вычислить константу α = (0,009 ÷ 0,016) ± 0,002 моль продукта · с–1·нм–1.
Для определения соответствия полученных величин с биологическими функциями фермента
проводятся дальнейшие исследования.
Работа была выполнена при поддержке гранта РФФИ 09-04-12113.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Thomson N.H., Fritz M., Radmacher M., Cleveland J.P. et al. // Biophys. J. 1996. V. 70.
P. 2421.
2.
Radmacher M., Fritz M., Hansma H.G et al. // Science. 1994. V. 265. P. 1577.
3.
Arnoldi M., Schäffer T.E., Fritz M. et al. //
http://www.azonano.com/details.asp?ArticleID=1461
4.
Neeli R., Girvan H.M., Lawrence A. et al. // FEBS Lett. 2005. V. 579. P. 5582.
5.
Noble M.A., Miles C.S., Chapman S.K. // Biochem. J. 1999. V. 339. P. 371.