На правах рукописи УДК: 616.314 - 74 14.01.14 - «Стоматология»
advertisement
На правах рукописи УДК: 616.314 - 74 ДУБОВА ЛЮБОВЬ ВАЛЕРЬЕВНА ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ 14.01.14 - «Стоматология» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва – 2010 1 Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медикостоматологический университет Росздрава». Научные консультанты: Заслуженный деятель науки РФ, Доктор медицинских наук, профессор Лебеденко Игорь Юльевич Заслуженный деятель науки РФ, Доктор медицинских наук, профессор Воложин Александр Ильич Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук, профессор Марков Борис Павлович Доктор медицинских наук, профессор Караков Карен Григорьевич Доктор медицинских наук, профессор Жолудев Сергей Егорович Ведущая организация: ФГУ "Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" Защита состоится « » 2010 г. в часов на заседании диссертационного совета Д208.041.03 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу: г. Москва, ул. Долгоруковская д.4; Почтовый адрес: 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20/1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» (127206, Москва, ул. Вучетича д.10) Автореферат разослан « » 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Гиоева 2 Введение В последние годы биосовместимость стоматологических материалов стала серьезной проблемой, поскольку она напрямую связана с качеством стоматологической помощи населению. Не в меньшей степени биосовместимость связана и с состоянием общесоматического здоровья стоматологических больных(Лебеденко И.Ю., 2007; Арутюнов С.Д. с соавт., 2008;). Резкое увеличение в последние десятилетия хронических заболеваний, нарушений иммунной системы, эндокринопатии и увеличение в масштабах планеты доли лиц пожилого и старческого возраста делают проблему диагностики и профилактики непереносимости стоматологических материалов крайне актуальной (Гожая Л.Д., 2005; Караков К.Г., 2006; Жолудев С.Е., 2005; Трезубов В.Н., 2008;Цимбалистов А.В., 2006; Воложин А.И. с соавт., 2006; Schmalz O., Garhammer P., 2002;). Стоматологические материалы, помещённые в полость рта, могут выделяться в окружающую среду в неизменённом виде, а также в виде их дериватов из места их аппликации в процессе лечения или долговременного нахождения (Vаn Dooren Е., 2000), что может вызывать нежелательные побочные явления вследствие их прямого токсического действия на клетки слизистой оболочки полости рта или десны, включая тучные клетки или базофилы находящиеся в этих тканях. При этом возможно неспецифическое высвобождение из клеток различных медиаторов, в том числе гистамина, который оказывает воздействие на иммунную систему посредством модуляции отдельных её звеньев, усиливая или ослабляя иммунный ответ на различные инфекционные или неинфекционные антигены (аллергены). Установлено, что гистамин влияет на созревание иммунокомпетентных клеток, регулирует функциональную активность антигенспецифических Th1- и Th2-клеток, а также изотипспецифический антительный ответ (Максимовский Ю.М., 2004;Лебедев К.А.. 2005;Марков Б.П..2006;Арутюнов А.С. с соавт., 2006; Ибрагимов Т.И., 2007; Митронин А.В. с соавт., 2008; Jutel M. et al., 2001; Banwell M.E. et al., 2003). 3 Во всем мире постоянно растет число аллергических заболеваний и осложнений, и они занимают важное место в структуре инфекционной и неинфекционной патологии (Щербаков А.С. 2006, DeWeck A.L., 2000). Источником чаще сенсибилизации всего бывают пыльцевые, бытовые, эпидермальные, пищевые аллергены и гаптены. В качестве гаптенов могут выступать различные химические вещества, в том числе и применяемые в стоматологии материалы, которые, соединяясь, как правило, с белковым носителем, выступают в роли адъюванта, становятся иммуногенными (Зайченко О.В., 2003; Cox J.C., Coulter A.R., 1997) и могут вызывать аллергические реакции (Воложин А.И. с соавт., 2004;Ряховский А.Н.,2005; Муляр А.Г.,2007; Рабинович С.А..2007;Трезубов В.Н.,2008;Bauer A., Wollina U., 1998). Это особенно важно для пациентов, страдающих атопической аллергией, поскольку появление гаптенов может вызывать обострение существующего аллергического заболевания (Nakamura M. et al., 1999; Yoshida S. et al., 1999). Одним из важных этапов изучения биосовместимости стоматологических материалов (сплавов ортопедической металлов, стоматологии, акриловых пластмасс, реставрационных используемых материалов в светового отверждения, паст для пломбирования каналов корней зубов) на фоне атопической аллергии, является экспериментальная оценка их модулирующего действия на иммунную систему, в частности, их острого аллергического (IgEопосредованного) и цитотоксического (IgG- опосредованного) ответа на модельный аллерген на фоне сенсибилизации. В настоящее время тестирование, которое позволяет анализировать различные клеточные функции, такие, как пролиферация, секреция, фагоцитоз, хемотаксис, хемокинез, клеточная адгезия и др. имеет решающее значение для определения биосовместимости различных стоматологических материалов (Михеева М.С., 2005). Однако, для in vitro тестов используются моноклеточные культуры, поэтому полученные результаты не могут напрямую экстраполироваться на живой организм (Воложин А.И. с соавт., 2004;Олесова В.Н.,2006;Абакаров С.И.,2007.). В ряде исследований показано, что выявленная 4 in vitro аллергенность материалов не проявлялась при исследовании in vivo (Rosengren A. et al., 2005). Клеточные аллергические тесты, а именно прямая микроскопическая оценка дегрануляции базофилов по окраске щелочными красителями или определение концентрации освобождённого гистамина из базофилов крови после стимуляции имеют ряд известных ограничений, препятствующих их широкому распространению (Babakhin A.A. et al., 2000). На сегодняшний гиперчувствительности день для немедленного типа специфической IgE диагностики опосредованной реакции используют кожные тесты, определение специфических IgE антител и провокационные тесты in vivo (Понякина И.Д. с соавт., 2004). Однако, несмотря на большой прогресс, специалисты сталкиваются с проблемой неясных результатов кожных тестов и определения IgE антител независимыми методами, а достоверными являются только дорогостоящие и опасные провокационные тесты (Лебедев К. А., Саган Л.Г., 2002). В настоящее время широкое распространение получает метод выявления реакции В-лимфоцитов на различные аллергены, которая в острой фазе сопровождается активным выбросом в кровь Ig Е и на более поздних стадиях развития аллергической реакции Ig G, в настоящее время получает широкое распространение (Wachholz P.A., et al., 2003). Анализ специальной литературы убедительно показывает, что изучение иммуномодулирующего действия стоматологических материалов является весьма актуальным новым научным направлением современного биоматериаловедения. Однако, к настоящему времени этот эффект изучен явно недостаточно для разработки научно обоснованных рекомендаций по врачебной тактике стоматологического лечения и реабилитации пациентов с учетом индивидуальных особенностей их иммунной системы. Цель исследования: Изучить иммуномодулирующее и цитотоксическое действие различных групп стоматологических материалов, применяемых в ортопедической, хирургической и терапевтической стоматологии на фоне модельной аллергии, вызванной у лабораторных животных. На основании полученных результатов разработать врачебную тактику стоматологической 5 реабилитации и профилактики развития непереносимости средств, используемых в лечении тканей и органов полости рта у пациентов с отягощенным аллергологическим анамнезом. Задачи исследования: 1. Оценить на экспериментальной модели атопической аллергии у лабораторных животных, вызываемой иммуномодулирующее стандартным действие аллергеном сплавов овальбумином, металлов и базисных стоматологических акриловых пластмасс, применяемых в ортопедическом лечении. 2. Исследовать в эксперименте реакцию организма лабораторных животных на пасты, используемые для пломбирования корневых каналов зубов, в условиях сенсибилизации по атопическому типу. 3. Выяснить характер иммунного ответа на овальбумин в присутствии различных стоматологических реставрационных материалов на экспериментальной модели атопической аллергии. 4. Определить морфологические изменения в окружающих тканях после подкожной имплантации различных групп стоматологических материалов (паст для пломбирования каналов корней зубов, реставрационных материалов, сплавов металлов и базисных стоматологических акриловых пластмасс) лабораторным животным, сенсибилизированным овальбумином. 5. Изучить гистаминвысвобождающую активность базисных акриловых пластмасс, сплавов металлов, паст для пломбирования каналов корней зубов и реставрационных материалов с помощью стекловолоконного метода с использованием образцов крови здоровых доноров и больных атопической аллергией. 6. Исследовать целесообразность использования в клинической практике метода определения в сыворотке крови пациентов специфических Ig Е и Ig G, выявляющих аллергические реакции на отдельные компоненты, входящие в состав стоматологических материалов и местноанестезирующие препараты. 6 7. Изучить у больных с атопической аллергией действие стоматологических материалов на ткани полости рта по активности ферментов: щелочной фосфатазы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, по содержанию иммуноглобулинов А, G, M в смешанной слюне. 8. Сформулировать предложения по профилактике неблагоприятного действия стоматологических материалов на организм пациентов с отягощенным аллергологическим анамнезом. Научная новизна Впервые в эксперименте в условиях краткосрочной и длительной сенсибилизации действие лабораторных различных лабораторных групп животных, животных изучено стоматологических иммуномодулирующее материалов. сенсибилизированных Показано, у овальбумином, имплантированные под кожу образцы из нержавеющей стали повышают антителообразование IgE и IgG, а образцы из сплавов на основе кобальта, на основе золота, на основе палладия, напротив, понижают их образование. Из 14 изученных стоматологических материалов лишь образцы реставрационного материала светового отверждения «Филтек» вызывали острый аллергический ответ на фоне сенсибилизации, но без цитотоксического эффекта. Полученные данные подтверждены гистологическими исследованиями. Впервые на фоне экспериментальной атопической бронхиальной астмы изучена биосовместимость образцов акриловых базисных пластмасс, полученных двумя принципиально различными методами полимеризации: на водяной бане и СВЧ-методом. Установлено, что образцы всех изученных пластмасс при подкожной имплантации не вызывали существенного антителообразования. Изучение гистаминолиберирующей активности 4 групп стоматологических материалов позволило установить выраженное высвобождение гистамина из базофилов крови как у больных с атопической аллергией, так и у практически здоровых лиц только для образцов базисной пластмассы «Этакрил» (при 7 термополимеризации в воде), корневой пасты «Форедент» и реставрационного материала «Филтек Z 250» . Научно обоснован и реализован на практике для индивидуальной скрининговой оценки влияния стоматологических материалов метод определения в плазме крови специфических антител IgE и IgG к ионам металлов, акрилату и местноанестезирующим средствам. Выявлена наибольшая реакция В- лимфоцитов у пациентов с атопической аллергией на ионы палладия, меди, платины, акрилат, прокаин и бупивакаин. Дана комплексная характеристика биосовместимости стоматологических материалов по показателям иммунологических экспериментальных исследований; гистологических клинико-лабораторных и исследований гистаминовысвобождающей активности, кожных проб и реакции В-лимфоцитов (образование антител IgE и IgG) к ионам металлов, акрилату и местноанестезирующим средствам у пациентов с атопической аллергией. Практическая значимость работы На основании эпидемиологических и клинических исследований установлен спектр оказания стоматологической помощи пациентам с атопической аллергией. Для диагностики возможной непереносимости стоматологических материалов у больных с атопической аллергией в клиническую практику внедрены скрининговые тесты: патч-тест, стекловолоконный метод оценки гистаминолиберации из базофилов крови, определение методом твердофазного иммуноферментного анализа наличия специфических иммуноглобулинов Е и G в плазме крови на определенные гаптены (акрилат, ионы металлов, местноанестезирующие препараты). Предложена тактика врача-стоматолога при обследовании пациентов с атопической аллергией для оптимального выбора корневых паст, 8 реставрационных материалов, акриловых базисных пластмасс, сплавов металлов для зубных протезов при оказании стоматологической помощи. Охарактеризована и выделена группа стоматологических материалов, не обладающих гистаминолиберирующей активностью, которые можно рекомендовать для лечения пациентов с атопической аллергией. Положения, выносимые на защиту: 1. Комплексные экспериментальные и клинико-лабораторные исследования убедительно свидетельствуют об отсутствии иммуноинертных стоматологических материалов в группах изученных базисных акриловых пластмасс, стоматологических сплавов металлов, корневых паст и композитных реставрационных материалов светового отверждения. 2. Ряд материалов и препаратов, используемых в стоматологической практике (ионы металлов и акрилат) вызывают выраженную острую аллергическую реакцию, опосредованную повышением уровня IgE антител в крови. Другие группы материалов и препаратов оказывают менее выраженное действие и могут быть применены у больных с атопической аллергией с учётом данных анамнеза и определения специфических IgE и IgG в крови для исключения индивидуальной непереносимости. 3. Реакция на имплантацию лабораторным животным, сенсибилизированным овальбумином, образцов 4-х групп стоматологических материалов зависит от длительности иммунизации. 4. Наиболее высокий уровень высвобождения гистамина из базофилов крови здоровых лиц и пациентов с атопической аллергией наблюдается после инкубации с образцами корневой пасты «Форедент». Стоматологические материалы для пломбирования корневых каналов зубов «Цинкоксидэвгенол» и «Сеалит Регуляр», палладиевый сплав «Суперпал» и золото-платиновый сплав «Супер КМ» для металлокерамики не оказывают раздражающего действия на эти клетки крови. 5. После ортопедического лечения в период адаптации пациентов с атопической аллергией к съёмным и бюгельным зубным протезам в слюне 9 происходит увеличение иммуноглобулинов А, G и М, повышение активности трансаминаз, щелочной фосфатазы, а на этапе адаптации к металлокерамическим конструкциям выраженная иммуноферментная реакция отсутствует. Внедрение результатов исследования Разработанные в диссертации методики и полученные результаты внедрены в практику ортопедического отделения стоматологического комплекса МГМСУ. Теоретические положения используются госпитальной ортопедической в учебном стоматологии, процессе кафедры кафедры патологической физиологии стоматологического факультета, кафедры биохимии МГМСУ. Личный вклад Автор лично сформулировала рабочую гипотезу, научно обосновала выбор 4-х групп стоматологических биосовместимости с материалов использованием для комплексного экспериментальных лабораторных методов. Автором лично проведены и изучения клинико- экспериментальные исследования на животных, которым были имплантированы специально изготовленные образцы 14-ти стоматологических материалов: акриловых пластмасс, полимеризованных на водяной бане и СВЧ-методом, сплавов металлов, корневых паст и реставрационных материалов. Выполнена выкопировка данных из учетной и отчетной документации, проведена статистическая обработка и анализ полученных результатов по оказанию стоматологической помощи больным с атопической аллергией. Автор лично обследовала и провела ортопедическое лечение 104-х пациентов с атопической аллергией с использованием индивидуального подбора разработанного авторского стоматологического алгоритма материала и местноанестезирующего препарата. Апробация работы Результаты диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на: VII Всероссийском научном форуме с международным участием. IV Городской конференции Московской Ассоциации Стоматологов (Москва, 2005); 10 V Международном научном конгрессе «Стоматология Казахстана – 2006» (Алматы, 2006); Всероссийской конференции по ортопедической стоматологии (Россия, Самара, 2006); Российском медицинском форуме «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); II международной конференции «Платиновые металлы в современной индустрии, водородной энергетике и сферах жизнеобеспечения будущего» (Берлин, 2006); VI международном научном конгрессе «Стоматология Казахстана-2007» (Алматы, 2007) Научно-практической конференции, посвящённой 100-летию со дня рождения з.д.н., проф. В.Ю. Курляндского (Тель-Авив, 2008); Международном конгрессе «Сиань-ПМ-2008» Platinum metals in modern industry, hydrogen energy and life maintenance in the future XI’AN – PM’08 (Сиань, 2008); XIX Всероссийской конференции «Актуальные проблемы стоматологии». (Москва 2008); На совместном заседании кафедры госпитальной ортопедической стоматологии, кафедры стоматологии общей практики и подготовки зубных техников ФПДО, кафедры ортопедической стоматологии ФПДО, лаборатории материаловедения НИМСИ, кафедры патологической физиологии стоматологического факультета, кафедры патологической физиологии лечебного факультета, кафедры биохимии МГМСУ (Москва, 2010). Публикации По материалам диссертации в центральной печати опубликовано 25 печатных работы, в том числе 14 публикаций - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России. Объём и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 233 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, глав, включающих обзор литературы, 11 материалы и методы, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 331 источник, из них 183 отечественных и 148 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 36 таблицами и 63 рисунками. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований Экспериментальная часть работы проведена на кафедре патологической физиологии стоматологического факультета МГМСУ (зав. каф. до 2009 года, з.д.н. РФ., д.м.н., профессор А.И. Воложин) и ГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России (зав. лаб., д.б.н., А.А. Бабахин). В экспериментах оценивали иммуномодулирующий и цитотоксический эффект различных групп мышах-самцах линии 4 стоматологических материалов. Опыты проводили на (СВА х С57BL/6)F1, массой 23-25 г. в возрасте от 8 до 12 недель. Всего было задействовано 1275 оборудованном животных, виварии с которых достаточным содержали в освещением и соответственно вентиляцией в специальных клетках, закрывающихся металлической сеткой. Все экспериментальные животные были разделены на 5 серий опытов. На мышах 4-х серий изучалось иммуномодулирующее действие имплантированных под кожу стоматологических материалов (СМ) на фоне только внутрибрюшинного введения овальбумина (ОА). Животным первой серии были имплантированы образцы отечественных стоматологических сплавов металлов «Нержавеющая сталь» (НС), кобальтохромовый сплав «Бюгодент», золото-платиновый сплав «Супер-КМ» и палладиевый сплав «Суперпал». Животным второй серии были имплантированы образцы акриловых пластмасс «Этакрил», «Фторакс»(Украина), «Стомакрил»(Россия), полимеризованные на водяной бане (ВБ) и СВЧ-методом. Животным третьей серии проводилась подкожная имплантация реставрационных стоматологических материалов (РСМ) светового отверждения: «Призмафил Плюс»(Россия), «Филтек Z-250»(США), «Геркулайт XRV»(США). 12 Животным четвертой серии имплантировали образцы корневых паст: «Эндометазон», «Цинкоксидэвгенол», «Форедент», «Сеалит Регуляр». У мышей пятой серии вызывали экспериментальную бронхиальную астму (БА) путём внутрибрюшинного и интраназального введения ОА, У животных этой серии изучали сенсибилизирующее действие базисных акриловых пластмасс, полученных разными способами полимеризации. Контрольные группы во всех сериях были представлены животными, которых иммунизировали только ОА без имплантации СМ, а в 5-ой серии эксперимента была вторая контрольная группа, представленная интактными животными. Атопическую аллергическую реакцию у экспериментальных животных вызывали путём сенсибилизации овальбумином. Препарат разводили в растворе Хэнкса, в дозе 10 мкг на мышь и внутрибрюшинно вводили в объеме 500 мкл. Однократным введением ОА вызывали первичный иммунный ответ (первичная иммунизация); через две недели повторяли введение ОА (вторичная иммунизация); на 5 неделе эксперимента проводили третичную иммунизацию. Образцы СМ имплантировали за неделю, одновременно и через неделю после первичной иммунизации. Через 2 недели после первичной иммунизации, через 1 неделю и через 3 недели после вторичной и третичной иммунизации под гексеналовым наркозом (0,1 мл 1% раствора на 10 г веса животного) у животных из ретроорбитального синуса забирали по 150 мкл венозной крови. Далее животных выводили из опыта с соблюдением правил эвтаназии, согласно Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Полученные пуловые сыворотки хранили на холоду при -30С. Определение анти-ОА антител (анти-IgЕ и анти-IgG) в пуловых сыворотках мышей осуществляли методом твёрдофазного иммуноферментного анализа в нашей модификации. У мышей 5-й серии моделировали краткосрочную IgE-зависимую бронхиальную астму по следующей методике: мышей иммунизировали 7 раз через день внутрибрюшинно ОА в дозе 0,5 мкг/г. Через 4 недели после последней внутрибрюшинной инъекции ОА мышам ежедневно проводили интраназальные 13 аппликации раствора ОА объёмом 50 мкл в концентрации 10 мг/мл в течение 8 дней. Все животные этой серии были разделены на 5 групп. Мышам 1-ой и 3-ей групп через 2 недели после последней иммунизирующей инъекции ОА подкожно имплантировали диски, изготовленные из акриловой пластмассы весом 500 мг, в одном случае - полимеризованной на водяной бане (ВБ) (1-ая группа), а в другом – СВЧ методом (3-я группа). Мыши 2-ой группы были ложно оперированы. Мышей 4-ой группы (контроль сенсибилизации) иммунизировали по схеме 1-ой и 3-ей групп, а интраназальные аппликации проводили физраствором (0,9% NaCl). Контролем служили интактные животные 5-ой группы, которые не подвергались никаким манипуляциям. Через 48 часов после последней интраназальной аппликации ОА животных выводили из эксперимента. У мышей всех групп осуществляли забор бронхоальвеолярного лаважа и крови из ретроорбитального синуса. Методика подготовки стоматологических материалов и методы их имплантации животным. Образцы сплавов металлов «Бюгодент», «Суперпал» и «Супер КМ» размером 5х1 мм изготавливали методом центробежного вакуумного литья, а образцы из «НС» вырезали из гильзы алмазным диском. Полученные образцы металлов шлифовали и полировали. Для изготовления образцов из пластмассы, восковые шаблоны помещали в кюветы с гипсом, при высокой температуре выплавляли воск и заменяли на пластмассу «Этакрил», «Фторакс» или «Стомакрил». Часть образцов полимеризовали на водяной бане, а другую часть СВЧ-методом. Образцы реставрационных материалов светового отверждения помещали в клише из силикона размером 5х1 мм и полимеризовали в течение 40 секунд световым излучением. Для получения образцов корневых паст вначале соединяли компоненты в пропорциях согласно инструкции производителя. Далее образцы вносили в круглые планшеты с плейтами из пластика до полного застывания. Все полученные образцы имплантировали под гексеналовым наркозом под кожу в область спины. Для гистологического исследования мышей выводили из опыта под гексеналовым наркозом через 1 месяц после имплантации. Вырезанный участок 14 кожи вместе с имплантатом и подкожной клетчаткой, фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение недели, проводили через спирты восходящей плотности и заливали в парафин. Готовили срезы толщиной 7-8 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином. В световом микроскопе в препаратах оценивали состояние капсулы, ее клеточный состав, сосуды и межклеточные структуры. Для дифференцировки клеток бронхоальвеолярного лаважа ( БАЛЖ) готовили мазки на предметных стёклах, фиксировали их в метаноле, окрашивали по Романовскому-Гимза и подсчитывали процентное соотношение клеток. Клиническая и лабораторная часть работы проведена во взрослой поликлинике Центра стоматологии и челюстно-лицевой хирургии МГМСУ. Обследовано 808 пациентов обоего пола в возрасте от 17 до 83 лет, из которых 444 пациента имели в анамнезе атопическую аллергию (АА) и 364 пациента без признаков АА. В соответствии с методикой и рекомендациями ВОЗ по репрезентативности выборки за период 2004-2009 гг. проведено стоматологическое эпидемиологическое обследование амбулаторных карт 250 пациентов с АА [(66 пациентов с бронхиальной астмой (БА), 80 пациентов с атопическим дерматитом (АД) и 104 человека с аллергическим ринитом (АР)], обратившихся за стоматологической помощью во взрослую поликлинику Центра стоматологии и челюстно-лицевой хирургии МГМСУ, которое предусматривало изучение показателей стоматологического статуса среди всех возрастно-половых групп взрослых пациентов. Из общего числа обследованных пациентов с АА 104 человека дали согласие на ортопедическое лечение. Из них 20 человек с БА, 31 человек с АД, и 52 человека с аллергическим ринитом. Контрольную группу (n=104) составили пациенты без АА, (ортопедическое лечение пациентов проводилось на кафедре госпитальной ортопедической стоматологии МГМСУ (зав. каф., з.д.н. РФ, д.м.н., проф. И.Ю. Лебеденко) и в ортопедическом отделении стоматологической поликлиники № 5 г. Москвы. У пациентов до начала лечения исследовали состояние имеющихся зубов и зубных рядов, определяли степень подвижности 15 зубов, проводили рентгенологическое обследование (внутриротовая прицельная рентгенография и ортопантомография), оценивали интенсивность кариеса по индексу КПУ, гигиену полости рта по индексу OHS-I, пародонтальный статус по индексам SBI и PMA в модификации Parma (1960). Все участники исследования на основании показаний к протезированию были рандомизированы в четыре группы. Пациентам 1-ой группы было проведено ортопедическое лечение с применением съёмных пластиночных протезов (СП), 2-ой группы - металлокерамическими мостовидными протезами и одиночными коронками (МК), 3-ей группы – бюгельными протезами (БП). Для изготовления съёмных протезов пациентам были использованы акриловые пластмассы «Фторакс» и «Этакрил», полимеризованные СВЧ-методом. Каркасы металлокерамических зубных протезов изготавливались из сплавов «Суперпал», «Супер КМ», «Бюгодент». Для каркасов бюгельных протезов использовали сплав «Бюгодент» и акриловую пластмассу «Фторакс» и «Этакрил». Адаптационную способность тканей полости рта после проведённого лечения оценивали на основании анализа жалоб, результатов осмотра, данных индексов, биохимических показателей смешанной слюны. Сбор смешанной слюны проводили путём сплёвывания в стеклянную пробирку в течение 5 минут до препарирования зубов и снятия анатомических оттисков, затем через 1 неделю, 1 и 6 месяцев после ортопедического лечения. Полученные образцы слюны центрифугировали и в супернатанте на спектрофотометре «StatFax 1904 plus» определяли аланинаминотрансферазы активность (АЛТ), аспартатаминотрансферазы щелочной фосфатазы (ЩФ) (АСТ), в МЕ/л, содержание иммуноглобулинов (Ig) А, G и М в мг/дл. Также определяли объём выделяемой слюны (мл), скорость секреции слюны (мл/мин) и рН слюны. Пациентам с АА и пациентам контрольной группы для выявления индивидуальной гиперчувствительности к СМ проводили диагностику in vivo и in vitro, включающую накожный патч-тест, метод высвобождения гистамина из базофилов крови, метод определения в сыворотке крови и смешанной слюне IgEи IgG-специфических антител на следующие аллергены: на 16 местноанестезирующие препараты - артикаин, лидокаин, прокаин, бензокаин, мепивакаин, бупивакаин, прилокаин, тетракаин, эпинефрин; на ионы металлов никель, хром, ртуть, медь, золото, платина, кобальт, палладий и на акрилат. У 95 человек в возрасте от 19 до 54 лет были проведены кожные аппликационные пробы на сплавы металлов и акриловые пластмассы. Обследуемые были разделены на 2 группы. Первая группа была представлена здоровыми волонтёрами (n=30), у пациентов второй группы (n=65) был диагностирован атопический дерматит (АД). Для проведения кожных проб использовались пластыри с камерами-ячейками Finn Chamber (Финляндия). В ячейки помещались образцы сплавов металлов «НС», «Бюгодент», «Суперпал», «Супер КМ», изготовленные в виде пластин (толщиной 1 мм) и пластины из акриловых пластмасс «Этакрил», «Фторакс» и «Стомакрил», полимеризованные на водяной бане или СВЧ-методом. В ячейку пластыря укладывался образец и наклеивался на кожную поверхность верхней части спины на 48 часов. Результаты оценивали следующим образом: «-» - отрицательная реакция; «±» сомнительная реакция (эритема, отёка нет); «+» - слабая реакция (эритема, инфильтрат); «++» - выраженная реакция (эритема, папулы или везикулы). У 125 пациентов с атопической аллергией (АА), из которых 44 человека имели в анамнезе заболевание бронхиальной астмой и 81 человек- аллергический ринит, а также у 30 здоровых волонтёров определяли высвобождение гистамина из базофилов крови под действием СМ. Для исследования забирали 30 мкл капиллярной крови в пробирку с гепарином и центрифугировали. Образцы акриловых пластмасс «Этакрил», «Фторакс» и «Стомакрил», полимеризованные на водяной бане или СВЧ-методом были измельчены до порошкообразного состояния, а образцы сплавов металлов «НС», «Бюгодент», «Суперпал», «Супер КМ» до мелкой стружки, полученной твёрдосплавной фрезой. Полученные образцы в количестве 125 мг помещали в стерильные полипропиленовые пробирки и заливали 1 мл стерильного PIPES буфера (С2Н2O2Nа•ЗН20; Piperazine-N,N'-bis[2-ethanesulfonic acid]; К2СОз; Tris[hydroxymethyl]aminomethane; CaCl2I•H2O; KC1) («Sigms»). Взвесь периодически перемешивали на магнитной 17 мешалке в течение 48 часов при 37°С и центрифугировали при 1250 об/мин в течение 15 минут. Затем в ячейки 96-луночных планшет заливали 25 мкл плазмы крови и добавляли по 25 мкл «супернатантов» исследуемых образцов, положительного и отрицательного контролей или только PIPES-буфера. Далее с использованием коммерческих наборов методом твёрдофазного иммуноферментного анализа на спектрофлюориметре Multiscan (Финляндия) в образце определяли содержание гистамина (нг/мл). Исследования на определение специфических IgE и IgG антител в сыворотке крови и смешанной слюне проводили в лабораторных условиях компании «Дитрикс Медикал» г. Москва (главный врач Л.И. Станкевич). У пациентов для исследования проводили забор 5 мл венозной крови и 2 мл смешанной слюны в стерильные стеклянные пробирки. Полученные образцы центрифугировали и на спектрофотометре Anthos 2020 методом твёрдофазного иммуноферментного анализа с использованием нитроцеллюлозных аллергодисков с иммобилизованными аллергенами по методу компании Dr.Fooke (EAST Specific IgE IgG Enzyme-Allergo-Sorbent-Test) в сыворотке крови и супернатанте слюны определяли специфические IgE и IgG антитела на артикаин, лидокаин, прокаин, бензокаин, мепивакаин, бупивакаин, прилокаин, тетракаин, эпинефрин, ионы никеля, хрома, ртути, меди, золота, платины, кобальта, палладия, на акрилат. Статистическая обработка данных проведена на компьютере с использованием программы Microsoft Excel и пакета прикладных программ Statistica 6.0. Данные представлены как среднее и стандартное отклонение для нормального распределения и как медиана и интерквартильный размах для распределения, отличного от нормального. Значимость различий для количественных переменных между группами оценивалась по критерию Вилкоксона и Манна-Уитни. Статистически значимыми считались различия при p<0,05. 18 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Экспериментальные исследования В данной работе была предпринята попытка в опытах на мышах доказать влияние наиболее часто используемых в практике врача-стоматолога материалов на окружающие ткани и иммунный ответ на фоне изменённого аллергологического статуса. Ранее было показано, что динамика иммунного ответа у мышей при сенсибилизации сходна с таковой у человека, а использование большого числа линейных мышей позволяет получить статистически достоверные данные. К тому же подобного рода эксперименты позволяют после их завершения изучить у сенсибилизированных животных патоморфологическую картину тканей вокруг имплантируемого материала. Согласно полученным данным введение ОА в организм мышей линии (СВА х С57 ВL/6)F1 приводило к развитию аллергической реакции, о чём свидетельствует рост уровня IgE и IgG антител в плазме крови. Содержание этих белков зависело от числа проведённых иммунизаций (рис.1). Как известно, уровень анти-ОА IgE в ответ на иммунизацию отражает аллергическую реактивность, а уровень анти-ОА IgG- преимущественно защитную реакцию иммунной системы против чужеродного белка. Определение количества этих белков после имплантации СМ до, во время иммунизации и после иммунизации позволяет оценивать иммуносупрессивный или иммуностимулирующий эффект имплантированных образцов. Хотя данную модель только условно можно считать адекватной реальной стоматологической практике, но тестирование стоматологических материалов при помещении их в полость рта, в полной мере себя не оправдало (Лебедев К.А. с соавт., 2009). 19 Опт. пл. при 450 нм 0,8 0,7 0,6 0,5 IgE 0,4 0,3 0,2 IgG 0,1 0 1 2 3 4 5 Рис. 1. Изменение количества анти-ОА IgE и IgG в разные сроки иммунизации овальбумином. Условные обозначения: 1 – 2 нед. после первичной иммунизации; 2 – 1 нед. после вторичной иммунизации; 3 – 3 нед.после вторичной иммунизации; 4 – 1 нед. после третичной иммунизации; 5 – 3 нед.после третичной иммунизации. Животным первой серии проводилась имплантация сплавов металлов, применяемых для ортопедического лечения. Данные об антителообразовании у сенсибилизированных ОА мышей в ответ на имплантацию сплавов «НС», «Бюгодент», «Суперпал» и «Супер КМ» представлены на рис.2 и 3. Имплантация образцов всех исследуемых сплавов металлов в процессе первичной иммунизации ОА вызывала подавление образования анти-ОА IgE. Сходные изменения наблюдались и на поздних сроках вторичной и третичной иммунизации при имплантации сплавов за 1 неделю до начала иммунизации, одновременно и через неделю после иммунизации ОА. Наиболее выраженное иммуносупрессивное действие оказывали образцы сплавов «НС» и «Суперпал». В то же время, имплантированные одновременно и через неделю после иммунизации ОА образцы сплава «НС» на ранних сроках вторичной и третичной иммунизации усиливали образование анти-ОА IgE, тогда как имплантация образцов сплава «Супер КМ» и «Суперпал» через 3 недели после вторичной и через 3 недели после третичной иммунизации ОА приводила к уменьшению количества анти-ОА IgE. Относительно анти-ОА IgG образования в ответ на имплантацию образцов сплавов металлов выявлялась несколько иная картина. 20 А Опт. пл. при 450 нм 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 3 4 5 4 5 4 5 Сроки забора крови Опт. пл. при 450 нм Б 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 Сроки забора крови В Опт. плотн. при 450 нм 3 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 Сроки забора крови Рис.2. Анти-ОА IgЕ ответ в крови мышей с имплантацией образцов сплавов металлов: А - за неделю до иммунизации; Б – одновременно с иммунизацией; В – через неделю после иммунизации. Условные обозначения: 1 – 2 нед.после первичной иммунизации; 2 – 1 нед.после вторичной иммунизации; 3 – 3 нед.после вторичной иммунизации; 4 – 1 нед.после третичной иммунизации; 5 – 3 нед.после третичной иммунизации; – НС; – Бюгодент; – Супер КМ; – Суперпал; – контроль ОА. 21 А 0,8 Опт. пл. при 450 нм 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 3 4 5 4 5 4 5 Сроки забора крови Б 0,8 Опт. пл. при 450 нм 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 3 Сроки забора крови В 0,8 Опт. пл. при 450 нм 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 3 Сроки забора крови Рис.3. Анти-ОА IgG ответ в крови мышей с имплантацией образцов сплавов металлов: А - за неделю до иммунизации; Б – одновременно с иммунизацией; В – через неделю после иммунизации. Условные обозначения1 – 2 нед.после первичной иммунизации; 2 – 1 нед.после вторичной иммунизации; 3 – 3 нед.после вторичной иммунизации; 4 – 1 нед.после третичной иммунизации; 5 – 3 нед.после третичной иммунизации; – НС; – Бюгодент; – Супер КМ; – Суперпал; – контроль ОА. 22 Так, через 2 недели после первичной иммунизации, когда сплавы были имплантированы за 1 неделю и через 1 неделю после иммунизации содержание анти-ОА IgG повышалось, и наибольшее увеличение наблюдалось при имплантации сплавов «НС» и «Бюгодент». Подобное увеличение анти-ОА IgG определялось через 1 неделю после третичной иммунизации. В случае имплантации сплавов одновременно с иммунизацией ОА наибольшее увеличение анти-ОА IgG имелось только на «НС» в разные сроки третичной иммунизации. Имплантация сплавов «Супер КМ» и «Суперпал» либо приводила к падению количества анти-ОА IgG, либо не вызывала существенных изменений в развитии защитных реакций против чужеродного компонента. Таким образом, как показали эксперименты по модуляции иммунного ответа, не все испытанные сплавы металлов, используемых в ортопедической стоматологии, ведут себя одинаково. Сплавы «Бюгодент», «Супер-КМ» и «Суперпал» снижают, а образцы «НС», наоборот, усиливают анти-ОА IgE и анти-ОА IgG антителообразование, то есть нахождение сплава «НС» в полости рта, вероятно, может способствовать сенсибилизации к другим аллергенам. По нашим данным, подкожная имплантация образцов реставрационных СМ (рис. 4) за неделю до иммунизации выявила подавление анти-ОА IgE и анти-ОА IgG антителообразование в случае вторичной и третичной иммунизации. Наиболее выраженным иммуносупрессивным действием обладали образцы реставрационного СМ «Призмафил». При подкожной имплантации этих же образцов реставрационного СМ через неделю после иммунизации на этих сроках эксперимента происходило увеличение анти- ОА IgE ответа на материал «Филтек», а иммуносупрессивное действие образцов реставрационного СМ «Призмафил» не определялось. Имплантация образцов «Призмафил», «Геркулайт» и «Филтек» за 1 неделю до иммунизации ОА приводила к заметному угнетению анти-ОА IgG ответа по сравнению с контролем (иммунизация только ОА на всех сроках наблюдения). 23 за 1 неделю до иммунизации ОА 0,8 0,8 0,7 0,7 Опт. пл. при 450 нм Опт. пл. при 450 нм IgЕ 0,6 0,5 0,4 0,3 IgG 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1 0 0 1 2 3 4 5 1 2 Сроки забора крови IgЕ 3 4 5 Сроки забора крови через 1 неделю после иммунизации ОА IgG 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0,8 Опт.пл. при 450 нм Опт. пл. при 450 нм 1 0,9 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Сроки забора крови Сроки забора крови Рис.4. Анти-ОА IgЕ и IgG ответ в крови мышей с имплантацией образцов РСМ. Условные обозначения: 1 – 2 нед. после первичной иммунизации; 2 – 1 нед. после вторичной иммунизации; 3 – 3 нед.после вторичной иммунизации; 4 – 1 нед.после третичной иммунизации; 5 – 3 нед. после третичной иммунизации; – Призмафил; – Филтек; – Геркулайт; – контроль ОА 24 В то же время имплантация образцов этих реставрационных СМ после иммунизации ОА несколько усиливала анти-ОА IgG антителообразование по сравнению с контролем, особенно на фоне третичной иммунизации и наибольшим действием обладали образцы реставрационного СМ «Геркулайт». Таким образом, введение мышам реставрационных стоматологических материалов после стандартной иммунизации ОА слабее изменяет величину антиIgG-ответа по сравнению с IgE-ответом к аллергену. Как показали наши исследования иммуномодулирующий эффект паст для пломбирования корневых каналов в значительной степени зависит от времени их имплантации под кожу (рис.5 и 6). Заметное торможение IgE- антителообразования отмечалось при имплантации под кожу животным всех 3-х материалов до начала иммуносупрессивным иммунизации действием ОА, обладали и наиболее образцы выраженным корневой пасты «Эндометазон» при её имплантации одновременно с иммунизацией ОА и на поздних сроках третичной иммунизации. Антителообразующий эффект образцов СМ «Эндометазон», «Цинкоксидэвгенол» и «Сеалит Регуляр» в случае их имплантации под кожу мышам через 1 неделю после первичной иммунизации полностью отсутствовал. Образцы корневых паст «Эндометазон», имплантированные до или одновременно с началом иммунизации ОА также вызывали подавление IgG-антителообразования. На фоне уже развившейся сенсибилизации организма ОА иммуномодулирующее действие всех образцов корневых паст не проявлялось. Таким образом, экстраполируя полученные экспериментальные данные на клинику, можно сделать заключение о том, что следует внимательнее подходить к выбору корневых паст, которые могут подавлять как IgE-, так и IgGантителообразование к антигену, индуцируя возможный иммунодефицит. 25 Опт. пл. при 450 нм А 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 Опт. пл. при 450 нм Б 3 4 5 3 4 5 Сроки забора крови 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 Сроки забора крови В Опт. пл. при 450 нм 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 3 4 5 Сроки забора крови Рис.5. Анти-ОА IgЕ ответ в крови мышей с имплантацией образцов паст для пломбировки корней зубов: А - за неделю до иммунизации; Б – одновременно с иммунизацией; В – через неделю после иммунизации. Условн ые обозначения: 1 – 2 нед. после первичной иммунизации; 2 – 1 нед.после вторичной иммунизации; 3 – 3 нед.после вторичной иммунизации; 4 – 1 нед.после третичной иммунизации; 5 – 3 нед.после третичной иммунизации; – Эндометазон; – Цинкоксидэвгенол; – Сеалит Регуляр; – контроль ОА 26 Опт. пл. при 450 нм А 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 4 5 Сроки забора крови Б Опт. пл. при 450 нм 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 4 5 4 5 Сроки забора крови В Опт. пл. при 450 нм 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 Сроки забора крови Рис.6. Анти-ОА IgG ответ в крови мышей с имплантацией образцов паст для пломбировки корней зубов: А - за неделю до иммунизации; Б – одновременно с иммунизацией; В – через неделю после иммунизации. Условные обозначения: 1 – 2 нед.после первичной иммунизации; 2 – 1 нед.после вторичной иммунизации; 3 – 3 нед. после вторичной иммунизации; 4 – 1 нед.после третичной иммунизации; 5 – 3 нед. после третичной иммунизации; – Эндометазон; – Цинкоксидэвгенол; – Сеалит Регуляр; – контроль ОА 27 В группе животных, которым вызывали экспериментальную бронхиальную астму (ЭБА), путём внутрибрюшинного введения и интраназальных аппликаций ОА количество анти-ОА IgE антител в сыворотке крови возрастало в 10-16 раз по сравнению с контролем. Имплантация под кожу образцов «Этакрил»-ВБ приводила к некоторому увеличению анти-ОА IgE антител по сравнению с животными, у которых вызывали только ЭБА. действие оказывали имплантированные Менее выраженное подобное образцы базисной пластмассы «Этакрил»-СВЧ. Проведённое макроскопическое и микроскопическое исследование животных на фоне сенсибилизации ОА и имплантации под кожу образцов базисных акриловых пластмасс «Фторакс»-ВБ, «Фторакс»-СВЧ и «Стомакрил»ВБ, «Стомакрил»-СВЧ, «Этакрил»-ВБ, «Этакрил»-СВЧ показало, что все имплантированные акриловые пластмассы, за исключением «Этакрил»-ВБ, были окружены плотной, минимально выраженной соединительнотканной капсулой без инфильтратов и признаков воспаления. При имплантации сплавов металлов «Бюгодент», «Суперпал» и «Супер КМ» животным с модельной аллергией наблюдалось торможение капсулообразования с небольшим числом полибластов и инфильтрата из микро- и макрофагов в периимплантационной зоне, которое было наиболее выражено при имплантации образцов сплава «НС». Вокруг имплантированных образцов реставрационного СМ «Призмафил» развивалась воспалительная реакция в прилежащих тканях и торможение процессов капсулообразования, а при имплантации образцов реставрационных СМ «Филтек» и «Геркулайт» имелось выраженное образование капсулы вокруг зоны имплантатов с наличием незначительного хронического воспаления. Мы установили ярко выраженную токсичность СМ «Форедент». Его имплантация приводила к гибели 50% мышей уже на 3-5 сутки. Корневые пасты «Цинкоксидэвгенол», «Сеалит Регуляр» вызывали слабо выраженную воспалительную реакцию, в то время как при имплантации образцов СМ «Эндометазон» воспалительная реакция полностью отсутствовала. 28 Результаты клинических исследований Изучение амбулаторных карт больных с атопической аллергией за период 2005 – 2009 годы выявило, что за стоматологической помощью в Центр стоматологии и челюстно-лицевой хирургии МГМСУ обратились 170 женщин и 80 мужчин. Средний возраст всех обследованных составил 46,3±17,8 и варьировал от 16 до 83 лет. По данным анамнеза, 100% пациентов с АА, обратившиеся за стоматологической помощью (65% женщин и 35% мужчин) имели осложнённый аллергостатус, проявлявшийся в большей степени на медикаменты (42%). Анализ карт показал, что в лечении кариеса нуждалось 33,3% от всех обратившихся. Помощь в лечении воспаления пульпы и периодонта получили 23,6% пациентов, в лечении заболеваний слизистой оболочки полости рта – 26,7% и пародонта – 16,7% пациентов с АА. Обращаемость в хирургическое отделение у пациентов с АА в большинстве случаев была связана с неотложной хирургической помощью, а именно: удалением зубов по причине оперкулита, периостита, хронического периодонтита и нагноения кист челюстей (34,9%). Нуждаемость пациентов с АА в ортопедическом лечении составила 100%, из которых 58,4% человек имели зубные протезы, но нуждались в дополнительном или повторном протезировании, а 41,6% ранее не протезировались. На основании проведённого эпидемиологического и клинического обследования пациентов с АА был предложен алгоритм диагностики, который позволяет достоверно аллергостатусом и оценить предложить состояние пациентов стоматологическое с осложнённым лечение с учетом индивидуальной переносимости СМ. Результаты исследований in vitro и in vivo реакции пациентов с атопической аллергией на стоматологические материалы. 29 Исследование гистаминолиберации показало, что инкубация образцов сплавов металлов «НС», «Бюгодент», «Суперпал», «Супер КМ» с кровью пациентов без аллергии и страдающих атопической аллергией не приводила к достоверным изменениям в освобождении гистамина в обеих группах. Данные представлены в таблице 1. Вместе с тем, инкубация супернатантов базисных акриловых пластмасс с клетками крови здоровых доноров приводила к гистаминолиберации, сходной с таковой при инкубации с кровью атопических больных. Высокий уровень высвобождения гистамина давали образцы пластмассы «Этакрил»-ВБ. Образцы «Фторакс»-СВЧ давал слабую гистаминолиберацию, тогда как «Этакрил»-СВЧ и «Стомакрил»-СВЧ не вызывали высвобождение гистамина. Изучение гистаминолиберации из базофилов крови больных АА под воздействием РСМ показало значительное высвобождение гистамина только в случае инкубации «супернатантов», полученных из образца «Филтек». При анализе результатов высвобождения гистамина из базофилов плазмы крови под воздействием супернатантов паст для пломбировки каналов корней зубов выявлено, что высокой уровень гистаминолиберации как у больных с АА, так и здоровых доноров продемонстрировал образец корневой пасты «Форедент», а наиболее низкий уровень образец пасты «Эндометазон». Во всех остальных случаях высвобождение гистамина из базофилов крови было на уровне значений контроля (инкубация с PIPES-буфером). Мы исследовали реакцию В-лимфоцитов на местноанестезирующие препараты, ионы металлов и акрилат. Всего было исследовано 3695 образцов сыворотки крови на наличие специфических IgE и IgG антител у пациентов обоего пола (1346 образцов крови у мужчин и 2349 образцов крови у женщин). Было проведено 2052 теста на определение специфических IgE антител и 1643 теста на определение специфических IgG антител в сыворотке крови. Таблица 1 Высвобождение гистамина (нг/мл) из базофилов крови пациентов после её инкубации с различными стоматологическими материалами (М±m) Образцы СМ Группы пациентов Атопическая аллергия Здоровые доноры n=125 Р n=30 Р «НС» 1,6±0,39 1,9±0,25 >0,1 «Бюгодент» 2,0±0,32 2,1±0,15 >0,1 «Супер КМ» 2,4±0,23 3,1±0,40 >0,05 «Суперпал» 2,6±0,50 >0,1 р1>0,5 >0,1 р1>0,1 >0,05 р1>0,05 >0,05 р1>0,1 2,5±0,77 >0,1 PIPES (контроль) «Этакрил»-ВБ 1,60±0,41 <0,001 52,0±0,81 1,92±0,47 <0,001 49,8±0,66 «Этакрил»-СВЧ 3,2±1,51 2,9±0,81 >0,1 «Фторакс»-ВБ 2,2±1,04 2,2±0,47 >0,1 «Фторакс»-СВЧ 11,2±0,43 9,2±0,58 <0,001 «Стомакрил»-ВБ 1,7±0,91 1,5±0,57 >0,1 «Стомакрил»-СВЧ 2,7±1,13 2,4±0,73 >0,1 PIPES (контроль) «Филтек» 2,32±0,45 <0,001 16,5±1,30 1,98±0,22 <0,001 17,1±1,25 «Призмафил» 6,1±1,33 5,5±0,95 >0,1 «Геркулайт» 4,3±1,20 4,1±0,55 >0,1 PIPES (контроль) «Эндометазон» 3,70±0,50 <0,001 12,9±1,88 3,75±0,45 <0,001 11,9±1,99 «Цинкоксидэвгенол» 2,8±0,38 2,6±0,49 >0,1 «Форедент» 39,5±6,27 35,9±7,15 <0,001 «Сеалит регуляр» 4,0±1,28 4,6±0,91 >0,1 р1>0,5 >0,1 р1>0,1 >0,1 р1>0,1 <0,001 р1<0,05 >0,1 р1>0,1 >0,1 р1>0,1 р1>0,1 >0,1 р1>0,1 >0,5 р1>0,1 р1>0,1 >0,1 р1>0,5 <0,001 р1>0,05 >0,1 р1>0,5 PIPES (контроль) 3,4±0,42 3,1±0,40 Примечание: р – по сравнению с контролем (инкубация только с PIPESбуфером); р1 - между здоровыми пациентами и с атопической аллергией.. 31 Для изучения частоты выявления специфических IgE и IgG антител на ионы металлов в плазме крови и в смешанной слюне пациентов (in vitro ) было исследовано 1670 образцов сыворотки крови, из них 615 образцов у мужчин и 1055 образцов у женщин. Наибольшее число тестов по исследованию специфических IgE и IgG антител в сыворотке крови пациентов было проведено на ионы никеля, хрома и кобальта ( табл.3). Из 1670 исследованных образцов положительные результаты были получены в 113 случаях, что составило 6,77%. Наибольшее число положительных тестов выявлено в 52 образцах на ионы палладия (29%), а наименьшее- на ионы хрома и никеля. При этом острофазный ответ (IgE) на ионы металлов практически не отличается от показателей положительных тестов на цитотоксичность (IgG) (6,81% и 6,72% соответственно). Установлено, что острофазный ответ в большей степени проявлялся на ионы никеля, хрома, ртути, золота и меди, а цитотоксический ответ характерен был только для ионов платины и палладия. Число положительных тестов в образцах крови женщин и мужчин отличаются. Так, у женщин содержание специфических IgE и IgG антител к металлам составило 6,44% от числа всех исследованных образцов женщин и 4,07% от общего числа исследований. Специфические IgE антитела в образцах крови женщин в 19,6% случаев тестировались положительно на ионы палладия, наполовину меньше на ионы меди (7,81%) и ртути (7,55%), а на ионы хрома, никеля, золота, платины, кобальта колебались в пределах от 2,47% до 4,92% случаев. В 22 образцах крови женщин (40%) были выявлены специфические IgG антитела к ионам палладия, в 5 образцах (8,62%) к ионам платины, в 3-х образцах (5,66%) к ионам ртути. К ионам никеля IgG антитела отсутствовали, а к ионам кобальта, золота, меди и хрома встречались в единичных случаях. Положительные тесты в образцах сыворотки крови мужчин на специфические IgE и IgG антитела к ионам металлам определены в 45 тестах (7,32%). 32 Таблица 2 Исследование специфических IgE и IgG антител в образцах сыворотки крови пациентов на ионы металлов (n=1670) Ионы металлов Число тестов Число положительных тестов n n IgE Всего IgG М Ж Итого М Ж Итого Никель 45 81 126 42 75 117 Хром 47 77 124 42 74 Ртуть 34 53 87 32 Золото 40 66 106 Медь 39 64 Платина 36 Кобальт IgE Всего IgG М Ж Итого М Ж Итого 243 3 2 5 1 0 1 6 116 240 0 4 4 0 1 1 5 53 85 172 2 4 6 1 3 4 10 38 61 99 205 2 2 4 1 1 2 6 103 37 61 98 201 7 5 12 0 1 1 13 61 97 34 58 92 189 3 3 6 2 5 7 13 41 77 118 40 83 123 241 2 3 5 2 1 3 8 Палладий 35 56 91 33 55 88 179 5 11 16 14 22 36 52 Всего образцов 317 535 852 298 520 818 1670 24 34 58 21 34 55 113 В образцах сыворотки крови мужчин специфические IgЕ антитела выявлены в 17,9% случаев на ионы меди, в 14,3% - на ионы палладия, в 8,33% на ионы платины и несколько меньше выявлялся положительный ответ на ионы никеля, золота, кобальта, а на ионы хрома отсутствовал. Специфические IgG антитела были выявлены на ионы палладия(42,4%) в 14 образцах крови мужчин, а в остальных случаях имелись единичные положительные результаты. Таким образом, частота выявлений специфических IgE и IgG антител на ионы металлов составила 4,05 случая на 1000 тестов, больше в образцах сыворотки крови женщин (68 положительных тестов против 45 у мужчин). Специфические IgE и IgG антитела на акрилат были определены in vitro в 163 образцах сыворотки крови (100 у женщин и 63 у подробный анализ показал, мужчин). Более что специфические IgE антитела на акрилат выявлены в 14,5% образцов сыворотки крови женщин и в 12,8% образцов мужчин, а специфические IgG антитела в 2,63% случаев у женщин и в 4,17% случаев у мужчин. В смешанной слюне нашими методами специфические IgE и IgG антитела на ионы металлов и акрилат не были выявлены. Проведение 1862 тестов на IgE местноанестезирующие препараты дало и IgG антитела в крови положительные результаты на в 55 случаях (в 48 случаях на IgE антитела и в 7 случаях на IgG антитела), что составило 2,95% от общего числа исследований (табл. 4). Наибольшее число положительных тестов на местноанестезирующие препараты в образцах крови обследованных пациентов выявлялось на бупивакаин (4,27%), прокаин (4,08%), лидокаин (3,97%). Наименьшая частота аллергических реакций выявлена на тетракаин (1,29%) и эпинефрин (1,59%). Следует отметить, что для всех местноанестезирующих средств был характерен острофазный ответ (IgE). Таблица 3 Исследование специфических IgE и IgG антител в образцах сыворотки крови пациентов на местноанестезирующие препараты (n=1862) Название препарата Число тестов Число положительных тестов n n IgE Всего IgG М Ж Итого М Ж Итого Артикаин 91 133 224 48 92 140 Лидокаин 73 116 189 40 73 Прокаин 38 69 107 31 Бензокаин 33 61 94 Мепивакаин 44 76 Бупивакаин 28 Прилокаин IgE Всего IgG М Ж Итого М Ж Итого 364 1 6 7 1 0 1 8 113 302 5 6 11 0 1 1 12 58 89 196 1 6 7 0 1 1 8 28 52 80 174 0 4 4 0 1 1 5 120 35 61 96 216 0 6 6 0 1 1 7 57 85 28 51 79 164 2 4 6 0 1 1 7 31 57 88 27 50 77 165 1 2 3 0 1 1 4 Тетракаин 29 56 85 23 47 70 155 1 1 2 0 0 0 2 Эпинефрин 38 69 107 3 16 19 126 0 2 2 0 0 0 2 Всего образцов 405 694 1099 263 500 763 1862 11 37 48 1 6 7 55 Таким образом, согласно полученным данным специфические IgE и IgG антитела на местноанестезирующие препараты обнаружены в 1,58 случаев на 1000 тестов и их число было больше у женщин (2,31%) по сравнению с мужчинами (0,64%). Проведенные кожные пробы у пациентов без АА на все исследуемые образцы сплавов металлов и базисных акриловых пластмасс показали отрицательные результаты, а у пациентов с АА положительные кожные реакции имелись на образцы СМ «НС» (27,7%), «Бюгодент» (10,8%), «Этакрил»-ВБ (9,2%), «Фторакс»-ВБ (9,2%) и «Стомакрил»-ВБ (3,1%). Наибольшая частота положительных кожных реакций была выявлена у женщин с АА (26,1%) против 12,3% у мужчин с АА. Влияние ортопедического лечения из различных стоматологических материалов на ткани полости рта больных с атопической аллергией. После проведённого ортопедического лечения пациентов с АА съемными протезами (СП) через 1 неделю выявлено достоверное повышение в слюне (р<0,01) активности обеих трансаминаз, причём эти значения были достоверно выше (р<0,05), чем у пациентов без АА. В эти сроки у пациентов с металлокерамическими протезами (МКП) и бюгельными протезами(БП) наблюдалось достоверное повышение (р<0,05) активности АСТ и АЛТ в смешанной слюне, которая к 6-му месяцу уже не отличалась от исходных значений. Через 1 месяц в группах со СП после протезирования активность трансаминаз в слюне пациентов с АА оставалась высокой (р<0,01; р<0,05) и сохранялась к 6-му месяцу адаптации. Таблица 4 Показатели смешанной слюны пациентов в период адаптации к съёмным протезам (М±m) Группы Пациенты без АА Пациенты с АА сроки иссл. до лечения 1 неделя 1 месяц 6 месяцев до лечения 1 неделя 1 месяц 6 месяцев АСТ 20,1+6,28 72,4 +5,50** 58,5+8,61** 42,9+ 7,21* 28,6+4,22 81,3 +9,22** 48,2+4,36** 38,7+ 5,31* АЛТ (МЕ/л) 27,7+3,13 42,3+ 4,62 * 31,1+5,59 21,5 + 3,62 31,4+2,81 52,8+ 5,15 ** 44,4+3,19* 41,2 + 5,24* ЩФ 24,2±4,15 35,8±5,67* 34,1±3,88* 33,2±3,81* 30,2±5,07 44,3±3,11* 46,7±4,45* 47,5±12,1** 267±34,1 654±74,3** 421±47,8* 341±31,0* 424±56,3 450±65,3 430±72,1 457±96,7 0,32±0,05 0,67±0,07** 0,56±0,03** 0,37±0,07 6,52±0,16 8,00±1,32* 10,2±2,02* 4,88±1,45* 215±34,4 299±24,7* 267±56,1* 234±67,2* 288±67,8 303±77,2 310±45,1 386±36,8** (МЕ/л) (МЕ/л) IgA (мг/дл) IgG (мг/дл) IgM (мг/дл) Достоверность различий по сравнению с показателями до протезирования: * - p < 0,05; ** - p < 0,01 37 Таблица 5 Показатели смешанной слюны пациентов в период адаптации к металлокерамическим протезам (М±m) Группы Пациенты без АА Пациенты с АА сроки иссл. до лечения 1 неделя 1 месяц 6 месяцев до лечения 1 неделя 1 месяц 6 месяцев АСТ 21,8+8,79 31,0+ 13,5 34,3+6,39* 17,1+ 3,05 27,1+6,13 43,5+ 8,57* 37,1+5,32 26,5+ 4,04 АЛТ (МЕ/л) 21,8+5,50 32,8 + 4,13* 24,6+6,79 19,1 + 1,86 31,7+3,41 32,2 + 2,55 30,5+4,31 31,3 + 0,18 ЩФ 21,0±2,98 25,8±4,90 23,6±1,04 19,5±2,54 28,3±3,44 38,7±3,21* 30,4±2,87 26,8±2,00 258±25,3 251±31,4* 226±34,3* 241±46,2 398±47,5 367±67,4 440±89,0* 402±20,8 0,24±0,06 0,37±0,01 0,36±0,02 0,27±0,01 5,89±0,45 6,01±0,56 6,20±1,00 5,88±0,25 207±28,8 216±17,7 198±66,4 204±27,9 306±76,2 345±87,4* 324±67,7 316±38,0 (МЕ/л) (МЕ/л) IgA (мг/дл) IgG (мг/дл) IgM (мг/дл) Примечание: Достоверность различий по сравнению с показателями до протезирования: * - p < 0,05; ** - p < 0,01 38 Таблица 6 Показатели смешанной слюны пациентов в период адаптации к бюгельным протезам (М±m) Группы Пациенты без АА Пациенты с АА сроки иссл. до лечения 1 неделя 1 месяц 6 месяцев до лечения 1 неделя 1 месяц 6 месяцев АСТ 22,2+2,56 29,2+ 1,03 29,2+1,03 19,9+0,92 27,4+6,56 39,6+ 3,45 29,8+11,2 39,1+3,65 АЛТ (МЕ/л) 27,1+2,73 27,1 + 1,93 26,2+2,72 17,8+ 2,90 32,8+3,32 47,1 + 1,93* 40,8+4,11 38,5+ 6,09 ЩФ 20,8±6,78 23,4±3,54 26,3±3,65 23,7±3,76 27,9±3,04 31,4±2,65 36,1±8,54* 31,7±6,54 261±47,4 304±36,8 323±87,3 260±65,1 406±89,3 390±90,1 456±78,0 420±112 0,30±0,01 0,37±0,02 0,36±0,04 0,27±0,02 5,55±0,22 5,80±0,35 5,26±0,66 4,76±0,47* 209±26,3 237±69,9* 227±14,5* 214±13,8 271±55,2 315±44,8* 321±26,9* 341±36,7** (МЕ/л) (МЕ/л) IgA (мг/дл) IgG (мг/дл) IgM (мг/дл) Достоверность различий по сравнению с показателями до протезирования: * - p < 0,05; ** - p < 0,01 39 Исследование активности ЩФ, показало, что у пациентов в группе сравнения до протезирования её активность в смешанной слюне была ниже, чем у пациентов с АА. У пациентов без АА, через 1 неделю после использования СП активность ЩФ в слюне достоверно повышалась, и это увеличение сохранялось до 6 месяца. При использовании БП и МКП активность фермента в смешанной слюне практически не отличалась от исходных значений на всех сроках исследований. У пациентов с АА со СП на протяжении всего периода исследования в смешанной слюне наблюдалось достоверное повышение активности ЩФ (р<0,01; р<0,05), которое сохранялось до 6-ого месяца, причём эти значения были выше, чем у пациентов группы сравнения. При использовании БП и МКП пациентами АА активность этого фермента в смешанной слюне практически не претерпевала существенных изменений. Таким образом, при использовании СП в смешанной слюне имеются существенные сдвиги в активности АСТ, АЛТ и ЩФ, причём у пациентов с АА эти показатели были значительно выше. Содержание IgA в смешанной слюне здоровых пациентов после протезирования СП через 1 неделю достоверно увеличивалось (р<0,001) и эта тенденция сохранялась до 6 месяца исследования (р<0,05) (рис.7). Достоверное увеличение (р<0,05) количества IgA в смешанной слюне пациентов этой группы наблюдалось также через 1 неделю и 1 месяц после пользования МКП и БП. Исследование содержания IgМ в смешанной слюне пациентов без АА до начала протезирования было ниже, чем у пациентов с АА. Адаптация к СП у здоровых лиц происходила с достоверным увеличением содержания IgМ (р<0,05) в смешанной слюне через 1 и 6 месяцев, в то время как при адаптации к МКП достоверные отличия в изменении количества Ig М в слюне не были выявлены. При пользовании БП наблюдалось повышение содержания Ig М во все сроки адаптации (р<0,01). У пациентов с АА содержание Ig A в смешанной слюне было исходно выше, чем у пациентов без АА. Использование СП из акриловых пластмасс в данной группе вызвало существенную реакцию со стороны клеток неспецифической иммунной защиты. Повышение содержания Ig A у пациентов с АА на фоне использования СП через 1 неделю было достоверным по отношению к показателям исходного уровня (р<0,001). К 6 месяцу адаптации эти отличия исчезали. Пользование МКП и БП пациентами с АА в течение 1 месяца сопровождалось достоверным увеличением содержания Ig A в слюне (р<0,05). В дальнейшем происходило снижение содержания Ig A в слюне до исходного уровня. Адаптация к СП и БП у этой группы пациентов протекала на фоне достоверного повышения содержания в смешанной слюне Ig М (р<0,05; р<0,01) во все сроки обследования. При пользовании МКП пациентами с АА через 1 неделю после протезирования наблюдалось достоверное увеличение в смешанной слюне Ig М (р<0,05), которое в дальнейшем снижалось до исходных значений. Исследование количества IgG в слюне в период адаптации выявило, что у здоровых лиц в ответ на использование СП происходило повышение содержания IgG (р<0,001) в смешанной слюне, а на длительных сроках адаптации (до 6-ти месяцев) количество IgG снижалось до исходных значений. У пациентов с АА наблюдалось достоверное увеличение содержания IgG в слюне во все сроки обследования (р<0,05; р<0,001). При пользовании БП имелось достоверное снижение содержания IgG к 6-му месяцу в обеих группах пациентов. Присутствие МКП в полости рта не оказывало влияния на уровень IgG в смешанной слюне, как у здоровых лиц, так и у пациентов с АА. ВЫВОДЫ 1. Комплексные экспериментальные исследования свидетельствуют об отсутствии иммуноинертных стоматологических материалов в группах изученных базисных акриловых пластмасс, стоматологических сплавов металлов, корневых паст, композитных реставрационных материалов. 2. Наиболее выраженной гистаминолиберирующей активностью обладают образцы из акриловой пластмассы «Этакрил», полученные термополимеризацией в воде, в отличие от как образцов, полученных СВЧметодом. 41 3. Реакция на имплантацию образцов стоматологических сплавов металлов: никель-хромовой нержавеющей стали, кобальто-хромового сплава «Бюгодент», палладиевого сплава«Суперпал», золото-платинового сплава «Супер КМ» зависит от длительности иммунизации, так как образование IgG увеличивается через неделю после первичной, вторичной и третичной иммунизации овальбумином экспериментальных животных, а через три недели после третичной иммунизации иммуномодулирующее действие прекращается. 4. На фоне атопической аллергии подкожная имплантация лабораторным животным образцов сплавов «Суперпал» и «Супер КМ» подавляет образование IgG на модельный аллерген – овальбумин, в то время как образцы из нержавеющей стали усиливают его образование. 5. Корневые пасты обладают различным иммуномодулирующим действием. Имплантация образцов корневых паст «Цинкоксидэвгенол», «Эндометазон», «Сеалит Регуляр» на всех сроках иммунизации не подавляет выработку IgE и IgG на аллерген. Имплантация образцов пасты «Форедент» под кожу лабораторным животных привела к гибели 45% особей, что свидетельствует о ярко выраженной токсичности исследованного материала. 6. Наиболее высокий уровень высвобождения гистамина из базофилов крови здоровых лиц и пациентов с атопической аллергией наблюдается после их инкубации с образцами корневой пасты «Форедент». Стоматологические материалы «Цинкоксидэвгенол», «Сеалит Регуляр», сплавы «Суперпал» и «Супер КМ» не оказывают подобного действия на эти клетки крови. 7. Исследование содержания специфических IgE и IgG в плазме крови пациентов показало, что наибольшее число положительных тестов выявлено на ионы палладия (29%), акрилат (9,82%), и местноанестезирующие препараты бупивакаин (4,27%), прокаин (4,08%), лидокаин (3,97%), при этом доминирует острофазный IgE ответ. В смешанной слюне здоровых лиц и пациентов с атопической аллергией 42 специфические IgE и IgG антитела на изученные аллергены не определяются. 8. В группе пациентов с аллергическим дерматитом наиболее часто в роли гаптенов выступают образцы из нержавеющей стали (27,7%) из сплава «Бюгодент» (10,7%), а также образцы из акриловых пластмасс, полимеризованных на водяной бане - «Этакрил» (9,2%) и «Фторакс» (9,2%). 9. У больных с атопической аллергией в 1,5 раза снижена скорость образования смешанной слюны, имеется сдвиг рН в кислую сторону, увеличено содержание иммуноглобулина А и G, активность трансаминаз, щелочной фосфатазы. 10. После стоматологического ортопедического лечения пациентов с атопической аллергией в ранний период адаптации наибольшая реакция выявлена на съёмные и бюгельные протезы, которая выражалась в повышении в слюне активности обеих трансаминаз, щелочной фосфатазы и содержания иммуноглобулинов A, G и М. В более поздние сроки адаптации повышение активности ферментов смешанной слюны сохранялось только на съёмные пластиночные протезы. На металлокерамические конструкции достоверная реакция отсутствовала. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для профилактики возможного неблагоприятного влияния стоматологического лечения на организм пациентов группы риска, особенно страдающих атопической аллергией, целесообразно использовать наиболее биосовместимые, низко аллергенные материалы и оптимальные технологии, научно обоснованные в проведенных исследованиях. В тяжелых случаях необходимо проводить индивидуальный подбор стоматологических материалов, а при невозможности – использовать 43 оптимальные материалы и технологии, определённые по результатам проведённых исследований. 2. Метод определения высвобождения гистамина из базофилов крови рекомендуем применять при предварительной оценке стоматологических материалов, используемых в стоматологической практике, а также для индивидуального подбора стоматологических материалов. Для исследования аллергологического статуса пациентов на стоматологические материалы (ионы металлов, акрилат и местноанестезирующие препараты) целесообразно использовать метод определения в плазме крови специфических IgE и IgG антител. 3. Для прогнозирования развития аллергической реакции у пациентов, имеющих зубные протезы, рекомендуется определение в плазме крови специфических IgG антител. Для выявления первичной реакции на аллергены (отсутствие контакта с материалом или препаратом) следует определять в плазме крови специфические IgE антитела. 4. Пациентам с атопической аллергией в ходе подбора материала для стоматологической изготавливать ортопедической реабилитации не следует зубные протезы из акриловой пластмассы «Этакрил», полимеризованной на водяной бане, использовать для обтюрации каналов корней зубов пасту «Форедент». Следует особенно тщательно обосновывать применение у этих пациентов протезов из сплавов на основе палладия. При выборе конструкционного отдавать предпочтение цельнолитым, материала целесообразно металлокерамическим и безметалловым зубным протезам. 5. Экспериментально-клиническими исследованиями обоснован высокий эффект новых диагностических тест-систем in vitro – метод оценки высвобождения гистамина специфических IgE и выявить из базофилов крови и определение IgG антител в сыворотке крови, позволяющих аллергические реакции на отдельные компоненты стоматологических материалов. 44 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Дубова 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Л.В., Киткина Т.Б. «Изменение биохимических и иммунологических параметров в динамике приспособления пациентов к несъемным зубным протезам»// Собрание научных работ «Новое в теории и практике стоматологии».-Ставрополь, 2003. - С. 397-401. Воложин А.И., Бабахин А.А., Дубова Л.В., Сорокин Д.А., Виноградова О.Д., Дюбуске Л.М. Возможные механизмы действия на иммунную систему сплавов металлов и акриловых пластмасс, используемых в стоматологии. //Дальневосточный медицинский журнал (приложение). – 2004. - № 1.- С. 160-162. Дубова Л.В., Сорокин Д.А., Бабахин А.А. Гистаминвысвобождающая активность сплавов металлов, используемых в ортопедической стоматологии. //III Российский Конгресс по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем». – 2004. - С. 112-113. Воложин А.И., Бабахин А.А., Дубова Л.В., Сорокин Д.А., Дюбуске Л.М. Иммунотропное действие сплавов, используемых в стоматологии.// Материалы XII и XIII Всероссийских научнопрактических конференций и труды IX съезда Стоматологической Ассоциации России.-М., -2004. - С. 533-535. Воложин А.И., Бабахин А.А, Дубова Л.В., Сорокин Д.А. Аллергия к металлам, используемым для зубного протезирования, и методы ее диагностики. //«Стоматология». – 2004. - №5. - С. 57-61. Воложин А.И., Бабахин А.А., Дубова Л.В., Сорокин Д.А., Виноградова О.Д., Дюбуске Л.М. Возможные механизмы действия на иммунную систему сплавов металлов и акриловых пластмасс, используемых в стоматологии.//Дальневосточный медицинский журнал. Регионарная научно-практическая конференция «Экология и здоровье человека на Севере» (приложение №1). 2004. - С. 160-162. Воложин А.И., Денисов А.Б., Лебеденко И.Ю., Дубова Л.В., Диева С.В., Киткина Т.Б., Михайлов А.Н. Адаптационные реакции зубочелюстной системы пациентов при протезировании (биохимические и иммунологические аспекты). //Российский стоматологический журнал. –М.,– 2004. - №1. - С.4-9. Дубова Л.В. Действие некоторых стоматологических сплавов на иммунную систему в эксперименте.//Материалы III Международной научно-практической конференции «Болезни 45 цивилизации в аспекте учения В.И.Вернадского», Москва 11-12 октября 2005, РУДН. –М., - 2005. – С.190-192 9. Дубова Л.В., Деев М.С., Обезьянина Е.В. Отдалённые результаты ортопедического лечения бюгельными протезами из кобальто-хромового сплава//Российский стоматологический журнал. –М., – 2005. - №4. – С. 31-32 10. Дубова Л.В., Лебеденко И.Ю., Парунов В.А., Перегудов А.Б., Степанова Г.С., Тагильцев Д.И. Физико-механические и эксплуатационные свойства нового отечественного золотого сплава для бюгельных съёмных зубных протезов «СуперЛБ»//Российский стоматологический журнал. –М., – 2005. - №2. – С. 14-17 11.Дубова Л.В., Киткина Т.Б. Выделение гистамина из базофилов крови – метод оценки адаптации пациентов к зубным протезам из акриловых пластмасс и сплавов металлов.// Сборник трудов III Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» по тематике «Пародонтология». Дентал-Ревю, Москва, 7-10 февраля 2006 г. –М., - 2006. – С. 62-63 12. Дубова Л. В., Воложин А. И., Бабахин А. А. Биосовместимость стоматологических материалов — оценка безопасности по способности к гистаминолиберации // Стоматология. –М.,2006. - № 4. – С.4-8 13. Лебеденко И.Ю., Деев М.С., Дубова Л.В., Парунов В.А. Палладий и его сплавы. Биологическое действие. Российский стоматологический журнал. –М.,-2006. № 5. – С. 38-43 14. Дубова Л.В., Деев М.С., Парунов В.А., Лебеденко И.Ю. Изучение физико-механических свойств образцов новых сплавов на основе палладия для бюгельных зубных протезов//Российский стоматологический журнал. –М.,– 2006. №5. – С. 6-7. 15. Дубова Л.В. Использование современного стекловолоконного метода определения гистамина для индивидуального тестирования акриловых пластмасс. Научно-практический журнал «Dentist Казахстан».-Алматы,-2007.- № 2 (6). – С.115-116. 16. Воложин А.И., Бабахин А.А., Казарина Л.Н., Дубова Л.В., Гущина О.О., Бабахина Ю.А. Иммуномодулирующая активность стоматологических материалов, применяемых для пломбирования каналов корней зубов. //Стоматология. –М., 2007. - Том 86, №2. - С.12-16. 17.Дубова Л.В., Воложин А.И., Лебеденко И.Ю. Непереносимость металлических зубных протезов. //Актуальные вопросы стоматологии. Тезисы докладов научно-практической конференции, посвящённой 100-летию В.Ю. Курляндского. –М., – 2008. – С.73-77. 46 18.Дубова Л.В., Денисов А.Б., Лебеденко И.Ю. Функция слюноотделения как показатель адаптации к зубным протезам.// Материалы XIX и XX Всероссийских научно-практических конференций. –М., – 2008. – С. 190-193. 19.А.А.Бабахин., А.И.Воложин., Л.В.Дубова., И.Ю.Лебеденко., Ю.А.Бабахина.,А.А.Журавлева.,Л.М.Дюбуске. Гистаминвысвобождающая активность стоматологических материалов как показатель их биосовместимости.// Стоматология.-М.,-2008.-Том 87,№1.-С.8-17. 20.Бабахин А.А., Воложин А.И., Журавлева А.А., Казарина Л.Н., Бабахина Ю.А., Дубова Л.В., Дюбуске Л.М.,. Гистаминвысвобождающая и иммуномоделирующая активность реставрационных стоматологических материалов // Стоматология. – 2008. - №4. – С.4– 10. 21.Дубова Л.В., Воложин А.И., Лебеденко И.Ю. Профилактика непереносимости к сплавам металлов. // «Цветные металлы».2009. - №3. – С. 39-41 22.Дубова Л.В., Воложин А.И., Лебеденко И.Ю., Отырба Р.Д. Определение биосовместимости стоматологических материалов, применяемых в ортопедической стоматологии. //Материалы XXI и XXII Всероссийских научно – практических конференций. – 2009. – С. 373-377 23.Дубова Л.В., Лебеденко И.Ю., Быкова М.В., Бабахин А.А. Исследование влияния стоматологических материалов на гистаминолиберацию базофилов крови in vitro//Эндодонтия Today. –М.,– 2010. - № 2 С.- 22-25. 24.Дубова Л.В., Лебеденко И.Ю., Бабахина Ю.А.,Стеценко О.Н., Борзова Н.В., Воронкова Л.Н., Бабахин А.А. Влияние образцов зубных протезов из акриловой пластмассы, на проявление краткосрочной IgE – зависимой бронхиальной астмы в эксперименте.//Российский стоматологический журнал. –М.,– 2010. - №4. – С. 12-22. 25.Дубова Л.В. Нуждаемость пациентов с бронхиальной астмой в стоматологической помощи. //Российский стоматологический журнал. –М.,– 2010. - №5. – С. 23-30. 47