ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ
ПАНАВИРА. Краткое резюме.
При исследовании эспериментальной противовирусной активности Панавира
использовались следующие материалы и методы:
Вирусы. Штамм «Софьин» вируса клещевого энцефалита в виде 10% мозговой
суспензии инфицированных мышей-сосунков. Для заражения животных использовали дозу
вируса, равную 5-10 ЛД50 в 0,2 мл.
ВПГ1 - штамм F, ВПГ2 - штамм G и референс-штамм ЦМВ АD 169, любезно
предоставленные проф. L. Pereira и проф. D. Emanuel (США).
Цитопатогенный штамм ВГС, относящийся к наиболее распространенному в России
генотипу 1В, выделенный из крови больной хроническим гепатитом С.
Штаммы вируса гриппа А: WSN/33(H1N1), Aichi Н3N2 2/2/68. Резистентный к
ремантадину штамм вируса гриппа АAichi Н3N2 2/68 получали в условиях стандартной
процедуры пассирования штамма вируса в клетках MDCK в присутствии возрастающих
концентраций ремантадина от 2 до10 мкг/мл. После 6-го пассажа этот штамм приобретал
выраженную резистентность к ремантадину и использовался для заражения мышей.
Отечественный вакцинный штамм Л-16 вируса кори, относящийся к генетической
линии 1.
Культуры клеток.
Для титрования вируса клещевого энцефалита (КЭ) была использована линия клеток
почки эмбрионы свиньи (СПЭВ), чувствительная к репродукции вируса КЭ.
Репродукцию вируса КЭ в головном мозге инфицированных вирусом КЭ мышей
контрольной и опытных групп на 8-й день после заражения определяли с помощью
титрования инфекционной активности вируса в суспензии мозга 5 животных от каждой
группы - в культурах клеток СПЭВ.
Вируснейтрализующие антитела в сыворотках крови животных, инфицированных
вирусом КЭ, в контрольных и опытных группах определяли в реакции биологической
нейтрализации с использованием культур клеток СПЭВ. Равные соотношения
инактивированной сыворотки животных, инфицированных и неинфицированных вирусом,
в разведении 1:10 и каждые из 10-кратных разведений вируса инкубировали в течение ночи
при 4°С, после чего вносили в суспензию культур клеток СПЭВ и инкубировали в течение
96 часов. Результаты реакции учитывали по индексу нейтрализации (по способности
сывороток нейтрализовать цитопатогенное действие разных концентраций вируса).
Для анализа анти-ВПГ активности препарата использовали клетки перевиваемой
линии Vero, являющиеся высоко чувствительными к ВПГ. Клетки Vero культивировали в
среде Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, глютамина и
гентамицина. Для анализа анти-ЦМВ активности применяли первичную культуру
диплоидных фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ). Фибробласты культивировали в
смеси сред Игла-MEM и 199 в соотношении 1:1 с добавлением 10% эмбриональной
телячьей сыворотки, глютамина и гентамицина.
Для титрования инфекционной активности ВГС использовали высоко чувствительные к
цитопатогенному действию ВГС культуры клеток аденокарциномы надпочечника человека
(SW-13), полученные из Национальной американской коллекции клеточных культур. Для
заражения готовили однодневный монослой клеток, выращенный 24- луночных
пластиковых панелях. Культуры клеток SW-13 выращивали на двойной среде Игла
(производство Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН) с добавлением
10% фетальной сыворотки телят, глютамина и канамицина (100 ЕД/мл).
Репродукцию вируса гриппа исследовали в перевиваемой культуре клеток почек
эмбрионов собаки – MDCK.
Действие Панавира на репродукцию вакцинного штамма вируса Кори Л-16
наблюдали в культуре перевиваемых клеток Vero , полученных из Национального
Института биологических стандартов ( Лондон, Великобритания) а также в перевиваемой
культуре В -95 ( перевиваемая культура лимфобластовмармозетов), полученной из
Института Р.Коха (Берлин, ФРГ). Обе культуры использовали в виде однодневного
монослоя клеток, выращенного в 96-луночных пластиковых панелях фирмы Costar. Для
пересева и проддержания культур использовали синтетические среды RPMI-1640 и MEM с
добавлением 5% фетальной сыворотки HyClone с добавлением глютамина и гентамицина.
Животные. Белые беспородные мыши массой 8-10 и 12 г., а также новорожденные
мыши 2-3-дневного возраста. Мыши инбредной линии DBA массой тела 18-22 г,
полученные из Центрального питомника лабораторных животных "Крюково" РАМН.
Беспородные белые мыши, самки, массой 13-14 г.
Препараты сравнения
Ридостин - отечественный индуктор интерферона, представляющий 2-спиральную РНК,
выделенную из киллерных штаммов дрожжей S.cerenisiae, использовали в качестве
контрольного препарата с известной противовирусной активностью в отношении КЭ.
Ридостин в дозе 5 мг на кг веса вводили инфицированным вирусом КЭ мышам спустя 4,24
и 72 часа после заражения.
Препарат Панавир использовался в виде субстанции (рег.№ 000299/01-2001)
производства Института молекулярной генетики РАН г.Москва по заказу ООО «Флора и
Фауна+», или в виде готовых лекарственных форм: раствор для инъекций 0,004%
стерильный в ампулах по 200 мкг в 5 мл (ООО «Флора и Фауна+»); ректальные
суппозитории Панавир-200 мкг (рег. № ЛС-001696) производства ООО «Ланафарм».
Статистическая
обработка.Статистическую
значимость
различий
между
экспериментальными и контрольными группами определяли по методу оценки для
выборочных долей вариант (Урбах В.Ю., 1964).
Достоверность полученных в исследовании результатов оценивали, используя tкритерий Стьюдента для малых выборок, а также непараметрические методы для попарно
связанных вариант.
Подготовка к работе первичных данных и расчеты проводились в среде пакета
статистических программ (PSP) STATISTICA (версия 6.0) для WINDOWS.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ
Защитное действие Панавира на модели мышей, инфицированных вирусом
клещевого энцефалита.
Препарат вызывал достоверную 33,3% защиту мышей, инфицированных подкожно
штаммом "Софьин" вируса КЭ в дозе 5 LD50/0,2 мл в случае его
двукратноговнутривенного введения (через 24 и 72 часа после заражения) в дозе по 200 мкг
в 0,2 мл в каждой инъекции, при этом средняя продолжительность инкубационного
периода увеличивалась на 1 сутки. Репродукция вируса КЭ в головном мозге
инфицированных вирусом КЭ мышей при подострой инфекции, на 8-й день после
заражения снижалась под воздействием препарата на 2,5 - 3,0 lg, что, вероятно, и
обеспечивало выживаемость животных, получавших препарат. Наблюдения показали, что
во всех сериях опыта у животных, получавших однократно и двукратно препарат в дозе
200 мкг на инъекцию, не было обнаружено изменений в поведении, росте, подвижности,
внешнем виде, по сравнению с контрольной группой, что свидетельствовало бы о
токсичности этих доз препарата.
Влияние Панавира на течение герпесвирусной инфекции in vitro.
Первая серия экспериментов была посвящена изучению цитотоксического действия
Панавира на культуру клеток Vero и ФЭЧ. Установлено, что практически полная гибель
клеток Vero(CC95) отмечалась при концентрации препарата 10 мг/мл через 3 суток (острая
цитотоксичность). Гибель 50% клеток(СС50) наблюдалась при концентрации 1 мг/мл. При
более низких концентрациях препарата цитотоксический эффект отсутствовал. Метод
графической экстраполяции позволил определить, что гибель 50% клеток ФЭЧ наступает
при концентрации препарата 90 мг/мл в первые сутки после внесения в культуру.
Вторая серия экспериментов была направлена на изучение действия препарата на
пролиферацию клеток Vero и ФЭЧ. Показано, что при концентрации 10 мг/мл Панавир
практически полностью подавлял пролиферацию клеток, при концентрации препарата 1
мг/мл - подавлял пролиферацию клеток на 50% (IP50). При концентрации 0,1 мг/мл и
меньше препарат не оказывал ингибирующего действия на клеточное размножение. Таким
образом, 50%-ый цитотоксический эффект и 50%-ое подавление пролиферации клеток
Vero (СС50 и IP50) наблюдались при одной и той же концентрации Панавира - 1 мг/мл.
50%-ое подавление пролиферации ФЭЧ наблюдалось при концентрации 2,4 мг/мл.
Третья серия экспериментов была посвящена изучению противовирусного эффекта
Панавира. Установлено, что Панавир в концентрациях 1 мг/мл и 0,1 мг/мл усиливает
действие как ВПГ1, так и ВПГ2 на клетки Vero, о чем судили по более быстро
наступающему и более выраженному ЦПД. При концентрации 0,01 мг/мл Панавир
практически полностью (IС95) препятствовал развитию ЦПД при ИМ ВПГ1 и ВПГ2 0,0001
БОЕ/кл. 50%-ое подавление вирусного ЦПД (IC50) наблюдалось при ИМ 0,001 БОЕ/кл.
При заражении клеток Vero сИМ 0,0001 БОЕ/кл. и использовании Панавира в
концентрации 1 мкг/мл цитопатогенное действие ВПГ наблюдалось на двое суток позже по
сравнению с контрольными зараженными клетками, не обработанными Панавиром. При
концентрации 0,1 мкг/мл препарат не обладал противовирусным действием. Для более
детального изучения противовирусною действия препарата были проведены опыты, в
которых Панавир был использован в концентрациях от 0,02 мг/мл до 0,001 мг/мл с
двукратным шагом разведения. На клетки, инфицированные ВПГ1 и ВПГ2 с ИМ 0,1
БОЕ/кл. препарат Панавир не действовал. При концентрации препарата 0,005 мг/мл IC50
наблюдалось при ИМ ВПГ1 и ВПГ2 0,001 БОЕ/кл. Практически полное подавление IC95
было отмечено при ИМ 0,0001 БОЕ/кл. Препарат в концентрации 0,0025 мг/мл действовал
только на ВПГ1 и только при низкой ИМ - 0,0001 БОЕ/кл. Важно отметить, что
инфекционная активность ВПГ1 и ВПГ2, определявшаяся в культуральной жидкости от
инфицированных клеток, под действием препарата снижалась в 10 раз.
При исследовании анти-ЦМВ активности Панавира на клетках ФЭЧ установлено.
При заражении клеток с ИМ 0,001 и 0,0001 БОЕ/кл. Панавир в концентрации 3 мг/мл
полностью подавлял развитие ЦМВ-инфекции в культуре ФЭЧ. Препарат в концентрации 1
мг/мл подавлял развитие ЦПД на 45% при ИМ 0,001БОЕ/кл. и на 70% при ИМ 0,0001
БОЕ/кл. При использовании концентрации 0,1 мг/мл ингибирование развития ЦПД
наблюдалось на 10% и 30% при ИМ 0,001 БОЕ/кл. и 0,0001 БОЕ/кл., соответственно. При
концентрации 0,01 мг/мл препарат не обладал противовирусным действием. Расчет
концентрации препарата, ингибирующей развитие вирусного ЦПД на 50% (IC50), показал,
что при ИМ вируса 0,001 БОЕ/кл. IC50 составляет 1,2 мг/мл, а при ИМ 0,0001 БОЕ/кл. - 0,6
мг/мл.
В условиях опытов индекс селективности (химиотерапевтический индекс) для
препарата Панавир, рассчитанный как отношение CC50/IC50 равен 100-200 и 200-400 для
ВПГ 2 типа и ВПГ 1 типа, соответственно, для ЦМВ равен 25-50.
Изучение действия Панавира на синтез белков ВПГ1 и ВПГ2 в культуре клеток
Vero показало, что: Панавир полностью подавляет экспрессию поздних белков ВПГ1 через
24 часа после заражения с ИМ 0,001-0,0001 БОЕ/мл; Панавир полностью подавляет
экспрессию поздних белков ВПГ2 через 48 часов после заражения с ИМ 0,001 БОЕ/мл и
через 72 часа после заражения с ИМ 0,0001 БОЕ/мл; Панавир полностью подавляет
экспрессию всех изученных (сверхранних, ранних и поздних) белков ВПГ2 в течение 48
часов после заражения с ИМ 0,0001 БОЕ/мл.
Действие Панавира на экспериментальную инфекцию, вызванную вирусом
гепатита С in vitro.
Препарат в различных концентрациях в объеме 200 мкл вносили в лунки 24луночных пластиковых панелей с монослоем культуры клеток SW-13 за 24 часа до
заражения клеток ВГС, в момент заражения и через 24 часа после заражения. Через 3-4 дня
после инфицирования клеток отбирали пробы культуральной жидкости и титровали на
культурах клеток SW-13. Инфекционную активность ВГС учитывали по результатам
титрования, как правило, на 6-7 день после инфекции, когда развивалось максимальное
цитопатогенное действие вируса, используя формулу Рида и Менча для подсчета титра
вируса гепатита С. Инфицированные культуры клеток, обработанные препаратом,
оставляли также до 5-6 дней, после чего подсчитывали % жизнеспособных клеток.
Показано, что Панавир не обладает вирулицидной активностью в отношении ВГС,
так как экспозиция различных концентраций препарата и ВГС содержащего материала в
течение до 1 часа не приводила к снижению инфекционной активности ВГС. Показано,
что Панавир в концентрации 150 мкг/200мкл и ниже не обладает цитотоксическими
свойствами для культур клеток SW-13.
Показано, что наибольшей противовирусной активностью препарат обладает в
случае обработки клеток в момент заражения культур клеток ВГС. Оптимальные для
противовирусной активности концентрации препарата были от 12 до 3 мкг в 200 мкл. В
этих случаях титры вируса снижались на 3,0-4,0 lgТЦД50. Обработка клеток Панавиром за
24 часа до инфекции, приводила к незначительному снижению инфекционных титров
ВГС, а его введение через 24 часа после заражения культур клеток, как правило, не
приводила к антивирусному эффекту препарата.
Действие Панавира на инфекцию, вызванную вирусами гриппа А.
Влияние Панавира на репродукцию вируса гриппа в культуре клеток.
При изучении влияния Панавирана репродукцию вируса гриппа в культуре клеток
MDCK клетки заражали лабораторным штаммом A/WSN/33(H1N1) вируса гриппа человека
в дозах от 0,01 до 10 ИД50 на клетку. Панавир вводили до заражения или в различные сроки
после заражения. Продукция вируса оценивалась по титрам гемагглютининов в
культуральной жидкости через 24 часа после заражения. Показано, что при заражении
клеток относительно большими дозами вируса (10 и 1 ИД50/клетка) выявляется тенденция к
двукратному и, в некоторых случаях, к четырехкратному ингибирующему действию
препарата на конечные тотальные титры вируса. Однако при использовании малых
заражающих доз вируса (0,1 – 0,01 ИД50) ингибирующее влияние Панавира не выявлено.
С целью более детального анализа возможного влияния Панавира на репродукцию
вируса гриппа при относительно малых дозах заражения – был проведен анализ динамики
вирусной продукции. Клетки заражали с множественностью 0,1 ИД50, Панавир в дозе 100
мкг/мл вводили сразу после заражения и регистрировали титры вируса через 7, 9 и 24 часа.
Оказалось, что в этом случае Панавир достоверно сдерживал продукцию вируса на ранних
этапах инфекции - через 7 и 9 часов, и только к 24-му часу титры вируса выравнивались в
опыте и контроле.
Для изучения возможного вмешательства Панавира в основные биохимические
процессы клетки был проведен анализ его влияния на синтезы ДНК, РНК и белка в
незараженных клетках MDCK –по включению соответствующих радиоактивно меченых
предшественников синтеза указанных макромолекул. Было установлено, что Панавир в
концентрациях от 10 до 1000 мкг/мл не оказывал влияние на синтез исследованных
макромолекул, что дополнительно свидетельствует об отсутствии у Панавира
цитотоксических свойств.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о ингибирующем эффекте
Панавира на продукцию вируса гриппаin vitro при отсутствии цитотоксичности, что
явилось основанием для исследования его антивирусного эффекта в условиях
экспериментальной гриппозной инфекции invivo.
Антигриппозные свойства Панавира в условиях экспериментальной инфекциина
мышах.
При заражении животных контрольной группы нерезистентным к ремантадину
вирусом гриппа А (штаммAichi Н3N2 2/68)регистрировали гибель 55% мышей, средняя
продолжительность жизни животных составила 11±0,3 дня. Двукратное применение
Панавира в разовой дозе 0,4 мг/кг в/ввызывало увеличение выживших животных на 25% и
их средней продолжительности жизни на 2 дня. Известный противогриппозный препарат
ремантадин способствовал выживанию всех животных, инфицированных вирусом гриппа
А.
При заражении мышей резистентным к ремантадину вирусом гриппа типа А
наблюдали гибель 45% животных. Под влиянием двукратного применения Панавирав той
же дозе гибель животных снизилась на 25%. Ремантадин в данных условиях не защищал
зараженных животных от гибели.
Таким образом, установлено, что в условиях экспериментальной инфекции на
мышах Панавир обладает противогриппозной активностью как в отношении устойчивой,
так и чувствительнойк ремантадину популяций вируса гриппа типа А.
Изучение противовирусной активности Панавира при экспериментальной
инфекции, вызванной вирусом кори в культурах клеток.
Первая серия экспериментов касалась изучения цитотоксического действия
панавира на перевиваемые культуры клеток, выбранных для проведения исследования. С
этой целью препарат в различных концентрациях вносили в культуру клеток Vero
(однодневную, в каждую лунку вносили по 30000 клеток). Концентрации препарата
варьировали в пределах от 10 мг/мл до 0,5 мкг/мл. Монослой клеток наблюдали в течение
10 дней. Полная гибель клеток наблюдалась на вторые сутки при концентрации препарата
10 мг/мл. Значительная часть клеток погибала через три дня при концентрации 1 мг/мл.
При более низких концентрациях цитотоксический эффект не наблюдался . Аналогичные
результаты наблюдались в отношении перевиваемой культуры В-95а. Следует отметить,
что данная культура частично отслаивается от стекла через 4-5 дней, поэтому опыты с
применением данной культуры проводились в период 5 дней.
Полученные данные позволяли сделать вывод, что препарат Панавир в
концентрации ниже 500 мкг/ мл не обладал цитотоксическими свойствами в
отношениивышеупомянутых клеточных культур и это позволяло использовать более
низкие концентрации препарата для изучения его антивирусного действия. Однако прежде
было целесообразно исследовать вирулицидное действие этого препарата, учитывая его
широкий спектр действия. С этой целью к 1 мл вируссодержащей жидкости штамма Л-16
вируса кори добавляли равное количество препарата в концентрации 10 мг/мл и
инкубировали при температурах 37ºС и 4ºС различные отрезки времени. Аликвоты
отбирались и тировались в культуре Vero. Было обнаружено, что при температуре 37º С
происходит быстрая инактивация вируса, даже в отсутствие препарата , что не позволяло
исследовать его вирулицидное действие. Данные, полученные при инкубации вируса с
препаратом при температуре 4º С, позволяют сделать вывод о том, что препарат в
концентрации 5 мг/мл обладает слабым вирулицидным действием.
На следующей стадии работы было исследовано антивирусное действие препарата в
отношении вируса кори. С этой целью клетки Vero были инфицированы штаммом Л-16 с
различной множественностью заражения (0,1 ТЦД 50/кл., 0,001 ТЦД 50/кл., 0,0001 ТЦД
50/кл) в присутствии концентраций препарата в диапазоне от 100 мкг/ 0,2 мл до 0, 1 мкг /
0,2 мл. Через 4 дня инкубации при 37ºС пробы замораживались и затем титровались в
культуре клеток Vero.
Установлено, что препарат обладает антивирусным действием в отношении вируса
кори при концентрациях 100 мкг/0,2мл - 12 мкг/0,2мл при множественности заражения:
0,001 - 0,0001 ТЦД 50/кл . Эффект подавления вирусной репродукции особенно проявлялся
при множественности заражения 0,0001 ТЦД 50/кл : снижение инфекционного титра
вируса достигало 2-3 lg.
Представляло интерес выяснить, на какой стадии цикла репродукции вируса кори
действует препарат Панавир. С этой целью препарат вносили в среду за час до
инфицирования клеток вирусом, одновременно с инфицированием и через час после
инфицирования. Внесение препарата за 1 час до адсорбции вируса на клетках приводило к
снижению вирусной репродукции на 1,5 lg. Аналогичные результаты были получены при
внесении препарата в момент инфекции. В то же время внесение препарата через 1 час
после адсорбции вируса на клетках незначительно снижало титр вируса.
Полученные факты свидетельствуют о том , что препарат действует на ранних
стадиях цикла репродукции вируса кори. Можно предполагать, что антивирусное действие
препарата
Панавир обусловлено нарушением адсорбции вируса на клеточной
поверхности. Учитывая полисахаридную природу препарата , можно допустить наличие
конкуренции между молекулами препарата и полисахаридными компонентами клеточных
рецепторов за связывание с вирусными рецепторами в момент адсорбции.
Таким образом: препарат Панавир обладает вирулицидным действием; препарат
ингибирует размножение вируса кори в концентрации 12 -100 мкг /0,2мл в клетках
различного происхождения, инфицированных с множественностью заражения 0,001 0,0001 ТЦД50/кл.; активность Панавира проявляется на ранних стадиях взаимодействия
вируса и клеток, возможно, препарат препятствует адсорбции вируса на клетках; препарат
Панавир обладает достоверным антивирусным действием в отношении вируса кори.