Автореферат - Южный федеральный университет

На правах рукописи
МУРАВЬЕВА АННА БОРИСОВНА
КОРРЕКЦИЯ ЕСТЕСТВЕННЫМИ АДАПТОГЕНАМИ
МЕТАБОЛИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ
САХАРНОМ ДИАБЕТЕ
03.01.04. – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Ростов-на-Дону
2014
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего профессионального образования «Ставропольский
государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения
Российской Федерации (г.Ставрополь).
Научный руководитель: Доктор биологических наук, доцент
Эльбекьян Карине Сергеевна
Официальные оппоненты: Главный научный сотрудник отдела медико
биологических проблем РНИИАП,
доктор биологических наук
Друккер Нина Александровна
Профессор кафедры внутренних болезней с
основами общей физиотерапии,
врач-эндокринолог,
доктор медицинских наук
Джериева Ирина Саркисовна.
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Кубанский государственный
медицинский университет» Минздрава России
Защита диссертации состоится «24» сентября 2014 г. в «13» часов на
заседании диссертационного совета Д 212.208.07 в ФГАОУ ВПО «Южный
федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 194/1, акт.зал).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВПО «Южный
федеральный университет» по адресу: г. Ростов-на-Дону, ул. Зоря, 21 Ж.
Автореферат разослан «___»________ 2014 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук, с.н.с.
Е.В. Асланян
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Сахарный диабет является полигенным
заболеванием, в патогенезе которого значительное место отводится как
наследственным, так и внешним, средовым факторам. Распространённость и
заболеваемость сахарным диабетом продолжают увеличиваться (Кудрякова
С.В. и др., 2001), и, по уточнённым данным экспертов ВОЗ, к 2025 году в мире
будет насчитываться более чем 380 млн. больных сахарным диабетом (IDF,
2011; Дедов И.И., Балаболкин М.И., 2005).
По определению ВОЗ, сахарный диабет (СД) – это группа
метаболических (обменных) заболеваний, характеризующихся хронической
гипергликемией, которая является результатом нарушения секреции инсулина,
действия инсулина или обоих этих факторов.
Хроническая гипергликемия, являющаяся основным и объективным
признаком наличия сахарного диабета, осуществляется инициацией
нескольких биохимических процессов, к которым относят: окислительный
стресс (GiuglianoD., 1996; TappiaP.S., 2006; Дедов И.И., Балаболкин М.И.,
2003; Недосугова Л.В., 2006; Джериева И.С., 2012), избыточное образование
конечных продуктов гликирования (Ahmed N.,2005; Kasradze D., 2010) и
нарушение обмена липопротеинов (LeeA. Y., 1999, Kozakiewicz M., 2009).
Нарушение гомеостаза при сахарном диабете сопровождается
изменением и в обмене микроэлементов (Джукенова А.М., 2007), которые
являются важными участниками обменных процессов.
Снижение чувствительности тканей к избыточному действию инсулина
и/или торможение процессов его секреции можно рассматривать как
проявление адаптации организма к изменившимся внутренним условиям.
В последние годы внимание исследователей привлекают адаптогенные
свойства целого ряда натуральных веществ. Как известно, к адаптогенам
относят биологически активные вещества естественного (в основном,
растительного) происхождения, стимулирующие способность организма
противостоять внешним и внутренним неблагоприятным факторам среды
(Арушанян Э.Б., Бейер Э.В., 2012; Сейфулла Р.Д., Кондрашин И.М., 2011). И
сегодня по-прежнему остро стоит проблема поиска такого рода средств с
целью повышения адаптивных возможностей организма человека в разных
ситуациях.
Действующие начала некоторых лекарственных растений, относимых к
разряду адаптогенов (женьшень, радиола, элеутерококк и др.), обладают
широким спектром фармакологической активности. Помимо центральных
3
(антистрессорных, психотонизирующих, ноотропных) свойств, они влияют на
деятельность различных внутренних органов (Арушанян Э.Б., 2006), проявляя,
в том числе, и отчётливую противодиабетическую активность.
За последние годы в медицинской науке резко возрос интерес к изучению
лечебных возможностей гормона мозговой железы эпифиза – мелатонина. В
круг его терапевтических возможностей входят разного рода патологии:
органические поражения головного мозга (Арушанян Э.Б., 2012), заболевания
желудочно-кишечного тракта (РапопортС.И, 2012; РахимоваО.Ю., 2012),
сердечно-сосудистые заболевания (Джериева И.С., 2012). Эпифизарный
гормон мелатонин обладает и универсальными адаптогенными свойствами
(Mertz W., 1987; Huang Y.C., 2005; Арушанян Э.Б., Бейер Э.В., 2012), которые
реализуются на самых разных функциональных уровнях и затрагивают
большинство органов и систем. Будучи естественным хронобиотиком,
мелатонин оказывает ритморганизующее влияние на патологически
изменённые колебания любых физиологических функций (Арушанян Э.Б.,
Бейер Э.В., 2009; Джериева И.С., 2012).
Все вышеизложенное в совокупности определило цель и основные
задачи настоящего исследования.
Цель работы. Экспериментальное изучение фармакологической
активности мелатонина и тонизида на модели декомпенсированного сахарного
диабета, а также сравнительная оценка их антидиабетических свойств.
Задачи исследования:
1.Изучить дозозависимые эффекты диабетогена аллоксана в отношении:
– показателей, характеризующих клиническую картину заболевания
(летальность животных; масса тела, потребление воды, диурез);
– уровня содержания глюкозы и длительности гипергликемического
периода;
– процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной
защиты (АОЗ);
– содержания макро- и микроэлементов.
2. На модели аллоксанового диабета оценить влияние адаптогенов на
углеводный и липидный обмены.
3.Оценить влияние мелатонина и тонизида на антиоксидантный статус
лабораторных животных с аллоксановым диабетом.
4.Изучить состояние элементного гомеостаза животных с аллоксаниндуцированным сахарным диабетом при использовании мелатонина и
тонизида.
4
5.Сопоставить фармакологические эффекты адаптогенов животного
(мелатонина) и растительного (тонизид) происхождения.
Научная новизна.
1. Впервые проведена комплексная оценка эффективности использования
препаратов мелатонина и тонизида в условиях экспериментального
декомпенсированного СД. Установлено, что изученные адаптогены оказывают
нормализующее влияние на патологические изменения углеводного и
липидного обменов, процессы перекисного окисления липидов и
антиоксидантную систему защиты организма у аллоксан-индуцированных
животных, причем более выраженное влияние оказывает мелатонин.
2. Впервые установлено, что введение мелатонина и тонизида
способствует коррекции минерального обмена в условиях модели
декомпенсированного СД.
3. В условиях экспериментальной модели СД впервые установлена
достоверная положительная корреляция между уровнем гликированного
гемоглобина, липопротеинов низкой плотности и нарушениями в
микроэлементном составе сыворотки крови (по уровню меди и цинка).
Практическая значимость работы.
Результаты
настоящего
исследования
свидетельствуют
о
перспективности использования препаратов антиоксидантно-метаболического
действия (мелатонина и тонизида) в комплексной терапии СД.
Количественные изменения макро- и микроэлементов и их
корреляционные связи с про- и антиоксидантным статусом могут стать
дополнительным признаком декомпенсированного СД.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Экспериментальная модель аллоксан-индуцированного СД позволяет
воспроизвести состояние, проявляющееся гипергликемией, нарушением
липидного обмена, развитием окислительного стресса и декомпенсацией
элементного статуса, и может быть использована для изучения
фармакологической активности препаратов.
2. При введении мелатонина и тонизида аллоксан-индуцированным
животным отмечается выраженный
антигипергликемический эффект,
который характеризуется снижением уровня глюкозы и HbA1c. Мелатонин,
обладая менее выраженным антигипергликемическим действием, в сравнении
с тонизидом, значительно превосходит его по степени корригирующего
воздействия на состояние липидного обмена.
5
3. Мелатонин и тонизид вызывают достоверное снижение содержания
малонового диальдегида у аллоксан-индуцированных животных, которое
сопровождается
значимым
увеличением
активности
ферментов
супероксиддисмутазы и каталазы.
Внедрение результатов исследования.
Результаты диссертационного исследования использованы в подготовке
краевой программы «Развитие здравоохранения Ставропольского края: меры
социальной поддержки по бесплатному обеспечению лекарственными
препаратами граждан, страдающих сахарным диабетом».
Результаты и выводы диссертационной работы внедрены в курс лекций
и практических занятий на 6 кафедрах Ставропольского государственного
медицинского университета: общей и биологической химии, эндокринологии,
детской эндокринологии и диабетологии, физиологии, патофизиологии.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались
и обсуждались на Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство»
(Москва, 2011); конкурсе «У.М.Н.И.К Ставропольского края 2011», по
результатам которого автор исследования признан победителем (Ставрополь,
2011); Международной конференции студентов и молодых учёных, СПбГМУ
им. акад. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2012); Международной научнопрактической конференции «Инновации молодых ученых» (Ставрополь,
2012);III Международной конференции «Актуальные проблемы биохимии и
бионанотехнологии» (Казань, 2012); Российской научно-практической
конференции «Актуальные вопросы медицинской биохимии и клинической
лабораторной диагностики» (Казань, 2013); II Международной научной
интернет-конференции «Физико-химическая биология» (Ставрополь, 2013);
IV Международной научно-практической дистанционной конференции
«Наука и образование» (Мюнхен, 2013); Международной научной
конференции «Образование и наука без границ» (Мюнхен, 2013); XV
международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва,
2013).
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в
13 научных работах, в том числе в 5 статьях в изданиях, рекомендуемых ВАК
РФ.
Общий объем публикаций составляет 1,4 п.л., личный вклад автора
составил 50-85%.
Объем и структура работы. Работа состоит из введения, обзора
литературы, 2 глав собственных результатов, обсуждения, заключения,
6
выводов, библиографического указателя, включающего 49 отечественных и
106 иностранных источников. Диссертация изложена на 110 страницах
компьютерного текста и иллюстрирована 8 рисунками и 13 таблицами.
МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проведены на базе кафедры общей и биологической
химии Ставропольского государственного медицинского университета,
клинико-диагностической лаборатории Краевого эндокринологического
диспансера, клинико-диагностической лаборатории городской клинической
больницы № 3.
Для достижения поставленной цели и решения задач был разработан
дизайн исследования, состоящий из 2 этапов (рис. 1).
I этап исследования выполнен на 90 белых нелинейных крысах-самцах
массой 150–180 гр. Содержание животных и проведение экспериментов
соответствовало правилам лабораторной практики при проведении
доклинических исследований в РФ (ГОСТ № 51000.3-96 и 51000.4-2008) и
осуществляли с соблюдением Международных рекомендаций Европейской
конвенции по защите позвоночных животных, используемых при
экспериментальных исследованиях. Настоящее исследование одобрено
локальным этическим комитетом СтГМУ (протокол заключения № 22 от
21.12.2010 г). Животных содержали в условиях вивария при стандартной
температуре с естественным освящением и свободным доступом к воде и
корму.
В двух группах (по 30 животных в каждой) воспроизводили
экспериментальный сахарный диабет внутрибрюшинным введением
аллоксана (производства ООО «НТК Диаэм») в дозе 100 мг/кг и 150 мг/кг
после 24 часового голодания. Эффект препарата регистрировали на 3, 10, 14
сутки. Для сравнения использовали 15 интактных животных и 15 животных с
введением дистиллированной воды в объеме 0,2 мл (контроль).
Для изучения антидиабетического эффекта веществ использовали
стандартные биохимические показатели углеводного, липидного и
минерального обменов, а также про-/антиоксидантный статус крови.
Определение
концентрации
глюкозы
в
крови
проводили
глюкооксидазным методом с помощью набора «Фотоглюкоза» (ООО
«ИМПАКТ»). Принцип метода основан на окислении β-D-глюкозы
кислородом воздуха при каталитическом действии глюкооксидазы.
Определение содержания гликозилированного гемоглобина проводили на
анализаторе D-10 компании Bio-Rad. Программа определения гемоглобина
7
A1c D-10
основана на принципах ионообменной высокоэффективной
жидкостной хроматографии.
I этап эксперимента
Экспериментальные животные (n=90, крысы)
Интактные
(n=15)
Контроль
(дист.вода) (n=15)
Аллоксан
100 мг/кг (n=30)
Аллоксан
150 мг/кг (n=30)
ЗАБОР КРОВИ для определения:
глюкозы,
гликолизированного
гемоглобина
(HbA1c),
холестерина
(ХС),
супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ), малонового диальдегида (МДА),
липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), липопротеинов высокой плотности
(ЛПВП), триглицеридов (ТГ), содержания микро- (Zn2+, Fe3+, Cu2+) и макро- (Na+, K+,
Ca2+) элементов.
II этап эксперимента
Экспериментальные животные (n=90, крысы)
Контроль
(дис.вода)
(n=15)
Аллоксан 150
мг/кг
(n=15)
Мелатонин 0,1
мг/кг
(n=15)
Тонизид
200 мг/кг
(n=15)
Аллоксан 150
мг/кг +
мелатонин 0,1
мг/кг (n=15)
Аллоксан 150
мг/кг +тонизид
200 мг/кг
(n=15)
ЗАБОР КРОВИ для определения:
глюкозы, HbA1c, ХС, ТГ, СОД, КАТ, МДА, ЛПНП, ЛПВП, содержания микро- (Zn2+, Fe3+,
Cu2+) и макро- (Na+, K+, Ca2+) элементов.
Статистический анализ
Рис. 1. Дизайн исследования.
Определение холестерина в крови осуществляли колориметрическим
методом с использованием набора реагентов «Холестерин-витал-12/22/32».
Метод основан на гидролизе эфиров холестерина холестеролэстеразой с
образованием свободного холестерина. Образовавшийся и имеющийся в пробе
8
холестерин
окисляется
кислородом
воздуха
под
действием
холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества перекиси
водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет
хромогенные
субстраты
с
образованием
окрашенного
продукта.
Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина в пробе.
Активность супероксоддисмутазы определяли спектрофотометрически
при длине волны 540 нм по методу Н.Р. Mistra и J. Fridowich в модификации
О.С. Брусова (1972). В основе метода лежит способность СОД тормозить
реакцию автоокисления адреналина при рН 10,2.
Активность каталазы определяли по методике А.Н. Баха и
С.А.Зубковой (1997). Метод основан на способности перекиси водорода
образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс.
Содержание макро- (Na+, K+, Ca2+) и микро- (Zn2+, Fe3+, Cu2+)
элементов определяли методом атомно-адсорбционного анализа на
спектрофотометре (ААS, тип-1N), принцип работы которого состоит в
поглощении ультрафиолетового или видимого излучения атомами газа.
II этап исследования выполнен на крысах-самцах (n=90), которые были
ранжированы на 6 подгрупп (по 15 животных в каждой): первая группа –
крысы, которым вводили дистиллированную воду (контрольные), вторая –
группа животных, получивших аллоксан однократно в дозе 150 мг/кг, третья и
четвертая группы – животные, получавшие внутрибрюшинно в течение14
дней мелатонин (Melatonin фирма Sigma-Aldresh, USA) в дозе 0,1 мг/кг между
16-18 часами и тонизид 200 мг/кг (Биолит, Россия) в утренние часы.
Животные пятой и шестой групп получали изучаемые вещества на фоне
аллоксан-индуцированного сахарного диабета.
При количественной обработке результатов сопоставляли значения,
полученные в опытных группах с контрольными и исходными показателями.
Полученные данные подвергали стандартной статистической обработке с
расчетом среднего значения, достоверного интервала и стандартного
отклонения. Для выборок с нормальным распределением использовали
параметрический t-критерий Стьюдента (пакет программ BIOSTAT для
статистического анализа) для двух независимых выборок. В других случаях
сравнения относительных величин с оценкой статистической зависимости
различий выполняли, используя критерий Пирсона. Статистические методы
были выбраны с учетом возможности их применения для «малых» (n<30)
выборок. Для всех видов анализа статистически значимыми считали различия
при р<0,05.
9
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Влияние исследуемых веществ на метаболические процессы и элементный
состав крови. Как следует из полученных результатов, выраженная дозовая
зависимость в действии аллоксана наблюдалась как в отношении летальности
(табл.1), так и интегральных показателей, характерных для клинического
течения экспериментального диабета (табл.2).
Таблица 1
Влияние различных доз аллоксана на летальность экспериментальных
животных
Экспериментальные группы, доза, мг/кг
Время регистрации
Интактные
животные
1-5 сутки
0/20
6-25 сутки
1/20
Аллоксан,
Аллоксан,
100 мг/кг
150 мг/кг
Изучаемые показатели:
гибель/всего животных
4/30
15/40
2/26
4/25
Кроме этого, у выживших животных из группы, получившей аллоксан в
дозе 150 мг/кг, в отличие от животных, получивших диабетоген в меньшей
дозе, в течение всего эксперимента наблюдалось дальнейшее
прогрессирующее снижение массы тела, гиподинамия, неопрятность, пилоэрекция, кровоточивость десен, шатание и выпадение зубов.
Для подтверждения патологического характера биохимических сдвигов
необходимо было в первую очередь определить выраженность и
длительность гипергликемического периода, обусловленного действием
аллоксана. Полученные данные представлены на рисунке 2.
Таблица 2
Влияние различных доз аллоксана на интегральные показатели
состояния животных (M±m)
Изучаемые
Экспериментальные группы
показатели
Контроль
Аллоксан,
Аллоксан,
(дис.вода)
100 мг/кг
150 мг/кг
Масса тела, г
200,0±10,0
180,0±5,0
160,0±6,2
Потребление
18,0±2,0
30,0±5,0*
48,2±7,1*
воды, мл/сутки
Диурез, мл/сутки
14,0±1,0
30,0±3,0*
57,0±4,2*
Обозначения: * - р< 0,05 – достоверность различий при сравнении показателей опытных
групп с контролем.
10
Уровень глюкозы в крови крыс после введения аллоксана в дозе
100 мг/кг и 150 мг/кг достоверно превосходил таковой у интактных
животных, причем пик подъёма наблюдался на 3-й день эксперимента. Для
формирования модели СД мы использовали аллоксан в дозе 150 мг/кг, так как
реакции, вызванные меньшей дозой, были менее выраженными, к концу
эксперимента (25 день) уровень глюкозы восстанавливался до нормы.
17.8
18
16
14
11.2
день
12
10
8
6
4
3.7
2
0
Контроль
Аллоксан 100 мг/кг
Контроль
3 день
10 день
Аллоксан 150 мг/кг
25 день
Рис. 2. Длительность гипергликемического периода у крыс при внутрибрюшинном
введении аллоксана в дозах 100 и 150 мг/кг.
Влияние аллоксана (150мг/кг) на метаболические показатели крови.
Содержание глюкозы в крови под влиянием аллоксана достигало
6,9±0,9 ммоль/л (у контрольных животных – 4,1±0,4 ммоль/л, р<0,01). Уровень
гликированного гемоглобина превышал таковые показатели у контрольных
животных в 2,6 раза. Тяжесть протекания СД подтверждалась и нарушением
липидного обмена, проявляющимся достоверным повышением в плазме крови
содержания ХС – на 32%, ТГ – на 25% и ЛПНП – на 29%, и одновременном
падении концентрации ЛПВП – на 29% (рис. 3).
11
Глюкоза
ммоль/л
Гликированный гемоглобин
*
7
%
*
14
5
4
10
2.5
8
2
6
3
ммоль/л
*
3
12
6
Холестерин
1.5
4
2
2
1
0
1
0.5
0
0
ТГ
ЛПНП
ммоль/л
4.5
*
ЛПВП
%
40
*
16
4
35
14
3.5
30
12
3
25
10
20
8
15
6
10
4
0.5
5
2
0
0
0
2.5
2
1.5
1
Интактные животные
Контроль
%
*
Аллоксановый диабет
Рис. 3. Изменения показателей углеводного и липидного обмена под влиянием аллоксана в
дозе 150 мг/кг.
Обозначения: * - достоверность различий при сравнении показателей опытных групп с
контролем (дис. вода).
При развитии СД отмечались выраженные сдвиги и в состоянии про- и
антиоксидантной систем крови (рис. 4), например, содержание МДА в
сыворотке крови оказалось на 120% выше, чем у контрольных животных, а
активность СОД уменьшилась в 2 раза. Одновременно с этим возрастало
содержание каталазы до 345,3±3,3 мкат/л (в контроле – 225,6±2,9 мкат/л) (рис.
4).
12
Нмоль/л
9
8
7
МДА
%
*
СОД
3
350
2.5
300
6
*
1.5
3
*
200
150
1
100
1
0.5
50
0
0
0
2
Интактные животные
КАТ
250
2
5
4
мкат/л
Контроль
Аллоксановый диабет
Рис. 4. Изменения показателей МДА, СОД и КАТ под влиянием введения аллоксана в дозе
150 мг/кг.
Обозначения, как на рис. 3.
Полученные данные указывают на то, что под влиянием аллоксана у
животных развивался окислительный стресс, что свидетельствует о
нарушении равновесия в балансе про- и антиоксидантной систем.
Биохимические исследования элементного статуса также показали, что
диабетоген вызывает значительные количественные сдвиги в содержании
крови крыс натрия, калия и кальция (табл. 3). Так, на 14-е сутки после
аллоксан-индуцированного сахарного диабета концентрация натрия в плазме
была снижена на 9,5 %, что может быть связано с массивным выведением
натрия вместе с осмотически обусловленным выходом воды из
внутриклеточного пространства. Концентрация кальция в крови у крыс с
аллоксановым диабетом увеличивалась до 5,2±0,1 моль/л (у животных
контрольной группы – 1,66±0,04 моль/л). Одновременно наблюдалось
значительное истощение (на 37 %, р<0,01) запасов калия в сравнении с
показателями животных контрольной группы.
13
Таблица 3
Содержание микро- и макроэлементов в крови крыс
с аллоксан-индуцированным сахарным диабетом (M±m)
Макроэлементы
Натрий,
Калий,
Кальций,
ммоль/л
ммоль/л
моль/л
Микроэлементы
Цинк,
Железо,
Медь,
мкмоль/л
мкмоль/л
мкмоль/л
Интакт188,49±
3,5±0,16
1,85±0,06 25,49±1,61
ные
1,27
Контроль
185,52±1,05 2,89±0,12
1,66±0,04 24,87±0,99
(дис.вода)
Аллоксан 170,87±7,03 1,94±0,11
5,24±0,06 16,27±0,88
150 мг/кг
*
*
*
*
Обозначения, как в таблице 2. В данной серии экспериментов
группой не проводилось.
42,74±0,43
8,96±0,38
41,76±0,42
9,07±0,10
53,58±1,90 8,34±0,11
*
*
сравнение с интактной
Диабетоген вызывал статистически достоверные сдвиги и в содержании
таких эссенциальных микроэлементов, как цинк, железо, медь. Свидельством
этому является уменьшение содержания цинка в 1,5 раза (p<0,01), меди – до
8,34±0,31 мкмоль/л (в контроле – 9,07±0,152 мкмоль/л, p<0,01). Однако стоит
отметить, что при этом содержание железа в этой группе животных достигало
53,58±1,90 мкмоль/л (p<0,01), что было существенно выше, чем в контрольной
группе (41,39±0,43 мкмоль/л).
Корреляционной
анализ
между
показателями
эссенциальных
микроэлементов и систем про- и антиоксидантной активности установил
достоверную положительную связь между содержанием меди и СОД
(r=+0,32; р>0,05), меди и МДА (r=+0,66; р>0,05) и отрицательную
корреляционную взаимосвязь между содержанием цинка и МДА (r=-0,95;
р<0,05). Положительная корреляционная связь установлена между
содержанием гликозилированного гемоглобина и меди (r= +0,97; р<0,05).
Влияние мелатонина и тонизида на метаболические процессы,
состояние про- и антиоксидантной систем и элементный гомеостаз.
Мелатонин и тонизид при повторном введении животным заметно
ослабляли метаболические процессы. Например, установлено, что под
влиянием мелатонина уровень глюкозы в крови повысился на 21% (р<0,01), а
содержание гликированного гемоглобина– на 18% (таб. 4). Эффект тонизида
проявлялся слабее.
При изучении липидного обмена было установлено, что и мелатонин, и
тонизид снижали содержание холестерола в крови до 1,6±0,1 ммоль/л и
14
1,9±0,2 ммоль/л, соответственно, однако следует заметить, что воздействие
тонизида не носило значимого характера. При анализе липидных фракций
было выявлено, что в подгруппе животных, получавших мелатонин, уровень
ЛПНП статистически значимо уменьшался на 16% (р<0,01), при
одновременном увеличении содержания фракции ЛПВП на 21%. Под
влиянием и мелатонина, и тонизида сдвиги в содержании триацилглицеролов
носили невыраженный характер.
Таблица 4
Влияние мелатонина и тонизида на состояние углеводного и липидного
обменов (M±m)
Состояние
№ животных
Глюкоза
ммоль/л
НЬА1с
(%)
Холесте
рин
ммоль/л
ЛПНП
(%)
ЛПВП
(%)
ТГ
ммоль/л
1
Интактные
4,05±0,39
5,05±0,39
2,12±0,06
2,81±0,73
1,45±0,49
2,72±1,47
2
Контроль
(дис. вода)
4,35±0,22
5,23±0,15
2,10±0,07
2,67±0,33
1,38±0,54
2,77±0,97
Мелатонин
5,27±0,30
*
6,19±0,16
*
1,63±0,11
*
2,34±0,28
*
1,67±0,16
*
2,66±0,13
Тонизид
4,72±0,33
5,49±0,17
1,98±0,15
2,25±0,15
1,52±0,30
3,12±0,24
3
4
Обозначения, как в таблице 2. В данной серии экспериментов сравнение с интактной
группой не проводилось.
Согласно полученным данным, мелатонин подавлял интенсивность
перекисного окисления (табл. 5) в сравнении с показателями контрольной
группы животных, что выражалось в снижении содержания МДА в 1,6 раза
(p<0,05). Под влиянием мелатонина активность СОД и КАТ изменялись
незначительно.
Тонизид, напротив, существенно увеличивал активность этих
ферментов, не изменяя концентрацию МДА.
15
Таблица 5
Влияние мелатонина и тонизида на выраженность ПОЛ
и активность ферментов антиоксидантной системы в крови крыс (M±m)
№
Состояние
животных
МДА
Нмоль/мл
Активность
СОД %
Активность
каталазы
мкат/л
1
Интактные
3,72±0,16
2,55±0,16
225,63±2,1
2
3,68±0,21
2,52±0,12
223,71±1,9
4
Контроль
(дис. вода)
Мелатонин
2,35±0,09
227,24±2,8
5
Тонизид
2,34±0,21
*
3,51±0,12
2,80±0,06
267,30±3,2
*
*
Обозначения, как в таблице 2. В данной серии экспериментов сравнение с интактной
группой не проводилось.
Изучение состояния элементного гомеостаза показало, что тонизид и
мелатонин влияют на минеральный обмен (табл. 6).
Таблица 6
Влияние мелатонина и тонизида на содержание макро- и микроэлементов в
крови аллоксан-индуцированных животных (M±m)
Интактные
Контроль
(дис. вода)
Мелатонин
Тонизид
Натрий,
Калий,
Кальций,
Цинк,
Железо,
Медь
ммоль/л
ммоль/л
ммоль/л
мкмоль/л
мкмоль/л мкмоль/л
188,49 ± 1,27 3,05 ± 0,16 1,85 ± 0,06 25,49 ± 1,61 42,74±0,43 9,07 ± 0,10
185,52±1,52
2,89±0,12
1,66±0,04
24,87±0,98
41,76±0,42
8,96±0,98
162,70±4,79
2,08±0,156
5,29±0,47
10,41±0,54
40,33±3,79
8,57±0,74
*
*
*
147,89±4,84
2,07±0,10
5,95±0,10
9,78±1,10
*
*
*
*
42,54±2,33 10,08±0,48
Обозначения, как в таблице 2. В данной серии экспериментов сравнение с интактной
группой не проводилось.
Под влиянием тонизида регистрировалось статистически достоверное
снижение содержания натрия на 21,5% и калия – на 32% при одновременном
повышении содержания кальция в 3,6 раза (p<0,05) в сравнении с
показателями контрольной группы животных.
Действие мелатонина имело ту же направленность, однако было менее
интенсивным. Под его влиянием концентрация натрия в крови животных
16
снижалась на 12% в сравнении с показателями животных контрольной
группы, а калия – на 28%.
Под влиянием мелатонина и тонизида концентрация цинка снижалась,
соответственно, до 30,3±3,8 мкмоль/л и 32,5±2,3 мкмоль/л (р<0,05) в
сравнении с показателями животных контрольной группы.
Фармакологические эффекты мелатонина и тонизида при
экспериментальном сахарном диабете.
При изучении интегральных показателей животных с аллоксаниндуцированным сахарным диабетом наблюдали выраженную полидипсию и
полиурию, потерю массы тела, резкое увеличение потребления воды и
суточного диуреза. Смертность в этой группе животных к концу наблюдения
достигала 30%. Адаптогены эффективно предотвращали гибель животных, что
проявлялось повышением количества выживших животных с аллоксаниндуцированным СД. Объем потребляемой жидкости и уровень диуреза
заметно снизились. Наиболее выраженное снижение наблюдалось у крыс,
получавших тонизид. Мелатонин оказывал менее эффективное действие.
Эффективность изучаемых препаратов оценивали по степени снижения
содержания глюкозы крови и показателям липидного обмена в сравнении с
показателями животных с аллоксановым диабетом. Полученные данные
представлены на рисунке 5. Введение мелатонина животным с аллоксаниндуцированным СД способствовало снижению содержания глюкозы в 1,5
раза, а гликированного гемоглобина крови - в 2,5 раза, тогда как под влиянием
тонизида отмечалось достоверное снижение только содержание глюкозы в 1,2
раза.
При применении мелатонина и тонизида отмечался значительный гиполипидемический эффект, выражающийся в снижении содержания общего
холестерола на 9% и 13, соответственно. Под воздействием мелатонина
содержание ТГ уменьшалось на 41%, ЛПНП и ЛПВП – на 32%, а отношение
ЛПНП к ЛПВП составило 1,7 (у животных с аллоксановым СД коэффициент
составил 8,2). Действие тонизида также вызывало снижение содержания ХС,
ТГ, ЛПНП и повышение ЛПВП (рис. 5).
17
Глюкоза
Гликированный
гемоглобин
Δ
14 %
7
6
*
*
5
4
Δ
12
2.5
10
2
6
2
4
1
2
0
0
3.5
3
2.5
2
1.5
0
*
1
0
ЛПНП
ТГ
Δ
%
10
Δ
*
*
*
0.5
ЛПВП
%
Δ
1.4
1.2
8
Δ
*
*
1
6
4
1
0.5
Δ
1.5
*
3
4
ммоль/л
3
8
ммоль/л
Холестерин
2
0.8
*
*
0.6
0.4
0.2
0
0
Аллоксан +
Контроль
Аллоксановый
Аллоксан +
тонизид
(дис. вода)
диабет
мелатонин
Рис. 5. Влияние адаптогенов на изменения углеводного и липидного обменов при аллоксаниндуцированном сахарном диабете.
Δ
Обозначения: - достоверность различий при сравнении показателей опытных групп с
контролем (дис. вода);
* - достоверность различий при сравнении показателей опытных групп с аллоксановым
диабетом.
Перекисное окисление липидов и антиоксидантная защита. Введение
адаптогенов способствовало ограничению оксидантного стресса, что
подтверждалось достоверным снижением содержания МДА под влиянием
мелатонина и тонизида, в сравнении с данными животных, не получавших
фармакологическую коррекцию. Снижение содержания МДА сопровождалось
достоверным увеличением активности СОД и КАТ в 1,5 раза (табл. 7).
18
Таблица 7
Влияния мелатонина и тонизида на выраженность ПОЛ и активности
ферментов антиоксидантной защиты животных с аллоксановым сахарным
диабетом (M±m)
№
1.
2.
Состояние
животных
(n=10)
Контроль
(дис.вода)
Аллоксановый
диабет
Активность
СОД, %
Активность
каталазы, мкат/л
МДА,
Нмоль/мл
2,52±0,12
223,73±1,91
3,68±0,21
1,45±0,04*
345,31±3,32*
8,22±0,41*
Аллоксан. диабет
2,88±0,10∆
219,54±2,80∆
3,20±0,13∆
+ мелатонин
4. Аллоксан. диабет
2,42±0,12∆
229,40±2,34∆
4,81±0,19∆
+ тонизид
Обозначения: * - достоверность различий при сравнении показателей опытных групп с
контролем (дис.вода);
∆
– достоверность различий при сравнении показателей животных опытных групп с
аллоксановым диабетом.
3.
Минеральный обмен. У животных с аллоксан-индуцированным СД
использование адаптогенов приводило к восстановлению содержания
микроэлементов в крови. Так, например, было установлено, что при введении
мелатонина значимо увеличивалось содержание цинка (в 1,3 раза), железа (в
1,7 раз), меди (в 1,1 раз) и калия (в 1,2 раза) и уменьшилось количество натрия
(в 1,2 раз) в сравнении с показателями животных с аллоксан-индуцированным
сахарным диабетом (табл. 8).
Тонизид при этих условиях увеличивал концентрацию калия (в 1,1 раз),
кальция и меди (в 2,6 и 1,2 раза соответственно) и снижал содержание цинка
(в 1,4 раза) и железа (в 1,1 раз).
19
Таблица 8
Содержание микро- и макроэлементов в крови крыс(M±m)
Натрий,
ммоль/л
Калий,
ммоль/л
Кальций,
моль/л
Цинк,
мкмоль/л
Железо,
мкмоль/л
Медь,
мкмоль/л
Контроль
(дис.вода)
170,87±7,00
3,05±0,16
1,85±0,06
25,49±1,61
42,74±0,43
9,07±0,10
Мелатонин
182,43±1,27
2,95±0,16
1,71±0,06*
24,58±1,61
41,39±0,43
9,07±0,15
Тонизид
171,69±4,51
2,28±0,14
5,94±0,17
11,48±0,32
35,24±5,46
9,88±0,41
Аллоксан
150 мг/кг
188,49±1,27
1,94±0,11
5,24±0,06
16,27±0,88
31,86±2,65
8,34±0,31
*
*
*
*
*
*
Аллоксан+
мелатонин
156,38±5,58
2,28±0,14
5,85±0,23
21,56±0,34
53,58±1,90
8,85±0,59
*Δ
*Δ
*Δ
*Δ
*Δ
*Δ
Аллоксан+
тонизид
171,60±4,48
2,11±0,04
5,94±0,17
11,48±0,31
30,04±3,13
9,88±0,41
*
*Δ
*Δ
*Δ
*Δ
*Δ
Обозначение, как в таблице 7.
Таким образом, тонизид и мелатонин улучшали измененный
минеральный обмен у животных с экспериментальным сахарным диабетом.
По мнению специалистов, важной характеристикой микроэлементного статуса
является не только абсолютное содержание микро- и макроэлементов, но и их
соотношение. Так, например, чем выше коэффициент Zn/Cu, тем устойчивее
система антиоксидантной защиты (Ракитский В.Н., Юдина Т.В., 2005). В
наших исследованиях значение этого коэффициента у контрольных животных
было равно 2,8. У крыс с диабетом величина отношения Zn/Cu в крови
уменьшалась в 1,44 раза, что указывает на преимущественное протекание
оксидантных реакций. После введения животным мелатонина величина
отношения Zn/Cu повысилась до контрольных величин, что указывает на
улучшение состояния антиоксидантной системы.
ВЫВОДЫ
1. Изученные адаптогенны гормонального (мелатонин) и растительного (в
виде комплекса лекарственных растений – тонизид) происхождения обладают
широким спектром антидиабетической активности. Исследованные вещества
при повторном введении снижают содержание глюкозы и гликированного
20
гемоглобина в крови, ограничивают смертность животных, снижают объем
потребляемой жидкости и суточный диурез.
2. Мелатонин и тонизид обладают антиоксидантными свойствами, которые
выявляются на модели экспериментального аллоксанового диабета.
Повторные инъекции мелатонина ограничивают интенсивность перекисного
окисления липидов, что проявляется в снижении содержания малонового
диальдегида. Тонизид заметно увеличивает активность ферментов
антиоксидантной системы супероксиддисмутазы и каталазы, существенно не
изменяя концентрацию малонового диальдегида.
3. Исследованные вещества при аллоксан-индуцированном сахарном диабете
меняют
целый
ряд
показателей
липидного
обмена,
проявляя
гиполипидемический эффект. Мелатонин и тонизид снижают содержание
холестерола в крови. В подгруппе животных, получавших мелатонин, уровень
липопротеинов низкой плотности уменьшается на 16% (р<0,01) при
одновременном увеличении содержания фракции липопротеинов высокой
плотности на 21% (р<0,01).
4. Мелатонин и тонизид восстанавливают измененный минеральный обмен
животных с экспериментальным сахарным диабетом. Введение мелатонина
увеличивает содержание цинка (в 1,3 раза), железа (в 1,7 раз), меди (в 1,1 раз)
и калия (в 1,2 раза), что заметно приближает эти значения к показателям,
характерным для нормы. Соотношение макро- и микроэлементов, являющееся
важной характеристикой минерального обмена, под влиянием мелатонина
нормализуется. После введения животным мелатонина величина отношения
Zn/Cu повысилась до контрольных величин, что указывает на улучшение
состояния антиоксидантной системы.
Список работ, опубликованных по теме диссертации в журналах,
рекомендованных ВАК
1. Муравьева А.Б. Изучение антидиабетических свойств естественных
адаптогенов различного происхождения в эксперименте / Эльбекьян К.С.,
Арушанян Э.Б., Муравьева А.Б.// Медицинский вестник Северного Кавказа.
Ставрополь, 2011. № 3. С. 55-57.
2. Муравьева А.Б. Особенности нарушения макро- и микроэлементного
спектра сыворотки крови при экспериментальном сахарном диабете /
Эльбекьян К.С., Ходжаян А.Б., Муравьева А.Б. // Фундаментальные
исследования. Москва, 2011. № 10 (2). С. 411-413.
21
3. Муравьева А.Б. Сравнительна оценка антиоксидантной активности
естественных адаптогенов при экспериментальном сахарном диабете /
Эльбекьян К.С., Муравьева А.Б., Шляхин Г.В. // Известия Саратовского
университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. Саратов,
2011. № 11. С.56-58.
4. Муравьева А.Б. Влияние мелатонина на показатели окислительного
стресса и элементного дисбаланса при экспериментальном сахарном диабете /
Эльбекьян К.С., Муравьева А.Б., Пажитнева Е.В. // Фундаментальные
исследования. Москва, 2013. №9(1). С. 178-181.
5. Муравьева А.Б. Биологическое моделирование аллоксан-индуцированного
сахарного диабета/ Эльбекьян К.С., Муравьева А.Б., Пажитнева Е.В. //
Здоровье и образование в XXI веке.Москва, 2013. - № 1- 4.Т. 15. С.117 -121 .
Список работ, опубликованных по теме диссертации
6. Муравьева А.Б. Влияние естественных адаптогенов гормонального и
растительного происхождения на показатели аллоскан-индуцированного
сахарного диабета / Эльбекьян К.С., Муравьева А.Б. // Сборник материалов
XVIII Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство" Москва,
2011. С. 495-496.
7. Муравьева А.Б. Изменение нарушения макро-и микроэлементного спектра
сыворотки крови при экспериментальном сахарном диабете /Муравьева А.Б. //
Международная конференция студентов и молодых ученых, СПбГМУ им.
акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, 2012. С. 36-38.
8. Муравьева А.Б. Недостаток микро- и макроэлементов как один из
признаков предрасположенности к сахарному диабету / Муравьева А.Б. //
Международная научно-практическая конференция «Инновации молодых
ученых», Ставрополь, 2012. С. 43-45.
9. Муравьева А.Б. Антиоксидантная активность адаптогенов различного
происхождения при экспериментальном сахарном диабете / Муравьева А.Б.,
Эльбекьян К.С. // III Международная интернет - конференция «Актуальные
проблемы биохимии и бионанотехнологии». Казань, 2012. С. 339-340.
10. Муравьева А.Б. Влияние мелатонина на выраженность процессов
перекисного окисления липидов и состояние механизмов антиоксидантной
защиты при экспериментальном сахарном диабете / Эльбекьян К.С.,
Муравьева А.Б., Пажитнева Е.В. // Российская научно-практическая
22
конференция «Актуальные вопросы медицинской биохимии и клинической
лабораторной диагностики». Казань, 2013г. С. 198-199.
11. Muravyeva A.B.,.Pharmacological action adaptogens various origin at
experimental diabetes / Elbekyan K.C., Muravyeva A.B., Gevandova M.G.,
Hodzhayan A.B., Pazhitneva E.B. // Materials of the conference "EDUCATION
AND SCIENCE WITHOUT BORDERS" № 2. Munich, 2013.
12. Муравьева А.Б. Некоторые биохимические основы и фармакологическая
активность адаптогенов различного происхождения при экспериментальном
сахарном диабете / Эльбекьян К.С., Муравьева А.Б., Гевандова М.Г, Ходжаян
А.Б., Пажитнева Е.В. // IV Международная научно-практическая
дистанционная конференция "Наука и образование". Мюнхен, 2013. С. 366370.
13. Муравьева А.Б. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная
активность при аллоксановом сахарном диабете у крыс и их коррекция
мелаксеном / Муравьева А.Б., Пажитнева Е.В.// II Международная научная
интернет- конференция «Физико- химическая биология». Ставрополь, 2014. С.
126 – 128.
Список сокращений.
- АОЗ – антиоксидантная защита
- КАТ – каталаза
- ЛПВП – липопротеины высокой плотности
- ЛПНП – липопротеины низкой плотности
- МДА – малоновый диальдегид
- ПОЛ – перекисное окисление липидов
- СД – сахарный диабет
- СОД – супероксиддисмутаза
- ТГ – триглицириды
- ХС – холестерин
- HbA1c – гликированный гемоглобин
23