МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профес-

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
МИЧУРИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ
ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ. ПОЛУЧЕНИЕ.
ПРИМЕНЕНИЕ.
Мичуринск – Наукоград – 2014
1
Составители:
1.Тарова З.Н., доцент кафедры садоводства, тепличных технологий и
биотехнологии, к.с-х.н.
2.Расторгуев С.Л., профессор кафедры садоводства, тепличных технологий и биотехнологии, д.с-х.н.
3. Сухорукова Н.В., ведущий программист ЦИТ.
Рецензенты:
Бобрович Л.В. – профессор кафедры агрохимии, почвоведения и агроэкологии, д.с.-х.н.;
Зюзина О.В. – доцент кафедры технологии и оборудование пищевых и
химических производств Технологического института ТГТУ, г. Тамбов.
Методическое пособие направлено на формирование у студентов в процессе обучения профессиональных
компетенций 15, 16,17 при реализации
учебного плана по направлению 240700.62 «Биотехнология». Контрольные
вопросы и тестовые задания помогут студентам самостоятельно оценить степень подготовки по дисциплинам: «Инженерная энзимология», «Основы
биотехнологии».
Мичуринск: Изд-во МичГАУ, 2014г., 110 стр.
2
Содержание
Введение .......................................................................................................... 4
1. Зарождение энзимологии, проблемы и перспективы развития ...... 7
2. Строение, свойства, механизм действия и классификация
ферментов ............................................................................................................. 14
2.1.Свойства ферментов .......................................................................... 14
2.2. Строение ферментов......................................................................... 18
2.3. Механизм действия ферментов........................................................ 22
2.4. Классификация ферментов ............................................................... 24
3. Источники ферментов............................................................................ 30
3.1. Растительное сырье ......................................................................... 30
3.2. Органы и ткани животных .............................................................. 33
3.3. Микроорганизмы ................................................................................. 37
4. Получение ферментных препаратов из культур .............................. 46
микроорганизмов ........................................................................................ 46
4.1. Получение посевного материала ...................................................... 46
4.2. Питательные среды для культивирования ..................................... 51
микроорганизмов в производственных ферментаторах ...................... 51
4.3. Производственное культивирование ................................................ 57
4.3.1. Глубинное культивирование ........................................................... 58
4.3.2. Поверхностное культивирование .................................................. 62
4.3.3. Выделение ферментов из культур микроорганизмов .................. 64
5. Иммобилизация ферментов .................................................................. 71
6. Ферментные препараты и их номенклатура ..................................... 85
7. Применение ферментов в пищевой и перерабатывающей ............ 89
промышленностях ...................................................................................... 89
Глоссарий...................................................................................................... 99
Литература ................................................................................................. 109
3
Введение
Подойдя к началу двадцать первого века, человечество столкнулось с
глобальными проблемами, решить которые традиционными методами уже не
представляется возможным. По мнению большинства ученых, вклад биотехнологии в обеспечение достаточного количества пищевых и кормовых продуктов, охрану окружающей среды, здравоохранение, сельское хозяйство,
химическую промышленность в определенном смысле имеет гораздо большее значение, чем известные до сих пор направления технического развития.
Именно поэтому двадцать первый век назван веком биотехнологии.
Термин «биотехнология» возник в начале прошлого столетия и был введен Карлом Эреки в 1917 году для обозначения работы с живыми объектами.
На настоящий момент биотехнология – многоотраслевая наука, которая, интегрируя достижения человечества в различных областях знаний, строится по
четырем направлениям: микробная биотехнология (промышленная микробиология), инженерная энзимология, генная инженерия и клеточная инженерия.
Целью инженерной энзимологии является создание технологических
процессов с использованием биологических катализаторов (ферментов). Инженерная энзимология не повторяет биохимию, физическую химию и другие
науки, изучающие структуру, свойства, функции и механизм действия ферментов. Теоретические основы этих наук инженерная энзимология применяет на практике. Знания о свойствах фермента, механизма их изменения она
использует при решении конкретных технологических задач: создание нового продукта или улучшение его качества, использования нетрадиционных
видов сырья, разработка безотходных технологий. Познание роли ферментов
для всего живого на Земле послужило основой для становления и развития
технологии ферментных препаратов как науки, и для создания промышленного производства наиболее широко используемых ферментных препаратов.
Они применяются в самых различных отраслях пищевой и легкой промышленности, при изготовлении косметики, в производстве моющих средств, в
4
сельском хозяйстве, в аналитических исследованиях, медицинской промышленности и здравоохранении.
Производство ферментных препаратов является одним из ведущих
направлений в развитии микробиологической промышленности.
Развитие рынка ферментов зависит от двух взаимосвязанных факторов —
возможности и экономической целесообразности их применения и возможности их промышленного производства. Совершенствование технологий
производства ферментов приводит к снижению цен на них. Так, мировые цены на α-амилазу и глюкоамилазу за последние 10 лет снизились в два раза,
при той же или даже большей эффективности самих ферментов.
Немаловажную роль в развитии рынка ферментов играет и тот факт, что во
многих развитых странах существенно возрос интерес к экологически чистым продуктам. Это подтверждается тем, что темпы роста производства таких продуктов питания (около 25% в год) значительно опережают общий
рост производства продуктов питания. Так, объемы их производства вышли
на уровень 25 млрд. долларов. По оценке зарубежных специалистов, к 2020
году этот объем увеличится на порядок. В настоящее время в странах Евросоюза, в США и Японии уже существуют национальные системы стандартов
по экологически чистым продуктам питания. В этих программах доминирующую роль играют ферменты и ферментные препараты, которые являются
натуральными биологическими препаратами и позволяют исключить применение различных химических и гормональных препаратов. Помимо этого,
использование ферментов в производстве продуктов питания практически
всегда снижает нагрузку на экологическую обстановку вокруг предприятия.
Эти природные вещества либо являются биоразлагаемыми, либо их присутствие не оказывает негативного воздействия на окружающую среду.
Представленное методическое пособие посвящено изучению некоторых
вопросов одного из разделов биотехнологии – инженерной энзимологии.
Основной задачей
данного методического пособия является помощь
студентам в самостоятельном изучении и освоении теоретических основ био5
технологических процессов и механизмов их использования при получении
полезных для человека продуктов. Пособие состоит из 7 разделов, в которых
кратко изложены основные положения по изучаемому вопросу: изложены
история возникновения и перспективы развития отрасли, основы строения и
механизма действия ферментов, номенклатуры выпускаемых препаратов,
сведения об основных источниках ферментов, о методах определения активности, мсм способах культивирования продуцентов. После каждого раздела
представлены тестовые задания для самоконтроля усвоения материала и вопросы для выполнения контрольной работы студентами заочной и дистанционной форм обучения.
6
1. Зарождение энзимологии, проблемы и перспективы развития
В глубокой древности люди хорошо знали способы приготовления хлеба, вина, пива, сыра, различных соусов, обработки льна и т.д. Наши предки
не имели представления о микроорганизмах и выделяемых ими ферментах,
которые играли в этих процессах главную роль. Они действовали интуитивно, но в течение тысячелетий использовали метод микробиологической ферментации. При раскопках Вавилона на дощечке, датированной шестым тысячелетием до н.э., дано описание процесса приготовления пива, а в третьем
тысячелетии до н.э. шумеры приготавливали уже два десятка его видов.
Уже в XVI веке в химии утверждается термин “ферментация” и процесс
брожения начали связывать с наличием дрожжей, природа которых была неизвестна. Термин “фермент”, по мнению многих исследователей, происходит
от латинского слова fermentum - закваска. Как синоним термина “фермент”
используется термин “энзим”, что в переводе с греческого также означает
“закваска”. Первый используется в основном в русской и немецкой научной
литературе, второй - в англоязычной. В позапрошлом веке собственно ферментами называли «организованные ферменты», то есть сами живые организмы, а термин энзим предложен в 1876 году В.Кюне для «неорганизованных ферментов», секретируемых клетками, например в желудок (пепсин) или
кишечник (трипсин, амилаза) (Чернов, 1996)
В 1814 году действительным членом Российской академии наук
К.С.Кирхгофом было сделано важное открытие: он установил, что в проросшем зерне содержится вещество, вызывающее осахаривание крахмала. Немного позднее французские ученые А.Пайен и Ж.Ф. Персо путем осаждения
спиртом получили из проросшего ячменя порошкообразный препарат амилазы. Это вещество и было первым описанным наукой ферментом и получило
название диастазы или амилазы. Открытие К.С.Кирхгофа рассматривается
как начало развития науки энзимологии. Э.Бухнер и А.Н.Лебедев доказали,
что процесс брожения может быть осуществлен при воздействии экстракта
из дрожжей, т.е. ферментами дрожжевой клетки. В 1907 году за эту работу
7
Э.Бухнер был удостоен Нобелевской премии. За 25 лет до открытия
Э.Бухнера русская женщина-учёный М.М. Манассеина опубликовала свои
работы, доказывающие возможность образования спирта в суспензии убитых
клеток дрожжей.
Под руководством профессора Александра Яковлевича Данилевского
(1838-1923) были проведены экспериментальные исследования, установившие факт обратимости действия ферментов. Им же предложен метод разделения ферментов с помощью избирательной адсорбции их из раствора на
коллоидных осадках.
Крупнейший вклад в дело изучения ферментов и выяснения сущности
их действия был внесен в науку великим русским естествоиспытателем академиком Иваном Петровичем Павловым (1849-1936) и его школой. Его работы были посвящены изучению ферментов пищеварительного тракта у животных. Им высказана идея о том, что “ферменты - тела белковой природы”.
В 1926 году Сёмнеру удалось впервые получить активный препарат кристаллической уреазы и доказать, что этот фермент представляет собой белковое вещество.
Промышленное применение ферментов, синтезированных микроорганизмами, было начато в 90-е годы XIX века. Японским ученым Дз.Такамине,
а также А.Кальметом и О.Бауденом была разработана технология получения
ферментов для спиртового и других производств с помощью плесневых грибов. В начале XX века О.Бауден и Ж.Эффрон провели первые исследования
по использованию бактерий в качестве продуцентов ферментов.
В России, в начале XX века, фундаментальные исследования в области
энзимологии
продолжались
выдающимися
учеными:
А.Н.Бахом,
А.И.Опариным, В.И.Палладиным, А.В.Благовещенским, В.А.Энгельгардом,
Б.И.Збарским.
Первые производственные установки для культивирования микромицетов нашей стране были созданы еще в 30-х годах под руководством
Л.И.Чекан. В качестве продуцентов использовались низшие грибы, синтези8
рующие пектиназу. Фермент использовался для осветления соков и при мочке льна. Здесь же велись разработки по исследованию инвертазы и пероксидазы грибов. В конце 30-х годов начаты разработки по получению протеолитических ферментов из грибов для замены протеаз животного происхождения в меховой и кожевенной промышленностях. В 1942 году Р.В.Фениксовой
разработана схема технологического процесса выращивания микромицетов
на отрубях кюветным способом и получения ферментных препаратов для
осахаривания зерно-картофельного сырья в спиртовом производстве. На основе этих разработок с 1951-52 гг. в нашей стране начинают функционировать два цеха по выращиванию культур микромицетов на отрубях.
В
60-х
годах
В.В.Вяткиным,
В.Б.Фремелем,
В.Л.Яровенко,
Б.А.Устиновым начаты работы по глубинному культивированию микроорганизмов в жидких средах. Сейчас производство ферментов осуществляется
главным образом глубинным способом в асептических условиях в биотехнологических реакторах (ферментерах).
Одним из основных достижений, вызвавших переворот в области производства и применения ферментов, были разработки по их иммобилизации.
Еще в 20 - 30-х годах А.Л.Курсанов и А.И.Опарин исследовали свойства адсорбированных на активированном угле ферментов. Первое промышленное
производство с применением иммобилизованных ферментов было организовано лишь в 1969 году, и в том же году создается Всесоюзный научноисследовательский институт прикладной энзимологии.
Согласно принятой классификации и номенклатуре сейчас идентифицировано около 2000 ферментов (1780 - в основном списке и около 200 - в дополнительном; описано свыше 4000). Промышленностью выпускается около
250 наименований ферментных препаратов, причем 99% общей суммы реализации приходится только на 18 ферментов. Основными из них являются:
протеазы, глюкоамилазы, -амилазы, глюкоизомеразы, пектолитические,
целлюлитические и гемицеллюлазные ферменты, молокосвертывающая кислая протеиназа, -галактозидаза, липаза и др. Очевидна перспектива исполь9
зования не только отдельных ферментов, а их определенного сочетания, где
учитывается вся гамма ферментов, необходимых для конкретной области
применения. Эти препараты получили название мультиэнзимных комплексов.
Ферментная промышленность наибольшее развитие получила в США,
Японии, Англии, Германии, Дании, Нидерландах, Франции. Прирост объема
биотехнологического производства в мире определяется ежегодно в 10-15%.
Отечественная промышленность заметно отстает от таких темпов, но учитывая большой экономический эффект от применения ферментных препаратов
в народном хозяйстве, намечается повысить объем выпускаемых ферментных
препаратов в несколько раз.
По прогнозам специалистов, использование ферментных препаратов
микробного происхождения в промышленности имеет устойчивую тенденцию к увеличению, при этом две третьих текущего объема составляют ферменты для пищевой промышленности, а их основная доля приходится на
спиртовую отрасль.
Потребность спиртовой отрасли России в комплексных ферментных
препаратах составляет около 7 тыс.т., среди которых доля отечественных
препаратов – менее 15%. Их ассортимент, готовая форма и упаковка не удовлетворяют в полной мере запросам промышленности.
Задания для самоконтроля
1. Термин «энзим» означает
1. инактивированный белок;
2. «неорганизованный фермент»;
3. фермент небелковой природы;
4. дрожжевой гидролизат.
2. То, что процесс брожения может быть осуществлен при воздействии
экстракта из дрожжей, было доказано
10
1. Ф.Сегнером;
2. Л.Пастером;
3. Ю.Либихом;
4. Э.Бухнером.
3. Первый описанный наукой фермент получил название
1. инвертаза;
2. диастаза;
3. уреаза;
4. дегидрогеназа.
4. Промышленное получение ферментов, синтезированных
микроорганизмами, было начато
1. в начале 20 века в России;
2. в 3 веке до н.э.;
3. в 90-е годы 19 века;
4. в 40 –е годы 20 века.
5. Согласно принятой классификации и номенклатуре
идентифицировано около
1. 2000 ферментов;
2. 100 ферментов;
3. 5000 ферментов;
4. 1000 ферментов.
6. В нашей стране первые производственные установки для
культивирования микромицетов были созданы
1. в 1910 году И.И.Мечниковым;
2. в 1930 году А.И.Опариным;
3. в конце 30-х годов под руководством Л.И.Чекан;
11
4. в 60-х годах В.В.Вяткиным.
7. Работы по глубинному культивированию микроорганизмов в жидких
средах были начаты
1. в 1930 году А.И.Опариным;
2. в 60-х годах В.В.Вяткиным, В.Б.Фремелем, В.Л.Яровенко;
3. в конце 30-х годов под руководством Л.И.Чекан;
4. в 1910 году И.И.Мечниковым.
8. Процесс осахаривания крахмала веществами, содержащимися в
проращенном зерне, был описан
1. К.С.Кирхгофом;
2. И.И.Мечниковым;
3. Л.Пастером;
4. А.И.Опариным.
9. Термин «фермент» происходит от
1. греческого слова, означающего «сосуд»;
2. греческого слова, означающего «закваска»;
3. латинского слова fermentum, означающего «закваска»;
4. латинского слова, означающего «сосуд».
10. Наука о ферментах называется
1. ферментологией;
2. энзимологией;
3. рибозимологией;
4. ферментоведением.
12
Вопросы для выполнения рефератов по первому разделу
1. История становления науки энзимологии.
2. Связь энзимологии с другими науками.
3. История становления промышленной энзимологии.
4. Исторические предпосылки возникновения инженерной энзимологии.
5. Направления развития энзимологии как науки.
6. Инженерная энзимология как составная часть современной биотехнологии.
7. Современное состояние ферментной промышленности в России и других
cтранах.
8. Перспективы развития ферментной промышленности.
13
2. Строение, свойства, механизм действия и классификация
ферментов
2.1.Свойства ферментов
Ферменты - биологические катализаторы, в основном белковой природы, ускоряющие химические реакции в живых организмах и вне их. Как и
неорганические катализаторы, они изменяют (обычно увеличивают) скорость
только таких химических реакций, самопроизвольное протекание которых
термодинамически невозможно, т.е. реакций с уменьшением свободной энергии. К настоящему времени известна лишь одна ферментативная реакция, катализируемая веществом небелковой природы: интронный участок молекулы
РНК автокаталитически, без каких-либо белков-ферментов, сшивал экзонные
участки собственной молекулы. Такие биологические катализаторы названы
рибозимами. За открытие нового класса энзимов американские учёные
Томас Р.Чек и Сидни Олтмен в 1989 году были удостоены Нобелевской премии по химии. Считается, что это открытие проливает свет на происхождение жизни на Земле.
Ферменты обладают уникальными свойствами, которые выделяют их на
фоне обычных катализаторов гомогенного типа:
- необычайно высокой каталитической активностью. Так, добавление
незначительного количества фермента (10 -9 - 10 -7 М) ускоряет превращение
субстрата в 108
- 10
12
раз (активность – это количество молей субстрата,
превращаемое в продукт реакции одним молем фермента за 1 мин при оптимальных значениях рН и температуры);
- очень высокой специфичностью (избирательностью) действия в отношении структуры субстрата, типа реакции и условий её проведения. Специфичность ферментов может проявляться на разных уровнях: абсолютная специфичность, когда фермент способен катализировать всего одну реакцию, а
иногда лишь реакцию только с одним изомером; относительная специфичность выражается в способности ферментов катализировать однотипные реакции с несколькими структурно подобными субстратами. Это обусловлено
14
главным образом определенной конформационной подвижностью белка.
Для живого организма характерны кооперативность и жесткая запрограммированность последовательности действия ферментов. При нарушении
структуры клетки живого организма ферменты не утрачивают каталитическую функцию, на чем основано их применение в народном хозяйстве. Исследования последних лет показывают, что ферменты in vivo и in vitro ведут
себя по - разному. Фермент in vivo может катализировать превращение разных субстратов. Объяснить это явление достаточно сложно. Постепенно
накапливаются факты, убеждающие в реальности существования надмолекулярной структурной организации ферментов в живой клетке. Для обозначения комплексов функционально связанных ферментов основных метаболических путей в 1985 году П.Шрер ввел термин «метаболон»;
- каталитическая активность проявляется в очень малых количествах: 1г
амилазы гидролизует 1т крахмала, 1г химозина сворачивает 12т молока;
- молекулы ферментов, как правило, значительно больше молекул веществ (субстратов), подвергающихся превращениям;
- фермент ускоряет взаимодействие реагирующих веществ, но не смещает равновесие химической реакции и не входит в состав конечных продуктов;
- большой лабильностью, т.е. зависимостью от ряда воздействий: температуры, pH среды, концентрации метаболитов, ионов металлов и т. д. Активный центр не имеет автономного существования. Нет определенной грани
между активным центром фермента и остальной частью белковой молекулы.
Именно это и является одной из причин высокой чувствительности и лабильности активного центра к различным воздействиям.
- если химическое превращение обратимо, то ферменты ускоряют как
прямую, так и обратную реакции. Направление процесса определяется концентрацией исходных и конечных продуктов реакции. В живых клетках,
обычно, реакции синтеза и расщепления вещества катализируют разные
ферменты;
- важным свойством ферментов, которые необходимо учитывать при их
15
практическом использовании, является стабильность, т.е. способность сохранять каталитическую активность. Одним из эффективных способов стабилизации ферментов является их иммобилизация.
Задания для самоконтроля
1. Термин «фермент» в переводе с греческого означает
1. белок;
2. закваска;
3. антибиотик;
4. катализатор.
2. Ферменты по своей химической природе в основном являются
1. липопротеидами;
2. гликопротеидами;
3. белками;
4. пептидогликанами.
3. Группа рибозимов представляет собой ферменты
1. белковой природы;
2. жирорастворимые витамины;
3. нуклеотидной природы;
4. комплексные соединения.
4. Количество молей субстрата, превращаемое в продукт реакции одним
молем фермента за 1 мин при оптимальных значениях рН
и температуры называется
1. амилолитической активностью;
2. декстролитической активностью;
3. лабильностью фермента;
16
4. активностью фермента.
5. Абсолютная специфичность проявляется, когда фермент
1. способен катализировать всего одну реакцию, а иногда лишь
реакцию только с одним изомером;
2. способен катализировать реакции абсолютно со всеми изомерами
и структурно похожими веществами;
3. способен катализировать реакции с веществами, относящимися к
одному классу;
4. способен катализировать реакции с веществами, проявляющими
амфотерные свойства.
6. Относительная специфичность выражается
1. в способности катализировать относительно небольшое
количество реакций;
2. в способности ферментов катализировать однотипные реакции с
несколькими структурно подобными субстратами;
3. в способности ферментов катализировать относительно большое
количество разнонаправленных реакций;
4. в способности ферментов катализировать однотипные реакции с
структурно разнородными веществами.
7. При нарушении структуры клетки живого организма ферменты
1. не утрачивают каталитическую функцию, на чем основано их
применение в народном хозяйстве;
2. ингибируют действие обратимо и восстанавливаются его при
восстановлении функций организма;
3. полностью ингибируются;
4. утрачивают каталитическую активность, но сохраняют другие
функции.
17
8. Каталитическая активность ферментов проявляется
1. в условиях, не зависящих от влияния внешних факторов;
2. в очень малых количествах;
3. только в живых организмах;
4. только in vivo.
9. Лабильность ферментов –
1. зависимостью от ряда воздействий: температуры, pH среды,
концентрации метаболитов, ионов металлов и т. д.;
2. способность катализировать ряд близких по энергозатратам
реакций;
3. полная независимость от факторов окружающей среды;
4. способность работать при температурах, превышающих порог
коагуляции;
10. Если химическое превращение обратимо, то ферменты
1. катализируют реакцию в одном направлении;
2. ферменты ускоряют как прямую, так и обратную реакции;
3. слипаются и образуют конгломераты, способные выпадать
в осадок;
4. флокулируют, всплывая на поверхность культуральной жидкости.
2.2. Строение ферментов
Исследованиями в области молекулярной биологии установлено, что все
ферменты обладают свойствами белков и их каталитическая активность зависит от степени сохранности нативной структуры белка. Молекулы ферментов обладают компактной структурой, отличающейся от структуры обычных
линейных полимеров. Молекулы ферментов плотно «уложены», содержат
18
всего лишь 20-30 % воды, их растворы имеют во много раз меньшую вязкозть, чем растворы линейных полимеров (Рогов, Антипова, Шуваева, 2004).
К настоящему времени для сотен ферментов полностью определена
трехмерная пространственная структура с высоким разрешением расположения отдельных атомов. Как и у всех белков, первичная структура ферментов
представлена последовательностью аминокислот, соединенных пептидными
связями. Вторичная структура возникает в результате образования упорядоченной структуры в виде спирали и поддерживается водородными и электростатическими взаимодействиями. Для большинства ферментов в сохранении
каталитической активности решающую роль играет третичная структура. В
создании и стабилизации третичной структуры принимает участие все типы
химических связей, включая ковалентные. В формировании третичной
структуры нередко важную роль играют катионы металлов, например в α –
амилазах – это ионы кальция. При укладке молекулы в глобулу углеводородные радикалы, направленные наружу по отношению к оси спирали, образуют гидрофобное ядро молекулы фермента. Для некоторых ферментов установлена четвертичная структура. От последовательности аминокислот и
конформации белка зависит, обладает ли данный белок каталитической активностью. В каталитическом действии фермента-белка принимают участие
лишь немногие реактивные группы, находящиеся в активном центре.
Активный центр состоит из каталитического центра и пространственно
ограниченного центра связывания. Каталитический центр ответственен за
химическую природу катализируемой реакции (специфичность действия),
центр связывания – за сродство к субстрату (субстратную специфичность).
Каталитический центр может быть довольно неспецифичным, специфичность центра связывания достаточно высока – в качестве субстрата могут использоваться лишь немногие близкие по структуре соединения.
По строению ферменты разделяются на два класса:
- однокомпонентные, состоящие исключительно из белка, обладающего
каталитическим свойством, которое в них проявляют чаще всего остатки се19
рина, гистидина, триптофана, аргинина, тирозина, аспарагиновой и глутаминовой кислот. Свободные радикалы (-NH2, -NH, -SH, -COOH и др.) этих аминокислот и составляют активный центр. Аминокислотные остатки, входящие
в состав центра, расположены в различных местах полипептидной цепи, поэтому активный центр образуется, когда белковая молекула приобретает
присущую ей третичную (глобулярную) структуру;
- двухкомпонентные, состоящие из белковой части (апофермента) и
небелковой части (простетической группы).
Простетические группы, легко отделяющиеся от белковой части фермента, по предложению выдающегося французского биохимика Г.Бертрана,
называются коферментами. В качестве коферментов функционируют производные витаминов, нуклеотиды и т.д. Активностью обладает только комплекс «апофермент – кофермент», называемый холоферментом. В отсутствии кофермента наблюдается эффект недостаточности фермента. Такое же
явление отмечается при затруднении образования активного холофермента.
Ферменты in vivo образуют структурные комплексы и ансамбли как друг
с другом, так и с участками клеточных и внутриклеточных мембран, с элементами цитоскелета и другими молекулами. Образование таких комплексов
приводит к изменению активности фермента, что играет роль в процессах регуляции.
Для многих ферментативных катализов наряду с каталитическим белком, играющим фундаментальную роль, и коферментов, необходимо присутствие кофакторов - катионов и реже анионов: Mg++, Ca++, Mn++, Fe++,
Fe+++ и др; Cl-). Некоторые из них поддерживают нативную структуру белка
(Ca, Mg), другие осуществляют связь фермента с субстратом (Mn) и непосредственно участвуют в реакциях, перенося электроны (Fe++, Fe+++, Cu++,
Mo++, Zn++ и др.).
Кроме активного центра ферментов различают аллостерический центр,
который взаимодействует с веществами, влияющими на активность фермента
- активаторами, ингибиторами или инактиваторами.
20
Ингибиторы могут действовать обратимо и необратимо. Примером необратимого ингибирования может быть ингибирование ферментов с
сульфгидрильными группами в активном центре йодуксусной кислотой. Обратимое ингибирование характеризуется равновесием между ферментом и
ингибитором. Так, гидролиз крахмала посредством α – или β – амилазы обратимо ингибируется продуктом расщепления – мальтозой.
Ингибиторы ферментов можно разделить на два класса: ингибиторы
общие и специфические. К общим ингибиторам относят соли тяжелых металлов: свинца, ртути, вольфрама и др., которые денатурируют белки и, следовательно, подавляют действие всех ферментов.
Наибольшее значение имеют специфические ингибиторы, которые
находят широкое практическое применение. Они действуют только на одну
ферментативную реакцию или группу близких реакций. Специфические ингибиторы делят на конкурентные и неконкурентные.
Конкурентное ингибирование происходит тогда, когда ингибитор близок по своей конфигурации к специфическому субстрату данного фермента.
В этом случае вместо субстрата с активной частью фермента реагирует ингибитор и блокирует часть активного центра фермента. Образуется неактивный
комплекс фермент-ингибитор, и фермент теряет свою каталитическую активность.
Неконкурентное ингибирование, как правило, необратимо. Его примером может служить действие синильной кислоты на ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, активные лишь в присутствии ионов Fе++ или Fе+++. Такие ферменты ингибируются синильной
кислотой вследствие образования комплексов CN с железом.
Активаторы могут ускорять реакцию, действуя в направлении, противоположном ингибированию. Например, активация протеиназы папаина синильной кислотой основана на связывании ею ионов тяжелых металлов, ингибирующих активность этого фермента. В других случаях активатор
предотвращает изменение конформации фермента-белка при физических
21
воздействиях (pH, температура).
Ряд ферментов существует в организме в неактивной форме –
проферментов или зимогенов. При определенных условиях они переходят
в активное состояние. Профермент пепсиноген активируется соляной кислотой желудка, липазой кишечника и желчными кислотами, превращаясь в активный пепсин.
2.3. Механизм действия ферментов
Действие ферментов, как и других катализаторов, заключается в понижении свободной энергии активации реакции. Однако, протекает реакция в
присутствии фермента значительно сложнее, чем при обычных катализаторах. Огромную роль в катализе ферментами приобретает образование фермент-субстратного комплекса. В этом случае реагирующие частицы оказываются сближенными и сориентированными до начала собственно химической реакции. Превращение осуществляется за счет функционирования специального участка фермента - сложноорганизованного активного центра.
Различные участки молекулы субстрата оказываются связанными с группами
активного центра фермента многочисленными слабыми связями: водородными, гидрофобными, ионными взаимодействиями, ван-дер-ваальсовыми силами. В результате такого взаимодействия и происходит правильная ориентация и сближение реагирующих групп до начала химической реакции и образование переходного состояния. Некоторые соединения фермента с субстратом удалось выделить в кристаллическом виде. В ходе взаимодействия с
субстратом в молекуле фермента могут происходить структурные (конформационные) изменения. Например, ион железа гема в молекуле “отдыхающей” каталазы находится под плоскостью порфиринового кольца. Взаимодействие с перекисью водорода приводит к перемещению железа в плоскость
гема. Аналогичные изменения могут происходить и в молекуле субстрата;
деформация ослабляет внутримолекулярные связи и делает молекулу значительно более способной к определенной реакции. При этом фермент является
22
начальным («запальным») фактором реакции. В дальнейшем катализируемая
ферментом реакция идет уже самостоятельно. Это объясняет тот факт, что
для ферментативной реакции достаточна незначительная концентрация энзима.
Факторы, определяющие характер течения ферментативных реакций,
многочисленны и разнообразны. К главным из них относятся: концентрация
фермента и субстрата, рН, температура, наличие активаторов или ингибиторов.
Концентрация субстрата – один из наиболее важных факторов, определяющих скорость реакции. При очень низких концентрациях субстрата скорость реакции очень мала, но постепенно возрастает по мере повышения
концентрации субстрата. В условиях возрастающих концентраций субстрата
каждый раз приращение скорости становится все меньше до бесконечно малого ускорения. Скорость, когда фермент насыщен субстратом, принято принимать за максимальную. В таком состоянии он не может функционировать
быстрее. Эффект насыщения свойственен почти всем ферментам. В 1913 году Михаэлис и Ментен определили константу (К m), которую удобно использовать для обозначения соотношения между концентрацией субстрата и скоростью катализируемой ферментом реакции. Величина Кm - концентрация
специфического субстрата, при котором данный фермент обеспечивает скорость реакции, равную половине её максимальной скорости. Физический
смысл Кm фактически показывает степень сродства фермента и субстрата.
Для большинства ферментов наиболее благоприятной температурой является 37-400С. При повышении температуры на 100С активность ферментов
приблизительно удваивается. При увеличении температуры выше 500С происходит снижении активности ферментов, а при 80-1000С она полностью
утрачивается.
Ферменты активны только в определенном интервале рН. Оптимальной
средой для действия ферментов является слабокислая или слабощелочная
среда. Изменение реакции среды в кислую или щелочную среду ведет к сни23
жению активности, а в последствии к полной инактивации. В большинстве
случаев для каждого фермента имеется свой определенный оптимум рН.
2.4. Классификация ферментов
Главный специфический признак, на основании которого отличают один
фермент от другого, это химическая реакция, катализируемая им. В соответствии с систематической классификацией все ферменты подразделяют на
шесть главных классов:
1) оксидоредуктазы - катализируют окислительно- восстановительные
реакции;
2) трансферазы - катализируют реакции переноса целых атомных групп
от одного соединения к другому;
3) гидролазы - катализируют реакции расщепления сложных соединений
на более простые при участии воды;
4) лиазы - катализируют реакции отщепления от субстратов отдельных
групп с образованием двойных связей или присоединение групп к двойным
связям;
5) изомеразы - катализируют реакции изомеризации;
6) лигазы (синтетазы) - катализируют реакции синтеза с участием АТФ
или аналогичных трифосфатов.
Эти шесть классов ферментов, в свою очередь, подразделяются на подклассы и еще более мелкие группы. Каждый фермент имеет рациональное
название и шифр. Название ферментам дают по названию реакции, которую
они катализируют, или по названиям субстратов, превращения которых катализируют ферменты, с добавлением к этим названиям, в большинстве случаев, окончание “аза”, например амилаза, сахараза, липаза и т.д. Такая система
названия была предложена учеником Луи Пастера -Эмилем Дюкло в 1898 году. Но и до настоящего времени сохранились старые названия: так, фермент
желудочного сока называют пепсином, фермент слюны - птиалином, фермент поджелудочной железы - трипсином и т.д. Шифр каждого фермента со24
стоит из четырех чисел, разделенных точками. Первая цифра указывает, к какому из шести главных классов принадлежит фермент. Второе число обозначает подкласс. Третья цифра обозначает еще более мелкую группу ферментов (подподкласс), а четвертая - номер конкретного фермента в данном подклассе.
Например:
3.- гидролазы
3.1.- гидролазы, действующие на сложноэфирные связи
3.2.- гидролазы гликозильных соединений
3.2.1.1 – 1,4 - α –D- Глюкан глюканогидролаза (α –амилаза)
3.2.1.2 – ß – амилаза
3.4.4.4 – трипсин
Изоферментами называют ферменты с одинаковой специфичностью
действия и субстратной специфичностью, но различающиеся первичной
структурой. Часто изоферменты различаются и по реакции на действие аллостерических эффекторов.
Задания для самоконтроля
1. Ферменты, относящиеся к полинуклеотидам, называются
1. дезоксирибонуклеотидами;
2. рибонуклеотидами;
3. рибозимами;
4. энзимами.
2. Каталитическая активность ферментов проявляется
1. в больших количествах;
2. в очень маленьких количествах;
3. в количествах, пропорциональных количеству субстрата;
4. только в присутствии активаторов.
25
3. Специфичность фермента по отношению к конкретному субстрату
связана
1. с простетической группой;
2. с коферментом;
3. с белковой частью фермента;
4. с отдельными группировками аминокислот.
4. Молекула фермента
1. значительно больше молекулы субстрата;
2. значительно меньше молекулы субстрата;
3. молекулы фермента и субстрата примерно равны по размерам;
4. реакция не зависит от размера молекул.
5. Молекулы фермента после осуществления катализа
1. входят в состав конечного продукта;
2. выходят из реакции не изменившись;
3. инактивируются;
4. теряют активность.
6. По строению ферменты могут быть
1. поликомпонентными;
2. только однокомпонентными;
3. однокомпонентными и двухкомпонентными;
4. однокомпонентные, двухкомпонентные и трехкомпонентные.
7. В состав небелковой части двухкомпонентных ферментов входят
1. остатки ароматических аминокислот;
2. ионы тяжелых металлов, микроэлементов;
3. остатки жирных кислот, нуклеотиды;
4. производные витаминов, нуклеотиды, ионы металлов.
26
8. Ингибиторы ферментов подразделяются на
1. общие и специфические;
2. специфические и индивидуальные;
3. однокомпонентные и двухкомпонентные;
4. характерные и неспецифические.
9. Ингибитор, близкий по своей конфигурации к специфическому
субстрату данного фермента, называется
1. специфическим;
2. конкурентным;
3. неконкурентным;
4. общим.
10.Название ферменту дают
1. в соответствии с именем ученого, открывшего фермент;
2 .в соответствии с местом, где был открыт и описан фермент;
3. в соответствии с организмом, где был впервые обнаружен
фермент;
4. в соответствии с реакцией, которую фермент катализирует.
11. Шифр каждого фермента состоит
1. из 3 цифр и буквенного обозначения;
2. из 4 цифр, разделенных точками;
3. из букв латинского алфавита;
4. из 6 цифр.
12. Класс ферментов, которые катализируют реакции синтеза с участием
АТФ, называется
1. оксидоредуктазы;
2. лигазы;
27
3. трансферазы;
4. лиазы.
13. Аллостерический центр ферментов предназначен
1. для прикрепления фермента к субстрату;
2. для прикрепления к ферменту веществ, влияющих на активность
фермента;
3. для прикрепления кофермента;
4. для прикрепления апофермента.
14. Если химическое превращение обратимо, то
1. фермент катализирует как прямую, так и обратную реакцию;
2. фермент катализирует реакцию только в одном направлении;
3. для катализа требуется несколько близких по химическому
составу ферментов;
4. фермент должен действовать только при определенном составе
субстрата.
15. Действие фермента заключается
1. в реагировании с субстратом и инактивации фермента после
реакции;
2. в образовании фермент-субстратного комплекса с последующей
инактивацией фермента;
3. в понижении энергии активации, необходимой для прохождения
реакции;
4. в образовании дополнительных макроэргических связях в
молекулах субстрата.
28
Вопросы для выполнения рефератов по второму разделу
1. Витамины как составная часть ферментов. Химическая природа,
классификация.
2. Кинетика ферментативных реакций. Факторы, влияющие на
скорость ферментативных реакций.
3. Регуляция ферментативной деятельности.
4. Строение ферментов в связи с их функциями.
5. Биологическая роль ферментов.
6. Классификация ферментов.
29
3. Источники ферментов
Все живые организмы содержат ферменты, и потенциально любой живой организм является источником ферментов для промышленных целей.
Основная задача заключается в поиске подходящего источника фермента: он
должен содержать фермент в достаточной концентрации; выделение и очистка фермента должны быть сопряжены с незначительными потерями активности.
3.1. Растительное сырье
По сравнению с расходом растительного материала, количество получаемых из него ферментов невелико. Солодовые амилазы и протеолитические
ферменты папаин, бромилин и фицин - единственные растительные ферменты, которые имеют промышленное значение.
Солод – проращенное в определенных условиях зерно различных злаков. Основное требование, предъявляемое к солоду – способность как можно
быстрее и полнее осахаривать крахмал, для чего должно накопиться следующие ферменты: α – амилаза, β-амилаза и декстриназа. В солоде, приготовленном из зерна различных злаков, содержатся неодинаковые количества
каждого из ферментов. Исходя из этого, все злаки делят на четыре группы:
1. ячменя (ячмень, рожь, пшеница) – солод с высокой α- и βамилолитической активностью и низкой декстринолитической активностью;
2. проса (могар, чумиза, гаолян, пайдзе – разновидности проса, дающие
солод со слабой β -амилолитической , средней α-амилолитической и очень
сильной декстринолитической активностью;
3. овса – занимает промежуточное положение между группами ячменя и
проса;
4. кукурузы – солод не обладает β –амилолитической, имеет слабую αамилолитическую и значительную декстринолитической активность.
На заводах России применяли наряду с ячменным солодом овсяный и
просяной солод, получившие за рубежом название «русские солоды». В
30
настоящее время готовят смесь, состоящую из трех солодов: ячменного, просяного и овсяного.
Солод может использоваться непосредственно и как технический препарат, и служить исходным материалом для получения очищенных ферментных препаратов. Применяется солод, главным образом, из-за его амилолитического действия. Способность солода осахаривать крахмал известна с давних времен и до сих пор используется для получения спирта, пива. Однако на
современном этапе солод активно заменяется амилазами бактерий и плесневых грибов. При солодоращении теряется 16-18% крахмала, часть крахмала в
процессе производства спирта остается неосахаренной и, следовательно, не
сбраживается; с солодом в сусло вносятся посторонние микроорганизмы, что
приводит к нежелательному появлению других типов брожения и снижению
качества конечных продуктов. Однако до сих пор ячменный солод составляет
основу пива. На отечественных спиртовых заводах для осахаривания используют сырцевой несушенный солод («зеленый»). Этот солод не может долго
храниться, поэтому его готовят в количествах, необходимых для текущей работы. В спиртовой промышленности США, Германии и некоторых других
стран применяют сухой ячменный солод, вырабатываемый специализированными солодовенными заводами. Сушка солода связана с боьшими капитальными и эксплуатационными затратами и сопровождается снижением
осахаривающей активности.
Папаин получают из плодов папайи (дынного дерева). Он представляет
собой гетерогенную систему протеиназ, отличающихся молекулярной массой
и изолектрической точкой, имеет оптимум действия при рН 5-7 и температуре 60-700 С, инактивируется при температуре 80-850С. Наибольшую активность папаин проявляет в отношении актомиозина. При 600С хорошо гидролизует не только белки мышечной ткани, но и коллаген и эластин. На нативный коллаген практически не действует.
Кристаллы папаина получают из жидкого или сухого латекса дынного
дерева. Несколько раз перекристаллизованный папаин ведет себя при элек31
трофорезе как однородное вещество основного характера с изоэлектрической
точкой около рН 9. Относительная молекулярная масса равна 20700. Папаин
не обладает субъединичной структурой и близок к глобулярным белкам. Обладает широкой специфичностью, осуществляя глубокий протеолиз белков и
синтетических субстратов. Только в США ежегодно расходуется около 100 т
папаина для обработки (тендеризации) мяса.
Бромелаин содержится в стеблях и плодах ананаса. Относительная молекулярная масса бромелаина около 33000. Молекула бромелаина содержит
285 аминокислотных остатков и представляет собой одну полипептидную
цепь. Бромелаин – сложный белок, содержащий в качестве небелковой части
прочно связанный углеводный компонент. Его активность повышается в
присутствии цистеина, цианида, меркаптоэтанола; угнетается веществами,
спецефически реагирующими с SH – группами. По способности гидролизовать белки мяса бромелаин напоминает папаин. Проявляет активность в широком диапазоне рН 4,5-8,5. Как и другие растительные ферменты не способен гидролизовать нативный коллаген и эластин, но проявляет высокую коллагеназную и эластазную активности при температурах 600С и выше. За рубежом его применяют с целью мягчения жесткого мяса, в производстве мясных паст, эмульсий.
Фицин получают из латекса деревьев рода Ficus (фиговое дерево). Это
протеиназа типа папаина, проявляет активность в широких пределах рН,
температурный оптимум активности находится в пределах 60-650С, инактивируется при 800С. Относительная молекулярная масса фицина равна 2500026000. Имеет довольно широкую субстратную специфичность. Фицинединственный представитель группы растительных протеиназ, способный
гидролизовать нативный коллаген. Вместе с тем он обладает высокой активностью по отношению к мукополисахаридному комплексу внутримышечной
соединительной ткани.
Эти препараты обладают очень узким диапозоном действия по сравнению с микробными аналогами и менее глубоко, чем микробные проводят
32
гидролиз субстрата. С этим и связано до сих пор их широкое применение в
пищевой промышленности. Их доля составляет 1/2 от объема всех выпускаемых протеиназ. Поставщиками сырья служат страны тропиков и субтропиков.
Из растительного сырья получают также фосфатазы (картофель), пероксидазы (хрен), уреазы (канавалия мечевидная).
3.2. Органы и ткани животных
Важными в промышленном отношении животными ферментами являются панкреатин, реннин, пепсин, трипсин, химотрипсин, коллагеназы, эластазы и каталаза. В технологии переработки мяса огромную роль играют
внутриклеточные протеолитические ферменты, называемые катепсинами,
локализованные в клеточных органеллах – лизосомах. Сбор сырья проводят
на мясоперерабатывающих комбинатах. Ферменты животного происхождения выделяются из органов, в которых протекают интенсивные биохимические процессы. Секрет поджелудочной железы и слизистые оболочки сычугов, желудков, кишечного тракта содержат сложный набор гидролитических
ферментов, в том числе протеаз. Практически все животные протеазы синтезируются тканями в виде неактивных предшественников – зимогенов и превращаются в активные ферменты по какому – либо механизму уже в самих
секретах. В промышленных условиях при переработке мяса различных животных в самый первый момент разделки туши проводят сбор ферментного
сырья. Из заготовленного сырья на специальных заводах органопрепаратов
получают ферментные препараты различной степени очистки.
В настоящее время на отечественном рынке появились ферментные препараты из гидробионтов. Разработана технологическая схема получения
ферментных препаратов из поджелудочной железы китов. Перспективным
видом сырья для получения ферментных препаратов являются органы дальневосточных и тихоокеанских рыб (кеты, горбуши, чавыги, кижича, нерки и
гольца).
33
Трипсин получен в кристаллическом виде и достаточно изучен. Кристаллический трипсин впервые получен Дж Х.Нортропом и М.Кунитцем в
1931 году. Трипсины различного происхождения имеют близкий качественный и количественный набор аминокислот и форму кристаллов. Молекулы
трипсина и трипсиногена имеют глобулярное строение. Оптимум активности
наблюдается в интервале рН 7,0-9,0, при температуре около 500С. Относительная молекулярная масса бычьего трипсина 23800 и состоит из 229 аминокислотных остатков. Важным свойством молекул трипсина в растворе является их способность к ассоциации, в которой активный центр не участвует.
Трипсин гидролизует связи, в которых карбоксильные группы принадлежат
основным аминокислотам – лизину или аргинину. Амиды расщепляются
быстрее, чем пептиды, а сложные эфиры – быстрее, чем амиды.
Химотрипсин был исследован более детально, чем другие очищенные
ферменты. Получены кристаллы химотрипсина А и химотрипсина В. Относительная молекулярная масса химотрипсина составляет 23000, рН-оптимум
7,0-9,0, температурный оптимум около 500С, ИЭТ молекулы хемотрипсина
составляет рН 8,1-8,2. Подобно трипсину химотрипсин осуществляет гидролиз субстратов типа сложных эфиров, который идет через образование ковалентного промежуточного соединения. Наряду с пептидами фермент гидролизует амиды и эфиры, при этом он предпочтительно расщепляет связи, образованные остатками ароматических аминокислот.
Пепсин – фермент слизистой оболочки желудков свиней и сычугов
крупного рогатого скота, впевые получен Дж.Нортропом в 1929-1930 гг., был
вторым в истории энзимологии кристаллическим ферментом. Препараты
кристаллического пепсина не отличаются высокой степенью однородности,
что связано с наличием в слизистой желудка нескольких форм пепсиногена, а
также с самоперевариванием фермента. Пепсин обнаружен в желудочном соке всех позвоночных. Относительная молекулярная масса пепсина равна
34163. Молекула пепсина имеет 321 аминокислотный остаток. Пепсин гидролизует белки намного медленнее, чем другие протеиназы. Ещё медленнее
34
он действует на пептиды. Его специфичность абсолютна в отношении оптической конфигурации аминокислотных остатков по обе стороны от гидролизуемой связи. В медицине находит применение в качестве переваривающего
средства и включен в рецептуру тонизирующих средств и жевательной резинки.
Реннин (сычужный фермент, химозин) – специфический фермент, синтезируемый в желудке молочных телят и ягнят. От одного теленка по сухой
массе можно получить 25 г сырья, а от ягненка - 8 г. Для изготовления 1 кг
стандартного препарата (90% NaCl, влажность 2%, активность 100 000 ед на
1 г препарата) требуется 13,5 сычужков молочных телят (или 105 сычужков
ягнят) и 0,8 кг слизистой оболочки желудка свиньи. Сычужный препарат используется в сыроделии и для приготовления сырковых масс. В настоящее
время с применением реннина изготавливают более 500 сортов сыра (химозиновые сорта).
Первичные структуры пепсина и реннина совпадают на 70%, оба фермента имеют близкие относительные молекулярные массы (33000-34000).
Реннин умеренно стабилен при рН2,0, устойчив в интервале рН5,3-6,3, инактивируется при рН больше 6,5.Температурный оптимум ренина лежит в интервале 40-450С. Ренин плохо растворим в дистиллированной воде, его растворимость возрастает с увеличением ионной силы раствора.
Препараты, обладающие молокосвертывающей активностью, можно получать из культур микроорганизмов, однако полноценных заменителей практически нет. Сычужный фермент в процессе свертывания молока разрывает
только одну пептидную связь в белке молока казеине и далее почти не гидролизует субстрат, что очень важно и необходимо для нормального течения
процесса созревания сыра. Тогда как протеиназы микробного происхождения
обладают способностью к более полному гидролизу белка, что нежелательно
в сыроделии. Этим и обусловлена большая ценность животного фермента.
Коллагеназа – фермент, секретируемый в растущих или подвергающихся метаморфозу тканях земноводных и млекопитающих. Впервые колла35
генолитическая активность коллагеназы была выевлена в хвостовом плавнике головастиков в период метаморфоза, когда в течении нескольких дней
происходит резорбция больших количеств коллагена в ткани. Кроме того,
коллагеназа выделена из поджелудочной железы млекопитающих, которая
имеет специфичность к гидролизу коллагена. Коллагеназно-эластазный комплекс получают на мясокомбинатах из экстрактов поджелудочной железы
КРС, но из-за ограниченности источников препарат выпускают лишь для медицинских целей. На практике для обработки различных белковых субстратов применяют ферменты пепсин, трипсин, химотрипсин или коплекс ферментов поджелудочной железы – панкреатин. Ферменты поджелудочной
железы убойного скота могут действовать на коллаген и эластин внутримышечной соединительной ткани. Панкреатин получают из поджелудочной железы свиней и КРС. Он обладает амилолитической, протеолитической и липолитической активностью. Трипсин и химотрипсин получают из панкреатина или непосредственно из необработанной поджелудочной железы. Применяются они в основном в медицинских целях как переваривающие ферменты.
Катепсины – ткневые ферменты, локализованные в лизосомах клеток
мышечного волокна. При посоле и созревании мяса они незаменимы, но при
обработке мясного сырья не используются, так как источник катепсинов –
ценнейший пищевой продукт. Однако закономерности их воздействия на
белки мышечной ткани имеют большое практическое значение и должны
учитываться при дополнительном внесении ферментов той или иной специфичности. При разработке новых препаратов ферментов для ускорения процессов созревания мяса свойства катепсинов принимают за образец для сравнения.
Каталаза обнаружена у всех организмов, за исключением анаэробов.
Получают ее из печени, крови, почек КРС и свиней. В настоящее время широко налажен выпуск микробного препарата.
36
3.3. Микроорганизмы
В специально созданных условиях микроорганизмы способны синтезировать огромное количество разнообразных ферментов, а учитывая успехи
генной инженерии, они способны синтезировать белки в нужных количествах и требуемого состава. Перед другими источниками ферментов микроорганизмы имеют ряд преимуществ:
- неприхотливы к составу питательной среды;
- легко переключаются с синтеза одного фермента на другой;
- имеют короткий цикл роста (16-100 час.);
- синтезируют экзоферменты, что облегчает выделение белка из культуральной жидкости;
- могут синтезировать одновременно целый комплекс ферментов;
- мутантные штаммы могут быть моноферментными и образуют в больших количествах только один фермент;
- благодаря своей природе, могут синтезировать термофильные, алкалофильные и ацетофильные ферменты.
В природе известно более чем 100 тыс. видов различных микроорганизмов, в биотехнологических производствах используется несколько сотен видов. Прикладное зачение того или иного микроорганизма связано с особенностями метаболизма, формирующими качественный и количественный
набор веществ, образующихся в процессе жизнедеятельности клетки.
Наиболее разнообразная группа используемых микроорганизмов –
бактерии: уксуснокислые (Gluconobacter, Acetobacter); анаэробные спорообразующие бактерии рода Clostridium, синтезирующие целый ряд ферментов,
представляющих интерес в переработке мяса (коллагеназы, протеиназы) и
способные сбраживать углеводы в ацетон, этанол, изопропанол и др.; строгие
аэробы рода Bacillus – наиболее часто используемая группа, синтезирующая
амилолитические и протеолитические ферменты; к бактериям, сбраживающим сахара до молочной кислоты относятся представители родов Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus; актиномицеты родов Streptomices и Actinomices
37
используют для получения антибиотиков, а также целый ряд протеолитических ферментов.
Биотехнологические функции грибов (дрожжи, мицелиальные грибы
или плесени) разнообразны. Их используют для получения таких продуктов,
как: антибиотики (пенициллы, цефалоспорины); гиббереллины и цитокинины
(фузариум и ботритис); каротиноиды (например, астаксантин, придающий
мякоти лососевых рыб красно-оранжевый оттенок вырабатывают Rhaffia
rhodozima, которых добавляют в корм на рыбозаводах); белок (Candida,
Saccharomyces lipolitica); сыры типа рокфор и камамбер (пенициллы); соевый
соус (Aspergillus oryzae).
Из 500 известных видов дрожжей наиболее популярны Saccharomyces
cerevisiae (пекарские дрожжи), различные расы которых используются в пивоварении, виноделии, производстве японской водки сакэ и других видов
продукции. Нашли применение дрожжи Kluyveromices fragilis, позволяющие
получать спирт из молочной сыворотки; Saccharomyces lipolytica, использующиеся для получения биомассы, богатой белком; Candida, штаммы которых
способны разлагать сильнейшие токсины, например фенолы, и используются
в очистке сточных вод.
Мицелиальные грибы вызывают многочисленные превращения в твердых средах и синтезируют широкий комплекс ферментов, чем и обусловлено
их широкое использование в биотехнологических производствах. Для биосинтеза ферментов различного назначения используются роды Aspergillus,
Penicillium, Endomyces, Endomycopsis и др. Грибы рода Rhizopus обладают
очень широким спектром синтезируемых ферментов и ведутся разработки по
их использованию с целью получения ферментов, заменителей сычужных
ферментов, широко применяются в Японии для получения глюкозы, возможно их использование в кожевенной, хлебопекарной промышленности благодаря высокой липолитической и протеолитической активности. Пищевые
продукты на основе сброженных плесневыми грибами Rhizopus oligosporus
соевых бобов или пшеницы содержат в 5 - 7 раз больше таких витаминов, как
38
рибофлавин, никотиновая кислота и отличаются повышенным в несколько
раз содержанием белка.
В последнее время широко стали применяться в биотехнологии микроскопические водоросли. Считается что спирулина (Spirulina platensis) пришла из Африки — население района озера Чад давно употребляет ее в пищу,
называя этот продукт «дихе». Другое место, откуда начала распространяться
спирулина, но иного вида (Spirulina maxima) — воды озера Тескоко в Мексике. Еще ацтеки собирали с поверхности озер и употребляли в пищу слизистую массу водоросли спирулины. Впервые галеты "текуитлатл" упомянуты
испанцем Кастильо в 1521 г. Анализ образцов Spirulina показал, что в ней содержится 65% белков (больше, чем в соевых бобах), 19% углеводов, 6% пигментов, 4% липидов, 3% волокон и 3% золы. Недавно было показано, что в
клетках спирулины, помимо ценного белка, углеводов, липидов, витаминов, в
значительных количествах запасается, например, такое ценное вещество, как
поли-b-оксибутират. Для белков этой водоросли характерно сбалансированное содержание аминокислот. Клеточная стенка этой водоросли хорошо переваривается. Растет спирулина в щелочной среде при рН вплоть до 11.
Спирулину культивируют обычно в искусственных водоемах или специальных емкостях. Можно культивировать её в открытых прудах или, как в
Италии, в замкнутой системе из полиэтиленовых труб. Урожайность очень
высокая: получают до 20 г сухой массы водоросли с 1 м2 в день, а расчеты на
год показали, что она превысит выход пшеницы примерно в 10 раз.
В ряде стран выращивают спирулину вида Spirulina platensis. Отечественная фармацевтическая промышленность выпускает препарат «Сплат» на основе цианобактерии Spirulina platensis. Он содержит комплекс витаминов,
ферментов и микроэлементов и применяется как общеукрепляющее и иммуностимулирующе средство.
Простейшие относятся к числу нетрадиционных объектов биотехнологии. До недавнего времени они использовались лишь как компонент активно-
39
го ила для биологической очистки сточных вод. В настоящее время они используются как продуценты биологически активных веществ.
В этом качестве чаще применяются свободноживущие простейшие, обладающие разнообразными биосинтетическими возможностями и потому
широко распространенными в природе.
Особую экологическую нишу занимают простейшие, обитающие в рубце
жвачных животных. Они синтезируют фермент целлюлазу, способствующую
разложению клетчатки в желудке жвачных. Простейшие рубца могут быть
источником этого ценного фермента.
В настоящее время микробиологическим путем налажено крупнотоннажное производство большого количества ферментов: протеазы, глюкоамилазы, -амилазы, глюкоизомеразы и пектиназы и др. Предприятия РФ выпускают ряд технических ферментных препаратов: амилосубтилин и протосубтилин (Bacillus subtilis), пектофеотидин (Aspergillus foetidus), мальтаваморин,
глюкоаваморин (Aspergillus awamori), амилоризин (Aspergillus orizae), глюконигрин (Aspergillus niger), протолихетин (Bacillus lichniformis) и др.
Задания для самоконтроля
1. Ферментные препараты, получаемые из растительного сырья:
1. трипсин, химотрипсин;
2. пепсин, ренин;
3. папаин, бромелаин;
4. амилосубтилин, термамил.
2. Ферментные препараты, получаемые из органов и тканей животных:
1. трипсин, химотрипсин;
2. зимаджунт, фунгамил;
3. папаин, бромелаин;
4. амилосубтилин, термамил.
40
3. Продуцентами ферментов могут быть
1. только высшие растения;
2. только теплокровные животные и высшие растения;
3. растения и микроорганизмы;
4. все названные организмы.
4. В стеблях и плодах ананаса содержится
1. пепсин;
2. бромелаин;
3. ренин;
4. хемотрипсин.
5. Основными ферментами солода являются
1. трипсин, химотрипсин;
2. пепсин, ренин;
3. папаин, бромелаин;
4. амилазы.
6. Комплекс ферментов поджелудочной железы называется
1. панкреатин;
2. пепсин, ренин;
3. папаин, Бромелаин;
4. амилоризин.
7. Специфический фермент, синтезируемый в желудке молочных телят
и ягнят:
1. панкреатин;
2. ренин;
3. папаин;
4. амилоризин.
41
8. Внутриклеточные протеолитические ферменты называются
1. панкреатинами;
2. ренином;
3. катепсинами;
4. амилоризином.
9. Фицин получают
1. из тканей животных;
2. из латекса деревьев рода Ficus (фиговое дерево);
3. из солода;
4. из культуральной жидкости микроорганизмов.
10. Папаин получают
1. из тканей животных;
2. из латекса деревьев рода Ficus (фиговое дерево);
3. из солода;
4. из плодов папайи (дынного дерева).
11. Папаин представляет собой
1. систему амилаз;
2. группу липолитических ферментов;
3. комплекс окислительных ферментов;
4. гетерогенную систему протеиназ.
12. Бромелаин – сложный белок,
1. содержащий гемин;
2. содержащий в качестве небелковой части прочно связанный угле
водный компонент;
3. катализирующий расщепление жиров;
42
4. катализирующий расщепление углеводов.
13. Коллагеназно-эластазный комплекс получают
1. из выжимок плодов и ягод;
2. из специальных видов растений;
3. из экстрактов поджелудочной железы КРС;
4. из зеленого солода.
14. Сычужный фермент в процессе свертывания молока
1. разрывает только одну пептидную связь в белке молока казеине;
2. проводит глубокий гидролиз казеина;
3. катализирует гидролиз практически всех белков молока;
4. не воздействует на белок молока казеин.
15. Пепсин – фермент, получаемый из
1. слизистой оболочки желудков свиней и сычугов крупного рогато
го скота;
2. из латекса деревьев рода Ficus (фиговое дерево);
3. из солода;
4. из плодов папайи (дынного дерева).
16. Каталаза обнаружена
1. только у растительных объектов;
2. у специальных видов растений;
3. у всех организмов, за исключением анаэробов;
4. в слизистой оболочке желудка КРС.
17. Представитель группы растительных протеиназ, способный
гидролизовать нативный коллаген1. панкреатин;
43
2. ренин;
3. папаин;
4. фицин.
18. Сычужный препарат используется
1. при тендеризации мяса и рыбы;
2. при очистки вин от осадка;
3. в сыроделии и для приготовления сырковых масс;
4. для удаления жира.
19. Микробные ферментные препараты получают культивируя
1. бактерии и грибы;
2. грибы и дрожжи;
3. только плесневые грибы и актиномицеты;
4. все названные микроорганизмы.
20. Основным потребителем ферментных препаратов является
1. химическая промышленность;
2. легкая промышленность;
3. пищевая промышленность;
4. экологические службы.
Вопросы для выполнения рефератов по третьему разделу
1. Солод. Получение и области применения.
2. Технологическая схема солодоращения.
3. Фермены солода. Механизм действия.
4. Молокосвертывающие ферменты. Характеристика и применение.
5. Протеиназы растительного происхождения. Области применения.
6. Основные продуценты для получения бактериальных амилаз.
44
Характеристика. Способы культивирования.
7. Основные продуценты для получения грибных амилаз Характеристика.
Способы культивирования.
9. Ферменты, применяемые в спиртовой промышленности.
10. Ферменты, применяемые в пивоварении и виноделии.
45
4. Получение ферментных препаратов из культур
микроорганизмов
Способ культивирования микроорганизма определяет и технологическую схему производства, которая включает:
1) получение посевного материала;
2) подготовка питательных сред;
3) получение производственной культуры одним из видов ферментации;
4) получение из готовой производственной культуры продуцента технических или очищенных ферментных препаратов.
4.1. Получение посевного материала
Для производства посевного материала используют исходный штамм
продуцентов, получаемый из лаборатории чистых культур. Каждая культура
штамма имеет паспорт с описанием культурально-морфологических, биохимических и биологических свойств микроорганизма, характеристики сред и
условий для их поддержания, выращивания, срока и условий хранения и
транспортировки. Чистая культура, размноженная до количества, достаточного для засева ферментатора, называется технической чистой культурой.
Она используется неоднократно для повторных производственных циклов
при условии сохранения её качества. Главными показателями качества чистой культуры являются биологическая чистота, морфологическое состояние
и физиологические свойства.
Биотехнологические объекты (продуценты ферментов) находятся на разных ступенях организации:
а) субклеточные структуры (вирусы, плазмиды, ДНК митохондрий и
хлоропластов, ядерная ДНК);
б) бактерии и цианобактерии;
в) грибы;
г) водоросли;
д) простейшие;
46
е) культуры клеток растений и животных;
ж) растения – низшие (азолла (водный папоротник), и высшие.
Для приготовления необходимого количества посевного материала на
заводе организуется цех чистой культуры. При постадийном выращивании
посевного материала возникает необходимость некоторое время хранить исходный штамм. Это достаточно сложная задача, особенно если исходным
штаммом является мутант, т.к. при его длительном хранении не исключена
возможность проявления спонтанной изменчивости культуры. Следует помнить, что ни один из многочисленных способов хранения живых культур
микроорганизмов не дает полной гарантии стабильности штамма и сохранения его продуктивности.
Наиболее распространенными являются следующие способы:
1. Посев микроорганизмов в пробирки на скошенные агаризованные питательные среды и хранение культуры при температуре 3-4С. Пересев культур проводят через определенные промежутки времени (1-2 мес.) с таким
расчетом, чтобы наилучшим образом сохранить физиолого-биохимические
свойства штамма.
2. Хранение культур под слоем минерального масла. Культуру заливают
стерильным маслом после того, как она достигает полной физиологической
зрелости. Обычно применяется медицинское вазелиновое масло. Продуценты
сохраняют активность и жизнеспособность после 3-5 летнего хранения.
3. Хранение культур при температурах от -11 до -14С. Сохранение активности в течение 10-16 месяцев.
4. Хранение в атмосфере жидкого азота при температурах от -165 до
-
196С. Этот способ применяется для грибных культур, которые замораживаются в 10% водном растворе глицерина в запаянных ампулах. Срок хранения
5 и более лет.
5. Хранение в виде спор. Спора - естественный анабионт. Для сохранения спор микромицетов используют активный уголь в соотношении (2-5):1.
47
Смесь подсушивают до влажности 20-25%. Споры могут храниться более 10
лет.
6. Консервирование спор и живых клеток при помощи высушивания в
конвективной сушилке.
7. Хранение культур в лиофилизированном состоянии. Этот способ считается наиболее перспективным. Культура микроорганизмов замораживается
при температуре от -35 до -78С в защитной сахаро-желатиновой среде, а затем высушивают в вакуум сушильных аппаратах. Такие культуры сохраняются до 5-6 лет.
8. Хранение на стерильном зерне (пшено) или в стерильной почве. Стерильный субстрат засевают культурой микроорганизмов, культивируют. Выросшую культуру высушивают до влажности 7-8% в вакууме при температуре 25С и в таком виде хранят от 1 до 3-5 лет.
4.1.1. Подготовка посевного материала
Посевной материал может быть приготовлен двух видов: а) в виде культуры, выращенной на твердой питательной среде поверхностным способом;
б) в виде глубинной культуры.
Получение посевного материала включает следующие операции:
1) обновление исходной культуры на агаризованной среде
(в случае необходимости);
2) приготовление питательной среды;
3) стерилизация питательной среды, аппаратуры, посуды;
4) охлаждение среды с соблюдением правил асептики до температуры
роста культуры;
5) засев среды исходным штаммом продуцента;
6) выращивание культуры продуцента до определенного возраста;
7) консервирование посевного материала (в случае необходимости).
Состав питательной среды определяется свойствами продуцента. При
поверхностном культивировании чаще всего для этой цели используют пше48
ничные отруби с добавлением солодовых ростков, древесные опилки, свекловичный жом, кукурузный жмых, спиртовую барду. Жидкую часть питательной среды (воду или фильтрат барды) обогащают питательными солями,
гидролизатами белков, аминокислотами, витаминами. При поверхностном
культивировании посевной материал может быть трех видов: споры, мицелий
и спороносящая культура.
При глубинном культивировании вид посевного материала зависит от
продуцента: для грибов это вегетативная масса или спороносящая культура,
для бактерий - молодая растущая культура на начальной стадии спорообразования.
Вначале из имеющегося эталонного штамма микроорганизма делают посевы в небольшие емкости объемом 200-250 мл. Затем пересевают в большие
емкости. При достаточном накоплении микроорганизмов такую культуру
вносят в инокулятор и называют посевной(матрацной, матровой, маточной).
Рис. 4.1.1.1 Маточники (инокуляторы) для выращивания посевной культуры
При выборе конструкции посевного биореактора (инокулятора) следует
учитывать определенные технические требования:
49
- инокулятор должен быть максимально простым по конструкции и
с минимальным числом штуцеров и передаточных устройств;
- в инокуляторе необходимо обеспечивать оптимальные
гидродинамические и массообменные условия.
Посевные микробные культуры контролируются на сохранение типичных морфологических, культурально-биохимических свойств и отсутствие в
них посторонней микрофлоры.
Расход посевного материала при поверхностном культивировании составляет 0,5-0,6% массы засеваемой питательной среды, при глубинном - 115%.
На Мичуринском экспериментальном спиртовом заводе схема для приготовления посевного материала для производственного культивирования
Aspergillus awamori 466 была значительно упрощена. Из колб посевной материал в виде водной суспензии пересевается непосредственно в производственный ферментер, минуя инокулятор. В зависимости от объема ферментера увеличивают количество колб с посевным материалом. При этом получается большой выигрыш в сокращении трудоемкости операций и более
надежная защита от инфекции.
Рис. 4.1.1.2 Размножение посевного материала в колбах на качалке.
50
4.2. Питательные среды для культивирования
микроорганизмов в производственных ферментаторах
Основным требованием, предъявляемым к составу питательной среды,
является ее полноценность для роста продуцента и обеспечения синтеза целевого продукта. Состав среды для того или иного микроорганизма различен,
однако все продуценты ферментов усваивают углерод преимущественно в
виде органических соединений, водород - в составе воды и органических соединений, кислород - из основного состава среды и в молекулярном виде.
Подавляющее большинство продуцентов ферментов являются аэробами, а
значит, углеводы ассимилируются ими путем окисления и одним из продуктов метаболизма являются диоксид углерода и вода.
Производственные питательные среды в зависимости от состава делятся
на среды синтетические и комплексные.
Синтетические среды состоят из вполне определенных по количественному составу индивидуальных веществ. Источниками углерода в таких средах могут быть углеводы, спирты, органические кислоты; источниками азота
- соли, содержащие азот, аминокислоты, пептиды определенного состава,
мочевина. Такие среды в крупнотоннажном производстве используются
только на стадии микробиологической лаборатории. Для получения конечного продукта используют комплексные питательные среды.
В комплексные среды обычно входят различные естественные продукты, богатые органическими соединениями, и отходы ряда производств. Комплексные среды значительно дешевле, более доступны и потому чаще используются в промышленности. Их компонентами служат отруби, мука различных злаков, меласса, гидрол, кукурузный экстракт, выжимки плодов и
овощей, жмыхи, замочные воды, барда спиртовых заводов, картофельная
мезга и прочие отходы картофеле- и кукурузокрахмального производств, а
также других пищевых производств.
51
Рис. 4.2.1 Отделение приготовления питательных сред.
В 1939 г. В.О.Таусоном была установлена способность разных видов
микроорганизмов использовать в качестве единственного источника углерода и энергии н-алканы и некоторые фракции нефти. Только немногие виды
микроорганизмов способны ассимилировать углеводороды из-за их слабой
растворимости в воде.
Ниже приведен состав питательной среды (%) для производственного
культивирования Aspergillus batatae 61:
Грубый фильтрат барды _________________________ 96,6
Мука кукурузная или пшеничная _________________1,95
Кукурузный экстракт____________________________ 0,6
Селитра аммиачная (NH4 NO3)_____________________0,5
Мел (CaCO3) ___________________________________ 0,2
Магнезит (MgO)_________________________________0,1
Растительное масло (пеногаситель)_______________0, 05
52
Как видно из приведенного состава, кроме основного источника углерода учитывается потребность микроорганизмов в азоте, кальции, фосфоре,
микроэлементах и факторах роста (витамины, аминокислоты).
В бактериальных клетках азота содержится до 12% в пересчете на сухую
массу, в мицелиальных грибах- до 10%. Микроорганизмы способны использовать как органические (аминогетеротрофы), так и неорганические (аминоавтотрофы) формы азота. Бактерии более требовательны к источникам азота,
чем большинство микромицетов, актиномицетов и дрожжей. В переодических режимах культивирования потребление азота заканчивается в первые 612 часов роста (в первой половине экспоненциальной фазы). При направленном биосинтезе азотсодержащих метаболитов потребность в азоте сущеественно возрастает. Большинство микроорганизмов хорошо усваивают аммиачные формы азота. Часто в качестве источника азота в состав сред включают мочевину. Некоторые виды грибов при биосинтезе ферментов наивысшей
биосинтетической активности достигают на средах с органическим азотом
(аспарагин, пептоны и т.д.)
Кроме макроэлементов (C, O, N, H, S, P, K, Mg, Ca, Fe) микроорганизмы нуждаются еще в 10 микроэлементах (Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, W,
Ni). Потребность в микроэлементах особенно возрастает, если целевой метаболит содержит микроэлемент. Кроме того, минеральный состав питательной
среды формирует распределение электрических зарядов на поверхности клеток. Обычно клетки микроорганизмов имеют отрицательный потенциал.
Добавление в среду электролитов может привести клетки в электронейтральное состояние, что приводит к изменению физиологической деятельности мембран и может повлечь слипание клеток между собой (флокуляцию) и
всплывание на поверхность питательной среды (флотацию). Не перезаряжаются клетки плесневых грибов и дрожжей.
Многие продуценты ферментов лучше растут в присутствии витаминов,
аминокислот, гормонов роста и других биологически активных веществ, которые называют «факторами роста». Они необходимы микроорганизмам в
53
малых дозах, но действие их многогранно. В крупнотоннажном производстве
эти вещества вносятся не в чистом виде, а в виде отходов пищевых и перерабатывающих отраслей или их продуктов: кукурузный экстракт, дрожжевой
автолизат, клеточный сок картофельных клубней, молочная сыворотка, экстракт пшеничных отрубей, экстракт солодовых ростков, мясной и рыбный
пептоны и т.д.
При аэробном глубинном культивировании важную роль играют процессы пенообразования и пеногашения. При сбалансированных пенных режимах увеличивается межфазная контактная поверхность и достигается интенсивный массообмен между средой и аэрирующим воздухом. Для создания устойчивых режимов пенообразования применяют механические и химические пеногасители и их комбинации. В качестве естественных пеногасителей при производстве ферментов используют пищевые растительные
масла (подсолнечное, кукурузное и т.д.). Для многих продуцентов жиры являются необходимым или дополнительным питательным компонентом. Однако необходимо учитывать, что продуктом гидролиза жиров являются органические кислоты, которые могут изменять рН среды.
В последнее время весьма эффективно применение синтетических пеногасителей (силиконы, пропинолы, контрамин, полиформаль и др.).
Потребность микроорганизмов в кислороде зависит от вида продуцента,
источника окисляемого углерода, активности роста и многих других факторов. При интенсивном потреблении субстрата продуценты ассимилируют
0,83-4,0 мг кислорода на 1 л среды в минуту (в зависимости от вида). В реальной питательной среде максимальная растворимость кислорода 2-5 мг/л.
Запасы кислорода в среде обеспечивают жизнедеятельность аэробного продуцента в течение 0,5-2 минут. При глубинном культивировании запасы кислорода в питательной среде возобновляются при подаче аэрирующего воздуха. Воздух, используемый для аэрации предварительно тщательно, очищается. Для этого в биотехнологических производствах организуется отдельный
цех по очистке воздуха (компрессорная станция), головные и индивидуаль54
ные фильтры воздуха. (рис. 4.2.2 и рис.4.2.3 )
Рис. 4.2.2 Компрессорная станция.
Вода для приготовления питательных сред должна соответствовать ГОСТу “Вода питьевая”; в воде должно содержаться не более 50 мг/л хлоридов,
не более 60 мг/л сульфитов. Концентрация ионов металлов (в мг/л) не должны превышать следующих пределов: свинец - 0,2; мышьяк - 0,05; фтор - 1,5;
цинк - 5,0; медь - 3,0.
В промышленных условиях питательные среды готовят в отдельном цехе, изолированном от цеха основной ферментации. Готовят среды в емкостях, снабженных мешалками. При приготовлении питательных сред для
глубинного культивирования особое внимание уделяют тщательной гомогенизации компонентов среды. Подготовленную питательную среду перед подачей в ферментатор стерилизуют в периодическом или непрерывном режиме.
55
При периодическом методе стерилизации среду загружают в ферментатор и там осуществляют три последовательные операции: подогрев до температуры стерилизации; выдержку при данной температуре; охлаждение до
температуры ферментации.
Рис. 4.2.3 Индивидуальный фильтр воздуха.
Периодический метод стерилизации не выгоден в экономическом отношении, поэтому на крупных производствах применяют в основном непрерывную стерилизацию, чаще всего это проводят на установках непрерывной
стерилизации (УНС). В специальных секция нагревания среда быстро разогревается до температуры 128-135 0 С и последовательно выдерживается 1015 минут в теплообменнике, затем охлаждается. В качестве секции нагревания среды используют колонны, паровые инжекторы, сдвоенные трубы
(«труба в трубе»), а также теплообменники пластинчатого типа. Режим стерилизации, оборудование и другие особенности этого этапа зависят от сырья,
количества и вида дополнительных компонентов среды. В процессе стерилизации необходимо следить за тем, чтобы не происходили нежелательные реакции, например меланоидинообразование, карамелизация.
56
Для охлаждения стерильной среды можно использовать теплообменники
пластинчатого типа или «труба в трубе».
В промышленной биотехнологии применяют также холодную стерилизацию сред, например – ультрафильтрацию при помощи мембранных фильтров. Используют её для обеззараживания термонестабильных растворов
(раствор мочевины, аммиачная вода и др.) и для раздельной стерилизации
биологически активных компонентов.
Перед началом культивирования берут пробы среды с целью определения качества стерилизации: отобранные пробы высеваются на среды МПБ,
МПА, Сабуро или Чапека.
4.3. Производственное культивирование
Культивирование является основной стадией технологического процесса
и во многом определяет количественные и качественные характеристики
производства биопрепаратов. Культивирование продуцента в производственных условиях называют ферментацией. Режимы и условия ферментации отражаются в технологическом регламенте, который включает описание продукта с указанием его культуральных, морфологических и физиологобиохимических характеристик и детальное описание технологического процесса, включая все основные этапы биосинтеза – от характеристики сырья до
реализации продукта. Указываются технические условия (ТУ) или государственный стандарт (ГОСТ), определяющие основные показатели качества
препарата и методы его проверки, которым продукт должен соответствовать.
Ферментация может осуществляться поверхностным (твердофазным) и
глубинным (жидкофазным) способами, которые могут реализовываться как в
периодическом, так и непрерывном режимах с различными модификациями.
Клетки продуцента могут
находиться непосредственно в составе питатель-
ной среды (суспендированно), либо быть иммобилизированными на носителе.
57
4.3.1. Глубинное культивирование
При современном производстве чаще других применяется глубинный
способ культивирования с различными модификациями по следующим причинам:
1. Позволяет получить за более короткое время большее количество
бактериальной массы и продуктов биосинтеза.
2. Возможность осуществлять управляемое культивирование
в стерильных условиях и четко контролировать все основные
процессы.
3. Возможность использования стандартного механизированного и
автоматизированного технологического оборудования для
культивирования (инокулятор, биореактор и др.), что обеспечивает
снижение подготовительных операций и операций съема биомассы и
повышение качества биопрепарата.
Периодический способ характеризуется несменяемостью питательной
среды в ферментере, состав которой в процессе развития культуры постепенно изменяется. Процесс протекает постадийно: в ферментер загружают питательную среду, задают посевной материал; после размножения микроорганизмов и накопления продуктов их обмена зрелую культуру выгружают, а
все оборудование, коммуникации промывают, а затем стерилизуют паром. И
процесс повторяется снова. Классическая периодическая культура представляет собой замкнутую систему, которая проходит в своем развитии 6 фаз
(фазы роста микроорганизмов). Для биотехнологии – первые две фазы (лагфаза и переходная фаза) – это потеря времени, так как накопления биомассы
и конечного продукта не происходит. Автоматическое регулирование замкнутой системы практически не возможно.
58
Рис. 4.3.1.1
Цех глубинной ферментации (Объем ферментатора 36м. куб)
Непрерывная культура – это открытая система, которая стремиться к динамическому равновесию. Условия культивирования этой системы постоянны и легко регулируются, обеспечивают высокий экономический эффект.
Непрерывный процесс обеспечивает однородность и стандартность конечного продукта, равномерную скорость процесса и полную переработку подаваемого субстрата.
Способ имеет две разновидности: гомогенно-непрерывный и градиентно-непрерывный. В первом случае выращивание ведут в одном ферментере:
при тщательном перемешивании среды и аэрации обеспечивается одинаковое
состояние культуры во всем объеме жидкости. Градиентно-непрерывное (гетерогенно-непрерывное) культивирование осуществляют в батарее ферментеров, соединенных переточными трубами. Питательная среда поступает в
первый аппарат, готовая культыральная жидкость вытекает из последнего.
Поддержание состояния динамического равновесия в реакторе осуществляется двумя способами - хемостатным и турбидостатным.
Хемостатное
культивирование представляет собой процесс, при котором в культуру с постоянной скоростью непрерывно подается свежая питательная среда, а объем
59
культуры при этом поддерживается на постоянном уровне путем непрерывного отлива части культуральной жидкости. При культивировании микроорганизмов в режиме турбидостата концентрация микроорганизмов поддерживается постоянной регулировкой оптической плотности культуры. При превышении установленной точки включается насос, подающий свежую среду.
Объем культуральной жидкости поддерживается постоянным с помощью
устройства для контроля верхнего уровня. При этом происходит тщательное
перемешивание содержимого ферментатора и культура при этом разбавляется.
Ведутся разработки по применению культивирования поршневого типа
(полного или идеального вытеснения). В отличии от биореактора с мешалкой, в данном случае концентрация клеток и питательных веществ изменяется в зависимости от местоположения каждой рассматриваемой точки. предполагается, что прохождение жидкости определенного расстояния в этом
биореакторе позволит компенсировать цикл инкубации.
Таким образом, можно выращивать микроорганизмы в условиях, оптимальных для их стадии развития. При этом такие важные факторы, как концентрация питательных веществ, количество продуктов обмена, pH, содержание растворенного кислорода, резко изменяющиеся при периодическом
способе культивирования, поддерживаются постоянными на заданном
уровне или изменяются по разработанной программе.
При непрерывноциклическом способе микроорганизмы, расположенные
на неподвижной насадке в ферментере (иммобилизированные), омываются
средой, протекающей в замкнутом контуре, который может состоять из нескольких ферментеров. Среда циркулирует до полного потребления микроорганизмами питательных веществ. После этого зрелую культуру выгружают, начиная с последнего ферментера. Аппараты промывают, стерилизуют и
цикл повторяется с головного ферментера. Процесс этот более продолжительный, чем периодический.
Способ непрерывного культивирования в производстве ферментных
60
препаратов для спиртового производства еще находится в стадии производственных испытаний. В настоящее время на большинстве заводов применяют
периодическое культивирование.
Основным оборудованием для глубинного культивирования микроорганизмов является биореактор (ферментатор, ферментер). В микробиологических производствах применяют разнообразные ферментаторы. Условно их
подразделяют на следующие типы: барботажные, эрлифтные, барботажноэрлифтные, с механическим перемешиванием, с эжекционнойт системой и
др.
Для стерильной ферментации обычно используют аппараты объемом 101000 кубических метров с механическими мешалками и барботерами. Ферментаторы обычно представляют собой герметические цилиндрические емкости, высота которых в 2-2,5 раза превышает диаметр. Биореакторы изготавливают из высоколегированных марок сталей. Внутренняя поверхность
ферментатора должна быть отполирована. Биореактор должен быть простым
в обслуживании. Регулированию подлежат отдельные физико-химические
параметры культивирования (температура стерилизации и культивирования,
рН, еН, рО2, рСО2, скорость вращения мешалки, давление, расход воздуха или
газов на аэрацию, пенообразование). Соответствующая гидродинамическая
обстановка в биореакторе, процессы тепло- и массообмена поддерживаются с
помощью специальной конструкции перемешивающих устройств, диспегаторов газа (барботеры), наличия перегородок (отбойников). Немаловажное значение могут иметь и геометрические соотношения отдельных элементов биореактора.
Количество питательной среды в ферментере не должно превышать 70%
его объема. Свободное пространство над поверхностью раствора используется как буферное, где накапливается пена. Температура и pH питательной среды должны быть доведены до оптимальных значений для данной культуры
перед внесением посевного материала. Соответственно регулируют интенсивность аэрации и перемешивания. При необходимости вводят пеногасите61
ли. Во время ферментации по специальному графику берут контрольные
пробы культуральной жидкости из ферментера.
Конструкции биореакторов не могут быть подчинены одному шаблону,
но общие требования к ним существуют. Ферментатор должен обеспечивать:
- гомогенность культуральной среды;
- оптимальные массо- и теплообменные характеристики по
потреблению питательных веществ и отводу продуктов метаболизма;
- обеспечение стерильности посева, взятия проб и процесса
культивирования;
- простота наладки и обслуживания;
- стандартность блоков оборудования для культивирования;
- возможность осуществления масштабного перехода;
- возможность автоматического контроля и регулирования основных
параметров культивирования.
Ферментатор и систему трубопроводов перед заполнением средой моют,
проверяют на герметичность и стерилизуют горячим паром. Для обеспечения
стерильности часто применяют предварительную обработку химическими
дезинфицирующими веществами.
Ферментацию прекращают, когда в среде накапливается максимальное
количество полезного продукта. Его количество или активность определяется
одним из методов, предусмотренных ГОСТом. Кроме того, на заводах конец
ферментации определяют микроскопированием по морфологическим изменениям клеток продуцента. По окончании ферментации культуральную жидкость охлаждают и перекачивают в резервуары для хранения или транспортировки. Резервуары снабжаются системой охлаждения.
4.3.2. Поверхностное культивирование
Этот способ в крупнотоннажном производстве применяются для культивирования плесневых грибов. Твердой питательной средой обычно служат
пшеничные отруби, содержащие в достаточных количествах все вещества,
62
необходимые для питания грибов и биосинтеза ими ферментов. Лучший результат достигается при содержании не менее 16% крахмала в питательной
среде.
Этот способ связан с большими затратами ручного труда. Культивирование проводится на отрубях, засыпанных в кюветы. Кюветы размещаются
на этажерках, которые устанавливаются в камеры с кондиционером. Общая
продолжительность выращивания 36-42 часа. В тех случаях, когда использование готовой культуры задерживается более чем на 2 часа, ее высушивают
до влажности 18-20%.
При необходимости транспортировки на дальние расстояния культуру
гриба дробят на шнек-дробилке до получения частиц размером не более 10
мм и высушивают в сушилке теплым воздухом до влажности 10-12%. Готовую культуру упаковывают в бумажные мешки, которые снабжают этикеткой
с указанием завода-изготовителя, наименования продукта, даты выпуска, номера партии, активности фермента и массы.
Предложены технологические схемы производства поверхностных культур с использованием механизированных установок: с вертикальными кюветами и непрерывнодействующая конвеерно-пластинчатая. К механизированным установкам относятся линии Джеффриса, Христенсена, Андеркофлера,
установки фирмы “Валерштейн” (США), а также конструкций отечественного производства ВНИИ биотехники, ВНИИФСа.
В первых трех установках используются кюветы различных конструкций
и традиционные растильные камеры с кондиционерами. Механизируется загрузка кювет, транспортировка, разгрузка и стерилизация.
Установки “Валерштейн” барабанного типа диаметром 2,1 м и длиной
5,2 м. Загрузка питательной среды до 200 кг. Перемешивание достигается
вращением барабана вокруг неподвижной рамы и подачей воздуха внутрь
барабана.
Более совершенный закрытый аппарат разработан во ВНИИ биотехники.
Он представляет собой вертикальный цилиндр, разделенный на секции пер63
форированными пластинами, укрепленными на поворотных осях. Внутри аппарата расположены перемешивающие устройства. Под каждую секцию подается стерильный воздух с заданной температурой и влажностью.
Преимущество данных конструкций в том, что в замкнутом пространстве легче сохранить стерильность культуры.
4.3.3. Выделение ферментов из культур микроорганизмов
Культура микроорганизмов, выращенная поверхностным способом,
культуральная жидкость после глубинного культивирования содержат большое количество балластных веществ. Выделение и очистка ферментов - трудоемкий и дорогостоящий процесс, поэтому, если ферментный препарат
можно использовать в виде неочищенной культуры, его очистку не проводят.
В спиртовой и кожевенной отраслях целесообразнее использовать именно
неочищенную культуру микроорганизмов. Неочищенные ферментные препараты получают высушиванием мицелия вместе с твердым субстратом при
поверхностном способе получения или биомассы вместе с культуральной
жидкостью при глубинном культивировании на распылительной сушилке.
Затем высушенный препарат измельчают до однородного порошка. Стоимость таких препаратов относительно невелика, они достаточно стабильны,
но удельная активность их невысока.
В пищевой промышленности: хлебопечении, пивоварении, виноделии,
сыроделии, крахмалопаточном и сокоэкстрактном производствах, а также в
текстильной, меховой и микробиологической промышленностях и особенно
в медицине используют только очищенные препараты ферментов. Ферментные препараты могут быть получены в виде порошков или жидких концентратов.
Исходным материалом для получения препаратов ферментов различной
степени очистки являются экстракт из поверхностной культуры или культуральная жидкость. Культуральную жидкость разделяют на фракции для последующей обработки, предварительно охладив до 10-150 С. В зависимости
64
от того, где содержится конечный продукт (фермент) и проводят дальнейшую обработку. Если фермент содержится в биомассе (биошроте), то её выделяют с помощью сепараторов, цинтрифуг, отстойников, фильтров (фильтр
– прессы, вакуум-фильтры) или добавлением электролита. Полученную сметанообразную массу промывают и обрабатывают в соответствии с регламентом, получая из нее целевой продукт. Если искомое вещество содержится в
культуральной жидкости, то биомассу используют как побочный продукт, а
целевой продукт выделяют из раствора, применяя методы в соответствии с
разработанной технологией (выпаривание, вымораживание, мембранные
способы очистки и т.д.).
В производстве ферментов стоимость выделения и очистки составляет
до 70% общих затрат, что значительно выше, чем в других производствах:
получение этанола - 15-20%, органических кислот - 30-40%.
Рис. 4.3.3.1 Аппарат ультрафильтрации культуральной жидкости.
Задания для самоконтроля
1. Биотехнологические объекты (продуценты ферментов)- это
1. клетки животных и растений;
65
2. клетки микроорганизмов;
3. находятся на разных уровнях развития;
4. используются все организмы, исключая высшие растения.
2. Для производства посевного материала используют
1. культуру, полученную на заводе из диких штаммов продуцента;
2. исходный штамм продуцентов, получаемый из лаборатории чистых культур;
3. отселектированную в производственных условиях расу микроорганизмов;
4. мутантные клоны, подвергающиеся реверсии.
3. Технической чистой культурой называется
1. чистая культура, размноженная до количества, достаточного для засева ферментатора;
2. культура микроорганизмов, размноженная до количества, достаточного для засева ферментатора и содержащая некоторое
количество посторонней микрофлоры;
3. культура микроорганизмов, размноженная до количества, достаточного для засева ферментатора и содержащая некоторое количество живых
клеток продуцента;
4. культура микроорганизмов, размноженная до количества, достаточного для засева инокулятора и содержащая некоторое количество посторонней микрофлоры.
4. Хранение в атмосфере жидкого азота осуществляется при
температурах:
1. от 00С до -100С;
2. от -165 до -196С;
3. от -16 до -19С;
66
4. от -50 до -96С.
5. Хранение культур при температурах от -11 до -14С осуществляется
в течение
1. 1-2 лет;
2. 8-10 месяцев;
3. 5-6 лет;
4. 10-16 месяцев.
6. Расход посевного материала при поверхностном культивировании
1. составляет 0,5-0,6% массы засеваемой питательной среды;
2. составляет 1-15% массы засеваемой питательной среды;
3. зависит от вида продуцента;
4. зависит от объема ферментатора.
7. Состав питательной среды определяется
1. количеством посевного материала;
2. свойствами продуцента;
3. выбранной технологией;
4. наличием компонентов для приготовления питательных сред.
8. Все продуценты ферментов усваивают углерод преимущественно
1. в виде двуокиси углерода;
2. в виде углеводородов;
3. в виде органических соединений;
4. в виде окиси углерода.
9. Синтетические среды состоят
1. из вполне определенных по количественному составу
индивидуальных веществ;
67
2. из химически чистых углеводов;
3. из химически чистых азотсодержащих соединений;
4. из неопределенных по химическому составу химических
соединений.
10. Отруби, мука различных злаков, меласса, гидрол, кукурузный экс
тракт, выжимки плодов и овощей, жмыхи, замочные воды, барда
спиртовых заводов служат компонентами
1. синтетических питательных сред;
2. сред для поверхностного культивирования;
3. комплексных питательных сред;
4. сред для глубинного культивирования.
11. Слипание клеток между собой называется
1. флотацией;
2. флокуляцией;
3. инокуляцией;
4. ферментацией.
12. «Факторами роста» называют
1. углеродсодержащие составляющие питательных сред;
2. азотсодержащие составляющие питательных сред;
3. витамины, нуклеотиды, ионы металлов;
4. аммонийные соли, амиды.
13. К синтетическим пеногасителям относятся
1. силиконы, пропинолы, контрамин, полиформаль и др.;
2. растительные масла;
3. рыбий жир;
4. растительные и животные масла.
68
14. Питательная среда при стерилизации разогревается до температуры
1. 1000 С;
2. 1200С при давлении в 1атм;
3. 128-135 0 С;
4. 160 -1700 С.
15. Культивирование продуцента в производственных условиях
называют
1. ферментацией;
2. инокуляцией;
3. стерилизацией;
4. тиндализацией.
16. При современном производстве чаще других применяется способ
культивирования
1. поверхностный непрерывный;
2. поверхностный периодический;
3. глубинный с различными модификациями;
4. периодический в инокуляторе.
17. Разновидности культивирования гомогенно-непрерывный и
градиентно-непрерывный характерны для способа
1. глубинного периодического;
2. глубинного непрерывного;
2. поверхностного периодического;
3. поверхностного непрерывного.
18. Градиентно-непрерывное (гетерогенно-непрерывное)
культивирование осуществляют
69
1. в батарее ферментеров, соединенных переточными трубами;
2. в двух ферментаторах, соединенных переточными трубами;
3. в одном ферментаторе при несменяемой среде;
4. в одном ферментаторе при постоянно сменяющейся среде.
19. В крупнотоннажном производстве поверхностное культивирование
продуцентов применяется для ращения
1. бактерий;
2. микромицетов;
3. дрожжей;
4. водорослей.
20. Неочищенную культуру микроорганизмов целесообразнее
использовать
1. при получении соков;
2. при получение пива и вина;
3. в спиртовой и кожевенной отраслях;
4. в хлебопечении.
Вопросы для выполнения рефератов по четвертому разделу
1. Получение посевного материала продуцентов ферментов.
2. Стерилизация питательных сред. Виды, режимы, технические средства.
3. Питательные среды для культивирования микроорганизмов глубинным
способом. Классификация, компоненты, приготовление.
4. Ферментация продуцентов. Виды, технические средства.
5. Очистка и выделение ферментов.
70
5. Иммобилизация ферментов
В клетках ферменты обычно находятся не в растворенной форме, а прикреплены к определенным структурам и локализованы в компартаментах. В
живых системах ферменты способны длительно работать без возобновления
и потери активности. Ферментные препараты достаточно нестабильные соединения: при воздействии ряда химических и физических факторов могут
инактивироваться. При применении ферментных препаратов очень часто
фермент после одноразового использования инактивируется, при этом обрабатываемый материал загрязняется препаратом. Эти обстоятельства породили проблему создания новых форм ферментных препаратов многократного
использования.
Наибольшее распространение получили препараты, в которых ферменты
в активной форме прикреплены к нерастворимой основе. Такие ферментные
препараты имеют в литературе различные названия: связанные, пришитые,
фиксированные, матрицированные, прикрепленные, но чаще всего их называют иммобилизированными.
Начало развития этого метода было положено в 1916 году, когда Дж.
Нельсон и Е. Гриффин адсорбировали на угле инвертазу (сахаразу) и показали, что она сохраняет в таком виде каталитическую активность. Сам термин
«иммобилизованные или иммобилизированные ферменты» узаконен в 1971
году, и означает любое ограничение свободы передвижения белковых молекул в пространстве.
Иммобилизированный ферментный препарат - это единая система,
которая состоит из трех частей: фермента, носителя и связывающего их звена. Сущность иммобилизации ферментов — прикрепление их в активной
форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембранную систему. Прикрепление фермента к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель (в капсулу и т. п.). При этом
допускается прикрепление фермента только за счет функциональных групп,
71
не входящих в активный центр фермента и не участвующих в образовании
фермент-субстратного комплекса.
Иммобилизированные ферменты по своим свойствам отличаются от нативных, поскольку в результате иммобилизации в той или иной мере изменяется пространственная структура белковой молекулы, при связывании фермента с носителем нарушается свободный доступ субстрата к активному центру или некоторые реакционноспособные группы активного центра используются для связывания фермента с носителем. Все это приводит к потере части активности фермента (от 10 до 90%), а также к некоторому уменьшению
скорости реакции.
Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ перед нативными предшественниками:
1. Гетерогенный катализатор легко отделим от реакционной среды, что
дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать
фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт.
2. Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных фер
ментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость
катализируемой реакции и выход продукта.
3. Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства,
такие как специфичность (особенно в отношении макромолекулярного
субстрата), зависимость каталитической активности от рН, ионного
состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим
воздействиям.
4. Можно регулировать каталитическую активность иммобилизован
ных ферментов путем изменения свойств носителя действием
физических факторов, таких как свет и звук. Иммобилизовать
ферменты можно как путем связывания на нерастворимых
носителях, так и путем внутримолекулярной или межмолекулярной
сшивки белковых молекул низкомолекулярными бифункциональ
ными соединениями, а также путем присоединения к растворимому
72
полимеру.
Все способы иммобилизации можно подразделить на две группы:
химические и физические.
Физические методы заключаются в связывании фермента без участия
ковалентных связей. Они подразделяются на два типа: адсорбционные и механические. При адсорбционной иммобилизации фермент удерживается на
поверхности носителя с помощью электростатических, гидрофобных, водородных связей. При механическом способе иммобилизации проводят включение фермента в гели, заключение их в микрокапсулы, волокна, мембраны и
т.д. Все физические методы иммобилизации достаточно просты, быстры и
эффективны.
Существует четыре типа связывания ферментов:
- адсорбция на нерастворимых носителях;
- включение в поры геля;
- пространственное отделение фермента от остального объема
реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки
(мембраны);
- включение в двухфазную среду, где фермент растворим, и может
находиться только в одной из фаз.
Перечисленные подходы проиллюстрированы на рис 5.1.
Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из существующих способов иммобилизации ферментов. Этот способ достаточно прост и
достигается при контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки не адсорбировавшегося белка иммобилизованный фермент готов к
использованию. Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности носителя может обеспечиваться за счет неспецифических ван-дерваальсовых взаимодействий, водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами
белка. Вклад каждого из типов связывания зависит от химической природы
73
носителя и функциональных групп на поверхности молекулы фермента. Взаимодействия с носителем могут оказаться настолько сильными, что сорбция
биокатализатора может сопровождаться разрушением его структуры. Например, при адсорбции некоторых растительных клеток на гранулах цитодекса
клеточная стенка деформируется, повторяя рельеф поверхности частиц носителя. Преимуществом метода адсорбционной иммобилизации является доступность и дешевизна сорбентов, выступающих в роли носителей. Им также
можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую пористость.
Важный фактор - простота применяемых методик. При адсорбционном связывании можно решить и проблему очистки фермента, так как связывание
белка с носителем во многих случаях достаточно специфическое. Прочность
связывания фермента с носителем не всегда достаточно высока, что ограничивает применение метода.
74
Рис. 5.1 Способы иммобилизации ферментов: а - адсорбция на нерастворимых носителях, б – включение в поры геля, в – отделение фермента с помощью полупроницаемой мембраны, г – использование двухфазной реакционной среды
Перспективным считается метод включения в гели. Суть этого метода
иммобилизации состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих гель.
Среднее расстояние между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного фермента, поэтому он не может покинуть полимерную
матрицу и выйти в окружающий раствор. Дополнительный вклад в удерживание фермента в сетке геля могут вносить также ионные и водородные связи
между молекулой фермента и окружающими ее полимерными цепями. Про75
странство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой обычно приходится значительная часть всего объема геля. Например,
широко применяемые гели полимеров акриловой кислоты в зависимости от
концентрации полимера и его природы содержат от 50 до 90% воды.
Для иммобилизации ферментов в геле существует два основных способа.
При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера, а затем
проводят полимеризацию, в результате чего образуется полимерный гель с
включенными в него молекулами фермента. В другом случае фермент вносят
в раствор готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в
гелеобразное состояние. Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гель позволяет создавать препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя. Метод универсален, применим для иммобилизации практически любых ферментов, полиферментных систем, клеточных
фрагментов и клеток. Фермент, включенный в гель, стабилен, надежно защищен от инактивации вследствие бактериального заражения, так как крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную
матрицу. В то же время, эта матрица может создавать значительные препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффективность иммобилизованного препарата, поэтому для высокомолекулярных
субстратов данный метод иммобилизации не применим вообще.
Общий принцип иммобилизации ферментов с использованием мембран
заключается в том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой перегородкой. Полупроницаемая мембрана легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но непреодолима для
крупных молекул фермента. Существующие модификации этого метода различаются лишь способами получения полупроницаемой мембраны и ее природой. Водный раствор фермента можно включать внутрь микрокапсул,
представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (микрокапсулирование). При двойном эмульгировании получа76
ется водная эмульсия из капель органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие капли водного раствора фермента.
Через некоторое время растворитель затвердевает, образуя сферические полимерные частицы с иммобилизованным в них ферментом. Если вместо водонерастворимого отвердевающего полимера используются жидкие углеводороды с высокой молекулярной массой, метод называется иммобилизацией
путем включения в жидкие мембраны. К модификациям метода иммобилизации ферментов с использованием полупроницаемых оболочек относятся
также включение в волокна (при этом вместо капель, содержащих ферменты,
получаются нити) и включение в липосомы. Применение систем мембранного типа позволяет получать иммобилизованные препараты с высоким содержанием фермента. Метод достаточно универсален, т.е. применим как к ферментам, так и к клеткам, а также их фрагментам. Благодаря высокому отношению поверхности к объему и малой толщине мембраны удается избежать
значительных диффузионных ограничений скорости ферментативных реакций. Основной недостаток мембранных систем - невозможность ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов.
При иммобилизации ферментов с использование систем двухфазного
типа ограничение свободы перемещения фермента в объеме системы достигается благодаря его способности растворяться только в одной из фаз. Субстрат и продукт ферментативного превращения распределяются между обеими фазами в соответствии с их растворимостями в этих фазах. Природа фаз
подбирается таким образом, что продукт накапливается в той из них, где
фермент отсутствует. После завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а фазу, содержащую фермент, вновь используют для
проведения очередного процесса. Одним из важнейших преимуществ систем
двухфазного типа является то, что они позволяют осуществлять ферментативные превращения макромолекулярных субстратов, которые невозможны
при применении жестких носителей с ограниченным размером пор.
Химические методы заключаются в ковалентном сшивании с полимер77
ным носителем и поперечном сшивании ковалентными связями молекул белка без носителя. Такие препараты стабильны, ферменты не вымываются. Существенным недостатком этого способа часто является значительная инактивация фермента (60-80%) в результате экранирования активного центра и
других причин.
Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между
белком и носителем. Препараты иммобилизованных ферментов, полученные
с применением химических методов, обладают, по крайней мере, двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем
обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При широком
варьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация
ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность.
Особое значение при иммобилизации имеют носители и сшивающие
агенты. К носителям предъявляются определенные требования: они должны
быть нерастворимы в реакционной среде, быть разнозаряженными с ферментом; иметь высокую гидрофильность; химическую, биологическую стойкость; механическую прочность; не вызывать неспецифической адсорбции и
сильных конформативных изменений молекулы белка; легко гранулироваться и активироваться.
78
Рис. 5.2 Классификация носителей для иммобилизованных ферментов
Носители для иммобилизации могут иметь зернистую структуру, могут
быть выполнены в виде волокон, пленок, полых трубок, мембран. Применяются как органические, так и минеральные носители. В качестве органических используют природные полисахаридные и белковые носители: целлюлоза, декстран, агароза, губчатый крахмал, хитин, коллаген, желатин, кератин
(белок из перьев), нерастворимый белок хлопчатника. Недостаток природных
полимеров - неустойчивость к воздействию микроорганизмов и довольно высокая стоимость.
Как заменители природных материалов используют синтетические полимерные носители: сополимеры стирола, дивинилбензола в форме гранул,
гели поливинилового спирта, а также на основе полиакриламида.
Наиболее часто для иммобилизации используются такие полисахариды,
как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Целлюлоза гидрофильна,
имеет много гидроксильных групп, что позволяет модифицировать её, замещая эти группы. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидролиза, в результате которого разрушаются
аморфные участки. На их место для сохранения пористости между кристаллическими участками вводят химические сшивки. Гранулированную целлюлозу довольно легко превратить в различные ионообменные производные,
такие как ДЭАЭ-целлюлоза, КМЦ и т.д.
79
Широко распространены носители на основе декстрана, выпускаемые
под названием «сефадексы». При высушивании они легко сжимаются, в водном растворе сильно набухают. В этих носителях размер пор в геле регулируется степенью сшитости. К группе декстранов относят и крахмал. Химически модифицированный крахмал сшивается агентами, такими как формальдегид. Таким способом был получен губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью по отношению к ферментам, гидролизу. Водорастворимые препараты на основе декстрана часто применяются как носители лекарственных средств в медицине.
Хорошим носителем считается агар-агар. Его свойства улучшаются после химической сшивки, например, диэпоксидными соединениями. Такой
агар-агар становится устойчивым к нагреванию, прочным, легко модифицируемым.
Белки в качестве носителей обладают рядом достоинств: вместительны,
способны к биодеградации, могут применяться в качестве тонкой (толщиной
80 мкм) мембраны. Иммобилизацию ферментов на белковых носителях можно проводить как в отсутствие, так и в присутствии сшивающих агентов.
Белки используются и в фундаментальных биологических исследованиях, и в
медицине. К недостаткам белков в качестве носителей относят их высокую
иммуногенность (за исключением коллагена и фибрина). Наиболее часто для
иммобилизации используются структурные (кератин, фибрин, коллаген),
двигательные (миозин) и транспортные (альбумин) белки.
Синтетические полимерные носители применяются для ковалентной и
сорбционной иммобилизации ферментов, для получения гелей, микрокапсул.
Полимеры на основе стирола применяются в сорбционной иммобилизации.
Они могут иметь макропористую, изопористую структуру, а также гетеропористую структуру. Для получения полимерных гидрофильных носителей
широко используется акриламид - производное акриловой кислоты.
Широкое распространение получил метод включения ферментов и клеток в полиакриламидный гель, имеющий жесткую пространственную сетча80
тую структуру. Полиакриламидный гель устойчив к химическим воздействиям. Очень интересную группу представляют полиамидные носители. Например, полимеры на основе N-винилпирролидона используются для получения
иммобилизованных ферментов, способных медленно распадаться в организме. Кроме того, они биологически инертны, что особенно важно при использовании в медицинских целях. Существенным недостатком большинства полимерных носителей является их способность накапливаться в организме. В
этом отношении предпочтение отдается природным полимерам, которые
гидролизуются ферментами. Поэтому в состав лекарственных препаратов часто входит декстран, а из синтетических носителей - полимеры на основе Nвинилпирролидона. В настоящее время ведутся эксперименты по созданию
синтетических полимеров, расщепляющихся с образованием нетоксичных
продуктов обмена.
В группу неорганических носителей входят: синтетические кремнеземные сорбенты, металлы и их оксиды, нержавеющая сталь, различные виды
глин, керамики и природные минералы, песок, активированный уголь. Эти
носители легко регенерируются, им можно придавать любой вид, они достаточно дешевы, удобны в работе.
В качестве сшивающих агентов чаще всего на практике используют глутаровый альдегид, изоксалевые соли, галогенцианы, -аминопропилтриэтоксилан, изоцианиды, карбодиимиды, ненасыщенные сульфоны и др.
В настоящее время разработаны методы иммобилизации большинства
промышленных ферментов.
Задания для самоконтроля
1. В клетках ферменты обычно находятся
1. в свободном состоянии и растворены в цитозоле;
2. в свободном состоянии находятся в основном гидролазы,
остальные адсорбированы;
3. в свободном состоянии находятся цитохромы;
81
4. прикреплены к определенным структурам и локализованы в
Компартаментах.
2. Сущность иммобилизации ферментов заключается в
1. прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе или
заключение в полупроницаемую мембранную систему;
2. инактивации ферментов при высокой температуре;
3. растворении фермента в цитозоле;
4. адсорбции фермента на легко растворимом носителе.
3.Иммобилизация ферментов приводит
1. к повышению активности ферментов;
2. к денатурации фермента;
3. к образовании мультиферментных комплексов, что приводит
к резкому повышению активности;
4. к потере части активности фермента (от 10 до 90%), а также
к некоторому уменьшению скорости реакции.
4. Физические методы иммобилизации ферментов заключаются
1. в связывании фермента без участия ковалентных связей;
2. в связывании фермента с участием ковалентных связей;
3. в облучении ферментов лучами различной длинны, что
приводит к активации ферментов;
4. в обработке ферментов высокими температурами.
5.Физические методы иммобилизации подразделяются на два типа:
1. адсорбционные и механические;
2. связывания на мембранах и заключение в гели;
3. гранулирование и включение в микрокапсулы;
4. механические и ковалентные.
82
6. В качестве органических носителей при иммобилизации используют
природные полисахаридные и белковые вещества:
1. сополимеры стирола, дивинилбензола в форме гранул, гели
поливинилового спирта и на основе полиакриламида;
2. целлюлозу, декстран, агарозу, губчатый крахмал, хитин,
коллаген, желатин, кератин (белок из перьев), нерастворимый
белок хлопчатника;
3. глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу, фумарозу и другие
оликосахариды;
4. инулин, гликоген, крахмал, целлюлозу, гемицеллюлозу,
пектиновые вещества.
7. В качестве сшивающих агентов чаще всего на практике используют:
1. целлюлозу, декстран, агарозу, губчатый крахмал, хитин, коллаген,
желатин, кератин (белок из перьев), нерастворимый белок
хлопчатника;
2. оксиды металлов, оксиды азота, перикись водорода;
3.глутаровый альдегид, изоксалевые соли, галогенцианы,
-аминопропилтриэтоксилан, изоцианиды, карбодиимиды,
ненасыщенные сульфоны;
4.отрицательно и положительно заряженные ионы, гидроксил – ион.
8. Носители на основе декстрана выпускаются под названием
1.сефадексы;
2.сульфанолы;
3.сульфорафаны;
4.декстрины.
9. В группу неорганических носителей входят:
83
1. оксиды металлов, оксиды азота, перекись водорода;
2. глутаровый альдегид, изоксалевые соли, галогенцианы,
-аминопропилтриэтоксилан, изоцианиды, карбодиимиды,
ненасыщенные сульфоны;
3. инулин, гликоген, крахмал;
4. синтетические кремнеземные сорбенты, металлы и их оксиды,
нержавеющая сталь, различные виды глин, керамики и природные
минералы, песок, активированный уголь.
10. Главным отличительным признаком химических методов
иммобилизации является то,
1. что путем химического взаимодействия на структуру фермента
в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности
между белком и носителем;
2. что активный центр фермента остается не задействованным и
легко доступен для контакта с субстратом;
3. что химические взаимодействия возникают, только если
носителем является заряженный белок;
4. что это самый простой, дешевый и доступный способ
иммобилизации ферментов.
Вопросы для выполнения рефератов по пятому разделу
1. Сущность иммобилизации ферментов, способы и виды
иммобилизации.
2. Применение иммобилизованных ферментов.
3. Характеристика носителей, применяемых при иммобилизации.
4. Свойства иммобилизованных ферментов.
84
6. Ферментные препараты и их номенклатура
Микроорганизмы синтезируют одновременно комплекс ферментов, но
некоторые, особенно мутантные штаммы, продуцируют один фермент в значительных количествах. При определении названия ферментного препарата
учитывают только основной фермент, активность которого в препарате превалирует. Название препарата образуется из сокращенного названия этого
фермента, вида микроорганизма-продуцента и оканчивается во всех случаях
на “ин”. Например, если продуцентом фермента глюкоамилазы является
плесневый гриб Aspergillus awamori, то препарат называется глюкаваморин.
Для препарата, полученного глубинным культивированием, после названия
ставится буква “Г”, при поверхностном - “П”.
Условно количество фермента в стандартной глубинной или поверхностной культурах обозначается буквой “х”. Под стандартной культурой понимается готовая культура продуцента, обладающая строго определенной активностью на единицу массы.
Цифры перед буквой “х” в наименовании препарата показывают степень
очистки фермента:
Пх и Гх - стандартная исходная культура продуцента без какой-либо
очистки;
П2х и Г2х - жидкий концентрат растворимых веществ исходной культуры, освобожденный от нерастворимой фазы, с содержанием сухих веществ
40-50%;
П3х и Г3х - сухие ферментные препараты, полученные высушиванием
экстракта из поверхностной культуры или культуральной жидкости при глубинном культивировании;
П10х и Г10х - сухие препараты, полученные осаждением ферментов из
водных растворов органическими растворителями или высушиванием;
П15х и Г15х; П18х и Г18х; П20х и Г20х - препараты ферментов, очищенных различными методами;
П25х и Г25х - высокоочищенные, но не кристаллические ферментные
85
препараты, содержащие до 20-25% балластных веществ.
Потребитель должен получать препараты с определенной стандартной
активностью. Стандартная активность - количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин. при заданных регламентированных условиях. Международной комиссией по ферментам рекомендовано придерживаться следующих условий: температура 30С; определять активность по начальной скорости реакции; концентрация субстрата, фермента
и pH оптимальные для данного фермента.
На русском и немецком языках эта единица обозначается буквой “Е”, на
английском, французском, итальянском и испанском - “U”.
Для получения постоянной активности в препараты вводят наполнитель
в определенном количестве. Наполнитель подбирается так, чтобы он выступал и в роли стабилизатора ферментов. Известно, что хорошим стабилизатором амилолитических ферментов является крахмал; пектолитических - крахмал, хлористый натрий, диатомит, желатин, бентонит. Выбор наполнителя и
стабилизатора, определение дозировки, необходимых условий хранения и
длительности сохранения активности осуществляются экспериментально.
Содержание фермента в данном препарате условно выражают в стандартных
единицах активности фермента на 1 мл ферментного раствора или 1 г препарата. Активность ферментного препарата выражается в микромолях субстрата, прореагировавшего в присутствии 1 мл ферментного раствора или 1 г
препарата в заданных условиях за 1 мин. Число микромолей и будет равно
числу стандартных единиц.
Задания для самоконтроля
1. При определении названия ферментного препарата учитывают
1. два фермента, активность которых максимальна;
2. родовое название продуцента;
3. только основной фермент, активность которого в препарате
превалирует;
86
4. термостабильность продуцента.
2.Буквы «П» и «Г» в названии ферментного препарата означают
1. способ очистки;
2. способ культивирования;
3. способ стерилизации питательной среды;
4. способ хранения посевного материала.
3. Цифры перед буквой “х” в наименовании препарата показывают
1. степень очистки фермента;
2. способ очистки фермента;
3. активность ферментного препарата;
4. номер мутантного штамма, используемого при ферментации.
4. Стандартная активность ферментного препарата – это
1. количество субстрата, превращаемого ферментом в единицу
времени;
2. количество фермента, которое катализирует превращение
1 мкмоль субстрата в 1 мин. при заданных регламентированных
условиях;
3. количество грамм субстрата, необходимое для максимальной
активности фермента в заданных условиях;
4. количество фермента, превращающего 1 г субстрата в конечный
продукт при заданных условиях.
5. Международной комиссией по ферментам рекомендовано определять
стандартную активность фермента при
1. 45С;
2. 30С;
3. 25С;
87
4. 15С.
Вопросы для выполнения рефератов по шестому разделу
1. Стандартизация ферментных препаратов.
2. Получение очищенных ферментных препаратов.
3. Получение сухих ферментных препаратов.
88
7. Применение ферментов в пищевой и перерабатывающей
промышленностях
Амилолитические препараты широко выпускаются в нашей стране и за
рубежом и находят применение почти во всех областях, где перерабатывается крахмалосодержащее сырье. Самым большим потребителем амилолитических ферментов являются спиртовая и пивоваренная промышленности, где
солод успешно заменяется амилолитическими препаратами микробиологического синтеза. Эти препараты используются в хлебопечении, а также в крахмалопаточном производстве для получения различных видов паток, глюкозы
и глюкозо-фруктозных сиропов. Амилазы используются для улучшения качества концентратов и быстро развариваемых блюд. К амилазам относятся
ферменты разжижающего, декстринирующего и осахаривающего воздействия на крахмал.
В настоящее время для получения амилаз, преимущественно используется глубинный способ культивирования продуцентов Aspergillus orizae,
Aspergillus usamii, Aspergillus batatae, Bacillus subtilis. На спиртовых заводах
наиболее широко культивируется микромицет Aspergillus awamori ВУД –Т-2.
Микроорганизмы синтезируют - и - амилазы, расщепляющие -1,4гликозидные связи в молекулах амилазы и амилопектина; глюкоамилазы, катализирующие распад как -1,4, так и -1,6-гликозидных связей; пуллуланазу, гидролизующую -1,6-связи в пуллунане, амилопектине, гликогене и др.
Свойства микробных амилаз весьма разнообразны. Существуют множественные формы одного и того же фермента (изоформы). Проведенные во
ВНИИПБТ исследования показали, что совместное действие -амилазы,
глюкоамилазы и поллуланазы повышает степень и скорость гидролиза крахмала при производстве спирта.
Перспективным для спиртового производства является термостабильная
-амилаза, продуцируемая Bacillus licheniformis. Оптимальная температура
действия фермента 85-900 С, рН 6,0-7,0. Полученный во ВНИИПБТ препарат
89
амилолихетерм наряду с термостабильной амилазой содержит ферменты
протеолитического действия.
Пектолитические препараты находят большое применение для переработки плодов, ягод и овощей. Применение этих препаратов позволяет резко
повысить сокоотделение при производстве осветленных соков, особенно из
плодов и ягод с повышенным содержанием пектина: слива, алыча, абрикос,
персик, груша. Выход сока увеличивается на 5-25% с единицы перерабатываемого сырья, что дает очень высокий экономический эффект. При изготовлении соков с мякотью с помощью пектолитических ферментов можно снять
нежелательный желирующий эффект, который не позволяет получать концентрированные жидкие соки из-за высокого содержания пектина. В виноделии данные препараты используются для увеличения выхода сока и интенсивности окраски. Используется и мацерирующее свойство пектиназ для
размягчения ткани плодов и овощей, что повышает их усвояемость.
В промышленном масштабе пектолитические препараты получают в основном из Aspergillus foetidus и Aspergillus awamori при поверхностном способе культивирования и из Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Clostridium
pectinofermentans - при глубинном.
Микроорганизмы синтезируют комплекс пектолитических ферментов,
зависящий от вида продуцента, состава среды и условий культивирования. В
него входят пектинэстеразы, омыляющие сложные эфирные связи в пектине
и пектиновой кислоте и полигалактуроназы, осуществляющие гидролитическое расщепление -1,4-гликозидных связей в цепи пектиновых веществ.
Степень очистки ферментов определяется областью их применения, чаще всего это 3х и 10х (пектоклостридин Г3х и Г10х).
Целлюлолитические препараты находят широчайшее применение в самых разных отраслях производства. В связи с ростом народонаселения Земли
и активным поиском источников пищевых ресурсов на основе непищевого
сырья и новых источников энергии возрос интерес к целлюлозосодержащему
сырью, возобновляемые запасы которого почти безграничны. Гидролиз цел90
люлозы дает глюкозу, которую можно использовать для производства пищевых и кормовых белковых препаратов, получать из нее спирт для энергетических целей. а также она может стать исходным продуктом для производства
глюкозо-фруктозных сиропов. Целлюлолитические ферменты с успехом
применяют в самых различных производствах (спиртовом, пивоваренном,
пищеконцентратном, хлебопечении, кормопроизводстве), где сырьем являются растительные материалы или отходы переработки растений. Использование целлюлаз повышает выход целевого продукта и позволяет подойти к
созданию безотходных технологий.
При использовании в спиртовом производстве ржи и ячменя – сырья, характеризующегося повышенным содержанием целлюлозы, гемицеллюлозы и
гумми-веществ, замесы получаются очень вязкими, что затрудняет атакуемость крахмала амилолитическими ферментами. Поэтому для деструкции
трудно гидролизуемых высокомолекулярных соединений растительного сырья используют ферментативные комплексы, содержащие целлюлазы, ксиланазы и др. Такие комплексы снижают вязкость сусла, повышают доступность крахмала к действию амилаз, способствуют улучшению технологических показателей брожения, повышению выхода этанола.
Целлюлазы активно синтезируются анаэробными бактериями рода
Clostridium и микромицетами рода Trichoderma, которые и используются в
промышленном масштабе. Получают ферменты чаще поверхностным способом. Эти препараты дешевы и содержат значительные количества сопутствующих гидролитических ферментов: амилазы, протеазы, пектиназы, гемицеллюлазы. Культивирование глубинным способом находится в стадии
разработки.
Получаемый целлюлазный комплекс очень сложный и пока изучен недостаточно, поэтому нет установившейся технологии по получению определенных индивидуальных ферментов этого комплекса.Для получения очищенных препаратов целлюлаз используют комбинацию самых различных
приемов: фракционирование, осаждение, хроматографию на молекулярных
91
ситах, электрофорез и др.
Гемицеллюлазные ферментные препараты с успехом применяются в
спиртовом и пивоваренном производствах. Эффект от применения этих препаратов заключается в том, что они позволяют повысить выход ряда продуктов без дополнительных затрат за счет появления дополнительных резервов
сахаров в обрабатываемом сырье в результате гидролитического расщепления гемицеллюлаз. С помощью этих ферментов можно получать глюкозу,
пентозы, которые могут использоваться для производства кормовых белков,
ксилита, фурфурола, этанола, биогаза и других продуктов.
Продуцентами гемицеллюлаз являются в основном грибы родов
Trichoderma, Trichothecium, Penicillum, Aspergillus, бактерии Bacillus subtilis.
Культивируют продуценты как поверхностным, так и глубинным способами.
Препараты гемицеллюлаз можно получать путем осаждения органическими
растворителями, нейтральными солями и при использовании различных видов хроматографии. Чаще всего используются препараты Пх и Гх, и П10х и
Г10х.
Липолитические препараты представляют большой интерес для многих
отраслей народного хозяйства, где необходим частичный или полный гидролиз жиров и масел.
В настоящее время липазы микробного происхождения вытесняют с
рынка животные липазы. Они используются при приготовлении сыров, изготовлении глицерина, жирных кислот, моно- и диглицеридов, при выделке
мехов и кож. Использование липаз в кожевенной промышленности позволяет
легко удалять липиды, придавая коже эластичность и мягкость, а мехам натуральный блеск и высокое качество структуры. Важна перспектива использования липаз для очистки сточных вод от жиров.
Липолитические препараты могут быть получены на основе трех источников: животные ткани, семена некоторых растений и микроорганизмы. Среди бактерий наиболее активными продуцентами являются бактерии родов
Pseudomonas, Bacillus, Propionibacterium, Acinetobacter и др, дрожжи рода
92
Condida, плесневые грибы родов Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Penicillum и
др. В основном применяют глубинное культивирование.
В мире мало выпускается высокоочищенных липолитических препаратов, чаще всего они выпускаются в виде комплексных препаратов, содержащих помимо липаз протеазы, амилазы, и, иногда, целлюлазу и пектиназу.
Липолитические препараты выпускаются в США, Японии, Германии, Франции, Нидерландах. В нашей стране осваивается промышленная технология
производства липаз.
Протеолитические препараты выпускаются промышленностью в большом количестве, это крупнотоннажное производство. Протеиназы применяются в пищевой технологии, где идет процесс с использованием микроорганизмов. Введение в процесс протеиназ позволяет в результате гидролиза белков обрабатываемого сырья обеспечить микроорганизмам нормальные условия жизнедеятельности, что улучшает весь технологический процесс, особенно в пивоварении, спиртовой промышленности, виноделии.
В последнее время все больше появляется сведений о возможности получения растворимых форм кератинов пера, рогов, копыт, шерсти пр действии на них специально подобранных ферментов. В результате получают
эффективные добавки для косметических средств, заменители яичного белка
для кондитерской промышленности, серосодержащие пищевые добавки.
В технологии переработки рыбы с целью получения гидролизатов в качестве основы для супов, заправок, подливок из нестандартной рыбы успешно применяют биокаталитические процессы.
В молочной промышленности продолжаются исследования по получению и применению заменителей сычужного фермента, пепсинов. Ферментативный гидролиз белков используется при осветлении мелассы и молочного
концентрата в технологии молочного сахара лактозы с целью повышения
биологической ценности напитков и продуктов из сыворотки.
Протеолитические ферменты используются в хлебопечении для уменьшения длительности замесов при производстве заварных сортов хлеба и спе93
циальных изделий, изготовляемых из муки с сильной клейковиной. Внесение
в тесто небольших количеств амилаз и протеиназ увеличивает аромат, цвет
корочки и мякиша, позволяет сократить процесс тестоведения. Широко применяются протеиназы для снятия различного рода белковых помутнений в
пивоварении и виноделии и для ускорения фильтрационных процессов, для
мягчения (тендеризации) мяса, мясных изделий, рыбы, что облегчает и ускоряет обработку полупродуктов, повышает их качество. В состав мяса и мясопродуктов входят простые и сложные белки, в том числе водо-, соле-, и щелочерастворимые, обеспечивающие такие важные функции, как удержание
воды, набухаемость, растворимость, а также характеризующиеся способностью к гидролизу, денатурации и другим превращениям. С целью ускорения
процессов, происходящих при автолизе мяса, в реальных технологиях все
чаще применяют ферментные препараты, обладающие протеолитической и
коллагеназной активностями. Введение ферментных препаратов в мясные
системы проводят на различных этапах переработки в зависимости от характеристик препарата. Широко испытывается и применяется в производстве
Протепсин® — энзимный препарат животной природы, содержащий комплекс кислых протеиназ, предназначен для применения в мясной промышленности для обработки мясного сырья. Ферментный состав препарата сбалансирован по степени воздействия на различные белки мяса и мясных систем, применяющихся в технологии получения мясных продуктов. Протепсин работает в мясной системе аналогично внутриклеточным ферментам
(катепсинам). Он является их синергистом и обладает дополнительными качествами, которые позволяют ему воздействовать в более широком диапазоне технологических параметров, а также влиять на те белковые системы, на
которые внутриклеточные ферменты не действуют или оказывают действие в
незначительной степени. Введение протепсина в мясную систему повышает
водосвязывающую способность и гидратацию белков за счет их взаимодействия с активными центрами энзимов. Это приводит к разрыхлению структуры белков, увеличению иммобилизованной влаги в мясе и степени пенетра94
ции. При использовании протепсина потери веса мясной системы при тепловой обработке уменьшаются. При производстве мясопродуктов протепсин
применяют в количестве 0,015–0,005 % к массе продукта.Протепсин представляет собой порошок светло-серого цвета.
Высокоочищенные протеолитические ферменты с успехом используются в крахмалопаточной промышленности для выделения особенно чистого
крахмала без сопутствующих белков. Комплексные ферментные препараты,
содержащие протеиназы, используются в пищеконцентратной и консервной
промышленностях при приготовлении концентратов из трудноразвариваемых круп, гороха, фасоли. Самая большая потребность в протеолитических
ферментах связана с их использованием в составе синтетических моющих
средств (СМС). Протеиназы различной степени очистки применяются в качестве лекарственных препаратов для регулирования процессов свертывания
крови, при лечении воспалительных процессов, для восполнения недостатка
ферментов в организме.
В промышленных целях, как источник получения протеиназ, используются животные ткани, растения и микроорганизмы. Животными тканями для
получения протеиназ являются поджелудочная железа и слизистые оболочки
желудка. Из растений промышленный интерес представляют плоды дынного
дерева (папайи), побеги и листья инжира и отходы переработки ананасов.
Среди микроорганизмов сотни видов, относящихся к различным таксономическим группам, способны синтезировать протеиназы. Чаще других в промышленности
используются
роды
Bacillus,
Aspergillus,
Penicillum,
Streptomyces, Pseudomonas и др. В настоящее время протеиназы в большинстве случаев получают при культивировании продуцента в глубинных условиях. В нашей стране наиболее широко применяются штаммы бактерий
Bacillus subtilis и Bacillus mesentericus, на основе которых выпускаются препараты протосубтилин и протомезентерин разной степени очистки, предназначенные для самых различных отраслей.
Препараты глюкозооксидазы и каталазы необходимы для удаления из
95
продуктов глюкозы и кислорода. При приготовлении яичного порошка или
мясных изделий в высушенном состоянии происходит потемнение готового
продукта в связи с образованием меланоидов при высокой температуре (соединения глюкозы со свободными аминокислотами). Обработка продукта перед сушкой глюкозооксидазой позволяет перевести глюкозу в глюконовую
кислоту, что исключает образование повышенной цветности в сухом продукте. Чаще эти ферменты используются в виноделии, пивоварении, консервной
промышленности, при изготовлении соков, безалкогольных напитков для
удаления кислорода, что способствует повышенной стойкости продуктов к
длительному хранению и сохранению цветности продукта.
Введение ферментов в напитки в момент их укупорки позволяет полностью удалить из продукта и воздушного объема кислород, что сильно замедляет процесс окисления различных соединений и делает невозможным развитие микроорганизмов.
Ферменты вводятся в состав смеси, наносимой на пергаментную бумагу
для упаковки масла, сыра, мяса, муки, круп, майонеза, молока и других продуктов. Влага, выделяемая из продуктов, растворяет фермент, буферные соли, глюкозу и кислород, находящийся в воздушном пространстве между маслом и пергаментом, расходуется на окисление глюкозы и полностью потребляется. В такой атмосфере продукты могут храниться дольше без порчи.
Источником этих ферментов являются микроскопические грибы рода
Penicillum, реже Aspergillus. В последние годы для культивирования используют исключительно глубинный способ.
Препараты глюкозоизомеразы. Производство препаратов глюкозоизомеразы вызвано необходимостью постоянно расширять объемы выпуска сахаристых веществ для пищевых целей. В среднем потребление сахара на душу
населения составляет около 40 кг в год. Население планеты растет, а возможности расширять площади для возделывания традиционных источников сахара (свеклы и тростника) небезграничны.
Один из путей решения этой проблемы - создание углеводов, эквива96
лентных по сладости сахарозе. Полноценным заменителем сахарозы может
служить инвертный сахар, который можно получить из крахмала путем последовательной обработки его ферментами.
На первом этапе крахмал гидролизуется до глюкозы. Но глюкоза уступает по сладости сахарозе, поэтому, вторым этапом является обработка гидролизата крахмала глюкозоизомеразой, превращающей 45-50% глюкозы во
фруктозу. Сладость полученного глюкозо-фруктозного сиропа (ГФС) близка
к сахарозе. В странах Европы и США в ближайшее время 50% потребности в
сахаристых веществах будет удовлетворяться за счет производства ГФС.
Для производства глюкозоизомеразы в прмышленности в основном используют микроорганизмы, относящиеся к родам Streptomyces, Aerobacter и
Lactobacillus.
Данный фермент является внутриклеточным, поэтому при его производстве целевым продуктом является биомасса продуцента, а не жидкая фаза.
Все препараты глюкозоизомеразы, производимые в мире, достаточно
стабильны, дешевы и способны конкурировать по экономическим показателям с тростниковым и свекловичным сахаром.
Задания для самоконтроля
1. В настоящее время для получения амилаз, преимущественно
используется
1. глубинный способ культивирования продуцентов Aspergillus orizae, Aspergillus usamii, Aspergillus batatae, Bacillus subtilis;
2. поверхностный способ культивирования продуцентов Aspergillus
orizae, Aspergillus usamii, Aspergillus batatae, Bacillus subtilis;
3. глубинный способ культивирования продуцентов Bacillus, Aspergillus, Penicillum, Streptomyces, Pseudomonas;
4. поверхностный способ культивирования продуцентов Bacillus, Aspergillus, Penicillum, Streptomyces, Pseudomonas.
97
2.Пектолитические препараты находят большое применение
1. при получении спирта;
2. при тендеризации мяса и рыбы;
3. для переработки плодов, ягод и овощей;
4. при получении кисло-молочных продуктов.
3. Для производства глюкозоизомеразы в прмышленности в основном
используют микроорганизмы, относящиеся к родам
1. Streptomyces, Pseudomonas;
2. Bacillus, Aspergillus, Penicillum;
3. Penicillum, Streptomyces;
4. Streptomyces, Aerobacter, Lactobacillus.
4. Препараты глюкозооксидазы и каталазы необходимы
1. для удаления из продуктов глюкозы и кислорода;
2. для получения глюкозо-фруктозных сиропов;
3. для тендерезации мяса;
4. для гидролиза крахмала.
5.Наиболее активными продуцентами липолитических ферментов
являются
1. плесневые грибы Aspergillus orizae, Aspergillus usamii, Aspergillus
batatae, Bacillus subtilis;
2. представители родов Bacillus, Aspergillus, Penicillum,
Streptomyces, Pseudomonas;
3. бактерии родов Pseudomonas, Bacillus, Propionibacterium,
Acinetobacter и др, дрожжи рода Condida, плесневые грибы родов
Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Penicillum;
4. бактерии родов Clostridium, Streptomyces, Pseudomonas.
98
Вопросы для выполнения рефератов по седьмому разделу
1. Характеристика ферментных препаратов, применяемых для получения
соков.
2. Характеристика ферментных препаратов, применяемых для получения
вина и пива.
3. Молокосвертывающие ферментные препараты. Получение, применение.
4. Применение протеолитических препаратов в пищевой промышленности.
5. Механизм действия и применение амилолитических препаратов.
6. Перспективы использования липолитических ферментов.
7. Использование ферментных препаратов, обладающих инвертазной
активностью.
Глоссарий
Алкалофилы - микроорганизмы, приспособившиеся развиваться в щелочной
среде.
Аллостерическая регуляция - регуляция активности фермента, осуществляемая эффекторной молекулой, которая связывается с участком в молекуле
фермента, удаленным от активного центра (аллостерическим центром).
Аллостерические ферменты - ферменты, изменяющие свою активность в
результате присоединения к их регуляторному (аллостерическому) центру
вещества-эффектора.
Амилазы - ферменты, катализирующие гидролиз крахмала.
Аминокислоты заменимые - аминокислоты, синтезирующиеся в организме
в достаточном количестве из незаменимых аминокислот или других соединений.
Аминокислоты полузаменимые - синтезируются в организме, но не в достаточном количестве, поэтому они должны поступать с пищей: аргинин, тирозин, гистидин (в организме детей вообще не синтезируется).
Аминокислоты незаменимые - не могут синтезироваться организмом человека и животных из других соединений: Валин, лейцин, изолейцин, треонин,
метионин, лизин, фенилаланин и триптофан.
99
Антибиотики - специфические соединения (вторичные метаболиты), способные в незначительных количествах избирательно задерживать рост или
убивать микробов. Термин введен в науку З.А. Ваксманом (1942). Синтезируются актиномицетами, бациллам, бактериями, плесневыми грибами, растениями и животными.
Антиген - чужеродное для организма сложное органическое вещество (белок, липид, нуклеопротеид, полисахарид др.), которое при попадании в организм вызывает в нем образование антител и изменяет его иммунологическую реактивность. В качестве антигена может выступать как свободное вещество, так и расположенное на поверхности вирусов и микробных клеток
вещество.
Антитела - белки, вырабатываемые иммунной системой для связывания и
обезвреживания несвойственных организму веществ и клеток.
Вторичный метаболит- вещество, не являющееся обязательным для роста или
функционирования клетки, но синтезирующееся в стационарной фазе (обычно участвует в защите клеток или микроорганизмов от тех или иных воздействий).
Ацидофилы - микроорганизмы, живущие в кислой среде.
Белково-витаминный концентрат (БВК)- белковый концентрат из кормовых дрожжей.
Белково-витаминная паста - белковый коагулят, образующийся в процессе
ферментации растительного сока.
Белок одноклеточных организмов (БОО) - белок, представляющий собой
высушенные клетки микроорганизмов (водорослей, актиномицетов, бактерий, дрожжей, плесневых грибов).
Биобезопасность - состояние защищенности человека, общества, цивилизации и окружающей среды от вредного, опасного для жизни и здоровья человека воздействия токсических и аллергенных биологических веществ и со100
единений, содержащихся в природных или генноинженерномодифицированных биологических объектах и полученных из них продуктах.
Биогаз - газ, образующийся в результате анаэробного брожения субстрата.
Состоит в основном из метана (до 60%),углекислого газа (35-40%) и незначительного количества других газов: сероводорода и водорода
( до 2%).
Биогенез - образование органических соединений живыми организмами.
Биодеградация - превращение вредных органических отходов в безвредные
при помощи микроорганизмов.
Биоконверсия - получение полезных веществ (биогаза, спирта, микробного
белка и др.) из органических отходов при помощи микроорганизмов.
Биоконтроль - процесс, в котором используются живые организмы для
ограничения роста и развития патогенных микроорганизмов.
Биомасса - общая масса особей одного вида, группы видов или сообщества в
целом на единицу поверхности или объема места обитания.
Биопрепараты - препараты и продукты, получаемые микробиологическим
синтезом. Подразделяются на три группы: биопрепараты, содержащие в своем составе живые микроорганизмы (закваски, бакудобрения и тд.); биопрепараты, содержащие инактивированную биомассу; биопрепараты, получаемые на основе очистки продуктов метаболизма микробов.
Биотехнология - наука о генно-инженерных и клеточных методах и технологиях использования генетически трансформированных (модифицированных) растений, животных, микроорганизмов и вирусов в целях интенсификации производства и получения новых видов продуктов различного назначения.
Биофильтры - сооружения для биологической очистки сточных вод. Представляет собой резервуар с двойным дном, наполненный фильтрующим материалом.
Биоэнергетика - раздел науки о закономерностях преобразования энергии в
процессах жизнедеятельности организмов.
101
Вектор - самореплицирующаяся (автономная) молекула ДНК, используемая
в генной инженерии для переноса генов и других последовательностей от организма-донора в организм-рецепиент, а также для клонирования нуклеотидных последовательностей.
Время генерации - время, за которое в популяции одноклеточных микроорганизмов удваивается число клеток. Называется также временем удвоения.
Вироиды - инфекционные агенты, представленные низкомолекулярной
кольцевой одноцепочечной РНК.
Галлофилы - микроорганизмы, которые могут жить при очень высоких концентрациях соли (20% и более).
Генетический риск - возможность проявления непредсказуемых, опасных
для здоровья и жизни человека и для окружающей среды наследственных
изменений генома и качества организма.
Генная инженерия - раздел биотехнологии, цель которого - направленное
создание организмов с заданными свойствами на основе рекомбинации их
генотипа.
Гибридома - клеточный гибрид, получаемый слиянием нормального лимфоцита, продуцирующего антитела, и опухолевой клетки; обладает способностью синтезировать моноклональные антитела.
Добавки пищевые - химические средства (консерванты, отбеливатели, загустители, осветлители, кислоты, ароматизаторы, вкусовые вещества, красители, эмульгаторы, антиокислители, стабилизаторы, ферментные препараты),
которые добавляют в продукты питания на разных этапах технологической
переработки.
Дезоксирибозим - молекула ДНК, обладающая каталитической активностью.
Деструкция-разрушение вещества, сопровождаемое потерей его физиологи102
ческой активности.
Жизнеспособность - устойчивость организма к изменению целого ряда факторов среды.
Зеин - растительный белок из группы проламинов. Накапливается в семенах
кукурузы, не содержит остатков глицина и лизина.
Изолейцин - незаменимая аминокислота, входящая в состав белка; проявляет
гидрофобные свойства.
Инсулин - гормон, вырабатываемый поджелудочной железой; увеличивает
проницаемость жировых и мышечных клеток для глюкозы, снижая тем самым содержание ее в крови. Недостаток инсулина или полная невозможность
его выработки приводит к сахарному диабету.
Интерфероны - группа белков, образующихся в клетках при вирусных инфекциях и обеспечивающих неспецифический противовирусный иммунитет.
In vitro - выращивание живого материала «в стекле», на искусственных питательных средах, в стерильных условиях.
In vivo - выращивание живого материала в естественных условиях.
Катал - единица количества фермента, которое катализирует превращение 1
мкмоль субстрата в течение 1 мин при стандартных условиях действия фермента или образование 1 мкмоль продукта.
Клеточная селекция - методы выделения генетически модифицированных
мутантных клеток и самоклональных вариаций с помощью селективных
условий.
Клон - (от греч. klon- ветвь, побег) – совокупность клеток или особей, произошедших от общего предка путем бесполого размножения.
Клональное микроразмножение - получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному растению.
103
Клонирование - точное воспроизведение живого объекта в одной или нескольких копиях.
Кормовые витаминные препараты - промышленные кормовые препараты,
обогащенные витаминами.
Кормовые дрожжи - отселектированные штаммы дрожжей, используемые
для промышленного получения кормовых белков.
Ксенобиотик - соединение, полученное искусственным путем, а не синтезированное живым организмом.
Культура микроорганизмов или клеток - популяция клеток или микроорганизмов, выращиваемых в контролируемых условиях in vitro.
Культуральная среда - твердая или жидкая среда, использующаяся для выращивания микроорганизмов in vitro.
Лизис - разрушение клеточных стенок под действием ферментов или других
агентов.
Липазы - ферменты, разрушающие жиры.
LD50 - смертельная концентрация (летальная доза), вызывающая гибель 50%
опытных организмов.
Мезофиллы - микроорганизмы, развивающиеся при средних температурах
20-400С. Оптимальная температура для их развития 25-390С.
Метантанк - резервуар для получения биогаза (ферментатор) из навоза и
других органических отходов в анаэробных условиях.
Осмотолерантные микроорганизмы - способны выдерживать значительные колебания концентрации веществ в окружающей среде.
Осмофильные микроорганизмы - предпочитают среды с высоким осмотическим давлением. В основном – это грибы, способные расти на едва увлажненных субстратах: некоторые дрожжи сбраживают мед с содержанием сахара 70-80%.
104
Периодическая ферментация - культивирование микроорганизмов в течение ограниченного интервала времени. Свежую среду инокулируют посевным материалом и проводят культивирование в непрерывном режиме, не добавляя новых порций среды и не удаляя продуктов, пока процесс не завершится.
Периодическая ферментация с добавлением субстрата - культивирование
микроорганизмов в течение ограниченного интервала времени с периодическим добавлением субстрата и сбором продукта только по завершению процесса.
Плазмида - кольцевая двухцепочечная ДНК, обладающая способностью к
автономной репликации, а также к встраиванию в нее и передачи в геном реципиента чужеродных генов и других последовательностей ДНК.
Протеиназы (протеолитические ферменты) - ферменты, расщепляющие
пептидные связи в белковых молекулах.
Протеолиз - ферментативное расщепление белков.
Психрофилы, криофилы (холодолюбивые) - микроорганизмы, развивающиеся при низких температурах от +15 до – 80С.
Рекомбинативный белок - белок, кодируемый клонированной рекомбинативной ДНК.
Рекомбинативный ген - ген, состоящий из компонентов различных генов.
Рекомбинативная ДНК - ДНК, состоящая из участков различных исходных
молекул ДНК.
Рибозим - молекула РНК, обладающая ферментативной активностью.
Ri – плазмиды-(от англ. Root inducing – индуцирующая (избыточное) корнеобразование) – кольцевые молекулы ДНК Agrobacterium rhizogenes, способные к независимой репликации. При встраивании в ДНК растений вызывает
усиленное образование корней, приводит к синтезу опинов, но не вызывает
105
образование опухолей. Используется в качестве векторов в генной инженерии.
Сбраживание - анаэробное расщепление молекул питательного вещества,
например глюкозы, сопровождающееся выделением небольшого количества
энергии.
Секреция - выделение веществ из клетки во внешнюю среду.
Солод - проращенное в определенных условиях зерно растений семейства
Мятликовых (злаков).
Сомаклоны - регенеранты растений, полученные из соматических клеток и
обладающие определенными отличиями от исходных форм.
Соматический гибрид - регенерантное растение, полученное путем слияния
соматических клеток.
Стрессовые белки - специальные белки, синтезируемые организмом в неблагоприятных условиях и позволяющие снизить вредоносное воздействие
стрессовых факторов на организм.
Суспензионная культура - суспензия клеток или их агрегатов во взвешенном состоянии в жидкой среде при использовании аппаратуры, обеспечивающей их аэрацию и перемешивание.
Термофилы - теплолюбивые микроорганизмы, развивающиеся при температуре 40-800С. Некоторые термофильные организмы способны расти при
температуре от 90 до 1000С.
Технология глубинной ферментации - выращивание клеток организмов в
жидкой питательной среде в контролируемых условиях для получения полезных для человека продуктов.
Технология твердофазной ферментации - выращивание микроорганизмов
на поверхности или внутри твердой питательной среды для получения полезных для человека продуктов.
Трансдуцирующие фаги - фаги, переносящие в своем геноме гены бакте106
рии-хозяина.
Трансгеноз - введение чужеродного гена в растительную или животную
клетку и его передача в ряду поколений.
Трансгенные (генетически модифицированные организмы – ГМО) - растения, животные, микроорганизмы с измененной наследственной информацией, вызванной включением в их геном чужеродных генов с помощью генно-инженерных методов.
Трансплант (инокулюм) - часть каллусной культуры, используемой для пересадки на свежую питательную среду.
Транспозоны - подвижные генетические элементы, представляющие собой
сегменты ДНК, способные к внутри- и межхромосомным перемещениям
(транспозиции). Осуществляют регуляцию активности генов и дифференцировки клеток, способны индуцировать мутации и геномные перестройки.
Трипсин - протеолитический фермент, синтезируемый клетками поджелудочной железы в форме неактивного предшественника – трипсиногена; гидролизует полипептидные цепи по лизину и аргинину.
Тотипотентность - свойство соматических клеток растений полностью реализовывать свою наследственную программу онтогенетического развития
при определенных условиях выращивания плоть до образования взрослых
растений и семян.
Ti – плазмиды-(от англ. Tumor inducing – индуцирующая опухоль) – кольцевые молекулы ДНК Agrobacterium tumefaciens, способные реплицироваться
автономно и частично встраиваться в хромосомы клеток растений. В ДНК
этих плазмид кодируется информация о синтезе опинов (чаще всего это аминокислоты нопалин или октопин), необходимых для метаболизма бактерии.
Используется в качестве природного вектора для переноса генов при трансгенозе растений.
Ферментаторы (биореакторы, ферментёры) - специальные емкости цилиндрической формы, снабженные термостатирующим, аэрирующим, переме107
шивающим и регулирующим рН среды устройствами. Используются для реализации глубинной ферментации. Часто этот термин относят к сосуду, в котором растут микроорганизмы.
Ферментация - в промышленной микробиологии – крупномасштабное культивирование микроорганизмов в специальных емкостях (ферментаторах).
Флокуляция - агрегация диспергированных частиц с образованием более
крупных частиц, которые под действием силы тяжести выпадают в осадок.
Холофермент - молекула фермента, включающая все необходимые для
функционирования субъединицы и кофакторы.
Экзоферменты - ферменты, выделяемые клетками микроорганизмов в окружающую среду, где проводят превращение питательных веществ в более
простые соединения, которые проходят через оболочку микробной клетки и
служат пластическим материалом.
Эксплант - фрагмент ткани или органа, инкубируемый на питательной среде
самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса.
Эндорфины - эндогенные пептиды с морфинным действием, вырабатываемые центральной нервной системой.
Эндоферменты - ферменты микроорганизмов, прочно связанные с цитоплазмой и осуществляющие процессы метаболизма в клетке.
Эрлифтный биореактор - цилиндрический биореактор, в котором перемешивание осуществляется потоком газа, подаваемого снизу.
Эффектор - небольшая молекула, связывающаяся с репрессором или ферментом и приводящая к их ингибированию или активации.
Живое вещество-совокупность всех живых организмов, населяющих землю,
а также все вещество, сосредоточенное на каждый момент времени во всей
совокупности живых организмов.
Ядерное клонирование - получение живого организма из безъядерной яйцеклетки с вживленным диплоидным соматическим ядром.
108
Литература
1. Асонов Н.Р. Микробиология. - М.: Колосс, 2001. - 352 с.
2. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. - М.: Агро
промиздат, 1990. - 334 с.
3. Березин И.В., Клесов А.А., Швядас В.К. и др. Инженерная энзимология.М.: Высшая школа, 1987.- 144 с.
4. Биотехнология: Учебник/ И.В.Тихонов, Е.А.Рубин, Т.Н.Грязнева и др.;
Под ред. Е.С.Воронина. – ГИОРД, 2008.- 704с.
5. Биотехнология. Принципы и применение / Под редакцией И.Хигпинса,
Д.Беста, Дж.Джонсона, - М.: Мир, 1988. - 478 с.
6. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. - М.: Изд-во «Элевар»,
2000. - 512 с.
7. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982. - Т.1.-389
8. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы / Под ред. Дж. Вудворта.
-М.: Мир, 1988. -215 с.
9. Клячко Н.Л. Ферменты - биологические катализаторы: основные принци
пы действия // Соросовский образовательный журнал. - 1997. - N 3. - С. 5863.
10. Мальцев П.М. Технология бродильных производств. - М.: Пищевая про
мышленность, 1980. - 560 с.
11. Рид Дж. Ферменты в пищевой промышленности. - М.: Пищевая промыш
ленность, 1971. - 414 с.
12. Римарева Л.В. Повышение эффективности биотехнологических
процессов спиртового производства// Производство спирта и
ликероводочных изделий.-2003.-№ 4 с.13-22.
13. Рогов И.А., Антипова Г.П., Шуваева Г.П. Пищевая биотехнология. – М.:
КолосС, 2004.- 440с.
14. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. - М.:Мир, 1987. - 410 с.
15. Технология спирта / Под редакцией профессора В.Л.Яровенко. - М.: Ко
лос, 1996. - 464 с.
109
16. Федоткин И.М. и др. Интенсификация технологических процессов
пищевых производств. - К.: Техника, 1984. - 176 с.
17. Чернов Н.Н. Ферменты в клетке и пробирке // Соросовский образователь
ный журнал. - 1997. - N 5. - С. 28-34.
18. Кузьмина Н.А. Биотехнология [Электронный ресурс]/Н.А. Кузьмина.Электрон.дан.- Омск: ОГПУ, 2010.- Режим доступа:
http://www.biotechnolog.ru/prombt/prombt8_1.htm
110