На правах рукописи ВОРОНИН ДМИТРИЙ НИКОЛАЕВИЧ РОЛЬ ДЕЦИДУАЛЬНЫХ ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРОВ В
advertisement
На правах рукописи ВОРОНИН ДМИТРИЙ НИКОЛАЕВИЧ РОЛЬ ДЕЦИДУАЛЬНЫХ ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ИНВАЗИВНЫХ СВОЙСТВ ТРОФОБЛАСТА ПРИ НЕОСЛОЖНЁННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ И САМОПРОИЗВОЛЬНОМ ВЫКИДЫШЕ НА РАННИХ СРОКАХ ГЕСТАЦИИ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Сотникова Наталья Юрьевна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Захарова Людмила Алексеевна доктор медицинских наук, профессор Стенина Марина Александровна Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Защита состоится «17» октября 2011 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1 Автореферат разослан «23» июня 2011 года Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат медицинских наук, доцент Кузнецова Т. Е. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность иммунного ответа темы. Известно, что нарушения материнского могут приводить к досрочному прерыванию беременности, задержке развития плода, гестозу и другим осложнениям гестационного процесса [Hu Y., et al., 2006, Sargent I., et al., 2007, Сидельникова В. М., Сухих Г. Т. 2010]. Важную роль в развитии и поддержании беременности отводят популяции естественных CD56+ киллеров, которые составляют доминирующую часть лейкоцитарного инфильтрата децидуальной оболочки плаценты Однако [Bulmer, 2009]. биологический смысл резкого увеличения содержания ЕК в материнской части плаценты на ранних сроках гестации все еще остается до конца не понят. Ранее высказывалось предположение о том, что при физиологически протекающей беременности неактивированном состоянии, децидуальные что ЕК препятствует находятся развитию в ими цитотоксического ответа в отношении клеток плодового происхождения [King A. 2001, Kopcow H.D. 2005], однако данные последних лет не подтвердили эту гипотезу [Trundley, A. 2004., Trowsdale J. 2008]. Показано, что децидуальные ЕК обладают достаточно высоким уровнем цитотоксической активности, сравнимым с таковым у ЕК эндометрия [Jones R.K. 1997., King A. 2000., Mincheva-Nilsson L 2000]. Известно, что функциональное состояние CD56+ ЕК определяется характером поступающего через рецепторы сигнала [Ярилин А.А. 2010], а уровень активации ЕК определяется балансом экспрессируемых на мембране активирующих и ингибирующих рецепторов [Kusumi M,, 2006, Grzywacz, 2006]. Однако, особенности экспрессии рецепторов различного типа децидуальными ЕК при физиологической и патологической беременности, а также возможные механизмы их регуляции в настоящее время практически не изучены. 4 При развитии тканей ранней плаценты клетки вневорсинчатого цитототрофобласта инвазируют децидуальную оболочку плаценты, формируя так называемые клеточные островки и клетки эндоваскулярного трофобласта [Bulmer 2010., Fontana VA 2010]. Успешная инвазия трофобласта обеспечивает нормальное развитие тканей плаценты и эмбриона [Chaouat G., e.a., 2002]. Процесс инвазии регулируется целым рядом факторов, таких как рецепторы к хемокинам [Hanna J, е.а., 2003], цитокины [Pang Z.J., е.а. 2008, Tapia A, е.а., 2008], матриксные металлопротеиназы [Jones A., e.a., 2006; Pang Z.J., е.а. 2008]. Существует предположение, что децидуальные ЕК регулируют инвазию трофобласта [King A., 2002; Hu Y., e.a., 2006]. Есть данные, что децидуальные ЕК способны угнетать миграцию клеток трофобласта и приводить к изменению экспрессии ингибитора-1 активатора плазминогена в клетках трофобласта [Hu Y., e.a., 2006]. Однако механизмы регуляции инвазивных свойств трофобласта децидуальными ЕК до настоящего времени остаются до конца не изученными. Нет данных о характере воздействия IFNγ, продукция которого резко возрастает при невынашивании беременности [Chaouat G., e.a., 2006], на функциональное состояние ЕК. Определение характера экспрессии активирующих и ингибирующих рецепторов децидуальными ЕК, а также направленности их влияния на инвазивные свойства трофобласта в ранние сроки неосложненной беременности и при самопроизвольном выкидыше в 1 триместре является актуальной задачей клинической иммунологии. Решение этой проблемы поможет уточнить характер иммунорегуляторных процессов, происходящих в интерфазе мать-плацента-плод и обеспечивающих нормальное течение беременности, глубже самопроизвольного выкидыша. понять патогенетические механизмы 5 Цель научного исследования Установить особенности функционального состояния децидуальных CD56+ ЕК и их роль в регуляции инвазии трофобласта для уточнения иммунных механизмов патогенеза раннего самопроизвольного выкидыша. Задачи исследования 1. Провести сравнительный анализ экспрессии активирующих (NKG2D, CD161) и ингибирующих (NKG2A) рецепторов децидуальными CD56+ ЕК, а также характера синтеза и продукции ими функциональных молекул при неосложненной беременности и раннем самопроизвольном выкидыше. 2. Определить особенности синтеза и продукции IFNγ в ткани ранней плаценты при неосложненной беременности и раннем самопроизвольном выкидыше по сравнению с аналогичными показателями эндометрия, и оценить in vitro влияние IFNγ на экспрессию активирующих и ингибирующих рецепторов децидуальными CD56+ ЕК. 3. В экспериментах in vitro установить особенности миграционной и инвазивной активности клеток трофобласта в норме и при раннем самопроизвольном выкидыше. 4. В эксперименте in выявить vitro особенности изменения функционального состояния децидуальных ЕК и инвазивной активности клеток трофобласта при их совместном культивировании у женщин с неосложненной беременностью и ранним самопроизвольным выкидышем. Научная новизна исследования Установлены самопроизвольного новые иммунные выкидыша, механизмы заключающиеся патогенеза в раннего нарушении функционального состояния децидуальных CD56+ ЕК и регуляции ими инвазивной способности клеток трофобласта. Впервые показано, что при раннем самопроизвольном выкидыше изменяется соотношение децидуальных CD56+ ЕК, экспрессирующих 6 активирующие и ингибирующие рецепторы в сторону преобладания цитотоксической активности, усиливается синтез и продукция IFNγ и GrB, а также рецепция IFNγ децидуальными CD56+ лимфоцитами. Выявлено, что на ранних сроках гестации повышается синтез и продукция IFNγ в тканях децидуальной оболочки плаценты, при самопроизвольном выкидыше дополнительно усиливается продукция IFNγ децидуальными лимфоцитами. Впервые показано, что IFNγ угнетает экспрессию активирующих и ингибирующих рецепторов децидуальными ЕК женщин с неосложненной беременностью ранних сроков по дозо- и время-зависимому типу. Впервые выявлены нарушения миграционной и инвазивной активности клеток трофобласта при раннем самопроизвольном выкидыше, сопровождающиеся снижением экспрессии мРНК ММР-2 и TIMP-2 в ткани ворсинчатого трофобласта, угнетением экспрессии мРНК ММР-9 при усилении экспрессия мРНК TIMP-1 в децидуальной оболочке плаценты, что сочетается с недостаточной инвазией эндоваскулярного трофобласта. Впервые показано, что при раннем самопроизвольном выкидыше взаимодействие трофобласта децидуальных CD56+ ЕК с клетками аутологичного ведет к неадекватной активации ЕК, сопровождающейся усилением синтеза IFNγ и GrB. Установлено, что при беременности децидуальные CD56+ ЕК и IFNγ оказывают угнетающее действие на миграционные и инвазивные свойства клеток трофобласта, снижая синтез ММР-9 и повышая экспрессию мРНК TIMP-2 в ткани трофобласта. Основные положения, выносимые на защиту: При физиологической беременности на поверхности децидуальных ЕК преобладает экспрессия ингибирующих рецепторов, отмечается умеренная активация ЕК при их взаимодействии с клетками трофобласта и происходит угнетение инвазивной активности клеток трофобласта под действием ЕК. 7 При самопроизвольном выкидыше усиливается продукция IFNγ и гранзима В (GrB) децидуальными ЕК, нарушается экспрессия активирующих и ингибирующих рецепторов на их поверхности. Неадекватная активация ЕК при взаимодействии с клетками плодового происхождения ведет к усилению цитотоксического потенциала клеток, вызывая чрезмерное ограничение инвазивной активности клеток трофобласта, что определяет нарушение. Практическая значимость результатов исследования Установлены новые патогенетические механизмы развития раннего самопроизвольного выкидыша, обусловленные нарушением функциональной активности децидуальных CD56+ ЕК, заключающиеся в угнетении миграции и инвазии клеток трофобласта, Разработаны нормативные значения показателей экспрессии рецепторов различного типа децидуальными CD56+ ЕК, которые можно использовать для оценки функциональной активности ЕК. Внедрение результатов работы в практику Результаты работы используются в учебном процессе на кафедре патофизиологии и иммунологии ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и на кафедре общей биологии и ботаники ГОУ ВПО «Ивановский государственный университет». Апробация работы Основные результаты докладывались и обсуждались исследований по теме диссертации на 12th International Symposium for Immunology of Reproduction- Varna, (Варна, Болгария, 10 мая 2009); Конференции молодых ученых, посвященной памяти В.Н. Городкова (Иваново, 16 марта 2009); Научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2009» (Иваново, 20-25 апреля 2009); XIII Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 8-11 июня 2009); 8 Конференции молодых ученых, посвященной памяти В.Н. Городкова (Иваново, 11 марта 2010); 90-й Юбилейной ежегодной итоговой научнопрактической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 80летию Государственной медицинской академии «Неделя науки - 2010» (Иваново, 19-23 апреля 2010); VIII конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 28-30 «Клиническая июня иммунология, 2010); Юбилейной иммуногенетика научной – конференции междисциплинарные проблемы» (Ташкент, Узбекистан, 11-12 октября 2010); 4-й Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» с элементами научной школы для молодежи (Пермь 5-8 декабря 2010). Личное участие автора Автором самостоятельно выполнялись иммунологические исследования. Была проведена систематизация полученных результатов, их статистическая обработка, описание полученных результатов. Публикации По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 6 в рецензируемых журналах, включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ. Структура и объём диссертации Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», трёх глав собственных исследований, главы «Обсуждение результатов», выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 18 отечественных и 216 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 11 рисунками и 10 фотографиями. 9 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Работа выполнена на базе Федерального государственного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н.Городкова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (директор – д.м.н. Малышкина А.И.). Исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии – зав. лабораторией д.м.н., профессор Сотникова Н.Ю. Всего было обследовано 82 пациентки, из них: 11 небеременных женщин фертильного возраста, 55 женщин с искусственным прерыванием неосложнённой беременности в сроке гестации 7-12 недель, 16 женщин с самопроизвольным прерыванием беременности в сроке гестации 7-12 недель. Материалом для исследования служили: биоптаты эндометрия, образцы децидуальной оболочки и ворсинчатого трофобласта плаценты. - Выделение клеток. Популяцию децидуальных МНК выделяли стандартным безферментативным механическим методом [Chеrnyshov V.P., et. al., 1993], с последующим удалением фракции макрофагов с помощью стандартного метода двукратной адгезии на пластике [Фримель Г., 1987]. Обогащенную популяцию децидуальных ЕК получали из фракции децидуальных лимфоцитов путем негативной селекции CD3+ клеток методом непрямой магнитной сепарации использованием магнитных частиц Dynalbeads M-280 Sheep anti-Mouse IgG (Dynal Biotech ASA, Norway). Выделение обогащенной популяции клеток трофобласта из ткани ворсинчатого трофобласта проводили стандартным ферментативным методом [Clover L.M., et al., 2000]. - Проточная цитофлюориметрия Поверхностный фенотип децидуальных CD56+ лимфоцитов и внутриклеточную экспрессию ими функциональных молекул (IFNγ и GrB) определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом проточной 10 цитофлюориметрии Характеристика на приборе панели FACScan используемых (Becton Dickinson, моноклональных USA). антител представлена в Таблице 1. Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Внутриклеточную продукцию IFNγ и GrB оценивали в популяции CD56+ лимфоцитов (CD56+IFNγ+ и CD56+GrB+), используя процедуру внутриклеточного окрашивания клеток с использованием коммерческого набора FIX & PERM cell permeabilization reagents (Invinrogen, Camarillo, CA, USA) для пермеабилизации клеточной мембраны. Таблица 1. Панель моноклональных антител, использованных в исследовании № мАТ Клон Фирма-производитель Флюорохром п/п ная метка 1. Human CD45 Immu 19.2 Beckman Coulter, France FITC 2. Human CD14 RMO52 Beckman Coulter, France PE 3. Human CD56 MEM-188 Invitrogen, USA FITC 4. Human CD56 N901 Beckman Coulter, France PE 5. Human CD56 LT56 Сорбент, Москва не меченные 6. Human CD161 191B8 Beckman Coulter, France PE 7. Human CD3 Сорбент, Москва не меченные 8. Human CD119 92101 R&D Sysnems FITC 9. Human NKG2D ON72 Beckman Coulter, France PE 10. Human CD159a Z199 Beckman Coulter, France PE (NKG2A) 11. Human IFNγ 45.15 Immunotech, France FITC 12. Human GrB GB12 Invitrogen, USA PE 13. Cytockeratin-7 OV-TL Invitrogen, USA не меченные 12/30 14 Mouse IgG1 Becton Dickinson, USA FITC Mouse IgG2a Becton Dickinson, USA PE - Иммуноферментный анализ Концентрацию IFNγ в экстрактах децидуальной ткани плаценты, определяли методом микропланшетном твердофазного ридере Multiscan иммуноферментного EX (Labsystems, анализа на Finland) с 11 использованием коммерческой тест-системы производства ООО «Цитокин» (С.-Петербург, Россия) с пределом чувствительности 20 пкг/мл. -Полимеразная цепная реакция Уровень экспрессии мРНК MMP-2, MMP-9, TIMP-2, TIMP-1 в образцах ткани ворсинчатого трофобласта, децидуальной оболочки плаценты и обогащенной популяции клеток цитотрофобласта, а также экспрессию мРНК IFNγ и GrB в децидуальных CD56+ лимфоцитах определяли методом количественной полимеразной цепной реакции (RT-PCR) в реальном времени на амплификаторе с оптической насадкой iCycler iQ (BIO-RAD, USA). При проведении RT-PCR использовались следующие наборы праймеров, зондов и реагентов: наборы «Онкоскрин» для количественного определения β2-микроглобулина, MMP-2 и TIMP-2 (ООО «ГеноТехнология», Москва); наборы для определения MMP-9, TIMP-1 (ООО «Фрактал Био», Санкт-Питербург); наборы реагентов для определения количества фрагментов генов IFNγ и GrB (ЗАО «Синтол», Москва). - Культуральные исследования Для определения влияния IFNγ на экспрессию поверхностных рецепторов децидуальными CD56+ лимфоцитами обогащенную популяцию децидуальных лимфоцитов стимулировали препаратом IFNγ (ООО «Цитокин», С.-Петербург) в концентрации 10, 100 или 1000 пг/мл в течение 2 и 24 часов при 370С и 5% СО2. Проводили совместное культивирование обогащенной популяции децидуальных CD56+ лимфоцитов и клеток цитотрофобласта в течение 24 часов при 370С и 5% СО2.. После окончания инкубации популяцию децидуальных CD56+ ЕК удаляли методом позитивной непрямой магнитной сепарации с использованием магнитных частиц Dynalbeads M-280 Sheep anti-Mouse IgG (Dynal Biotech ASA, Norway) и определяли уровень экспрессии мРНК IFNγ и GrB в CD56+ лимфоцитах. В клетках цитотрофобласта после культивирования оценивали уровень экспрессии мРНК MMP-2, MMP-9, TIMP-2 TIMP-1. 12 Для оценки спонтанной и стимулированной децидуальными CD56+ лимфоцитами миграции клеток трофобласта использовали стандартную 2-D модель клеточной миграции в коллагеновом геле в модификации Hu Y. et al. (2006). Для оценки спонтанного и стимулированного IFNγ инвазивного потенциала клеток трофобласта использовали коммерческий набор BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber (BD Biosciences, USA). - Иммуногистохимия Проводили иммуногистохимическое окрашивание на Cytokeratin-7 замороженных срезов децидуальной оболочки плацент. Общее количество проведенных исследований составило 1372. Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использованием программы Microsoft из Excel комплекта Microsoft Office 2003. Достоверность различий показателей в группах определялась по t-критерию Стьюдента. Результаты работы и их обсуждение Нами было установлено, что популяция CD56+ ЕК являлась доминирующей оболочки как среди клеток лейкоцитарного инфильтрата децидуальной при неосложнённой беременности, так и при самопроизвольном выкидыше. Их уровень составлял около 80% в обеих клинических группах и достоверно не различался (p>0,05). Полученные результаты согласуются с литературными данными [Bulmer, 2009]. Однако значительные при самопроизвольном изменения в выкидыше экспрессии нами рецепторов и отмечались продукции эффекторных молекул децидуальными ЕК, которые проявлялись снижением количества CD56+ клеток, экспрессирующих ингибирующие рецепторы NKG2A (81,97±3,09% при неосложнённой беременности и 44,83±6,25% при самопроизвольном выкидыше, p<0,001) и увеличением количества клеток, 13 экспрессирующих активирующие рецепторы неосложнённой беременности выкидыше, p<0,01). изменялся индекс Кроме и 63,31±0,38% того, соотношения CD161 (50,27±4,18% при при при самопроизвольном самопроизвольном и CD56+NKG2D+ выкидыше CD56+NKG2A+ лимфоцитов: при неосложнённой беременности этот индекс был меньше 1 (0,71±0,03), а при самопроизвольном выкидыше этот индекс существенно возрастал (1,64±0,34, р<0,05), что позволяет говорить об относительном преобладании естественных CD56+ киллеров, экспрессирующих активирующие рецепторы NKG2D, при данной акушерской патологии. В группе женщин с самопроизвольным выкидышем в децидуальных ЕК значительно усиливалась экспрессия мРНК IFNγ (14,58±4,69*104 копий пар/мкл при неосложнённой беременности и 62,84±17,91*104 копий пар/мкл - при самопроизвольном выкидыше, p<0,05) и GrB (631,04±175,75*104 копий пар/мкл при неосложнённой беременности и 1651,44±76,46*104 копий пар/мкл при самопроизвольном выкидыше, p<0,001), по сравнению с таковыми при самопроизвольном повышалось неосложнённой беременности. Кроме выкидыше децидуальной оболочке относительное в содержание ЕК, того, при плаценты внутриклеточно продуцирующих IFNγ (7,72±0,80% при неосложнённой беременности и 25,38±6,97% при самопроизвольном выкидыше, p<0,01) и GrB (15,11±0,75% при неосложнённой беременности и 27,68±1,45% при самопроизвольном выкидыше, p<0,001), и экспрессирующих рецепторы к IFNγ – молекулы CD119 (4,16±0,46% при неосложнённой беременности и 9,60±0,89% при самопроизвольном выкидыше, p<0,001). Как известно, GrB участвует в реализации цитотоксического действия ЕК, способствуя индукции апоптоза в клетках мишенях [Nakashima A. et al., 2008]. IFNγ является одним из основных цитокинов, приводящих к активации ЕК [Кетлинский С. А., Симбирцев А. С. 2008]. Выявленные изменения в синтезе, внутриклеточной продукции и рецепции IFNγ и GrB 14 свидетельствуют о высоком уровне активации децидуальных CD56+ ЕК при развитии раннего досрочного прерывания беременности. Таким образом, самопроизвольный выкидыш на ранних сроках гестации ассоциировался со снижением в лейкоцитарном инфильтрате децидуальной оболочки плаценты количества CD56+NKG2A+ ЕК, повышением уровня CD56+CD161+ лимфоцитов и индекса соотношения экспрессии активирующих и ингибирующих рецепторов децидуальными CD56+ лимфоцитами при усилении продукции ими цитолитических молекул и эффекторных цитокинов. Принято считать, что индукция Th1 типа иммунного ответа в ранние сроки беременности вызывает активацию цитотоксических реакций, ведущих к отторжению плода [Wegmann T. G., et al. 1993, Vigano P. et al. 2001]. Одним из цитокинов Th1 типа является IFNγ. По нашим данным синтез IFNγ в децидуальной оболочке ранних плацент увеличивается независимо от характера беременности. Мы не выявили достоверных различий в синтезе и тканевом содержании данного цитокина в норме и при патологии. Усиление продукции IFNγ при самопроизвольном выкидыше отмечалось нами только в пуле децидуальных CD56+ ЕК. Учитывая данные литературы о важной роли IFNγ в регуляции функционально активности ЕК, мы предположили, что данный цитокин может непосредственно влиять на экспрессию рецепторов различного типа децидуальными ЕК. В эксперименте in vitro было установлено, что при 2-х часовой инкубации IFNγ в дозах 100 и 1000 пг/мл оказывал выраженное угнетающее действие на экспрессию ингибирующих рецепторов NKG2A (69,58±3,32% - контроль, 57,70±4,03% и 55,33±5,18% - IFNγ в концентрации 100 и 1000 пг/мл соответственно, p<0,05 в обоих случаях). При 24-часовом воздействии IFNγ в тех же дозах оказывал выраженное угнетающее действие на экспрессию децидуальными CD56+ как активирующих рецепторов NKG2D (49,96±5,09% - контроль, 31,11±4,02% и 27,13±3,60% - IFNγ в 15 концентрации 100 и 1000 пг/мл соответственно, p<0,05 и p<0,01 соответственно), так и ингибирующих рецепторов NKG2A (63,60±4,98% контроль, 46,84±4,49% и 44,16±5,15% - IFNγ в концентрации 100 и 1000 пг/мл соответственно, p<0,01 в обоих случаях). Следует отметить, что в низких концентрациях IFNγ существенно не влиял на экспрессию рецепторов. По-видимому, физиологическое увеличение продукции самого IFNγ в ткани плаценты на ранних сроках гестации не сопровождается одновременной активацией CD56+ ЕК, инфильтрирующих децидуальную оболочку плаценты, что является необходимым условием пролонгации беременности. А усиление продукции IFNγ самими децидуальными CD56+ ЕК может аутокринно приводить к нарушению функционирования рецепторов различного типа на поверхности ЕК, определяя тем самым их неадекватную активацию. Таким образом, IFNγ, продуцируемый децидуальными ЕК, может являться фактором, поддерживающим высокий уровень их активности при самопроизвольном выкидыше. Как известно, обязательным условием нормального развития тканей плаценты является инвазия клеток из ворсинчатого трофобласта в материнскую часть плаценты [Сидельникова В. М., Сухих Г. Т. 2010]. Конечным пунктом инвазии клеток трофобласта являются материнские спиральные артерии, модификация которых во время беременности ведет к их стойкому расширению, увеличивая приток крови к ворсинам хориона [Parham P., 2008, Whitley G. S., Cartwright J. E. 2010]. В процессе инвазии трофобласта важную роль отводят протеиназам из семейства матриксных металлопротеиназ (ММРs) и их тканевым ингибиторам (TIMPs), участвующим в деградации компонентов экстроцелюлярного матрикса [Staun-Ram E. et al., 2004]. Нами было установлено, что при развитии раннего самопроизвольного выкидыша в ткани трофобласта снижалась экспрессия мРНК MMP-2 16 (73,23±25,00*104 копий пар/мкл при неосложнённой беременности и 17,14±5,31*104 копий пар/мкл при самопроизвольном выкидыше, p<0,05) и TIMP-2 (1399,07±237,65*104 копий пар/мкл при неосложнённой беременности и 401,67±111,01*104 копий пар/мкл при самопроизвольном выкидыше, p<0,001), по сравнению с аналогичными показателями при неосложнённой беременности. Данные результаты позволяют говорить о значительном снижении инвазивного выкидыше. потенциала Это значительным клеток трофобласта предположение снижением инвазии при подтверждается клеток самопроизвольном выявленным трофобласта в нами матригеле (коэффициент инвазии 0,58±0,04 при неосложнённой беременности и 0,36±0,02 при самопроизвольном выкидыше, p<0,01) и миграции клеток трофобласта в коллагене (средняя дистанция миграции 152,84±9,07 мкм при неосложнённой беременности и 10,35±0,51 мкм при самопроизвольном выкидыше, p<0,001) при раннем самопроизвольном выкидыше по сравнению с неосложненной беременностью. Кроме того, в ткани децидуальной оболочки плацент, полученных после самопроизвольного выкидыша, отмечалось резкое снижение количества Cytokeratin-7-позитивных клеток по сравнению с таковым в плацентах женщин с неосложненной беременностью. Известно, что формирование вневорсинчатого трофобласта также определяется и особенностями микроокружения в децидуальной оболочке плаценты. Нами было установлено, что на ранних сроках гестации, вне зависимости от характера течения беременности, в ткани децидуальной оболочки плаценты усиливалась экспрессия мРНК ММР-2, ММР-9 TIMP-1 и по сравнению с таковой в эндометрии небеременных женщин. Уровень экспрессии мРНК ММР-2 составил 22,99 ± 14,08*104 копий пар/мкл в ткани эндометрия, 1949,02±692,67*104 копий пар/мкл в децидуальной оболочке при неосложнённой беременности и 388,03±107,93*104 копий пар/мкл при самопроизвольном выкидыше (p<0,01 в обеих группах), ММР-9 - 17 0,06±0,034*104 копий пар/мкл в ткани эндометрия, 217,41±52,71*104 копий пар/мкл в децидуальной оболочке при неосложнённой беременности и 0,440±0,074*104 копий пар/мкл при самопроизвольном выкидыше (p<0,05 и p<0,001 соответственно) TIMP-1 - 0,277±0,094*104 копий пар/мкл в ткани эндометрия, 19,14±6,15*104 копий пар/мкл в децидуальной оболочке при неосложнённой беременности и 335,51±89,27*104 копий пар/мкл при самопроизвольном выкидыше (p<0,05 и p<0,01 соответственно). Сравнительный анализ показателей синтеза ММРs при физиологической беременности и при спонтанном выкидыше показал, что при досрочном прерывании беременности отмечался более низкий уровень экспрессии мРНК ММР-9 (p<0,05), но более высокий уровень экспрессии мРНК ее специфического ингибитора TIMP-1 (p<0,01). Кроме того мы наблюдали снижение синтеза как MMP-2 (p<0,05), так и её специфического тканевого ингибитора - TIMP-2 (60377,63±27868,30*104 децидуальной оболочке при неосложнённой копий пар/мкл в беременности и 111,91±39,49*104 копий пар/мкл при самопроизвольном выкидыше, p<0,05). Таким образом, при раннем самопроизвольном выкидыше происходит значительное угнетение миграционной и инвазивной активности клеток трофобласта, по-видимому, обусловленное снижением синтеза матриксных металлопротеиназ, что может приводить к нарушению нормального формирования вневорсинчатого трофобласта и определять патологический характер течения беременности. Известно, что децидуальные ЕК вступают в непосредственный контакт с инвазирующим трофобластом в материнской части плаценты [Bulmer J. N., et al., 2008]. Этот контакт может привести к развитию цитотоксических реакций со стороны ЕК в отношении клеток трофобласта, однако в норме этого не происходит. Более того, существует мнение, что этот контакт необходим для нормального развития плаценты, так как децидуальные ЕК осуществляют непосредственный контроль инвазивной активности 18 вневорсинчатого цитотрофобласта [Hanna J., et al., 2006, Moffett A., et al 2006]. Мы оценили влияние децидуальных ЕК на инвазию клеток трофобласта в серии экспериментов in vitro. Было установлено, что при неосложненной беременности в клетках трофобласта после культивирования с децидуальными ЕК снижалась экспрессия мРНК MMP-9 (13,62±1,36*104 копий пар/мкл при спонтанном синтезе и 3,43±1,37*104 копий пар/мкл при взаимодействии децидуальными ЕК, p<0,001) и TIMP-2 (240,24±69,95*104 копий пар/мкл при спонтанном синтезе и 30,87 ± 9,64*104 копий пар/мкл при взаимодействии с децидуальными ЕК, p<0,05). Аналогичные изменения наблюдались при самопроизвольном выкидыше. Под действием децидуальных ЕК в клетках трофобласта снижался синтез MMP-9 (47,16±12,59*104 копий пар/мкл при спонтанном синтезе и 19,22±7,64*104 копий пар/мкл при взаимодействии с децидуальными ЕК, p<0,05) и TIMP-2 (184,99±37,59*104 копий пар/мкл при спонтанном синтезе и 90,79±12,88*104 копий пар/мкл при взаимодействии с децидуальными ЕК, p<0,05). В эксперименте по изучению прямого влияния ЕК на миграцию клеток трофобласта в коллагене было установлено, что предварительная инкубация эксплантов ворсин хориона с децидуальными CD56+ ЕК приводила к существенному угнетению миграции клеток из ворсин трофобласта в коллагене как в случае неосложненной беременности (152,84±9,07 мкм спонтанная миграция, 74,87±4,36 мкм – миграция после воздейсвтия децидуальных ЕК, p<0,001), так и при самопроизвольном выкидыше (10,35±0,51 мкм - спонтанная миграция и 5,56±0,14 мкм миграция после воздейсвтия децидуальных ЕК, p<0,001). Таким образом, ЕК ограничивают чрезмерную инвазивную активность трофобласта, сравнимую с таковой у опухолевых клеток. Это соответствует литературным данным [Bulmer J. N., et al., 2010]. А самопроизвольный выкидыш ассоциирован с резким угнетением инвазивного потенциала клеток 19 трофобласта, что может являться причиной нарушения развития тканей плаценты на ранних сроках гестации. Одним из факторов, участвующих в реализации ингибирующего действия ЕК на инвазию клеток трофобласта, по-видимому, является IFNγ. По нашим данным, IFNγ резко угнетал инвазию клеток трофобласта в матригеле как при физиологической беременности (0,58±0,04 – инвазия в середе RPMI 1640, и 0,17±0,07 – в присутствии IFNγ, p<0,01), так и при самопроизвольном выкидыше (0,36±0,02 - инвазия в середе RPMI 1640, и 0,14±0,01 – в присутствии IFNγ, p<0,001) Нами было установлено, что не только децидуальные ЕК влияли на инвазию клеток трофобласта, но и сам трофобласт оказывал выраженное действие на функциональное состояние CD56+ клеток. Нами было установлено, что как при неосложнённой беременности, так и при самопроизвольном выкидыше в децидуальных CD56+ лимфоцитах после их инкубации с клетками ворсинчатого трофобласта усиливалась экспрессия мРНК IFNγ и GrB. Однако только у женщин с самопроизвольным выкидышем данное увеличение было статистически достоверным (экспрессия мРНК IFNγ: 137,73±52,11*104 копий пар/мкл– контроль, 399,80±121,89*104 копий пар/мкл - после взаимодействия с клетками трофобласта, p<0,05; экспрессия мРНК GrB: 60,82±8,36*104 копий пар/мкл– контроль, 474,11±76,85*104 копий пар/мкл - после взаимодействия с клетками трофобласта, p<0,01). По-видимому, усиление экспрессии мРНК IFNγ и GrB децидуальными ЕК после их взаимодействия с клетками аутологичного трофобласта может приводить к несбалансированному локальному усилению продукции цитолитических молекул и цитокинов Th1 типа и вызывать развитие цитотоксических реакций, направленных против семиаллогенного плода. Суммируя полученные нами данные, можно заключить, что при физиологической беременности на поверхности децидуальных ЕК 20 преобладает экспрессия ингибирующих рецепторов, отмечается умеренная активация ЕК при их взаимодействии с клетками трофобласта и происходит угнетение инвазивной активности клеток трофобласта под действием ЕК. При самопроизвольном выкидыше усиливается продукция IFNγ и GrB децидуальными ЕК, что ведет к нарушению экспрессии активирующих и ингибирующих рецепторов на их поверхности. Неадекватная активация ЕК при взаимодействии с клетками плодового происхождения ведет к усилению цитотоксического потенциала ЕК, вызывая чрезмерное ограничение инвазивной активности клеток трофобласта. ВЫВОДЫ 1. Развитие самопроизвольного выкидыша на ранних сроках гестации при отсутствии изменений в содержании децидуальных CD56+ ЕК ассоциируется со снижением уровня CD56+ лимфоцитов, экспрессирующих ингибирующие рецепторы NKG2A и увеличением количества клеток, экспрессирующих рецептор цитотоксичности CD161, по сравнению с показателями при неосложненной беременности ранних сроков. 2. При раннем самопроизвольном выкидыше отмечается усиление синтеза и внутриклеточной продукции IFNγ и GrB децидуальными лимфоцитами с фенотипом CD56+, а также повышение уровня CD56+ ЕК, экспрессирующих рецепторы к IFNγ – CD119, относительно показателей контрольной группы. 3. Как при физиологическом течении беременности, так и при самопроизвольном выкидыше на ранних сроках гестации повышается синтез IFNγ в тканях децидуальной оболочки плаценты. In vitro IFNγ после 2-х часовой инкубации в концентрации 100 и 1000 пг/мл угнетает экспрессию ингибирующих рецепторов NKG2A децидуальными ЕК, после 24-часовой инкубации IFNγ в тех же концентрациях снижает экспрессию как активирующих, так и ингибирующих рецепторов децидуальными CD56+ 21 лимфоцитами у женщин с неосложненной беременностью ранних сроков. Степень угнетения экспрессии активирующих рецепторов после 24-часового культивирования с IFNγ более выражена, чем после 2-х часовой инкубации. 4. В децидуальной оболочке плаценты ранних сроков как при неосложнённой беременности, так и при её раннем прерывании усиливается экспрессия мРНК MMP-2, ММР-9, TIMP-2 и TIMP-1 по сравнению с таковой в эндометрии небеременных женщин. При раннем самопроизвольном выкидыше в отличие от ткани децидуальной оболочки плаценты женщин с медицинским абортом снижается экспрессия мРНК MMP-2 и TIMP-2, угнетается синтез ММР-9, но повышается синтез ее специфического тканевого ингибитора TIMP-1. 5. При раннем самопроизвольном выкидыше в отличие от неосложненной беременности отмечается сниженная миграционная и инвазивная активность клеток трофобласта и сниженная экспрессия мРНК MMP-2 и TIMP-2 в ткани ворсинчатого трофобласта, что сочетается с уменьшением количества цитокератин-7-позитивных клеток вневорсинчатого цитотрофобласта в ткани децидуальной оболочки плаценты. 6. В децидуальных CD56+ лимфоцитах, независимо от характера течения беременности, после инкубации с аутологичными клетками ворсинчатого трофобласта повышается экспрессия мРНК IFNγ и GrB, однако при раннем самопроизвольном выкидыше усиление экспрессии мРНК IFNγ и GrB децидуальными ЕК более выражено, чем у женщин с неосложненным течением беременности. 7. IFNγ подавляет инвазию клеток ворсинчатого трофобласта в матригеле, а децидуальные естественные киллеры угнетают миграционную активность клеток ворсинчатого трофобласта в коллагене и снижают экспрессию мРНК TIMP-2 и MMP-9 в клетках ворсинчатого трофобласта как у женщин с неосложненной самопроизвольным выкидышем. беременностью, так и с ранним 22 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Рекомендуется определять в децидуальной оболочке ранней плаценты относительное содержание CD56+ лимфоцитов, экспрессирующих ингибирующие и активирующие рецепторы, и при значениях показателя CD56+NKG2A+ клеток менее 61,5%, CD56+CD161+ лимфоцитов более 54,4%, а также коэффициента CD56+NKG2D+/CD56+NKG2A+ более 0,84 диагностировать самопроизвольный выкидыш для оптимизации тактики прегравидарной подготовки женщин при последующих беременностях. Рекомендуется определять коэффициент инвазии клеток ворсинчатого трофобласта в матригеле и при его значениях менее 0,47 диагностировать нарушение инвазивности клеток трофобласта ранней плаценты для оптимизации прегравидарной подготовки женщин при последующих беременностях. Рекомендуется использовать модель совместного культивирования децидуальных CD56+ ЕК с клетками ворсинчатого трофобласта для изучения функциональной активности децидуальных естественных киллеров. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Sotnikova N.Yu., Kroshkina N.V., Voronin D.N., Lepilova I.B. Local immune events in RSA // Abstracts book of 12th International Symposium for Immunology of Reproduction- Varna, Bulgaria, 2009. – P. 46–47. 2. Воронин Д.Н., Крошкина Н.В., Сотникова Н.Ю., Чухина С.И., Бойко Е.Л. Взаимосвязь активации CD56+ естественных киллеров с уровнем регуляторных Т-лимфоцитов у женщин с угрозой невынашивания ранних сроков беременности // Вестник Военно-Медицинской академии. – 2009. – №1(25). – С.288–289. 3. Воронин Д.Н., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Крошкина Н.В., Димитриенко Т.А. Характер экспрессии активирующих и ингибирующих рецепторов на поверхности CD56+ естественных киллеров периферической крови и децидуальной оболочки плаценты при физиологическом течении беременности и при спонтанном аборте на ранних сроках гестации // Медицинская иммунология. – 2009. – Т.11, №4–5. – С.405–406. 4. Воронин Д.Н., Крошкина Н.В., Сотникова Н.Ю. Особенности экспрессии рецепторов различного типа децидуальными CD56+ ЕК в ранние 23 сроки неосложненной беременности // Аллергология и иммунология. – 2009. – Т.10, №2. – С.243–244. 5. Воронин Д.Н., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Малышкина А.И., Крошкина Н.В. Особенности экспрессии лектин-подобных рецепторов C-типа на поверхности CD56+ естественных киллеров периферической крови и децидуальной оболочки плаценты при физиологическом течении беременности и при спонтанном аборте на ранних сроках гестации // Сб. науч. тр. и материалов науч.-практ. конф. «Современные перинатальные медицинские технологии в решении проблем демографической безопасности». – 2009, г.Минск. – С.139–142. 6. Воронин Д.Н., Лазарева Ю.Ю., Панова И.А., Лукина Н.С., Чухина С.И. Изменение дифференцировки лимфоцитов в динамике неосложненной беременности // Материалы научно-практической конференции ЦФО РФ с международным участием «Инновации и информационные технологии в диагностической, лечебно-профилактической и учебной работе клиник» Тверь. – 2009. – С. 327–328. 7. Можаева Т.А. Малышкина А.И. Сотникова Н.Ю. Воронин Д.Н. Характеристика инфекционного фактора у женщин с угрозой прерывания беременности в первом триместре // Материалы научно-практической конференции «Ранние сроки беременности. Профилактика репродуктивных потерь». – 20 ноября 2009. 8. Воронин Д.Н. Особенности экспрессии активирующих и ингибирующих NKG2 рецепторов и CD161 на поверхности CD56+ естественных киллеров в децидуальной оболочке у беременных и женщин со спонтанным абортом на ранних сроках гестации // Материалы 89-й ежегодный научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2009». – С. 178. 9. Воронин Д.Н., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Букина Е.А., Крошкина Н.В. Особенности регуляции инвазивнных свойств клеток трофобласта при физиологической беременности и самопроизвольном выкидыше // Jurnali nazariy va klinik tibbiyot (Журнал теоретической и клинической медицины, Узбекистан). – 2010. – №5. – С. 77–79. 10. Воронин Д.Н., Можаева Т.А. Экспрессия MMP-2, MMP-9 и их тканевых ингибиторов в трофобласте и в децидуальной оболочке ранней плаценты при неосложненной беременности и самопроизвольном выкидыше // Ж. «Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии».-2010.- № 2/1 (29). – С.24. 11. Сотникова Н.Ю., Воронин Д.Н., Крошкина Н.В., Малышкина А.И., Анциферова Ю.С., Букина Е.А. Роль IFN в регуляции функциональной активности децидуальных естественных киллеров при беременности // Ж. «Иммунология», – 2010. – №3 (31), – С.136–139. 12. Малышкина А.И., Можаева Т.А., Воронин Д.Н. Особенности реакций врождённого иммунитета у женщин с угрозой прерывания 24 беременности на ранних сроках // «Российский Иммунологический журнал», октябрь- декабрь 2010, Т.4(13), №4, -С.407-408. 13. Воронин Д.Н., Можаева Т.А. иммунные механизмы регуляции инвазивности трофобласта при неосложнённой беременности и при её спонтанном прерывании на ранних сроках гестации // «Российский Иммунологический журнал», – 2010, – Т.4(13), №4, –С.414. 14. Воронин Д.Н., Сотникова Н.Ю., Крошкина Н.В. Продукция IFNg в тканях децидуальной оболочки первого триместра при нормальной беременности и при спонтанном выкидыше // Сборник научных трудов «Репродуктивное Здоровье Нового Поколения». – 2010. – С. 151–155. 15. Воронин Д.Н. Особенности активации децидуальных CD56+ естественных киллеров в ранние сроки беременности // Сборник научных трудов «Репродуктивное Здоровье Нового Поколения». – 2010. – С. 351–352. ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ ЕК – естественные киллеры ИФА – иммуноферментный анализ мАТ – моноклональные антитела МНК – мононуклеарные клетки мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота CD – cluster of differentiation (кластер дифференцировки) FITC – флюоресцеин изотиоционат GrB – Granzyme B (гранзим В) IFNγ – интерферон-γ MMP – матриксная металлопротеиназа РЕ – фикоэритрин RSA – recurrent spontaneous abortions (повторяющийся самопроизвольный выкидыш) RT-PCR – полимеразная цепная реакция в режиме реального времени TIMP – тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы
