морфологическое исследование поджелудочной железы
advertisement
На правах рукописи Савельева Екатерина Сергеевна МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПЕРВИЧНОВОДНЫХ И НАЗЕМНЫХ АНАМНИЙ 03.03.04– клеточная биология, цитология, гистология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научноисследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук Научный руководитель: Доцент, кандидат биологических наук Прощина Александра Евгеньевна Официальные оппоненты: Главный научный сотрудник лаборатории развития эндокринной системы ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН, доктор медицинских наук, профессор Яглов Валентин Васильевич Профессор кафедры физиологии, морфологии и биохимии животных Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А.Тимирязева, доктор биологических наук, профессор Панов Валерий Петрович Ведущее учреждение: Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова Защита диссертации состоится « » октября 2013 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы д. 3. Автореферат разослан «__» _______ 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Л. П. Михайлова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Одной из актуальных проблем современной морфологии является изучение различных аспектов строения и функций поджелудочной железы человека и животных. В литературе существует довольно много сведений об анатомии, физиологии, эмбриологии поджелудочной железы различных видов рыб, земноводных, пресмыкающихся, птиц и млекопитающих, а также достаточно обширны данные по сравнительной анатомии, патологии и возрастной изменчивости поджелудочной железы животных и человека (Евдокимов, 1948; Яглов, 1977, 1978, 1989; Голованов, Валтонен, 2000; Чумасов, Петрова, Коржевский, 2011; Macallum, 1886; Epple, 1969; Van Noorden, 1972; Brinn, 1975; Wagner, McKeown, 1981; Bjenning, 1990; Agulleiro, 1993; Al-Mahrouki, Youson, 1998 Carbone, 2011). Однако многочисленные работы концентрируются в пределах легкодоступных объектов исследований – лабораторных животных и распространенных в природе видов. Выбор исследуемых животных в нашей работе – рыб и амфибий – неслучаен. Филогенетически рыбы относятся к первичноводным животным, а амфибии – самый древний класс наземных позвоночных, что делает эти группы наиболее интересными для исследования. Данные о структурно-функциональных особенностях поджелудочной железы у представителей этих групп необходимы для понимания адаптивных и патологических изменений этого органа у человека. Помимо этого, широкий спектр биологических адаптаций, приобретенных этими группами животных в связи с чрезвычайно широким ареалом обитания, также требует исследования. Данные о строении поджелудочной железы рыб и амфибий носят фрагментарный характер и не охватывают группы целиком. Так, сравнительно-анатомические работы по поджелудочной железе рыб, как правило, включают несколько отрядов одного класса, а исследования поджелудочной железы земноводных не простираются далее нескольких родов (Порошин, 2006; Желтов, Дворецкий, Северов, Павлюченко, Дерень, 2012; Babkin, 1932; Thomas, 1940; Winbladh, 1976; Ahrén, 2000; Bosi, 2004; Cabrera-Vásquez, 2009; Brass, 2010;). Имеется четыре основных теории эволюционного развития поджелудочной железы. Первая заключается в обособлении органа из кишки методом компактизации. Следующая теория сходна с предыдущей и показывает, что предковым организмом является личинка миноги, так как у этого вида поджелудочная железа представлена отдельно лежащими клетками, встроенными в эпителиальную выстилку кишечной трубки. Еще одна теория предполагает происхождение эндокринных клеток, а, следовательно, и эндокринной части железы, из клеток ацинарной ткани путем выселения. Последняя из наиболее популярных теорий основана на распределении регуляторных пептидов в теле поджелудочной железы. Эти теории неясны и отрывочны, так как ни одна из них не объясняет всех основных процессов (Epple, 1973; Jönsson, 1991; Lozano, 1991; Falkmer, 1995). Недостаточный набор видов, принадлежащих к различным классам, приводит к множеству диаметрально противоположных выводов, как по морфологическим закономерностям, так и по интерпретации полученных результатов. До сих пор неизвестно, существует ли прямая зависимость строения поджелудочной железы от экологии вида животных. Таким образом, изучение строения поджелудочной железы рыб и амфибий имеет актуальное значение, как в теоретическом аспекте, так и для практического применения. Цель исследования – изучение анатомического строения, гистологической и иммуногистохимической организации поджелудочной железы рыб и амфибий и ее адаптации к биологии пищеварения. Задачи исследования: 1. Провести сравнительно-морфологическое исследование экзокринной и эндокринной частей поджелудочной железы, организации ее кровеносной системы, иннервации и анатомического строения у различных видов надкласса рыб и класса амфибий. 2. Изучить гистологические и иммуногистохимические особенности пространственной организации и распределения инсулин-, глюкагон-, соматостатин-, и продуцирующих панкреатический полипептид клеток в эндокринной части поджелудочной железы, при помощи моноклоналных и поликлональных антител, у представителей надкласса рыб и класса амфибий. 3. При помощи набора иммуногистохимических маркеров к антигенам нервной системы (SNAP-25, NCAM, нейрон-специфическая энолаза (NSE), нейрон-специфический β-III тубулин, нейрофилламентам, S-100, нейропептид Y, PGP-9,5, синапсин, синаптофизин, тирозин гидроксилаза) провести анализ организации нервного аппарата эндокринной части поджелудочной железы у различных видов анамний. 4. Определить роль цитологических изменений в инсулин-, глюкагон-, соматостатинпродуцирующих клетках в различные периоды годового цикла у представителей класса амфибий: пипы суринамской; обыкновенной и зеленой жабы; травяной и озерной лягушек. Научная новизна Впервые проведено комплексное исследование морфологического строения поджелудочной железы рыб и амфибий как представителей древнейших позвоночных в филогенетическом аспекте. Выявлена связь морфологической организации поджелудочной железы анамний с биологией питания. Доказано отсутствие закономерностей в распределении различных типов эндокринных клеток внутри островков в зависимости от типов питания. У акулы впервые среди позвоночных выявлен синусоподобный тип строения поджелудочной железы. При помощи линейки иммуногистохических нейромаркеров исследована система регуляции поджелудочной железы рыб и амфибий. У рыб, в отличие от амфибий, установлено отсутствие иннервации островков. Исследованы сезонные изменения в клеточной организации островков у некоторых видов амфибий. В период спаривания среди эндокринных клеток островка преобладают инсулин-позитивные клетки в фазе накопления секрета, а в период анабиоза – глюкагонпозитивные клетки. Научно-практическая значимость Работа носит фундаментально-теоретический характер. На основании гистологического и иммуногистохимического исследования установлены закономерности филогенетических изменений поджелудочной железы у анамний и выявлены особенности ее морфологической организации в зависимости от биологии питания вида. Результаты работы вносят несомненный вклад в сравнительно-морфологические исследования, в эволюционную гастроэнтерологию, отражающую возможности адаптации поджелудочной железы к изменениям типа питания животных в процессе годового цикла и филогенеза. Полученные данные о функции поджелудочной железы рыб и амфибий могут быть использованы при интерпретации результатов сравнительно-видовых экспериментов. Проведенные исследования показывают разнообразие строения эндокринной ткани у низших позвоночных, что вносит вклад в исследование происхождения диабетогенных механизмов, характерных для млекопитающих и человека. Результаты исследования представляют общенаучный интерес в области биологии, имеют прикладное значение в изучении и углублении знаний о функциональной деятельности поджелудочной железы животных. Помимо этого практическое значение полученных данных заключается в возможности определения морфогенетических закономерностей инсулином – опухолей, в формировании которых могут иметь место рекапитуляции морфологических этапов развития экзокринных и эндокринных частей поджелудочной железы. Внедрение в практику в курс лекций на кафедре гистологии и биологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Положения, выносимые на защиту 1. Установлены эволюционные изменения соотношения инсулин-, глюкагон- и соматостатин-продуцирующих клеток в островках и островковоподобных структурах у анамний. 2. На основе гистологических и иммуногистохимических методов выявлена закономерность в строении поджелудочной железы анамний в зависимости от количества и качества потребляемой пищи. 3. Установлено существование двух типов регуляции активности эндокринной части поджелудочной железы, которые состоят в том, что сигнал между эндокринными клетками передается при помощи регуляторных нейропептидов и, помимо этого имеется разветвленная сеть нервных окончаний. 4. Показано гистологическими и иммуногистохимическими методами, что соотношение инсулин-, глюкагон-, соматостатин-позитивных клеток меняется в зависимости от годовой цикличности, которая отражает температурные, гормональные и пищевые колебания. Апробация работы Результаты данной работы были представлены на XII Международной научнопрактической конференции «Наука и современность» (Новосибирск, 2011), I международной научной конференции «Современное естествознание: вопросы и ответы» (Санкт-Петербург, 2011), IV Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2011» (Санкт-Петербург, 2011), научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2012), на межлабораторной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (Москва, 2013). Публикации материалов исследования По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы». Работа изложена на 182 страницах машинописного текста, содержит 41 иллюстрации и 3 таблицы. Список использованной литературы содержит 272 источника (из них 85 в отечественных и 187 публикации в зарубежных изданиях) СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Работа выполнена на материале поджелудочной железы рыб и амфибий (эмбрионы, мальки, половозрелые особи). Для исследований отбирались особи различного возраста одного и того же вида. Часть материала поджелудочной железы рыб была отобрана из коллекции лаборатории развития нервной системы ФГБУ «НИИМЧ» РАМН, и была собрана в 2007-2011 гг. в рыбоводческих хозяйствах Московской области: «Рыбхоз Клинский», «Нарские острова», «Двенди», «Константиново», в фирмах по поставке аквариумных животных «Aqua-logo» и «Day sea», у лицензированных частных рыболовов Московской, Астраханской, Санкт-Петербургской и Беломорской областей. Виды рыб, использованные в работе: акула коричневополосая (Chilosyllium punctatum Müller and Henle, 1838), акула короткоперая колючая, или катран (Squalus acanthias L., 1758), скат хвостокол (Potamotrygon motoro Müller & Henle, 1841), скат шиповатый (Raja), стерлядь (Acipenser ruthenus L., 1758), угорь речной (Anguilla anguilla L., 1758), форель радужная (Salmo irideus L., 1758), ряпушка европейская, или рипус (Coregonus albula L. 1758), корюшка малоротая (Hypomesus olidus L., 1758), щука обыкновенная (Esox lucius L., 1758), карп (Carpio carpio L., 1758), сазан (C. carpio L., 1758), лещ (Abramis brama L., 1758), краснопёрка, или плотва краснопёрая (Scardinius erythrophthalmus L., 1758), уклейка обыкновенная (Alburnus alburnus L., 1758), сом обыкновенный (Silurus glanis L., 1758), пангасиус, или акулий сом (Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878), сом оринокский, или фрактоцефалус краснохвостый (Phractocephalus hemiliopterus Bloch & Schneider, 1801), ласкирь (Diplodus sargus L., 1758), спикара, или синий окунь (Spicara flexuosa Rafinesque, 1810), калкан черноморский, или ромб азовский (Psetta maeotica Pallas, 1814), арована серебрянная, или рыба дракон (Osteoglossum bicirrhosum Cuvier, 1829), минога (Lampetra fluviatilis L. 1758), окунь речной, или окунь обыкновенный (Perca fluviatilis L. 1758), судак обыкновенный (Sander lucioperca L. 1758), змееголов красный (Channa micropeltes Cuvier, 1831). При работе с материалом земноводных использовали животных из коллекции лаборатории развития нервной системы ФГБУ «НИИМЧ» РАМН, полученные от фирм по продаже экзотических животных «Гекко», «Папа Карло» и от частных, лицензированных заводчиков города Москвы и Челябинска. Виды амфибий, использованные в работе: аксолотль мексиканской амбистомы (Ambystoma mexicanum, Shaw and Nodder, 1798), тритон обыкновенный (Lissotriton vulgaris, L. 1758), тритон краснобрюхий (Pachytriton labiatus Unterstein, 1930), тритон крокодиловый (Tylototriton vemucosus, Anderson 1871), углозуб сибирский, или тритон четырёхпалый (Salamandrella keyserlingii Dybowski, 1870), жаба серая (Bufo bufo или Bufo vulgaris L.1758), жаба зеленая (Bufo viridis, Laurenti 1758), жаба ага (Bufo marinus L. 1758), жаба чернорубцовая (Bufo melanostictus Schneider, 1799), пипа суринамская (Pipa Pipa L. 1758), лягушка травяная (Rana temporaria, L. 1758), лягушка озерная (Rana ridibunda, Pallas 1771), лягушка остромордая, или лягушка болотная (Rana arvalis Nilsson, 1842), квакша краснопятнистая (Phrynohyas venulosa, Laurenti 1768), литория пустынная (Litoria rubella, Gray 1842), лягушка-помидор, или узкорот томатный (Dyscophus antongilii Grandidier, 1877), веслоног лишаистый (Theloderma corticale, Boulenger 1903), веслоног белокаёмчатый (Boophis albilabris, Boulenger 1888), калоула украшенная (Kaloula pulchra Gray 1831). Общее количество животных составляло: для рыб 108 особей, принадлежащих 26 видам; для амфибий 88 особей, принадлежащих 19 видам. Тактика сбора материала заключалась в отборе животных из разных семейств, имеющих различную экологию – тип питания, место обитания и т.д. После получения животных проводили их эвтаназию согласно международным правилам (Hampson, 1990; Drummond, 2009; Kilkenny, 2010; Carbone, 2011). После эвтаназии животных взвешивали на электронных весах фирмы «Sartorius». У рыб измерение длины тела проводили от начала рыла до конца хвостового плавника по боковой линии и наибольшей толщины по общепринятой методике (Правдин, 1939; Гуртовой и др., 1976; Баклашова, 1980; Зиновьев, Мандрица, 2003). Вскрытие осуществлялось по срединной линии от нижней челюсти до анального отверстия. Далее надрез проходил по концу рыла с двух сторон туловища, что обеспечивало наилучший обзор при фотографировании. У амфибий измерение длины тела проводилось от носа до кончика хвоста и наибольшей толщины – обхват туловища за передними лапками. Вскрытие осуществлялось по срединной линии от диафрагмы до анального отверстия, далее от срединной линии под прямым углом в стороны (Гуртовой и др., 1978; Ноздрачев, Поляков, 1994). Для контроля выполнялось препарирование млекопитающих по стандартной методике (Карташев и др., 1981; Гуртовой, Дзержинский, 1992). Во время вскрытия проводили поэтапное фотографирование. После получения фотографий поджелудочной железы осуществляли зарисовку стандартным методом. Препаровка включала как извлечение поджелудочной железы с кусочком печени, кишки и желудка, так и разделение ее на фрагменты равного объема (но не более 1х1х1см) для последующей фиксации. При исследовании амфибий поджелудочная железа фиксировалась целиком. Весь материал фиксировали в 10%-м кислом формалине, а поджелудочную железу стерляди фиксировали в жидкости Буэна. Фиксация проходила в течение не менее 14 и не более 23 суток с двумя сменами формалина для амфибий и четырьмя сменами для рыб. При работе с фиксированным материалом из коллекции лаборатории развития нервной системы ФГБУ «НИИМЧ» РАМН проводили смену формалина и выдерживание в нем в течение семи суток. После фиксирования кусочки промывали 70° спиртом и помещали в него на четырнадцать дней. При исследовании мы придерживались международной классификации рыб и амфибий по справочникам: «Рыбы мировой фауны» (Нельсон, 2009), «Пятиязычный словарь названий животных» (Ананьева с соавт. 1988) и «Земноводные и пресмыкающиеся России» (Дунаев, Орлова, 2012). Гистологические методы. Гистологические препараты были приготовлены из всех образцов поджелудочной железы. Для исследования использовали поджелудочные железы, рассеченные на кусочки равного объема (для крупных животных) или целые поджелудочные железы с прилегающими органами и тканями (для мелких животных). Материал обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, диоксане и заливали в гистомикс (Семченко и др., 2006). Серийные срезы 5-8-10 мкм получали на ротационных микротомах фирм «Slee» и «Leitz». Далее части серии (каждые 12-18 срезов) наклеивали на гистологические стекла, по три среза на стекло, оставшиеся срезы наклеивали на стекла покрытые адгезивом. Впоследствии срезы депарафинировали, гидратировали, проводили гистологические окраски гематоксилином Эрлиха – эозин-оранжем (по Доминичи), гематоксилиномпикрофуксином по Ван Гизону (Волкова, Елецкий, 1971), метиловым зеленымпиронином-оранжевым G по Гроссо, а также по методу Маллори и заключали в бальзам (Ромейс, 1953). Окраска гематоксилин-эозином была модифицирована в процессе отработки в связи с неудовлетворительными результатами при исследовании препаратов поджелудочной железы рыб. Выбор метода Доминичи обусловлен наличием специфичной окраски клеток крови, что помогало при ориентировке препарата во время фоторегистрации (рис. 1, А). Окраска по методу Гроссо давала приемлемые результаты, но не достаточно четко выявляла границы между ацинарной и островковой тканью, поэтому она была модифицирована добавлением спиртового раствора альцианового голубого (25% раствор) (рис. 1, Б). Окраска по Ван Гизону применялась для выявления соединительнотканных элементов. Окраска по Маллори проводилась по рутинной гистологической методике (Меркулов, 1956). А Б Рис. 1. Гистологическое исследование поджелудочной железы; примеры гистологических окрасок модифицированных для дальнейшего исследования: А – стерлядь, окраска Гематоксилин -эозином; Б – щука обыкновенная, окраска по Гроссо; ув. 200. Иммуногистохимическое исследование. Иммуногистохимическое исследование проводили на ступенчатых срезах поджелудочной железы. При проведении иммуногистохимических реакций депарафинированные, гидратированные срезы обрабатывали 3%-м раствором перекиси водорода для блокировки эндогенной пероксидазы. В работе использовали антитела к гормонам эндокринных клеток поджелудочной железы (инсулину, глюкагону, соматостатину, панкреатическому полипептиду) и некоторым антигенам нервной системы (SNAP-25, NCAM, нейронспецифическая энолаза (NSE), нейрон-специфический β-III тубулин, нейрофилламентам, S-100, нейропептид Y, PGP-9,5, синапсин, синаптофизин, тирозин гидроксилаза). Выбор маркеров к эндокринным клеткам обусловлен функциями гормонов, так как регулирование уровня глюкозы в крови позвоночных осуществляется посредством деятельности А-, В- и D- клеток. Что касается панкреатического полипептида, то данные о его присутствии в островках рыб и амфибий единичны (Lozano, 1991). Характеристика примененных в работе антител и условия проведения реакций указаны в таблице 2. При выборе антител к клеткам нервной системы мы руководствовались также наличием небольшого количества работ по исследованию этих белков у анамний. Выбор фирмы производителя конкретных антител основывался на наличии в протоколе рекомендаций к использованию на рыбах и земноводных. Время инкубации антител составляло 45 минут при температуре +24°С; при температуре +20°С – 60 минут; при температуре +29°С – 30 минут. Для визуализации антител использовали стандартные наборы Ultra Vison Detection System, anti-polyvalent фирмы Thermo Scientific. Негативным контролем служили реакции с заменой первых антител фосфатным буфером pH=7,4. Во всех случаях в негативном контроле неспецифическая реакция отсутствовала. Позитивным контролем для исследования гормонов поджелудочной железы рыб и земноводных служили реакции на образцах поджелудочной железы нелинейных мышей дикого типа. Позитивным контролем при исследовании иннервации поджелудочной железы для всех исследованных видов являлась стенка кишечника, присутствовавшая на срезах. Для проведения иммуногистохимических реакций на поджелудочных железах, как рыб, так и амфибий выбирали срезы из центральной области поджелудочной железы с максимальной площадью образца. В реакциях на инсулин, глюкагон и соматостатин использовали серийные срезы, толщиной 10 мкм (для рыб) и 5-8 мкм (для амфибий). Для проведения иммуногистохимических реакций на образцах поджелудочной железы мышей также использовали серийные срезы. Реакции проводили по протоколам, предлагаемым фирмами-производителями. Иммунореактивность антител представлена в таблице 1. Методы микроскопического исследования. Все полученные препараты оценивали визуально с помощью микроскопов Leica DM2500 и Zeizz Axio Imager.A1. Видеозахват осуществляли с помощью камер DFC290, Lomo и программы Image Scope M. При просмотре гистологических препаратов описывали структуру поджелудочной железы всех образцов. Отмечали характер кровоснабжения, иннервации, соединительной ткани и распределение эндокринных и экзокринных клеток. При исследовании уделяли особое внимание структурам эндокринной ткани: наличие или отсутствие соединительнотканной оболочки, наличие входящих нервов и капилляров, количество клеток в обнаруженном скоплении, расположение относительно других структур. При исследовании экзокринной ткани отмечали плотность расположения ацинусов и протоков. При оценке иммуногистохимических препаратов отмечали наличие или отсутствие специфической иммунопозитивной реакции, распределение иммунореактивного материала в ткани железы, локализацию относительно других клеток, форму клеток. В островках исследовали распределение иммунопозитивных к инсулину, глюкагону и соматостатину клеток. Таблица 1 Иммунореактивность антител к белкам эндокринной части поджелудочной железы Вид рыб Антитела К инсулину Стерлядь A.ruthenus Угорь A.Anguilla Форель S.irideus Корюшка H. olidus Щука E. Lucius Карп C. carpio carpio Сазан C.carpio Сом S. Glanis Панга́сиус P.hypophth almus Сом P.hemiliopt erus К глюкагону К соматостатину К РР Мышь монокл . Lab Vision Кролик поликл. Sigma Морск. свинки Sigma Мышь монокл. Sigma Кролик поликл. Lab Vision + + + - + + + - - + - + + + - + + - + + + - - + - + + + - + + - + + + - - + - + + + - - + - + + + - + + + + + + - + + - + + + - + + - + + + Кролик поликл. Abcam козьи поликл. Abcam Результаты исследования и их обсуждение Морфофункциональные особенности организации поджелудочной железы анамний Для изучения морфофункциональных особенностей строения поджелудочной железы рыб и амфибий использовали анатомические и гистологические методы исследования. Строение поджелудочной железы рыб и амфибий. Исследование организации поджелудочной железы у водных анамний (рыб) выявило шесть типов анатомического строения (рис. 2). 1. Диффузный – клетки поджелудочной железы распределены в эпителии и стенке кишечника, выделяют секрет непосредственно в кишку (миноги). 2. Многодольчатый – многочисленные мелкие компактные доли, распределенные в брыжейке кишечника и имеющие собственные экзокринные протоки, впадающие в кишечник. 3. Гепатопанкреас – дольчатые скопления, распределенные в брыжейке кишечника, некоторые из которых частично внедрены в ткань печени, имеющие многочисленные собственные экзокринные протоки, впадающие в кишечник. 4. Лентовидный – тонкие лентовидные доли, вытянутые вдоль тонкого кишечника и его пилорических выростов, имеющие многочисленные экзокринные протоки, впадающие в кишку на всем протяжении доли. 5. Компактный дольчатый – компактная поджелудочная железа, имеющая небольшое количество вытянутых долей, расположенных вдоль кишки, имеющих общий выводной проток, впадающий в кишку в месте соединения долей. 6. Компактный - компактная поджелудочная железа, вытянутая вдоль кишечника, имеющая единственный проток, впадающий в тонкий кишечник в первой его трети. Как частный случай можно рассматривать анатомическое строение ПЖ акулы коричневополосой, у которой поджелудочная железа, имеет единственный проток, впадающий в зоне расположения спирального клапана. К первому типу, при котором поджелудочная железа не оформлена в отдельный орган и клетки ПЖ распределены в эпителии кишечника, относится ПЖ миног (Barrington, 1972; Youson, 1981; Gillett et al., 1996; Youson, 2007). На протяжении продолжительного времени миноги были фильтраторами донного субстрата, - получали пищу мало питательную, но в неограниченном количестве и в постоянной доступности (Анисимова, Лавровский, 1983). Переход миног на паразитический образ жизни повлек за собой компактизацию инсулин-продуцирующих клеток в островковом органе расположенном вблизи желчного протока, обеспечив наличие депо инсулина для моментального введения при необходимости (Яглов, 1978; Youson, 2000; Youson, 2007). К следующему типу относится поджелудочная железа, характерная для сомовых рыб. Появление компактных, несвязанных между собой долек поджелудочной железы, имеющих собственные панкреатические протоки, можно объяснить пищевыми предпочтениями сомовых – всеядных на стадии малька и хищных половозрелых особей. Переходным к следующему типу является поджелудочная железа, состоящая из множественных отдельных долек, имеющих собственные протоки и объединенных жировой тканью так, что при препаровке складывается впечатление о едином дольчатом органе. Подобный тип организации встречается у угря (Ince, 1979; Shu-gen., De-feng, Shoukun, 2003; Kurokawa, Suzuki, 2006). Следующим этапом (типом) анатомического строения поджелудочной железы является наличие в ней длинных лопастей с многочисленными панкреатическими протоками, отходящими от железы в различные стороны. Такой тип строения выявлен у рыб с выраженными пилорическими выростами кишечника (Boldyreff, 1935; Weinreb, Bilstad, 1955; Bucke, 1971; Loewe, Eckmann, 1988). Частным случаем анатомического строения ПЖ является, вероятно, обнаруженный многими авторами гепатопанкретический тип (Smallwood, Derrickson, 1933; Titelbach, 1966; Яглов, 1978; Грищенко, 1999; Youson, 2000; Ильмаст, 2005). Характерное для карпообразных гепатопанкреатическое строение ПЖ встречается у всех изученных нами представителей этого класса независимо от типа питания. Количество ткани ПЖ, внедренной в печень, может изменяться от вида к виду. Это вызвано не только дозированностью пищи, ее количеством, но и температурным диапазоном активного питания. Так, белый амур, имеющий наименьшую долю ПЖ, внедренную в ткань печени (до 25%), питается при температурах от 14 до 25ºС и потребляет пищу с высоким содержанием сахаров, но низким содержанием белка. Период питания при таких условиях уменьшается, как и калорийность пищи, таким образом, потребность в одновременном выбросе ферментов снижается. Это приводит к уменьшению внедренной в печень ткани ПЖ. У всеядных карповых рыб потребности в ферментах несоизмеримо больше и периодичность питания чаще, что сказывается на количестве панкреатических клеток, внедренных в ткань печени (около 70%) (рис. 3). Следующим типом анатомического строения ПЖ рыб является тип, при котором поджелудочная железа имеет более двух долей с единственным панкреатическим протоком. Подобное строение обнаружено нами у представителей хищных рыб – щуки и ласкири. Изменение строение железы повлекло за собой слияние многочисленных панкреатических протоков в единый макропроток, впадающий в тонкую кишку. Однако слияние мелких протоков происходит только в месте соединения самих долей (образования тела железы). После появления сливающихся панкреатических протоков следующим шагом стала компактизация поджелудочной железы до монотела, в редких случаях имеющего 2-3 слабо дифференцированные доли. При такой форме ПЖ обладает разветвленной системой панкреатических протоков, сливающихся в монопроток еще внутри железы. Впадение этого протока в тонкий кишечник происходит в первой его трети. Примером наиболее специализированного строения поджелудочной железы может служить ПЖ акул. У изученных нами акул (катрана и акулы кошачьей коричневополосой) поджелудочная железа имеет единственный проток, впадающий в зоне расположения спирального клапана. Известно, что в спиральном клапане происходит активное расщепление пищи, и он служит рыбам так же как и пилорические выросты (Matthews, Parker, 1950; Sekine, Yui, 1981; El-Salhy, 1984). Детально анализируя полученные результаты и останавливаясь на каждом типе анатомического строения поджелудочной железы рыб отдельно, нами выявлены вероятные причины формообразования и локализации ПЖ: 1. Протяженность и форма тонкого кишечника 2. Наличие порционности питания (соотношение периодов насыщения пищей и периодов вынужденного голода) 3. Физиологические особенности пищеварения Рис. 2. Схемы анатомического строения поджелудочной железы рыб. Зеленым обозначен кишечник, розовым - печень, изумрудным – желчный пузырь и проток, желтым – панкреатические протоки, коричневым поджелудочная железа; желтые вкрапления – инсулин-продуцирующие клетки, синие - глюкагон-продуцирующие клетки, красные соматостатин-проуцирующие клетки. А – распределение эндокринных клеток у миног (А1 минога северная, А2 минога южная); Б – анатомическое строение поджелудочной железы угря; В - анатомическое строение по типу гепатопанкреас (карпообразные); Г – анатомическое строение поджелудочной железы, расположенной между пилорическими выростами (корюшка, окунь) ; Д – анатомическое строение поджелудочной железы щуки; Е – анатомическое строение поджелудочной железы полиптеруса, акул и др. (Е1 – общее строение для данного типа; Е2 – у акул, при наличии спирального клапана). 100% часть, внедеренная в ткань печени 80% 60% 40% свободнолежащая железа 20% 0% карп сазан лещ белый амур Рис. 3. Полиморфизм вариантов организации экзокринной и эндокринной внутри одного (гепатопанкреатического) типа строения поджелудочной железы карпообразных. Таким образом, исходя из физиологических особенностей строения тонкого кишечника и данных, полученных при анатомическом исследовании ПЖ, можно заключить, что форма и расположение поджелудочной железы рыб относительно кишечника связаны с потребностью в обработке ферментами ПЖ получаемой пищи и коэффициентом насыщения. У наземных анамний в отличие от рыб поджелудочная железа менее вариабельна по строению. Однако у всех амфибий она представляет собой компактный орган, имеющий выводной (панкреатический) проток, впадающий в тонкий кишечник. Поджелудочная железа хвостатых амфибий, относительно небольшой, компактный орган, расположенный в пределах поддерживающих его связок, и прилежащий к двенадцатиперстной кишке (Фрай, 1958; Wonderly, 1963; Penhos, 1973). Наши результаты частично подтверждают данные этих исследователей. Так, у всех исследованных нами тритонов поджелудочная железа представлена компактным органом с единственным панкреатическим протоком, впадающим в последнюю треть тонкой кишки. Однако количество долей, обнаруженных у этих земноводных, значительно отличается от указанных в литературе. Наше исследование показало наличие от двух до семи долей поджелудочной железы, вытянутых в одном направлении вдоль желудочно-кишечного тракта. При сравнении морфологии поджелудочной железы рыб и амфибий можно заключить, что шесть типов организации железы, выявленной нами при исследовании рыб, вполне применимы и к амфибиям. Наземные анамнии, как животные с хищническим образом жизни удовлетворяют характеристикам пятого и шестого типа организации поджелудочной железы. ПЖ хищных рыб относится к следующим типам: компактная поджелудочная железа, разделенная на небольшое количество вытянутых долей расположенных вдоль кишки и общий выводной проток, и компактная поджелудочная железа, вытянутая вдоль кишечника, имеющая единственный проток, впадающий в тонкий кишечник в первой его трети. Строение эндокринного аппарата поджелудочной железы первичноводных позвоночных Строение эндокринной части поджелудочной железы водных анамний Проведенные гистологические и иммуногистохимические исследования показали наличие нескольких вариантов организации поджелудочной железы на тканевом уровне. Нами выявлены два типа организации экзокринной части: 1. Неоформленная, имеющая протоки, но представленная скоплениями клеток, не образующих ацинусы. 2. Оформленная, имеющая разветвленный трабекулярный аппарат и ацинусы, характерные для млекопитающих и человека. И шесть типов организации эндокринной части: 1. Отдельные клетки – все типы эндокринных клеток локализованы независимо друг от друга, капсула отсутствует. 2. Лентовидные скопления – клетки выстраиваются в цепочки (шнуры) или ленты, которые могут состоять из одного или нескольких типов эндокринных клеток, капсула отсутствует. 3. Скопления неправильной формы – клетки образуют скопления из 3-5 и более клеток, не имеющих единой соединительнотканной капсулы и принадлежащие к одному или нескольким эндокринным типам. 4. Островки, характерные для млекопитающих островки имеющие соединительнотканную капсулу и включающие несколько типов эндокринных клеток: А. «плащевого типа» – инсулин-продуцирующие клетки в центре, глюкагонпродуцирующие по периферии, и соматостатин-продуцирующие клетки, занимающие промежуточное положение. Б. «смешанные» – эндокринные клетки равномерно распределены по всему островку. В. «инвертированные островки плащевого типа» – глюкагон-продуцирующие клетки занимают центральное положение, инсулин-продуцирующие – периферию островка, соматостатин-продуцирующие клетки – промежуточное положение. 5. Островковые конгломераты – скопления островков, имеющих слабовыраженную собственную капсулу (в некоторых случаях она может отсутствовать) и общую соединительнотканную капсулу. 6. Встроенные отдельные клетки – отдельные эндокринные клетки закрытого и открытого типа встроенные в эпителий кишечника. Первый вариант тканевой организации заключается во встраивании клеток эндокринного аппарата в покровный эпителиальный слой кишечника, он выявлен у миноги, что подтверждает данные других исследователей (Van Noorden, et al., 1972; Cheung et al., 1991; Elliott, Youson, 1993). Так, нами обнаружены инсулин-, глюкагон- и соматостатин- продуцирующие клетки, локализованные в кишечнике взрослой миноги. Однако островков или островковоподобных структур обнаружить не удалось, что противоречит некоторым литературным данным (Elliott, Youson, 1986; Youson, Cheung, 1990; Conlon et al., 1995). Исследование поджелудочной железы хрящевых рыб подтвердило данные о ее островковом строении у акулы-катрана и выявило многочисленные островки иммунопозитивные к инсулину, глюкагону и соматостатину, что подтверждается более ранними работами (Kobayashi, Ali, 1981; El-Salhy, 1984). При изучении поджелудочной железы коричневополосой акулы нами выявлен неизвестный ранее тип организации ПЖ. Отсутствие экзокринной и эндокринной ткани в обычном понимании этого слова, наличие в теле железы клеток крови, зональность в распределении клеток экзо- и эндокринного типа – все это говорит о новой синусоподобной, структурной организации органа. Единственным отличием биологии исследованного вида от других представителей придонных акул является то, что коричневополосая акула может оставаться в приливной зоне после отлива в небольших пересыхающих озерцах. В некоторых источниках указывается на возможность этой акулы находиться вне водной среды более 12 часов (Leonard, 2001). Возможно, что именно это послужило причиной подобного формирования поджелудочной железы. Исследования скатов показывают наличие различных форм компактизации эндокринных клеток. В работах встречаются данные как об оформленных островках, имеющих соединительнотканную капсулу (Jönsson, 1991; Reinecke et al. 1992), так и об эндокринной ткани, представленной скоплениями клеток или тонкими слоями, окружающими панкреатические протоки (Sekine, Yui, 1981). Выбрав шипохвостого ската (Bathyraja spinicauda) и хвостокола речного (Potamotrygon motoro), мы не только исследовали поджелудочную железу ранее неизученных рыб, но и предположили наличие значительных различий в строении железы, связанные с разницей в биологии видов. Однако структура железы у обоих видов оказалась практически идентичной. Так, у них присутствует экзокринная ткань, характерная для млекопитающих, а эндокринные клетки не образуют островков или островковоподобных структур и распределяются тонкими лентовидными скоплениями или конгломератами неправильной формы около сосудов и капилляров. Помимо этого выявлено некоторое преобладание эндокринных клеток ближе к периферии железы. Хрящевые ганоиды (Chondrostei) и ангвиллоидные (Anguillomorpha), являются филогенетически наиболее древними группами среди Actinopterigii. Поджелудочная железа стерляди и угря как по нашим, так и по литературным данным образует компактный оформленный орган (Epple, Brinn, 1975, 1987; Kim, 2000; Мускалу-Наджи, 2006). При исследовании стерляди нами показано наличие всех типов эндокринных клеток в поджелудочной железе, а также распределение эндокринных клеток в теле железы, при котором островки содержат исключительно инсулин-позитивные клетки, а глюкагон- и соматостатин-позитивные распределены по внешней границе островка. В островках поджелудочной железы угря речного(Anguilla anguilla L., 1758) обнаружены все виды эндокринных клеток (Noorden, Patent, 1978), а А- и В-клетки выявлены также и вне островковых образований (Clarke, Witcomb, 1980). В нашем исследовании мы обнаружили островки различного размера – крупные (до 300 мкм диаметром), которые являются, по всей видимости, основными островками; более мелкие, добавочные, островки; единичные эндокринные клетки и небольшие кластеры. Это дополнило имеющиеся данные по поджелудочной железе данного вида. Помимо этого мы подтвердили наличие в поджелудочной железе угря основных типов гормонпродуцирующих клеток. Представители отряда карпообразных наиболее изучены, так как эти виды легкодоступны и многочисленны. Исследования поджелудочной железы этих рыб выявило наличие основных типов эндокринных клеток – инсулин-, глюкагон-, соматостатин-, РР- позитивные клетки (Rombout et al., 1979; Rombout, Taverne-Thiele, 1982; Jeong, 2002; Ostaszewska et al., 2003; Ward et al., 2007; Parsons et al., 2009). Наша работа показала наличие характерного для ранее исследованных видов (карп, сазан, барбус суматранский, язь, данио рерио, карась и др.) типа организации поджелудочной железы у леща, уклейки и белого амура, что дает возможность говорить о наличии единого типа гистологической и иммуногистохимической организации органа для всех представителей рода. При исследовании поджелудочной железы щуки обыкновенной нами выявлена компактная форма и строение эндокринной части железы, в целом соответствующее данным некоторых исследователей (Bucke, 1971; Wagner, McKeown, 1981). У щукообразных нами, как и другими авторами, обнаружены островки (Bucke, 1971; Wagner, McKeown, 1981). Однако мы впервые выявили присутствие островков гигантского размера, имеющих смешанный тип строения, и подтвердили наличие небольших островков плащевого типа. Эндокринная часть поджелудочной железы сомообразных (на примере канального сомика и обыкновенного сома) представляет собой островки различного размера, иногда образующие скопления. В островках сомов выявлены все типы клеток, а строение организовано по плащевому типу (Яглов, 1978; Kozarić et al., 2008; Dezfuli et al., 2011). Подобное строение обнаружено авторами у окунеобразных (Lozano et al., 1991 а, б; Agulleiro et al., 1993; Lee et al., 2004), лососеобразных (Epple, 1969; Яглов, 1978; Wagner, McKeown, 1981; Youson, Al-Mahrouki, 1999), аравановых (Al-Mahrouki, Youson, 1998; 1999). В наших исследованиях, мы подтвердили эти данные и дополнили список видов, обладающих подобным строением эндокринной части поджелудочной железы. Однако конгломераты, выявленные у форели, являются, по нашему мнению, островковым органом. Изученные нами рыбы различаются как по экологии (морские, пресноводные и проходные), так и по типу питания (хищники, всеядные и растительноядные). Однако нам не удалось выявить связи между строением эндокринной части ПЖ и образом жизни рыб. Несмотря на обширные данные по биологии изученных видов, нам не удалось обнаружить причину различного распределения эндокринной ткани внутри поджелудочной железы. Вероятно, наличие такого многообразия показывает все пути развития железы от наиболее архаичного к современному типу (рис. 4). Рис. 4. Типы организации эндокринной ткани в поджелудочной железе анамний. Красным цветом: инсулин-, синим – глюкагон, зеленым – соматостатин-продуцирующие клетки. Однако на основании полученных данных нельзя определить первичный тип поджелудочной железы. Если предположить, что наиболее архаичным является поджелудочная железа с неоформленной эндокринной и экзокринной тканью, наблюдающаяся у акулы коричневополосой, то эндокринные клетки, включенные в покровный эпителиальный слой кишечника, у миног, могут быть отдельной ветвью филогенетического древа рыб. Островки плащевого типа наиболее часто встречаются у представителей исследованного класса, и, возможно, являются конечным этапом развития островковой ткани поджелудочной железы. Строение эндокринной части поджелудочной железы наземных анамний. Исследование поджелудочной железы наземных анамний, проведенное на 19 видах амфибий, принадлежащих к различным семействам, позволило выявить ранее не известные типы структуризации эндокринной части ПЖ. При исследовании тритонов показано, что эндокринная часть их поджелудочной железы представлена единичными клетками и клетками, образующими скопления. Среди эндокринных клеток выявлены четыре основных типа, что соответствует работам других авторов (Яглов, 1976; Putti et all., 1990). Buono, Putti в 2004 году выявили поляризацию секреторных гранул в сторону капилляров, что также подтверждено нашими исследованиями. Однако нами впервые выявлена тенденция к ассоциированию глюкагонпродуцирующих клеток с капиллярами, и, в случае полиморфного питания исследуемого вида, наличие подобного контакта у инсулин-продуцирующих клеток. Помимо этого в нашей работе впервые было описано строение поджелудочной железы в целом и эндокринного аппарата в частности у крокодилового тритона, имеющего наиболее архаичное строение органа, и тритона коротконогого краснобрюхого, ведущего водный образ жизни и имеющего ряд значительных отличий в биологии от европейских тритонов. При исследовании аксолотля мексиканской амбистомы нами показано наличие у него телец Брокмана, что показывает возможный путь эволюции структуры железы. Однако, крупные островки, обнаруженные у амблистом другими авторами (Frye, 1958; Пузырев и др., 1974; Conlon et all., 1985; Hansen et all., 1989; Maake et all., 2001) в поджелудочной железе исследованного вида, нам выявить не удалось. Среди бесхвостых амфибий, исследованных нами, наиболее консервативным по строению эндокринной ткани была суринамская пипа. Единичные исследования поджелудочной железы представителя данного вида ограничены сравнением гормонов инсулина и глюкагона с этими гормонами у шпорцевой лягушки (Matuttea, Conlon, 2000). Нами впервые изучено строение поджелудочной железы пипы суринамской и выявлено значительно сходство ее строения со структурой поджелудочной железы тритонов. Так, нами показаны скопления клеток неправильной формы, не образующие островков, принадлежащие трем эндокринным типам – инсулин-, глюкагон-, соматостатинпродуцирующим. Структура экзокринной части ПЖ пипы суринамской напоминает таковую у животных и человека: имеет выраженные секреторные клетки и разветвленную сеть протоков, сливающуюся в единый панкреатический проток. Следует отметить «жесткий» соединительно-тканный каркас, пронизывающий всю железу и не характерный для других амфибий. Обширные исследования посвящены поджелудочной железе подотряда жабообразных (Epple., 1966; Accordi et all., 1998). В нашем исследовании поджелудочной железы серой жабы мы получили данные, подтверждающие работы авторов по клеточному составу и распределению гормон-секретирующих клеток. Но нами впервые показаны не только наличие неоформленных скоплений клеток, но и характер их группирования – вокруг капилляра. Дальнейшее ветвление капилляров приводит к формированию вокруг островка капиллярной сети. В клетках, иммунопозитивных к инсулину,наблюдается поляризация секреторных гранул в сторону капилляров независимо от удаленности от них. Кроме этого, мы обнаружили, что большая часть глюкагон-позитивных клеток располагается в поджелудочной железе серой жабы по одиночке, небольшими группами и в виде кольцевых образований, прилежащих к сосудам или экзокринным протокам. При исследовании поджелудочной железы жабы аги впервые было выявлено, что инсулин продуцирующие клетки, образуя крупные скопления, которые не составляют многослойные структуры, а наблюдаемое нами островковоподобное скопление разделяется на моно слои. Также впервые получены данные о том, что глюкагон-позитивные клетки у жабы аги не контактируют с капиллярами. Мы показали, что у жаб этого вида присутствуют специализированные островки, содержащие все три типа клеток, хотя и не обособленные от окружающей экзокринной ткани специфической соединительнотканной оболочкой. Нами впервые проведены исследования поджелудочной железы жабы чернорубцовой (Bufo melanostictus Schneider, 1799). В отличие от исследованных другими авторами видов жаб у данного животного в островковоподобных структурах присутствуют только инсулин-позитивные клетки, хотя организация островков повторяет обнаруженную у жабы аги. Глюкагонпозитивные клетки чернорубцовой жабы образуют поля одиночных клеток одинаковой направленности. Островково-подобных структур глюкагон- и соматостатинсекретирующие клетки не образуют. У представителей настоящих лягушек (Rana) выявлены тельца Брокмана (Яглов, 1976; Trandaburu et al., 1995; Etayo et al., 2000), содержащие основные типы эндокринных клеток – инсулин-, глюкагон- и соматостатин продуцирующие. Эндокринная часть поджелудочной железы исследованных нами травяной и озерной лягушек представлена эндокринными клетками, встроенными в ацинусы экзокринной ткани, что подтверждает работы других исследователей (Trandaburu et al., 1995; Etayo et al., 2000). Исследования поджелудочной железы квакш, микроквакш и ракофорид в нашей работе проведены впервые. У квакши краснопятнистой выявлен архаичный тип строения поджелудочной железы, сопоставимый с организацией органа у пипы суринамской. Эндокринные инсулин-, глюкагон- и соматостатин-продуцирующие клетки распределены между ацинусами экзокринной ткани хаотично, по одиночке. В редких случаях нами обнаружены скопления по 3-5 клеток. При этом глюкагон-продуцирующие клетки, вероятно, обеспечивают прямой и не прямой путь транспорта гормонов т.к. каждая глюкагон-продуцирующая клетка снабжена выростами, направленными как в межклеточное пространство, так и в капилляры. Исследование нами поджелудочной железы литории пустынной показало более «продвинутое» строение, нежели у краснопятнистой квакши. У литории встречаются уже не только отдельные или собранные в небольшие группы эндокринные клетки, а также островковоподобные монотипные структуры, состоящие из инсулин- или глюкагон-секретирующих клеток. Организация соматостатин-продуцирующих экзокринных клеток более консервативна, и эти клетки все еще остаются рассредоточенными между ацинусами. Эндокринная часть поджелудочной железы квакши калоулы украшенной образована инсулин-продуцирующими клетками, контактирующими с капиллярами, но образующими не скопления, а островки. Глюкагон-продуцирующие клетки ассоциированы с островками и с капиллярами, а соматостатин- продуцирующие клетки чрезвычайно редки, но также имеют отростки, направленные к капиллярам, что предполагает выброс гормонов в кровь. У ракофарид с капиллярами ассоциированы только инсулин-продуцирующие клетки, а соматостатин- и глюкагон-позитивные в островках и экзокринной паренхиме с капиллярами не связаны и не участвуют в формировании телец, которые характерны для инсулин-продуцирующих клеток. При сравнении эндокринной части поджелудочной железы рыб и амфибий можно заключить следующее: многообразие видов с одной стороны и разница в экологии с другой, дают возможность оценить уровень морфогенетических адаптаций различных животных к среде обитания. Нервный аппарат поджелудочной железы рыб и амфибий Исследование нервного аппарата поджелудочной железы рыб и амфибий проводилось гистологическими и иммуногистохимическими методами. Полученные нами результаты об иммунореактивности клеток поджелудочной железы рыб к антителам к нейрон-специфической энолазе (NSE), β-III тубулину, S-100 и NPY показали, наличие двух механизмов контроля за функциональной активностью поджелудочной железы. Подобные выводы также встречаются в литературе (Klein, 1970; El-Salhy, 1984; Pana et al., 1992; Chow, 1997; Putti et al., 2000), однако исследования с одинаковым набором антител для всех выбранных видов не проводилось. Наиболее архаичный механизм построен на прямой регуляции активности эндокринных и экзокринных клеток со стороны периферической нервной системы. Он осуществляется через входящие нервные волокна, иммунопозитивные к β-III тубулину. Этот вариант был обнаружен у акулы, стерляди и ската, в ПЖ которых были найдены специализированные нервные клетки. Иммунореактивность клеток эндокринной и экзокринной ткани к нейропептиду Y позволила предположить наличие другого механизма регуляции, за счет сигнальных нейропептидов. По-видимому, нехарактерные для ПЖ нейропептиды появились в эволюции для контроля за секреторной или морфогенетической активностью эндокринных клеток. Хотя в нашей работе мы не исследовали принципы взаимодействия секреторных клеток посредством нейропептидов, но на основании работ других авторов возможно утверждать наличие такого механизма (Bjenning, 1988, 1990, 1993; Lozano, et al., 1991; Cheung, 1991; Chow, 1997; Ahre´n, 2006). Следовательно, можно заключить, что происхождение нервного аппарата ПЖ не зависит от уровня дифференцировки и морфологического обособления эндокринной и экзокринной ткани. Эти данные позволяют предположить, что эволюционное становление нервного аппарата ПЖ происходило преимущественно под влиянием развития специфических механизмов регуляции углеводного обмена. В отличие от рыб у амфибий присутствует разветвленная нервная сеть, которая выявляется гистологическими методами и показывает иммунопозитивную реакцию на все использованные типы маркеров. Так, нейрон-специфическая энолаза (NSE) экспрессируется в ауэрбаховском сплетении кишечника и экзокринных клетках поджелудочной железы (крокодиловый, обыкновенный тритон), в клетках, окружающих артериолы и образующих группы (тритон коротконогий краснобрюхий).Также нейронспецифическая энолаза выявлена в клетках, ассоциированных с островками и в единичных клетках, рассеянных между ацинусами (квакша краснопятнистая, лишаистый веслоног). Практически во всех клетках как экзокринной, так и эндокринной ткани (литория пустынная), экспрессируется NSE как в островках, так и в отдельных клетках (калоула украшенная), встречаются как отдельно, так и небольшими скоплениями (лишаистый веслоног), в стенке кишечника и стенках протоков (лягушка травяная). Иммунопозитивная реакция к нейрофиламентам (NF) выявлена нами только в периферических нервах кишечника у крокодилового и обыкновенного тритона. Иммуногистохимическое исследование с антителами к белку S-100 показало наличие иммунопозитивной реакции в апикальной части экзокринных клеток поджелудочной железы (крокодиловый тритон). В нервных волокнах S-100 выявлен у обыкновенного тритона, а в местах локализации инсулин- и соматостатинпродуцирующих клеток у тритона коротконогого краснобрюхого и пипы суринамской. S- 100 проявляет иммунопозитивную реакцию в стенках артерий (пипа суринамская, жаба серая) и в ассоциированых с инсулин-позитивными клетках (квакша краснопятнистая). Также этот белок экспрессируется в клетках островка и некоторых отдельных клетках, расположенных в экзокринной паренхиме (калоула украшенная, жаба серая), в виде одиночных клеток в паренхиме ПЖ, но значительное их количество ассоциировано с островками (лишаистый веслоног). Наличие экспрессии белка S-100 выявлено нами как в отдельных клетках, так и в островках (белокаемчатый веслоног), в зонах локализации инсулин-продуцирующих клеток. Однако иммунопозитивная реакция отсутствовала в обнаруженых нами нервах (жаба чернорубцовая). Белок S-100 локализован в клетках, ассоциированных с тельцами Брокмана (лягушка озерная) и в отдельных клетках экзокринной паренхимы железы (аксолотль). Таким образом белок S-100 оказался наиболее консервативным для исследуемых амфибий. Исследование экспрессии β-III тубулина в поджелудочной железе амфибий выявило локализацию этого белка в одиночных клетках, расположенных между ацинусами (обыкновенный тритон), в стенках экзокринных протоков и в зоне пролиферации кишечного эпителия, однако отсутствует в нервах (лишаистый веслоног), клетках экзокринной части поджелудочной железы (белокаемчатый веслоног). Этот белок ассоциирован с капиллярами и эндокринными клетками ПЖ, в виде гранул, в зонах пролиферации крипт кишечника (жаба серая, чернорубцовая жаба), экспрессированы в секреторных клетках кишечника (лягушка озерная), в нервах, как стенки кишечника, так и во всех тонких и крупных нервах в паренхиме поджелудочной железы (аксолотль). Иммуногистохимическое исследование выявило наличие нейропептида Y в местах локализации инсулин- и соматостатин-продуцирующих клеток (пипа суринамская), в стенках экзокринных протоков и в зоне пролиферации кишечного эпителия. Но он отсутствует в нервах (лишаистый веслоног). Нейропептид Y выявлен в клетках экзокринной ткани (белокаемчатый веслоног), в зонах пролиферации крипт кишечника (жаба серая, жаба чернорубцовая), в нервах, как стенки кишечника, так и во всех тонких и крупных нервах в паренхиме поджелудочной железы (аксолотль). Такое распределение показывает вероятную неспецифичность маркеров β-III тубулин и нейропептид Y для нервной ткани исследованных земноводных. Таким образом, несмотря на наличие разветвленного нервного аппарата в поджелудочной железе большинства исследованных амфибий, нейральная регуляция процессов происходит посредством нейропептидов. Исходя из литературы и проведенной работы, можно с уверенностью говорить о преобладании в поджелудочной железе рыб и амфибий пептидного типа регуляции над нервным. По-видимому, у низших позвоночных в процессе эволюции появилось два пути косвенного контроля за транспортом гормонов ПЖ. Наиболее архаичный механизм построен на прямой регуляции активности эндокринных и экзокринных клеток со стороны периферической нервной системы. Этот вариант обнаружен у акулы, стерляди и ската, в ПЖ которых были найдены специализированные нервные клетки, являющиеся предшественниками нейроинсулярных комплексов млекопитающих. Другой механизм построен на том, что эндокринные клетки приобрели способность влиять на дифференцировку окружающей ткани за счёт синтеза регуляторных пептидов. Особенности строения поджелудочной железы амфибий в различные периоды годового цикла Исследование проводилипри помощи иммуногистохимических методов. Был использован материал поджелудочной железы самцов пяти видов бесхвостых земноводных в брачный период, период активного питания и анабиоза: пипы суринамской; обыкновенной и зеленой жабы; травяной и озерной лягушек. У всех исследованных представителей земноводных сохраняется анатомическое строение поджелудочной железы, характерное для особей данного вида. Гистологическое исследование также не выявило изменений в строении ПЖ. У всех видов экзокринная часть ПЖ представлена ацинусами и экзокринными протоками. Эндокринная ткань образована островками, островковоподобными структурами, конгломератами или тельцами Брокмана соответственно виду. Однако, иммуногистохимическое исследование с антителами к инсулину, глюкагону и соматостатину выявило явные различия в соотношении различных типов эндокринных клеток. Известно, что питание анамний напрямую зависит от сезона года или годового цикла (Ананичев, 1959; Чучукало и др., 1999; Шляхтин, Табачишин, 2010). В многочисленных работах рассматривалось воздействие на питание рыб и амфибий изменений температурного режима (Коржуев, 1936; Кузьмина, 1985; 1999; Голованов, Валтонен, 2000; Голованова и др., 2002). В связи с питанием также исследовали выделение пищеварительных ферментов (Львова, 1978; Голованова, 2000). Однако работ по исследованию иммуногистохимических изменений в поджелудочной железе при сезонных и годовых колебаниях температуры и пищевой биомассы проведено не было. Наши исследования, показали, что у земноводных во время годичных изменений окружающей среды меняется секреторная деятельность гормон-продуцирующих клеток поджелудочной железы. Нами впервые выявлено уменьшение количества выявляемых иммунопозитивных глюкагон-секретирующих клеток у самцов в период спаривания. Это объясняется потребностью быстрой утилизации продуктов расщепления углеводов при поступлении в кровоток из жировых депо и, напротив, увеличение иммунореактивных глюкагон-секретирующих клеток в период подготовки к анабиозу, что вызвано потребностью длительного пребывания в состоянии отсутствия поступления корма в пищеварительную систему. Данные, полученные не только на зимующих видах средней полосы (зеленая и серая жабы, травяная и озерная лягушки), но и на тропической суринамской пипе, дают возможность экстраполировать результаты на всех представителей класса. Таким образом, можно заключить, что в период спаривания в поджелудочной железе исследованных видов бесхвостых земноводных происходит значительное уменьшение продукции глюкагона, вплоть до полной блокировки его выделения. Однако продукция инсулина и соматостатина остается неизменной или, в случае инсулинпродуцирующих клеток, несколько возрастает. В период активного питания (для лягушек средней полосы – июнь-август, для пипы суринамской все время вне периода размножения) распределение эндокринных клеток в островке было типичным для бесхвостых земноводных и полностью подтверждало исследования других авторов (Harri, 1973; Epple, 1987; Trandaburu, 1995; Trandaburu, 2010). Авторами показано, что у жаб инсулин-позитивные клетки располагаются в центре псевдо-островка, глюкагон-позитивные образовывают тонкий слой по периферии, конгломераты и небольшие группы, а соматостатин-позитивные клетки представлены одиночными, распределенными в паренхиме железы, клетками. Подобное распределение клеток неоднократно описывалось в литературе, и признано как неоспоримый факт (Putti R., et al., 1995; Trandaburu, 2010). У настоящих лягушек, эндокринные клетки образовывали тельца Брокмана, встраиваясь в окружение экзокринных протоков. Исходя из этого, ставятся под сомнение данные других авторов о соотношении иммунореактивных эндокринных клеток в поджелудочной железе различных амфибий, так как отсутствуют данные о времени забора материала (сезоне) и физиологическом состоянии животных. Таким образом, при исследовании поджелудочной железы амфибий в различные периоды годового цикла нами показано, что эндокринная ткань поджелудочной железы земноводных чрезвычайно пластична и распределение различных типов эндокринных клеток в островках подвержено изменениям в зависимости от физиологического состояния животного и влияния внешних факторов. ВЫВОДЫ 1. При исследовании поджелудочной железы рыб выявлено шесть типов ее структурной организации: диффузно распределенные клетки поджелудочной железы (миноги); мелкие автономные доли (сомы); гепатопанкреас (карпообразные); лентовидные железы при наличии пилорических выростов (лососеобразные, окунеобразные и др.), небольшое число долей, имеющих общий выводной проток (щука, ласкирь), компактная поджелудочная железа с единственным протоком (полиптерус, панцирная щука, и др.). 2. Изучение поджелудочной железы у анамний позволило установить два типа организации экзокринной части: диффузный, компактный. Диффузный - неоформленный, имеющий протоки, но представленный скоплениями клеток, не образующих ацинусы. Компактный - оформленный, имеющий разветвленный трабекулярный аппарат, характерный для млекопитающих и человека. 3. Во всех типах организации экзокринной части поджелудочной железы были установлены несколько вариантов строения эндокринной ткани: отдельно лежащие клетки; шнуровидные или лентовидные компактные группы; скопления неправильной формы без островковой капсулы и полноценные островки, характерные для млекопитающих. 4. Установлено, что панкреатические островки первичноводных позвоночных имеют три типа распределения эндокринных клеток в островках: плащевой, инвертированный плащевой; смешанный; экстракапсулярный. Для плащевого типа строения характерна локализация инсулин-продуцирующих клеток в центре, глюкагон-продуцирующих клеток по периферии и соматостатин-продуцирующих клеток, занимающих промежуточное положение. Для плащевых островков инвертированного типа строения характерно: глюкагон-продуцирующие клетки занимают центральное положение, инсулинпродуцирующие периферию островка, соматостатин-продуцирующие клетки промежуточное положение. В островках смешанного типа строения эндокринные клетки распределены в толще островка. При экстаракапсулярном строении островка инсулинпродуцирующие клетки заполняют островок целиком, а глюкагон- и соматостатинпродуцирующие клетки распределены за пределами островковой капсулы. 5. Иммуногистохимический анализ поджелудочной железы амфибий показал, что эндокринные клетки могут транспортировать гормоны через межклеточное пространство (по непрямому пути) или осуществлять транспорт через кровяное русло (по прямому пути). У амфибий обнаружено, что эндокринные клетки, организованные в тельца Брокмана, осуществляют транспорт по специальным протокам. 6. Установлен архаичный механизм прямого взаимодействия периферической нервной системы на эндокринные и экзокринные клетки у акулы, стерляди, ската. У земноводных обнаружена редуцированная сеть нервных волокон по сравнению с рыбами. При этом у угря, радужной форели, ската хвостокола, стерляди выявлены нервные волокна иммунореактивные к нейропептиду Y, иммунопозитивные клетки к S-100 и гранулы, содержащие β-III тубулин. Редукция иннервации поджелкдочной железы амфибий допускает замену прямого нервного контроля на паракринную регуляцию при помощи нейропептидов. 7. Установлены цитологические изменения поджелудочной железы амфибий в соотношении инсулин-, глюкагон-, соматостатин-продуцирующих клеток в зависимости от состава пищевого рациона. Выявлено, что поджелудочная железа амфибий с широким пищевым диапазоном имеет дольчатое строение, значительна по размерам и в некоторых случаях имеет эндокринную специализацию долей. Поджелудочная железа амфибий с узким пищевым диапазоном представлена уплощенным телом со слабовыраженными долями или без таковых, при сохранении соотношения инсулин-, глюкагон- и соматостатин-продуцирующих клеток. 8. Исследование годовых циклов амфибий показало, что во время анабиоза в панкреатических островках накапливается секрет в глюкагон-позитивных клетках, а инсулин-синтезирующие клетки иммуногистохимическими методами не выявляются. В период репродуктивной активности в островках пипы суринамской, жабы серой, жабы зеленой, лягушки озерной, лягушки травяной обнаружено обратное состояние глюкагон- и инсулин-продуцирующих клеток. Установленные изменения подтверждают сезонную адаптацию поджелудочной железы анамний. 1. 2. 3. 4. 5. Список работ, опубликованных по теме диссертации Кривова Ю. С., Барабанов В. М., Савельева Е.С., Савельев С. В. Нейроэндокринные комплексы в поджелудочной железе нутрии (Myocastor coypus) (иммуногистохимическое исследование) // Морфология. – 2009. – Т.135. – №3. – С. 59-62. Савельева Е.С., Прощина А.Е Иммуногистохимическая организация эндокринной ткани поджелудочной железы некоторых видов лучеперых рыб (Actinopterigii) / Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. – 2012. – N.1. – С. 8-15 Савельева Е.С., Прощина А.Е., Савельев С.В. Исследование нейроэндокринной организации поджелудочной железы некоторых видов рыб (Pisces) / Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. – 2012. – N.2. – С. 12-19 Савельева Е.С. Исследование локализации инсулин-, глюкагон-, соматостатинпозитивных клеток островков лангерганса в различные периоды годового цикла бесхвостых земноводных (Аnura) / Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. – 2013. – N.1. – С. 10-14 Савельева Е.С., Прощина А.Е. Морфологическое исследование поджелудочной железы ската Potamotrygon Motoro / Современное естествознание: вопросы и 6. 7. 8. ответы / Материалы I международной конференции 30-31 августа 2011 года, г. Санкт-Петербург – Петрозаводск: издательство ПетроПресс, 2011. – С. 47-50 Савельева Е.С., Прощина А.Е. Морфологическое исследование эндокринной составляющей поджелудочной железы акулы (Chillosyum punctatum)/ Наука и современность – 2011: сборник материалов XII Международной научнопрактической конференции: в 3-х частях / под общей редакцией Чернова – Новосибирск: издательство НГТУ, 2011. – Часть 1. – С. 25-32 Савельева Е.С. Морфологические особенности эндокринной составляющей поджелудочной железы некоторых видов рыб / IV Международный молодежный медицинский конгресс / Санкт-Петербургские научные чтения – 2011, 7–9 декабря 2011 г – Санкт-Петербург., 2011. – С. 379 Савельева Е.С., Прощина А.Е. Иммуногистохимическое исследование иннервации поджелудочной железы первичноводных позвоночных / Сборник научных трудов научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» - М., 2012. – С. 127-130 Соискатель Е.С. Савельева