На правах рукописи ЗАДЕСЕНЕЦ КИРА СЕРГЕЕВНА 03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология

На правах рукописи
ЗАДЕСЕНЕЦ КИРА СЕРГЕЕВНА
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
ХРОМОСОМ ОПИСТОРХИД
03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Новосибирск 2013
Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур
Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института
цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Научные руководители:
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Рубцов Николай Борисович
доктор биологических наук, профессор
Кикнадзе Ия Ивановна, главный научный сотрудник
сектора эволюционной геномики хирономид,
Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки Институт цитологии и генетики СО РАН,
г. Новосибирск
кандидат биологических наук,
Трифонов Владимир Александрович, заведущий
лабораторией сравнительной геномики,
Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки Институт молекулярной и клеточной биологии
СО РАН, г. Новосибирск
Ведущее учреждение:
Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки Институт молекулярной биологии
им.В.А. Энгельгардта РАН, г. Москва
Защита диссертации состоится «___» ____________ 2013 г. на утреннем
заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание
ученой степени кандидата наук, по защите на соискание ученой степени доктора наук
в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу:
630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, д. 10, тел. (383) 363-49-06,
факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.
Автореферат разослан «___» _____________ 20___ г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук
Т.М. Хлебодарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Исследование организации хромосом описторхид
является актуальной фундаментальной задачей. Класс Trematoda (трематоды или
сосальщики), к которому относятся исследованные в настоящей работе виды,
представляет одну из наиболее эпидемиологически значимых групп паразитических
червей. Характерной особенностью трематод является наличие сложного жизненного
цикла ди- или триксенного типа, в течение которого происходит чередование бесполого
(партеногенетического) и полового поколений. Дефинитивными хозяевами трематод
являются пресмыкающиеся, птицы, млекопитающие, в том числе человек.
Некоторые виды (Opisthorchis felineus, Opisthorchis viverrini, Clonorchis sinensis),
составляющие так называемую «описторхозную триаду», образуют обширные ареалы
инвазии, практически сливающиеся друг с другом в один крупный очаг. Самый
крупный очаг зараженности O. felineus расположен в Российской Федерации, в ОбьИртышском бассейне, причем в некоторых его районах уровень инвазии среди
местного населения может быть близок к 100%. Ареалы инвазии описторхидами
расширяются, возникают новые ареалы, что в последние годы связано с активной
миграцией населения в страны Европы. На сегодняшний день O. viverrini и C. sinensis
официально внесены в список IARC (International Agency for Research on Cancer)
биологических канцерогенов (Bouvard et al., 2009), O. viverrini и C. sinensis относятся к
первому классу, O. felineus – к третьему классу канцерогенов (IARC, 2011). В странах,
где эти виды широко распространены, самые высокие в мире показатели по
возникновению холангиокарциномы (WHO, 1995).
В связи с этим, полноценное и разностороннее изучение описторхид стало
актуальной задачей, решение которой будет иметь не только фундаментальное, но и
практическое значение, например, при разработке чувствительных и специфичных
методов диагностики, а также создания новых лекарственных препаратов.
Полноценное изучение описторхид помимо описания их морфологии,
жизненного цикла, ареала зараженности, клинической картины вызываемых ими
заболеваний, отношений паразит – хозяин, систем размножения должно включать
также детальное изучение их генома. Описторхиды, несмотря на сложную программу
онтогенеза, имеют небольшой размер генома (300-400 Mb) и кариотип представленный
6-8-ю парами хромосом.
Исследование структурно-функциональной организации хромосом является
необходимым элементом при изучении геномов описторхид. Однако на данном этапе
существует ряд технических проблем, без решения которых изучение организации
генома на хромосомном уровне у описторхид невозможно. Одной из таких проблем
является ограниченное количество материала, которое может быть использовано для
цитогенетических исследований. Прежде всего, это вызвано небольшим размером
описторхид и их сложным онтогенезом.
Основной причиной того, что хромосомы описторхид, как и у всех трематод слабо
изучены, является сложный жизненный цикл этих паразитов. На сегодняшний день в
1
лабораториях мира удавалось лишь частично воспроизвести жизненный цикл трематод
(для кровяных сосальщиков полностью). В случае с описторхидами дополнительные
проблемы обусловлены микст-инвазией первого промежуточного хозяина трематод моллюска, и чрезвычайно низкой частотой заражения моллюсков мирацидиями в
лабораторных условиях. Поэтому многие исследователи при изучении трематод
работают с их дефинитивными стадиями, а именно: маритами. Одним из главных
вопросов, которые встают перед исследователем при работе с хромосомами не только
описторхид, но и трематод в целом, является следующий: какую ткань или орган
мариты следует брать для приготовления хромосомных препаратов и каким образом
фиксировать выбранный материал? Для ответа на этот вопрос было целесообразно
провести комплексный микроскопический анализ, который предварял исследование
непосредственно самих хромосом описторхид. Главной целью подготовительного этапа
являлся поиск тканей или органов мариты описторхид, которые характеризуются
высоким митотическим индексом.
Исследование
структурно-функциональной
организации
хромосом
подразумевает обязательное решение ряда вопросов: определение локализации ЯО
(ядрышковый организатор) районов, выявление и описание блоков структурного
гетерохроматина, анализ распределения в хромосомах кластеров повторенных
последовательностей (теломерной ДНК и рДНК). Для успешного проведения
исследований, направленных на детальное описание хромосом, необходимо получение
препаратов хромосом, позволяющих выявлять и описывать их линейную
дифференциацию. Имеющиеся на сегодняшний день данные, указывают на небольшой
размер генома и малый размер хромосом у большинства трематод, что в значительной
степени затрудняет использование стандартных методов хромосомного анализа и
определяет необходимость поиска новых подходов в получении хромосомных
препаратов трематод, обеспечивающих проведение цитогенетического анализа на
высоком уровне разрешения.
В связи с высокой значимостью изучения структурно-функциональной
организации хромосом описторхид, были сформулированы следующие цели и задачи
настоящего исследования.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось изучение особенностей структурнофункциональной организации хромосом описторхид.
В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
 Разработать методы приготовления препаратов митотических и мейотических (в
том числе пахитенных) хромосом из марит описторхид (Opisthorchis felineus,
Opisthorchis viverrini, Metorchis xanthosomus, Metorchis bilis, Clonorchis sinensis);
 Провести цитогенетический анализ хромосом описторхид с использованием
методов дифференциального окрашивания и гибридизации in situ:
а) выполнить морфометрический анализ хромосом описторхид;
б) провести дифференциальное окрашивание хромосом исследуемых видов
описторхид (С- и AgNOR-окрашивание);
2
в) получить микродиссекционные ДНК-пробы, специфичные хромосомам 1 и 2 O.
felineus и M. xanthosomus;
г) изучить локализацию кластеров (рДНК, теломерные повторы) и распределение
диспергированных повторенных последовательностей в хромосомах описторхид.
3. Выполнить сравнительный межвидовой анализ хромосом исследуемых видов
описторхид.
Научная новизна
При изучении структурно-функциональной организации хромосом описторхид
были использованы морфометрические и молекулярно-цитогенетические методы, в
результате которых впервые:
 дано описание кариотипа M. bilis;
 показано, что кариотип C. sinensis из Дальнего Востока РФ содержит 7 пар
хромосом;
 проведен морфометрический анализ хромосом M. bilis, M. xanthosomus;
 изучена локализация ЯО районов и С-позитивных блоков в хромосомах
описторхид;
 получены микродиссекционные ДНК-пробы для хромосом описторхид;
 показано
наличие
хромосомоспецифичных
кластеров
повторенных
последовательностей в хромосомах у плоских червей (у O. felineus и M.
xanthosomus);
 определена локализация рДНК в хромосомах описторхид;
 установлено, что кластеры теломерной ДНК у описторхид состоят из повторов
(TTAGGG)n и локализованы тольков в теломерных районах хромосом;
 построены идиограммы мелких пахитенных хромосом описторхид.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты, полученные при проведении на современном уровне комплексного
микроскопического анализа мариты O. felineus, могут быть использованы в курсе
лекций по паразитологии и зоологии беспозвоночных. Данные, полученные при
проведении цитогенетического анализа хромосом описторхид, являются весомым
вкладом в развитие цитогенетики трематод. Впервые для плоских червей (для
описторхид) были получены пахитенные хромосомы с выраженной хромомерной
организацией; результаты сравнения хромомерной организации пахитенных хромосом
описторхид являются первыми в сравнительной цитогенетике трематод. Разработанный
автором метод приготовления препаратов пахитенных хромосом станет мощным
инструментом в руках исследователей, как в области сравнительной цитогенетики, так
и при проведении полногеномного секвенирования описторхид на этапе финальной
сборки генома.
Положения, выносимые на защиту.
1) В ходе кариотипической эволюции представителей семейства Opisthorchiidae
(O. felineus, O. viverrini, M. bilis, M. xanthosomus) имели место внутрихромосомные
перестройки.
3
2) Хромосомы описторхид имеют единственный кластер рибосомных генов,
состоящий из двух GC-богатых субблоков, разделенных АТ-богатым участком.
3) Теломерная ДНК описторхид представлена мотивом (TTAGGG)n и
локализована только на концах плеч всех хромосом. В хромосомах описторхид
интерстициальные кластеры теломерной ДНК отсутствуют.
4) Хромосомы представителей плоских червей (описторхид) характеризуются
наличием хромосомоспецифичных кластеров повторенных последовательностей.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на
следующих конференциях и сессиях: на итоговой конференции по результатам
выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления “Живые
системы” (Москва, Россия, 2009), на III Межрегиональной конференции паразитологов
Сибири и Дальнего Востока, посвященной 80-летию профессора К.П.Федорова
(Новосибирск, Россия, 2009), на 7-ой Международной конференции по
биоинформатике
регуляции
генома
и
структурной\системной
биологии
(BGRS/SB’2010) (Новосибирск, Россия, 2010), на V Международной конференции по
кариосистематике беспозвоночных животных (KARYO V) (Новосибирск, Россия,
2010), на международной научной конференции “Теоретические и практические
проблемы паразитологии” (Москва, Россия, 2010), на 18-ой Международной
хромосомной конференции (18 ICC) (Манчестер, Великобритания, 2011), на отчетной
сессии ИЦИГ СО РАН (Новосибирск, Россия, 2012), на 8-ой Международной
конференции по биоинформатике регуляции генома и структурной\системной
биологии (BGRS/SB’2012) (Новосибирск, Россия, 2012), на международной
конференции “Хромосома 2012” (Новосибирск, Россия, 2012), на международной
конференции “Современные проблемы общей паразитологии” (Москва, Россия, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 4
работы – статьи в отечественной и зарубежной печати, в журналах, входящих в список
ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация включает следующие разделы:
введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы,
список литературы, приложения. Работа изложена на 169-и страницах, иллюстрирована
32-мя рисунками, содержит 8 таблиц и 8 приложений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Мариты были предоставлены сотрудниками лаборатории молекулярных
механизмов патологических процессов Института цитологии и генетики СО РАН.
Метацеркарии описторхид были диссектированы из мышц зараженной рыбы,
пойманной на территории Российской Федерации (Новосибирская область;
Приморский край) и Таиланда (провинция Кхон-Каен) (Таблица 1).
4
Таблица 1. Источники метацеркарий описторхид
Вид
O. felineus
O.viverrini
M.xanthosomus
M. bilis
C.sinensis
Источник
Leuciscus idus (язь)
рыбы сем. Cyprinidae
(Карповые)
Leucaspius delineatus
(верховка)
Leucaspius delineatus
(верховка)
Rhodeus sericeus (горчак),
Phoxinus phoxinus (гольян)
Район отлова зараженной рыбы
р. Обь, нижний бьеф ГЭС г. Новосибирска
оз. Лава, провинция Кон Каен (Khon Kaen),
Таиланд
р. Ельцовка, Нижняя Ельцовка,
Советский район г. Новосибирска
р. Ельцовка, Нижняя Ельцовка,
Советский район г. Новосибирска
оз. Магдыковое, р. Большая Уссурка,
Дальнеречинский район, Приморский край
Получение половозрелых особей описторхид (марит) проводили путем
скармливания метацеркарий описторхид лабораторным животным (хомячок, крыса,
цыпленок). Через 1-1,5 месяца после заражения, производили забой животных и
выделяли марит описторхид из гепатобилиарной системы дефинитивного хозяина.
Подготовка материала для микроскопического анализа марит.
Подготовка препаратов для проведения лазерной сканирующей микроскопии
(ЛСМ), микроскопии со структурированным освещением (ЛМСО). Фиксированные
мариты (2 часа в 10% формалине или 4% параформальдегиде) заключали в криогель
O.C.T. и на микротоме готовили замороженные срезы (40-50 мкм). Затем криосрезы
окрашивали красителем DAPI, разведенном в антифейде. Для проведения ЛСМ и
ЛМСО использовали криосрезы и целые мариты O. felineus.
Подготовка препаратов для световой микроскопии. Мариты описторхид
фиксировали в 4% параформальдегиде, проводили дегидратацию материала и образцы
заключали в парафин, криогель O.C.T. или 10 % желатин по стандартным протоколам.
Далее готовили криосрезы (5 мкм) и парафиновые срезы (3-7 мкм). Гистологические и
гистохимические окрашивания проводили по стандартным протоколам.
Приготовление цитологических препаратов хромосом, дифференциальное
окрашивание хромосом и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH).
Хромосомные препараты готовили из задней части тела мариты, содержащей органы
репродуктивной системы (яичник, семенники, семяприемник). С-бэндинг и AgNORокрашивание проводили по стандартным протоколам с небольшими модификациями
(Sumner, 1972; Howell and Black, 1980). FISH проводили по стандартному протоколу
(Rubtsov et al., 2000). Для изучения локализации рДНК использовали фрагмент 18S
рДНК человека, клонированный в плазмиде pHr13 (Malygin, 1992), и 5,8 S рДНК
описторхид,
полученную
в
ПЦР
с
праймерами
ITS1_F
(5'GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3') и ITS2_R (5'-GGAACGACCTGAACACCA-3').
Выявление локализации теломерных повторов проводили с помощью
теломерной ДНК-пробы и теломерной PNA-пробы. Теломерная ДНК-проба была
синтезирована в безматричной ПЦР по стандартному протоколу (Ijdo et al., 1990).
Метод FISH был проведен по стандартному протоколу без супрессии повторенных
последовательностей (Pinkel et al., 1988).
5
Получение микродиссекционных ДНК-проб. Диссекцию хромосом и
последующую амплификацию диссектированного материала проводили по
стандартному протоколу (Rubtsov et al., 2000). Мечение полученных продуктов ПЦР
проводили AlexaFluor488, биотином или дигоксигенином в дополнительных циклах
ПЦР.
Микроскопический анализ. Микроскопический анализ препаратов марит
проводился
в
Межинститутском
центре
коллективного
пользования
микроскопического анализа биологических объектов (ИЦИГ СО РАН, Новосибирск).
Изображения живых марит были получены с помощью стереомикроскопа Stemi
2000 (Zeiss, Germany), программное обеспечение AxioVision (Zeiss, Germany).
Широкопольная световая микроскопия проводилась на микроскопе AxioScop 2 Plus
(Zeiss, Germany) с CCD-камерой AxioCam HRc (Zeiss, Germany), программным
обеспечением AxioVision (Zeiss, Germany). ЛМСО была выполнена на микроскопе
AxioImager Z1 (Zeiss, Germany), оснащенном модулем ApoTome (Zeiss, Germany),
программное обеспечение AxioVision (Zeiss, Germany). ЛСМ проводилась на
конфокальном микроскопе LSM 510 META (Zeiss, Germany), программное обеспечение
LSM (Carl Zeiss). При проведении ЛСМ использовали режим multitrack
(последовательное сканирование при раздельном возбуждении флуорохромов лазерами
с разной длиной волны). Флуоресценция DAPI регистрировалась в диапазоне эмиссии
420-480 нм при возбуждении лазером 405 нм, собственная флуоресценция материала
мариты регистрировалась в диапазоне от 505 нм и выше при возбуждении 488 нм.
Микроскопический анализ препаратов хромосом проводили на микроскопе
AxioPlan 2 Imaging microscope (Zeiss, Germany) с набором фильтров 49 (Zeiss, Germany),
SP101 FITC (CHROMA, USA) and SP103v1 Cy3.5v1 (CHROMA, USA), CCD-камерой
(CV M300, JAI Corporation, Japan), программное обеспечение ISIS4 (METASystems
GmbH).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Комплексный микроскопический анализ. В результате проведения трехмерной
конфокальной микроскопии и ЛМСО выполнено описание общей морфологии мариты
описторха (Рисунок 1 а, б). Широкопольная микроскопия физических срезов описторха,
окрашенных с помощью различных гистологических и гистохимических методов,
позволила дать более детальное описание клеточного состава различных органов и
тканей мариты описторха (Рисунок 1 в).
6
Рисунок 1. ЛСМ O. felineus. a – марита описторха (сборка изображений оптических
срезов). Длины волн возбуждения флуоресценции – 405 и 488 нм. Запирающие
эмиссионные фильтры: BP 420-480IR (DAPI, синий псевдоцвет), LP 505
(автофлуоресценция, зеленый псевдоцвет). Объективы 20x/0.5. Scale bar 1 mm. б – ЛМСО O.
felineus (трехмерная реконструкция метратерма описторха). Яйца описторха
(автофлуоресценция, красный псевдоцвет), зрелые сперматозоиды (DAPI, синий
псевдоцвет). Объектив 63x/1.25. в – световая широкопольная микроскопия O. felineus. Срез
семенного пузырька и матки описторха. Окрашивание гематоксилин-эозином. Scale bar 20
mkm.
Основная часть мариты содержит матку с большим количеством яиц, которые,
несмотря на наличие активно делящихся клеток, не пригодны в качестве источника
хромосомного материала из-за твердой и плотной оболочки. Остальные ткани мариты
(паренхима, кожно-мускульный мешок и др.) характеризовались крайне низким
митотическим индексом. В проведенном исследовании клетки на стадии метафазы в
составе этих тканей не были обнаружены. Более того, указанные ткани плохо
подвергались мацерации, что не позволяло получать суспензию отдельных клеток.
Единственным источником легкодоступных делящихся клеток оказались семенники,
яичник и семяприемник мариты описторха. В дальнейших исследованиях они были
использованы для приготовления хромосомных препаратов, содержащих хромосомы
клеток, находящихся на разных стадиях митоза и мейоза.
Кариотипы описторхид, исследованные в настоящей работе. Анализ
хромосом описторхид в настоящей работе был выполнен на препаратах митотических и
мейотических хромосом, полученных из семенников, яичника и семяприемника
половозрелых марит. Диплоидное число хромосом у трематод варьирует от 12 до 28,
причем преобладают виды с 2n=22 (около 20%) и 2n=18 (18%) (Баршене, 1993).
Кариотипы, состоящие из от 24 до 28 хромосом, встречаются гораздо реже (около 4 %
исследованных видов). У описторхид, вовлеченных в настоящее исследование, ранее
были определены следующие хромосомные числа: O. felineus, M. xanthosomus - 2n=14;
O. viverrini - 2n=12; C.sinensis - 2n=56; данные о числе хромосом у M. bilis
отсутствовали. В результате кариотипирования показано, что число хромосом (2n) у
исследованных образцов, O. felineus, M. xanthosomus, C. sinensis и M. bilis равно 14, у O.
viverrini - 12 (Рисунок 2). Следует отметить, что число хромосом у C. sinensis из РФ,
определенное в настоящей работе как 2n=14, отличается от числа хромосом 2n=56 у C.
sinensis из Кореи и Китая (Park et al., 2000).
7
Рисунок 2. Кариотипы представителей
описторхид, исследованных в настоящей
работе.
Приведены
инвертированные
изображения хромосом, окрашенных DAPI.
а – O. felineus;
б – O. viverrini;
в – M. xanthosomus;
г – M. bilis;
д – C. sinensis.
Scale bar 10 mkm.
Возможно, представители C. sinensis из Китая и Кореи являются октаплоидной
формой (8n=56). С этим согласуются данные морфометрии хромосом C. sinensis из
разных географических ареалов (Китая, Кореи и РФ). Показано, что кариотип C. sinensis
из стран Азии образован 8-ю парами крупных хромосом и 20-ю парами мелких
хромосом. Кариотип C. sinensis из РФ представлен двумя парами крупных и пятью
парами мелких хромосом. Ранее полиплоидия уже была выявлена у некоторых видов
трематод (P. westermani, F. hepatica), однако максимальная плоидность у описанных на
сегодняшний день трематод не превышает 4n.
Нельзя исключить, что представленные данные о числе хромосом C. sinensis из
Китая и Кореи являются следствием методической ошибки, связанной с особенностью
приготовления хромосомных препаратов: восемь гаплоидных клеток семенника,
представляющих единую группу, содержит 56 хромосом, способных формировать на
цитологическом препарате общую пластинку, имитируя мейотические хромосомы
одной клетки. Мы часто наблюдали такие общие пластинки у C. sinensis из РФ
(Zadesenets et al., 2012). Возможно, представители C. sinensis из юго-восточной Азии и с
Дальнего Востока РФ являются разными видами. Решение этого вопроса требует
дополнительных исследований.
Сравнительный анализ хромосомных чисел у трематод показал тенденцию к
уменьшению количества хромосом в ходе эволюции их кариотипа (Short et al., 1989;
Баршене, 1993). В некоторых работах в качестве предкового кариотипа трематод
предлагается кариотип с 19-ю парами акроцентрических хромосом. Предполагается,
что эволюция предковой формы кариотипа трематод шла по пути робертсоновских
слияний (Short et al., 1989).
Как показали результаты сравнения хромосомных наборов описторхид, уже
описанные в литературе и полученные в ходе настоящего исследования, они имеют
схожую морфологию хромосом, кариотипы у них - асимметричные. Согласно
терминологии асимметричным кариотипом называют кариотип, хромосомы которого
резко отличаются по своему размеру (Баршене, 1993; Spakulova et al., 2011). Проведение
8
сравнительного морфометрического анализа хромосом описторхид показало некоторые
расхождения между результатами, полученными в настоящей работе и приведенными
другими исследователями. Данные различия обусловлены разной степенью
конденсации и распластывания хромосомного материала, которые возникают при
использовании разных источников делящихся клеток, разных способов фиксации
материала и приготовления препаратов. В разных исследованиях использовали
партениты или мариты трематод. В данной работе источником хромосомного
материала служили мариты. При сравнении данных морфометрии хромосом
описторхид, полученных в ходе настоящего исследования, были выявлены лишь
небольшие недостоверные различия в относительных размерах как крупных, так и
мелких хромосом (Таблица 2).
Таблица 2. Результаты морфометрического анализа хромосом описторхид
N
1
2
3
4
5
6
7
O. felineus
RL,%
M
29.97±
m
1.31
23.41±
m
1.28
11.35±
sm
0.39
10.23±
sm
0.67
9.15±
m
0.62
8.35±
sm
0.59
7.54±
sm
0.76
O. viverrini
RL, % M
31.04±1 m
.17
23.19±0 m
.81
16.04±0 m
.63
11.12±0 m
.64
10.07±0 m
.63
8.54±
sm
0.56
-
M. xanthosomus
RL, %
M
30.13±
sm
1.15
22.83±
m
0.76
11.01±
sm
0.89
10.22±
sm
0.65
9.54±
sm/m
0.67
8.53±
m
0.62
7.74±
m
0.59
M. bilis
RL, %
M
32.61± m/sm
1.06
24.45±
m
0.85
10.30±
sm
0.82
9.19±
sm
0.66
8.43±
sm
0.62
7.78±
sm/a
0.65
7.24±
sm
0.43
C. sinensis
RL, %
M
31.18±
m
0.70
25.02±
m
0.90
9.76±
m
0.36
9.31±
sm/m
0.41
8.85±
sm/m
0.26
8.34±
m
0.36
7.54±
sm/a
0.42
RL (relative length) – относительная длина хромосом; М – морфотип хромосом.
Исключением является значимое отличие относительной длины хромосомы 3 у
O. viverrini: данная хромосома является метацентриком среднего размера, возникшим в
результате слияния двух хромосом предкового кариотипа. Результаты сравнительной
морфометрии хромосом указывают на высокий консерватизм кариотипов описторхид.
Дифференциальное окрашивание хромосом описторхид. Дифференциальное
окрашивание хромосом широко используется при анализе структурно-функциональной
организации хромосом (Dutrillaux, 1979; Sumner, 1994). Однако, выполненные на
сегодняшний день работы по проведению дифференциального окрашивания хромосом
трематод единичны. Проведенные в ходе настоящей работы исследования дали
следующие результаты:
9
1). Для хромосом описторхид характерно наличие С-блоков небольшого размера,
в прицентромерных районах и прителомерных районах. У некоторых видов были
выявлены также интерстициальные - в плечах хромосом (O. felineus, M. xanthosomus, M.
bilis) (Рисунок 3). Для мелких хромосом описторхид дифференцировать прителомерные
и интерстициальные С-блоки не представлялось возможным ввиду слишком малых
размеров хромосом.
Рисунок 3. Локализация блоков конститутивного гетерохроматина (С-блоков) в
хромосомах описторхид. OFE – O. felineus; OVI – O. viverrini; MXA – M. xanthosomus; MBI
– M. bilis; CSI – C. sinensis.
2). Окрашивание азотнокислым серебром (AgNOR-окрашивание) позволило
выявить единственный активный ЯО район на одной из мелких хромосом описторхид.
Более того, специфичное окрашивание было обнаружено в мейотических хромосомах
на стадии профазы (пахитены включительно), в ранних сперматидах и интерфазных
ядрах. В метафазных хромосомах мейоза I и II специфичные сигналы не были
обнаружены. Ag-позитивные сигналы выявлялись в ранних сперматидах, по всей
видимости, после реактивации ЯО районов. Аналогичные результаты уже были ранее
получены при AgNOR-окрашивании хромосом на различных стадиях сперматогенеза
беспозвоночных и позвоночных, включая человека (Schmid et al., 1982, 1983; de Campos
et al., 2005). Известно, что AgNOR-окрашивание может выявлять не только
транскрипционно активные ЯО районы, но и кислые белки в других районах, таким
образом, не всегда давая верное представление о локализации ЯО района (Dobigny et al.,
2002). В таких случаях используют метод гибридизации in situ с ДНК-пробами,
специфичными рДНК.
Флуоресцентная гибридизация in situ с хромосомами описторхид
Локализация рДНК. У высших эукариот гены рРНК организованы в два
мультигенных семейства, состоящих из тандемно повторяющихся единиц. Основной
класс рРНК (45S) содержит гены 18S, 5,8S и 28S рРНК, которые участвуют в
формировании ядрышка. В настоящей работе для определения локализации кластера
рибосомных генов использовали ДНК-пробы: 18 S и 5,8S рДНК. При использовании
18S рДНК-пробы человека было показано наличие кластера рДНК в хромосоме 3 для
10
всех исследованных видов. Однако зона выявляемого на хромосомах сигнала, занимала
очень большой по размеру район хромосомы, что затрудняло интерпретацию
полученных результатов и субхромосомную локализацию кластера рДНК (Рисунок 5
а). Использование 5,8S рДНК-пробы позволило уточнить район локализации кластера
рибосомных генов в хромосомах описторхид. На конденсированных хромосомах
сигнал рДНК был локализован в нехарактерном для кластеров повторов рДНК АТбогатом (согласно окраске DAPI) районе хромосомы 3 (Рисунок 5 б). Однако при
проведении FISH с менее конденсированными пахитенными хромосомами было
обнаружено, что этот АТ-богатый район «распадается» на два АТ-богатых района и
расположенный между ними GC-богатый район. Кластер рДНК также распадается на
два: один локализован в GC-богатом районе, расположенном между АТ-богатыми
районами, другой – в прилегающей к АТ-богатому району части соседнего GC-богатого
района (Рисунок 5 в, г).
Локализация теломерной ДНК. В хромосомах многих позвоночных
«теломерная ДНК» помимо концов хромосом, может быть локализована в виде
кластеров в интерстициальных районах хромосом (ITSs, interstitial telomere sequences)
(Meyne et al., 1989). К возникновению ITSs могут приводить либо перестройки
хромосом, либо репарация или негомологичная рекомбинация ДНК с участием
теломеразы. Крупные кластеры теломерной ДНК, выявляемые как ITSs, могут служить
своеобразным маркером произошедшего робертсоновского слияния хромосом в ходе
эволюции кариотипа (Slijepcevic, 1998).
Поэтому предполагалось наличие ITSs, по крайней мере, в хромосоме 3 O.
viverrini (2n=12), возникшей, в результате робертсоновского слияния мелких хромосом
предковой формы описторхид.
В ходе настоящего исследования в качестве проб использовали меченую
теломерную ДНК и PNA-пробу. Было показано, что теломеры описторхид, так же как и
теломеры у позвоночных, образованы мотивом TTAGGG и теломерная ДНК
локализована на концах плеч всех хромосом (Рисунок 5 д). Большее увеличение
разрешения метода FISH достигнуто при использовании в качестве ДНК-мишени
пахитенных хромосом. Однако даже на пахитенных хромосомах интерстициальных
сайтов хромосом теломерной ДНК обнаружено не было (Рисунок 5 е, ж). Отсутствие
ITSs в хромосоме 3 виверровой двуустки можно интерпретировать следующим
образом: или слияние хромосом произошло достаточно давно, и произошла
элиминация возникшего в результате слияния ITSs, или размеры ITSs столь малы, что
не могут быть выявлены с помощью FISH на мейотических хромосомах. Также
возможно, слияние предковых хромосом произошло в результате разрывов, приведших
к элиминации теломерных районов обеих исходных хромосом.
11
Рисунок 4. Результаты FISH различных ДНК-проб с хромосомами описторхид: 18S
рДНК-проба на хромосомах M. xanthosomus (а); 5,8 S рДНК-проба на хромосомах O.
viverrini (б), O. felineus (в), M. xanthosomus (г); теломерная ДНК-проба на хромосомах M.
bilis (д); теломерная PNA-проба на хромосомах C. sinensis (е) и O. viverrini (ж); Op1-ДНКпроба (зеленый псевдоцвет) и Op2-ДНК-проба (красный псевдоцвет) на хромосомах O.
felineus (з); Met1-ДНК-проба (красный псевдоцвет) и Met2-ДНК-проба (зеленый
псевдоцвет) на хромосомах M. xanthosomus (и); Op1-ДНК-проба (зеленый псевдоцвет) и
Op2-ДНК-проба (красный псевдоцвет) на хромосомах M. xanthosomus (к); Met1-ДНК-проба
(зеленый псевдоцвет) на хромосомах M. xanthosomus до (л) и после проведения Prep-ISH
(м).
Стрелками
указаны
хромосомоспецифичные
кластеры
повторенных
последовательностей.
Сравнительный анализ хромосом. Сравнение данных, полученных после
проведения С-дифференциального и AgNOR-окрашивания, анализа распределения
повторенных последовательностей, указывают на консервативность кариотипа
описторхид.
К сожалению, попытки использования GTG-дифференциального окрашивания
хромосом описторхид, показавшие свою высокую эффективность в сравнительной
цитогенетике млекопитающих (Richard et al., 2003), не увенчались успехом. Возможно,
12
одной из причин была высокая степень конденсации хромосомного материала. Ввиду
слабой изученности хромосомной организации трематод, идиограмм ранее не было
построено ни для одного вида, лишь в работе Hirai (2004) присутствует схематичное
изображение хромосом с учетом локализации ЯО районов и С-позитивных блоков для
одного вида S. mansoni (Hirai H. and Hirai Y., 2004).
Рисунок 5. Пахитенные хромосомы описторхид и схематичные изображения их
хромомерной организации. Изображения мелких хромосом (3-7) увеличены.
а – O. felineus, б – M. bilis, в – M. xanthosomus, г – O. viverrini (инвертированные
изображения хромосом, окрашенных DAPI).
Решением данной проблемы стало получение и анализ препаратов пахитенных
хромосом. В ходе работы были подобраны условия для фиксации и приготовления
хромосомного материала, позволившие получать препараты, содержащие значительное
количество пахитенных хромосом с отчетливой хромомерной организацией.
13
Окрашивание пахитенных хромосом описторхид красителем DAPI сделало
возможным проведение идентификации и сравнительного анализа индивидуальных
хромосом описторхид. Таким образом, удалось построить схемы всех малых
пахитенных хромосом изучаемых видов, но, к сожалению, не удалось провести полную
идентификацию всех районов крупных пахитенных хромосом 1 и 2 из-за варьирования
уровня конденсации их материала и многочисленных налеганий хромосом друг на
друга. В зависимости от продолжительности гипотонической обработки и условий
распластывания на предметном стекле уровень конденсации пахитенных хромосом
существенно варьировал: в крупных хромосомах описторхид насчитывалось от 80 до
220 хромомеров.
Предварительный сравнительный межвидовой анализ мелких хромосом
описторхид позволил выявить наличие внутрихромосомных перестроек, вероятно
перицентрических инверсий. При межвидовом сравнении пахитенных хромосом
удалось идентифицировать хромосомы, слияние которых привело к возникновению
хромосомы 3 в кариотипе виверровой двуустки. При сравнении хромомерной
организации мелких хромосом было показано, что данная метацентрическая хромосома
возникла в результате слияния хромосом 3 и 7 возможного предкового кариотипа
описторхид.
Для проведения хромосомного пэйнтинга, который успешно зарекомендовал
себя
в
сравнительной
цитогенетике
млекопитающих,
были
созданы
микродиссекционные ДНК-пробы (WCPs, Whole Chromosome Paints) из материала
крупных хромосом 1 и 2 для двух видов, - O. felineus (Op1 и Op2, соответственно) и M.
xanthosomus (Met1 и Met2, соответственно). Одним из условий успешного проведения
хромосомного
пэйнтинга
является
наличие
супрессии
повторенных
последовательностей с помощью Cot1 или Cot2 ДНК. Однако при работе с
хромосомами описторхид получение фракции высокоповторенной ДНК оказалось
проблематичным ввиду отсутствия достаточного количества исходного материала
(марит). Гибридизация in situ ДНК-проб, полученных из индивидуальных хромосом,
без супрессии повторов специфически окрашивала исходные хромосомы, но дала
достаточно высокий уровень неспецифического сигнала на всех хромосомах (Рисунок 4
з, и). Для разрешения данной проблемы непосредственно перед проведением
гибридизации денатурированную ДНК-пробу инкубировали при 370С для отжига
повторенных последовательностей самих на себя, что не привело к решению проблемы.
В результате проведения гомологичной гибридизации WCPs хромосом 1 и 2 O. felineus
и M. xanthosomus были выявлены хромосомоспецифичные кластеры повторенных
последовательностей, локализованные в прицентромерных районах хромосом 1 и 2 и у
O. felineus, и у M. xanthosomus (Рисунок 4 з, и). Также был обнаружен дополнительный
хромосомоспецифичный кластер в терминальной части р-плеча хромосомы 1 у M.
xanthosomus (Рисунок 4 и). Однако попытки проведения хромосомного пэйнтинга с
использованием WCPs близкородственных видов, O. felineus и M. xanthosomus, не дали
ожидаемых результатов (Рисунок 4 к). Возможно, это обусловлено проведением
14
гетерологичной FISH без супрессии гибридизации повторенных последовательностей,
что часто является необходимым условием успешного проведения хромосомного
пэйнтинга. Полученный результат указывает на то, что, несмотря на небольшой размер
генома описторхид, диспергированные повторенные последовательности представлены
в их хромосомах в значительном количестве, и сохранили высокий уровень гомологии
у исследованных видов.
Наличие столь большого количества диспергированных повторов существенно
затруднило проведение гетерологичного хромосомного пэйнтинга даже между двумя
представителями одного рода (M. bilis и M. xanthosomus). Оно оказалось
неэффективным, несмотря на использование варианта гибридизации Prep-ISH,
позволявшего обогатить ДНК-пробу уникальными последовательностями (Рисунок 4 л,
м). Наличие кластеров хромосомоспецифичных повторенных последовательностей в
хромосомах 1 и 2 у O. felineus и M. xanthosomus описторхид свидетельствует о том, что,
ДНК прицентромерных С-позитивных районов крупных хромосом указанных видов
описторхид является наиболее быстро эволюционирующей частью их генома, как и у
большинства эукариот (Henikoff et al., 2001).
***
Полногеномное секвенирование описторхид позволит решить значительную
часть проблем, касающихся эволюции геномов в этом таксоне. Стоит отметить, что
проведение секвенирования генома описторха даже с многократным перекрыванием
едва ли позволит провести полную сборку секвенированных последовательностей без
предварительного построения физических карт хромосом описторха. Для решения этой
задачи необходимо получение ВАС-библиотек или космидных библиотек хотя бы
одного из видов описторхид. Это позволит с помощью гомологичной и гетерологичной
гибридизации in situ индивидуальных клонированных последовательностей построить
физические карты хромосом изучаемых видов описторхид и получить необходимые
реперные точки для полной сборки их геномов. Для успешного развития этих работ
разработка метода получения препаратов пахитенных хромосом, выполненная в
настоящем исследовании, имеет огромное значение, так как открывает возможности
построения физических карт хромосом описторхид с высоким разрешением и
привязкой к их структурно-функциональной организации.
Проведение FISH клонированных в ВАСах или космидах фрагментов ДНК
крупных хромосом обеспечит надежное маркирование конкретных районов в
пахитенных хромосомах, что позволить построить надежные схемы их хромомерной
организации и завершить начатую работу по созданию идиограмм пахитенных
хромосом изучаемых видов. Построение физических карт хромосом, также позволит
провести детальный анализ хромосомных перестроек, имевших место в эволюции
описторхид. В связи с этим создание ВАС-библиотеки или космидной библиотеки
одного из видов описторхид с последующим ее использованием для построения
15
физических карт на базе пахитенных хромосом описторхид является естественным и
необходимым продолжением настоящей работы.
ВЫВОДЫ
1. В результате проведения цитогенетического анализа хромосом описторхид с
использованием методов дифференциального окрашивания и флуоресцентной
гибридизации in situ было показано:
- кариотип C. sinensis (2n=14) из Дальнего Востока РФ представлен, образован двумя
парами крупных метацентрических хромосом и пятью парами мелких хромосом
(субмета-, мета- и акроцентрических);
- кариотип M. bilis (2n=14) представлен, двумя парами крупных метацентрических
хромосом и пятью парами субмета- и акроцентрических хромосом;
- наличие узких С-позитивных блоков в прицентромерных районах всех хромосом
исследованных видов описторхид, интерстициальные (у O. felineus, M.
xanthosomus) и прителомерные (у всех видов) С-позитивные блоки; обнаружено
наличие одного транскрипционно активного ЯО района в одной из мелких
хромосом у всех изученных видов описторхид;
- кластер рДНК расположен в терминальной части q-плеча хромосомы 3 у
исследованных видов описторхид и представлен двумя субблоками,
локализованными в GC-богатых районах; показано, что теломерная ДНК
описторхид (TTAGGG)n локализована только в теломерных районах их хромосом;
- наличие кластеров хромосомоспецифичных повторов для хромосом 1 и 2 O. felineus
и M. xanthosomus; показано, что хромосомы описторхид, несмотря на небольшой
размер их генома, содержат большое количество диспергированных повторов;
2. Проведение морфометрического анализа хромосом описторхид позволило
установить, что их кариотипы обладают схожей морфологией и имеют одинаковое
хромосомное число (2n=14) за исключением виверровой двуустки O. viverrini
(2n=12), в кариотипе которой присутствует метацентрическая хромосома средних
размеров;
3. . Разработанный метод приготовления препаратов пахитенных хромосом позволил
впервые предложить номенклатуру хромосом для описторхид (O. felineus, O.
viverrini, M. xanthosomus, M. bilis). Сравнительный анализ хромомерной
организации мелких хромосом описторхид (O. felineus, O. viverrini, M. bilis, M.
xanthosomus) выявил наличие видоспецифических внутрихромосомных перестроек
(преимущественно перицентрических инверсий). Установлено, что хромосома 3
виверровой двуустки O. viverrini возникла в ходе слияния хромосом 3 и 7
возможного предкового кариотипа описторхид.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Zadesenets K.S., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Telomeric DNA in
chromosomes of five opisthorchid species. // Parasitology International. 2012. 61(1). P.81-83.
2. Zadesenets K.S., Karamysheva T.V., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B.
Distribution of repetitive DNA sequences in chromosomes of five opisthorchid species
(Trematoda, Platyhelminthes). // Parasitology International. 2012. 61(1). P. 84-86.
16
3. Zadesenets K.S., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Comparative
cytogenetics of opisthorchid species (Trematoda, Opisthorchiidae). // Parasitology
International. 2012. 61(1). P. 87-89.
4. Богомолов А.Г., Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Подколодный Н.Л., Рубцов Н.Б.
Визуализация хромоспецифичных последовательностей ДНК при проведении FISH
микродиссекционных ДНК-проб с метафазными хромосомами. // Вавиловский журнал
генетики и селекции. – 2012. – 16(2). – С. 202-211.
5. Мордвинов В.А., Катохин А.В., Брусенцов И.И., Романов К.В., Шеховцов С.В.,
Татьков С.И., Фурман Д.П., Сивков А.Ю., Помазной М.Ю., Львова М.Н., Шаманина
М.Ю., Задесенец К.С., Рубцов Н.Б. Исследование генетического разнообразия
возбудителей биогельминтозов человека, передающихся через рыбу, ракообразных и
продукты их переработки. // Итоговая конференция по приоритетному направлению
“Живые системы”. Москва, 2009.
6. Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Катохин А.В., Мордвинов В.А.
Молекулярно-цитогенетический анализ хромосом видов Opisthorchis felineus и
Metorchis xanthosomus. // III Межрегиональная конференция паразитологов Сибири и
Дальнего Востока, посвященная 80-летию проф. К.П.Федорова. Новосибирск, 2009.
7. Rubtsov N.B., Zadesenets K.S. Chromosome organization in the Opisthorchiidae
(Trematoda). // 7th International conference on bioinformatics of genome regulation and
structure\system biology (BGRS/SB’2010). Novosibirsk, 2010.
8. Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Катохин А.В., Мордвинов В.А.
Хромосомы описторхид (Trematoda, Opisthorchiidae). // V Международная конференция
по кариосистематике беспозвоночных животных (KARYO V). Новосибирск, 2010.
9. Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Катохин А.В., Мордвинов В.А., Рубцов Н.Б.
Анализ распределения повторенных последовательностей в хромосомах O. felineus и M.
xanthosomus. // Международная научная конференция “Теоретические и практические
проблемы паразитологии”. Москва, 2010.
10. Zadesenets K.S., Karamycheva T.V., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B.
Chromosomes of five species of liver flukes (Platyhelminthes, Trematoda). // 18th International
Chromosome Conference 2011. Manchester, UK, 2011.
11. Pakharukova M.Y., Ershov N.I., Vavilin V.A., Zadesenets K.S., Katokhin A.V.,
Merkulova T.I., Mordvinov V.A. Organization of xenobiotic-metabolizing system phase 1 in
Opisthorchis felineus (Trematoda, Platyhelminthes). // 12th International Symposium on
Flatworm Biology. Stockholm, Sweden, 2012.
12. Bogomolov A.G., Zadesenets K.S., Karamysheva T.V., Podkolodny N.L., Rubtsov N.B.
Fluorescence in situ hybridization with chromosome-derived DNA probes on Opisthorchis
felineus and Metorchis xanthosomus chromosomes without suppression of repetitive DNA
sequences. // 8th International conference on bioinformatics of genome regulation and
structure\system biology (BGRS/SB’2012). Novosibirsk, 2012.
13. Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Катохин А.В., Мордвинов В.А., Рубцов Н.Б.
Структурно-функциональная организация хромосом описторхид (Platyhelminthes,
Trematoda). // Хромосома - 2012. Новосибирск, 2012.
14. Задесенец К.С., Дюкалова М.Б., Виноградова М.С., Катохин А.В., Мордвинов В.А.,
Рубцов Н.Б. Комплексный микроскопический подход в изучении морфологии
кошачьей двуустки Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884). // “Современные проблемы
общей паразитологии”. Москва, 2012.
17