Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова
advertisement
Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова УТВЕРЖДАЮ УДК 547.057 № госрегистрации 114120370034 Проректор Инв. № МГУ имени М.В. Ломоносова ______________ А.А. Федянин «30» июня 2015 г. ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ ОТЧЕТ О ПРИКЛАДНЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Разработка методов получения наногрибридных функциональных магнитных материалов для МРТ диагностики и исследование их токсичности по теме: «Разработка нанодисперсного оксида железа в оболочках из неорганических материалов» промежуточный Этап 2 Шифр 2014-14-576-0056 Соглашение о предоставлении субсидии от «17» июня2014 г. № 14.604.21.0007 В рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса на 2014-2020 годы» Научный руководитель, доктор химических наук _______________ А.Г. Мажуга подпись, дата Москва 2015 СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ Руководитель работы Д.х.н., доцент Нормоконтролер, д.х.н. проф. Мажуга А.Г. Белоглазкина Е.К. Исполнители темы Инженер Рудаковская П.Г. (разделы 1-6) Инженер Мачулкин А.Э. (раздел 6) Индустриальный партнер Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная фирма «БиоКлиникум» Генеральный директор ООО НПФ «БиоКлиникум» Е.В. Трушкин РЕФЕРАТ Отчет 65 страниц, 1 ч, 66 рис., 7 таблиц МАГНИТНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ, НАНОЧАСТИЦЫ МАГНЕТИТА, ЧАСТИЦЫ ТИПА ЯДРО-ОБОЛОЧКА, МАГНЕТИТ-ЗОЛОТО, МАГНЕТИТ-КРЕМНИЙ, МАГНЕТИТ-УГЛЕРОД, МРТ ДИАГНОСТИКА, КОНТРАСТНЫЕ АГЕНТЫ Объектом исследования являются наночастицы магнетита, магнетит-оболочка (золото, кремний, углерод) для дальнейшего использования в качестве агентов для МРТ диагностики Цель работы – 1)Разработка высокоадаптируемых методов синтеза гибридных бифункциональных магнитных наноматериалов (ГБМН) для визуализации опухолей методом МРТ, 2) Разработка методологии комплексной оценки токсичности гибридных бифункциональных магнитных наноматериалов в экспериментах in vitro и in vivo. В ходе второго этапа нами были осуществлены физико-химические методы исследования наночастиц магнетита в неорганических оболочках и на основании полученных исследований были выбраны три потенциальных образца – гибридных бифункциональных магнитных наноматериалов (ГБМН): образец магнетит-золото сферической формы, диаметром 22±3 нм, образец магнетит-золото сферической формы, диаметром 26±3 нм, и образец сферической формы магнетит-кремний диаметром 9±1 нм. Для получения стабильных гибридных бифункционалиных материалов, а также для функционализации поверхности необходимо было изучение возможностей функционализации неорганической оболочкой – покрытия органической наночастиц оболочкой на магнетита основе с как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных лигандов. В ходе исследований были разработаны полиэтиленгликоля ковалентной связи методы на с нанесения поверхность лигандом бифункционального наночастиц (в качестве магнетита лиганда производного с образованием был использован дикарбоксиполиэтиленгликоль с молекулярной массой 2000 и 6000). Также были разработаны методы функционализации поверхности наночастиц магнетит-золото бифункциональным производным полиэтиленгликоля, содержащим тиольную группу для связывания с поверхностью золота, с образованием ковалентной связи сера – золото, а также имеющего в своем составе карбоксильную группу обеспечивающую функциональность полученных материалов. По результатам работы были разработаны лабораторные регламенты синтеза гибридных бифункциональных магнитных наноматериалов и наработаны образцы по данным регламентам в количествах достаточных для дальнейших исследований. Была исследована цитотоксичность на двух клеточных линиях человека, эксперименты показали низкую цитотоксичность гибридных бифункциональных магнитных наноматериалов. На следующих этапах планируется биологических свойств полученных ГБМН. исследование физико-химических и СОДЕРЖАНИЕ Введение 6 1. Изучение физико-химических свойств нанодисперсного оксида железа в оболочке из неорганических материалов, в том числе комплексное изучение динамических и статических магнитных свойств, изучение закономерностей с структура/строение – свойства. 41 2. Выбор по результатам проведенных исследований образцов нанодисперсного оксида железа в оболочке из неорганических материалов для дальнейшего исследования возможности применения их для визуализации опухолей методом МРТ. 3. Разработка методов 42 нанесения органической оболочки на образцы нанодисперсного оксида железа в оболочке из неорганических материалов. 4. Разработка лабораторных регламентов синтеза гибридных бифункциональных магнитных наноматериалов (ГБМН). 50 5. Наработка экспериментальных образцов ГБМН в количестве, достаточном для дальнейших исследований. 59 6. Исследования цитотоксичности (in vitro) экспериментальных образцов ГБМН на клеточной культуре человека. 60 Заключение..................................................................................................................... 63 ВВЕДЕНИЕ Рак одна из самых тяжелых, опасных и трудноизлечимых болезней на земле. Ранняя диагностика позволяет осуществить своевременное лечение. Основным методом диагностики опухолей является магнитно-резонансная томография (МРТ) с использованием контрастных агентов. Для более точного определения границ патологических изменений и оценки внутренней структуры используется диагностика с введением контрастных веществ. Основными проблемами в данной области медицины являются токсичность препаратов и сложность осуществления их адресной доставки. Вследствие высокой удельной намагниченности и возможности функционализации поверхности, магнитные наночастицы на основе оксида железа являются перспективным материалом для разработки как опухоль селективных МРТ-контрастирующих агентов, так и различных конструкций на основе магнитных наночастиц для адресной доставки лекарственных средств или противоопухолевой терапии методом локальной гипертермии. Кроме того, типичные значения релаксивности для магнитных наночастиц на порядок выше, чем соответствующие значения для используемых повсеместно в клинике контрастных агентов на основе хелатных комплексов гадолиния, что позволяет существенно снизить дозировку диагностического препарата и уменьшить его стоимость. Коллоидные растворы наночастиц чистого железа крайне нестабильны, окисляются на воздухе и в сухом виде пирофорны, поэтому чаще всего используют наночастицы оксида железа Fe3O4 или γ-Fe2O3, обладающие схожими магнитными свойствами. Но данные препараты также имеют целый ряд недостатков: высокая токсичность, склонность к быстрой агрегации в физиологических условиях, трудности функционализации поверхности. В российской медицинской практике в настоящий момент нет ни одного контрастного агента на основе магнетита, в мировой практике существующие агенты выводятся из практики из-за их высокой токсичности. Адресные контрастные агенты пока остаются лишь на стадии научных исследований. Таким образом, разработка методов синтеза гибридных бифункциональных магнитных наноматериалов для визуализации опухолей методом МРТ является актуальной задачей. В связи с этим, целью нашей работы на втором этапе является комплексное изучение физико-химических свойств полученных на первом этапе материалов на основе наночастиц магнетита в неорганической оболочке (золото, кремний, углерод), а также выявление закономерностей структура свойства для выбора оптимальных материалов в качестве потенциальных лекарственных ГБМН. Покрытие наночастиц магнетита в неорганической оболочке (золото, кремний, углерод) органическими бифункциональными лигандами позволяет ковалентно присоединять векторные или транспортируемые наночастицам. Данное свойство делает молекулы возможным к подобным адресную доставку диагностического препарата в орган-мишень и позволяет проводить более точную верификацию степени и размера патологического процесса в исследуемой ткани. Таким образом на втором этапе перед нами стояла задача разработки методов нанесения органической оболочки на образцы нанодисперсного оксида железа в неорганической оболочке. Современным препаратов направлением «тераностиков» медицинской позволяющих химии является осуществить создание одновременную визуализацию и терапию. Наночастицы типа ядро-оболочка (магнетит-золото, магнетит-кремний, магнетит-углерод) являются перспективными материалами в данной области, благодаря возможности бифункционализации поверхности (введение адресных и лекарственных молекул). Использование тераностиков позволяет снизить уровень токсичности препаратов и увеличить эффективность воздействия. В настоящее время существуют различные виды контрастных агентов для МРТ. Все контрастные агенты могут быть разделены на 2 большие группы: неспецифичные и специфичные. В настоящее время в клинической практике в основном представлены неспецифичные контрастные агенты на основе комплексов ионов Gd, Mn, Fe, а также суперпарамагнитных частиц оксидов железа. Использование контрастных агентов на основе металло-комплексов имеет ряд недостатков, таких как риск высвобождения свободных ионов в плазму крови с последующими осложнениями, такими как нефрит, васкулит, системное поражение соединительных тканей. К тому же препараты этого ряда имеют высокую стоимость. Препараты на основе суперпарамагнитных частиц являются менее дорогими, однако, в последнее время их выводят из производства из-за высокой токсичности. Следует отметить, что безопасные специфичные препараты не введены в клиническую практику. Таким образом, перед нами стоит важная задача поиск и разработка высокоадаптируемых методов синтеза гибридных бифункциональных магнитных наноматериалов для визуализации опухолей методом МРТ. А на следущем этапе Разработка методологии комплексной оценки токсичности гибридных бифункциональных магнитных наноматериалов в экспериментах in vitro и in vivo. Основными задачами этапа являются: исследование физико-химических свойств образцов магнетита в неорганической оболочке, полученных на первом этапе работ, выбор оптимальных материалов для дальнейшей модификации, разработка методик функционализации поверхности, наработка образцов ГБМН и изучение их токсичности. Основанием для проведения ПНИ, выполняемой в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», является Соглашение о представлении субсидии от «17» июня 2014 г. № 14.604.21.0007. Первая часть работы заключается в комплексном исследовании и анализе физико-химических свойств материалов полученных на первом этапе – 12 образцов, имеющих структуру ядро-оболочка и различную морфологию. Комплексное изучение включает в себя полный анализ размера наночастиц – размер ядра толщина неорганической оболочки, наличие органического покрытия и стабильность наночастиц, а также изучение динамических и статических магнитных характеристик. Следующим этапом является анализ полученных свойств и выделение наиболее перспективных материалов. Данный этап работы (второй) является наиболее важным, так как в ходе него осуществляется анализ полученных препаратов и выбор оптимельных образцов для дальнейших исследований. Основными параметрами для выбора материалов являются: простота синтеза, возможность масштабирования, воспроизводимость результатов, высокие магнитные свойства, отсутствие патентов по данным типам препаратов. На основании физико-химических и аналитических исследований будут выявлены оптимальные материалы для осуществления модификации адресными лигандами и биологических исследований, так называемые материалы-лидеры. В ходе этапа были предложены методы модификации поверхности материалов органическими лигандами, что позволит расширить и оптимизировать дальнейшее использование материалов для биомедицины. 1 ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НАНОДИСПЕРСНОГО ОКСИДА ЖЕЛЕЗА В ОБОЛОЧКЕ ИЗ НЕОРГАНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ, В ТОМ ЧИСЛЕ КОМПЛЕКСНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИЧЕСКИХ И СТАТИЧЕСКИХ МАГНИТНЫХ СВОЙСТВ, ИЗУЧЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ С СТРУКТУРА/СТРОЕНИЕ – СВОЙСТВА. 1.1 Введение В ходе первого этапа работ были синтезированы образцы предположительно имеющие структуру типа ядро-оболочка, состава: магнетит-золото, магнетиткремний, магнетит-углерод. Целью второго этапа является анализ структуры и изучение физико-химических свойств полученных материалов с целью выделения оптимальных образцов – структур-лидеров (не менее трех), для их дальнейшего исследования и модификации в качестве потенциальных агентов для МРТ диагностики. Для полного изучения закономерностей стуктура/строение – свойства и анализа полученных данных необходимо использование следующих методов анализа. Для определения размера и формы частиц используется метод просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Для оценки структуры экспериментальных образцов используют несколько методов, во-первых - метод просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения с использованием метода EDX (определение элементного состава) и метод рентгеновской дифракции XRD с использованием дифрактометра. Также для оценки структуры используют метод РСА и РФА. Данный метод позволяет оценить состав и структуру образцов. По результатам указанных методов получается полная картина структуры и строения образца. Далее для оценки свойств изучают динамические и статические магнитные характеристики, а также коллоидную стабильность образцов, что необходимо для любых биологических экспериментов. Все исследования были осуществлены согласно ТЗ и разработанным на предыдущем этапе программам и методикам исследовательских испытаний физико-химических свойств нанодисперсного оксида железа в оболочках из неорганических материалов (золото, кремний и углерод). 1.2 Проверка размера наночастиц в экспериментальном образце Для проверки размера наночастиц использовался прибор JEM-1400Plus. Для обсчета размера и определения распределения по размерам были получены не менее 10 фотографий наночастиц каждого образца, обсчет проводили в программе ImageJ, а также с использованием программы Exel. Первый образец: наночастицы магнетит-золото. На рисунке 1 представлена одна из 10 микрофотографий по которым затем был проведен обсчет. Золото имеет большую молекулярную массу в сравнении с железом, поэтому на микрофотографиях золото имеет больший контраст в сравнении с наночастицами чистого железа. Результаты обсчета представлены на рисунке 2. Рис. 1Данные ПЭМ для наночастиц магнетит-золото (образец 1) Рис. 2 Распределение по размерам для наночастиц магнетит-золото (образец 1) По данным просвечивающей электронной микроскопии (обсчитано более 500 частиц) образец 1 имеет размер 22±3 нм. Второй образец: наночастицы магнетит-золото. На рисунке 3 представлена одна из 10 микрофотографий по которым затем был проведен обсчет. Результаты обсчета представлены на рисунке 4. Рис. 3 Данные ПЭМ для наночастиц магнетит-золото (образец 2) Рис. 4 Распределение по размерам для наночастиц магнетит-золото (образец 2) По данным просвечивающей электронной микроскопии (обсчитано более 500 частиц) образец 2 имеет размер 26±3 нм. Третий образец: наночастицы магнетит-золото. На рисунке 5 представлена одна из 10 микрофотографий по которым затем был проведен обсчет. Результаты обсчета представлены на рисунке 6. Рис. 5 Данные ПЭМ для наночастиц магнетит-золото (образец 3) Рис. 6 Распределение по размерам для наночастиц магнетит-золото (образец 3) По данным просвечивающей электронной микроскопии (обсчитано более 500 частиц) образец 3 имеет размер 35±4 нм. Четвертый образец: наночастицы магнетит-золото. На рисунке 7 представлена одна из 10 микрофотографий по которым затем был проведен обсчет. Результаты обсчета представлены на рисунке 8. Рис. 7 Данные ПЭМ для наночастиц магнетит-золото (образец 4) Рис. 8 Распределение по размерам (длина, ширина) для наночастиц магнетит-золото (образец 4) По данным просвечивающей электронной микроскопии (обсчитано более 500 частиц) образец 4 имеет размер 40±4 нм*13±2 нм. Пятый образец: наночастицы магнетит-золото. На рисунке 9 представлена одна из 10 микрофотографий по которым затем был проведен обсчет. Результаты обсчета представлены на рисунке 10. Рис. 9 Данные ПЭМ для наночастиц магнетит-золото (образец 5) Рис. 10 Распределение по размерам (длина, ширина) для наночастиц магнетит-золото (образец 5) По данным просвечивающей электронной микроскопии (обсчитано более 500 частиц) образец 4 имеет размер 55±4 нм*14±1 нм. Шестой образец: наночастицы магнетит-кремний. Так как оболочкой в случае наночастиц магнетит-кремний является силан, то по данным ПЭМ мы можем судить лишь о размере металлического ядра магнетита. Данный размер является показателем стабильности неизменности структуры при осуществлении покрытия наночастиц оболочкой силана, а также является определяющим по условиям ТЗ. На рисунке 11 представлена одна из 10 микрофотографий по которым затем был проведен обсчет. Результаты обсчета представлены на рисунке 12. Рис. 11 Данные ПЭМ для наночастиц магнетит-кремний (образец 6) Рис. 12 Распределение по размерам для наночастиц магнетит-кремний (образец 6) По данным просвечивающей электронной микроскопии (обсчитано более 500 частиц) образец 6 имеет размер ядра 9±1 нм. Седьмой образец: наночастицы магнетит-кремний. На рисунке 13 представлена одна из 10 микрофотографий по которым затем был проведен обсчет. Результаты обсчета представлены на рисунке 14. Рис. 13 Данные ПЭМ для наночастиц магнетит-кремний (образец 7) Рис. 14 Распределение по размерам для наночастиц магнетит-кремний (образец 7) По данным просвечивающей электронной микроскопии (обсчитано более 500 частиц) образец 7 имеет размер ядра 16±2 нм. Восьмой образец: наночастицы магнетит-кремний. На рисунке 15 представлена одна из 10 микрофотографий по которым затем был проведен обсчет. Результаты обсчета представлены на рисунке 16. Рис. 15 Данные ПЭМ для наночастиц магнетит-кремний (образец 8) Рис. 16 Распределение по размерам для наночастиц магнетит-кремний (образец 8) По данным просвечивающей электронной микроскопии (обсчитано более 500 частиц) образец 8 имеет размер ядра 25±4 нм. Девятый образец: наночастицы магнетит-кремний. На рисунке 17 представлена одна из 10 микрофотографий по которым затем был проведен обсчет. Результаты обсчета представлены на рисунке 18. Рис. 17 Данные ПЭМ для наночастиц магнетит-кремний (образец 9) Рис. 12 Распределение по размерам для наночастиц магнетит-кремний (образец 9) По данным просвечивающей электронной микроскопии (обсчитано более 500 частиц) образец 9 имеет размер ядра 35±3 нм*12±1. Десятый образец: наночастицы магнетит-кремний. На рисунке 19 представлена одна из 10 микрофотографий по которым затем был проведен обсчет. Результаты обсчета представлены на рисунке 20. Рис. 19 Данные ПЭМ для наночастиц магнетит-кремний (образец 10) Рис. 20 Распределение по размерам для наночастиц магнетит-кремний (образец 10) По данным просвечивающей электронной микроскопии (обсчитано более 500 частиц) образец 10 имеет размер ядра 50±2 нм*10±1. Одиннадцатый образец: наночастицы магнетит-углерод.. На рисунке 21 представлена одна из 10 микрофотографий по которым затем был проведен обсчет. Результаты обсчета представлены на рисунке 22. Рис. 21 Данные ПЭМ для наночастиц магнетит-углерод (образец 11) Рис. 22 Распределение по размерам для наночастиц магнетит-углерод (образец 11) По данным просвечивающей электронной микроскопии (обсчитано более 500 частиц) образец 11 имеет размер ядра 80±10 нм. Наночастицы магнетит-углерод были получены размером 80±10 нм, что не соответствует ТЗ. В ходе литературного обзора представленного на первом этапе было обнаружено, что методик получения наночастиц магнетитуглерод ограниченное количество, причем магнетит генерируется во всех случаях in-situ, таким образом, в соответствии с ТЗ и ПГ (синтез по известным литературным методикам) нами были синтезированы наночастицы магнетитуглерод указанного размера по известной литературной методике. В ходе работы второго этапа методика была оптимизирована и был получен образец 12. В ходе оптимизации была снижена концентрация и увеличено время протекания реакции, что позволило снизить размер наночастиц до требуемых в ТЗ. Оптимизированная методика приведена в МЕТОДИКЕ СИНТЕЗА наночастиц магнетит-углерод, размером 25±3 нм (М13) от 10 февраля 2015. Двенадцатый образец: наночастицы магнетит-углерод. На рисунке 23 представлена одна из 10 микрофотографий по которым затем был проведен обсчет. Результаты обсчета представлены на рисунке 24. Рис. 23 Данные ПЭМ для наночастиц магнетит-углерод (образец 12) Рис. 24 Распределение по размерам для наночастиц магнетит-углерод (образец 12) По данным просвечивающей электронной микроскопии (обсчитано более 500 частиц) образец 12 имеет размер ядра 25±3 нм, что соответствует ТЗ. Далее вместо образца 11 был исследован образец 12, строго соответствующий ТЗ. 1.3 Проверка формы наночастиц в экспериментальном образце По результатам просвечивающей электронной микроскопии может быть определен не только размер наночастиц но и форма. Соответственно для образцов 13 (магнетит-золото), для образцов 6-8 (магнетит-кремний) и для образца 12 форма наночастиц сферическая (с небольшими отклонениями, присутствуют овальные частицы, что соответсвует условиям ТЗ). Для образцов 4,5 (магнетит-золото), 9, 10 (магнетит-кремний) форма наночастиц цилиндрическая, что строго соответсвует условиям ТЗ. На рисунках 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23 представлены микрофотографии по которым можно видеть, что форма соответсвует действительности. 1.4 Проверка структуры наночастиц в экспериментальном образце и толщины оболочки 1.4.1Структура Ядро-оболочка Для оценки структуры наночастиц магнетит-золото необходимо проведение дополнительных исследований, а именно исследований наночастиц с помощью микроскопии высокого разрешения и метода элементного анализа EDX. Данные исследования необходимы так как золото не позволяет видеть частицу магнетита (ядро) так как дает более интенсивное окрашивание на микрофотографиях с использованием ПЭМ. Таким образом образцы 1-5 были исследованы при помощи ПЭМ высокого разрешения с использованием метода EDX. На рисунках 25 и 26, 27 и 28, 29 и 30, 31 и 32, 33 и 34 показаны данные ПЭМ высокого разрешения и результаты элементного анализа для выбранной области для образцов 1-5 соответственно, по этим данным можно убедиться о наличие структуры ядрооболочка. В выбранной области присутствуют как линии железа, так и линии золота. Рис. 25 Данные ПЭМ ВР образца 1 Рис. 26 Данные EDX образца 1 Рис. 27 Данные ПЭМ ВР образца 2 Рис. 28 Данные EDX образца 2 Рис. 29 Данные ПЭМ ВР образца 3 Рис. 30 Данные EDX образца 3 Рис. 31 Данные ПЭМ ВР образца 4 Рис. 32 Данные EDX образца 4 Рис. 33 Данные ПЭМ ВР образца 5 Рис. 34 Данные EDX образца 5 Прямым методом доказательства структуры «ядро-оболочка» в случае образцов 1-5 служат результаты EDX-спектроскопии, снятой в ходе анализа методом ПЭМ высокого разрешения. Можно видеть, что на микрофотографиях данных образцов отсутствуют отдельные наночастицы магнетита, в то время как в спектре одновременно присутствуют линии железа и линии золота. В случае образцов магнетит-кремний оболочкой является силан (производное кремния). Связывание наночастиц магнетита с производными кремния осуществляется за счет ковалентной связи железо-кислород-кремний. В качестве реагентов использовался 3-аминопропилтриэтоксисилан. Наличие в структуре трех этокси групп обеспечивает связывание с поверхностью магнетита за счет постепенного гидролиза и образования новой связи по механизму нуклеофильного замещения (рис. 35). Рис. 35 Механизм покрытия магнетита силаном Такой подход к функционализации обеспечивает получение наночастиц магнетита полностью покрытых оболочкой, согласно литературным данным и механизму. Наличие силана на поверхности наночастиц магнетит-силан подтверждается методом элементного анализа а также методом термогравиметрии (ТГА), а также косвенно потверждается увеличением стабильности по сравнению с наночастицами магнетита (подробно рассмотрено в 1.7). Результаты EDX сходны между собой в качестве примера на рис. 36 представлен результат для образца 6 магнетит-силан. Рис. 36 Данные EDX образца 6 1.4.2Толщина оболочки Для анализа толщины оболочки в случае наночастиц магнетит-золото использовался следующий подход. Зная размер ядра магнетита и размер полученных наночастиц магнетит-золото из последнего диаметра вычитали первый и по разнице деленной на два находили толщину оболочки . Данные вычисления сделаны в приближении что частицы имеют идеальную сферическую формы и с условием доказанности структуры ядро-оболочка. В случае цилиндрической формы аналогично определяли толщину по длине и ширине наночастиц. Возможные отклонения могут быть связаны с неидеальностью структуры (эллипсоидальная форма), но максимальная погрешность вносимая отклонениями составляет ±0,5 нм, что допустимо по условиям ТЗ и программ и методик разработанных на первом этапе. Таблица 1. Рассчет толщины оболочки наночастиц магнетит-золото Образец № Размер ядра Размер частицы Толщина оболочки 1 9±1 нм 22±3 нм 6±3 нм 2 16±2 нм 26±3 нм 5±3 нм 3 25±4 нм 35±4 нм 5±4 нм 4 35±3 нм*12±1 40±4 нм*13±2 нм 2,5±4 нм 5 50±2 нм*10±1 55±3 нм*14±1 нм 2,5±3 нм 6 9±1 нм 1,7 нм 7 16±2 нм 1,5 нм 8 25±4 нм 0,7 нм 9 35±3 нм*12±1 0,4 нм 10 50±2 нм*10±1 0,6 нм 12 16±2 нм 25±3 нм 4,5 нм В таблице 1 приведены данные по расчетам толщины оболочки для образцов 1 – 5 магнетит – золото. Толщина составляет от 2 до 6 нм, что в пределах погрешности соответствует ТЗ (±3 нм). В случае наночастиц магнетит-силан (образцы 6-10) толщина оболочки не превышает 2-3 нм согласно литературным данным о строении оболочки и размеру молекулы силана (низкомолекулярное соединение 3-аминопропилтриэтоксисилан). Также толщина оболочки была доказана при помощи микроскопии высокого разрешения с методом EDX. Элементный анализ показал наличие кремния на поверхности частиц (образцы 6-10) и углерода для образца 12. На рисунке 36 показаны данные ПЭМ ВР для наночастиц магнетит- кремний и магнетит-углерод, в таблице 1 приведены полученные по данным микроскопии данные ширины оболочки, данные совпадают с теоретически расчетными. образец 6 образец 7 образец 8 образец 9 образец 10 образец 12 Рис. 36 Данные ПЭМ ВР 1.5 Проверка массы сухого экспериментального образца Для всех полученных образцов была проведена проверка массы сухого экспериментального образца необходимого для изучения магнитных свойств и структурных свойств. Минимально необходимая масса для образцов магнетитзолото (1-5) составляет 10 мг, для образцов магнетит-силан (6-10) 100 мг, для образцов магнетит-углерод (12) 10 мг. Все массы согласно таблице 2 соотвествуют ТЗ или превышают положенные данные. Таблица 2. Масса полученных образцов 1.6 Образец № Масса образца Масса по ТЗ Магнетит-золото 1 35 мг >10 мг Магнетит-золото 2 38 мг >10 мг Магнетит-золото 3 32 мг >10 мг Магнетит-золото 4 26 мг >10 мг Магнетит-золото 5 31 мг >10 мг Магнетит-кремний 6 120 мг >100 мг Магнетит-кремний 7 114 мг >100 мг Магнетит-кремний 8 146 мг >100 мг Магнетит-кремний 9 103 мг >100 мг Магнетит-кремний 10 111 мг >100 мг Магнетит-углерод 12 12 мг >10 мг Проверка объема раствора экспериментального образца Для всех полученных образцов была проведена проверка объема раствора экспериментального образца необходимого для изучения стабильности в водных растворах а также для дальнейших испытаний. Минимально необходимый объем для образцов составляет 50 мл. Все объемы согласно таблице 3 соотвествуют ТЗ. Таблица 3. Объем полученных образцов 1.7 Образец № Объем образца Масса по ТЗ Магнетит-золото 1 60 мл >50 мл Магнетит-золото 2 60 мл >50 мл Магнетит-золото 3 60 мл >50 мл Магнетит-золото 4 60 мл >50 мл Магнетит-золото 5 60 мл >50 мл Магнетит-кремний 6 60 мл >50 мл Магнетит-кремний 7 60 мл >50 мл Магнетит-кремний 8 60 мл >50 мл Магнетит-кремний 9 60 мл >50 мл Магнетит-кремний 10 60 мл >50 мл Магнетит-углерод 12 60 мл >50 мл Проверка гидрофильности наночастиц в Экспериментальном образце и Проверка коллоидной стабильности наночастиц экспериментального образца в течение определенного времени Проверка гидрофильности заключается в исследовании возможности ресуспензирования образца в определенном объеме с получением необходимой концентрации наноночастиц в растворе. Минимальная концентрация составляет 1 мг/мл. минимальное время в течение которого раствор должен быть стабилен 30 дней. Далее за раствором также продолжают наблюдение. Для определения гидрофильности и коллоидной стабильности наночастиц экспериментальный образец суспензируют в деионизованной воде и оценивают размер наночастиц или агрегатов в растворе методом динамического светорассеивания, сразу после приготовления раствора и через определенные временные промежутки. Навеску образца суспензируют в эппендорфе в деионизованной воде, выдерживают в УЗ-бане в течение полу часа до получения коллоидностабильного раствора. Полученный раствор исследуют методом ДСР через определенные промежутки времени: 1 мин, 5 мин, 10 мин, 20 мин, 30 мин, 45 мин, 60 мин, 120 мин, 1 день, 2 дня, неделя, 30 дней. Объект испытаний считается выдержавшим испытание, если образцы частиц суспензируются в заданной концентрации и остаются стабильны не менее суток. Все образцы были исследованы методом динамического светорассеивания и данные сведены в таблицу 4 Образец 0 № ∕ ДСР мин мин мин мин мин мин мин мин мин Магнетит 51 1 5 10 20 30 45 60 120 1 2 7 день дня дней 30 40 55 54 58 57 59 55 58 56 78 76 92 88 91 68 72 70 66 64 78 74 78 77 80 76 82 80 76 74 76 77 76 79 77 78 92 99 104 112 112 112 115 114 123 124 119 128 137 158 164 180 180 200 128 146 143 154 150 149 167 163 169 169 210 220 250 62 62 68 66 68 72 72 70 84 82 84 84 84 112 112 116 118 122 121 135 138 180 180 195 200 240 145 142 145 153 187 193 201 201 205 210 224 225 280 180 180 185 185 185 190 190 200 210 210 220 240 350 210 225 228 230 230 235 235 235 245 245 250 250 310 -золото 1 Магнетит 70 -золото 2 Магнетит 72 -золото 3 Магнетит 111 -золото 4 Магнетит 120 -золото 5 Магнетит 60 -кремний 6 Магнетит 110 -кремний 7 Магнетит 130 -кремний 8 Магнетит 170 -кремний 9 Магнетит 190 -кремний 10 Магнетит 110 115 115 120 120 120 140 180 180 215 220 300 ТЗ. Все 310 890 -углерод 12 Все образцы 1-12 прошли испытание согласно образцы суспензируются в воде с получением стабильных коллоидных растворов в течение тридцати дней. Размер полученный методом ДСР свидетельствует о том, что наночастицы в растворе находятся в виде небольших агрегатов, склонных к увеличению с течением времени. Наилучшим образом показали себя три образца: магнетит-золото образцы 1 и 2 и магнетит-кремний образец 6. Данные образцы были стабильны и после достижения необходимого времени(30 суток), а также следует отметить воспроизводимость всех полученных результатов. На рис. 37 и 38 в качестве примера приведены данные ДСР для 0 минуты и 40 дней для образца 6 магнетит-кремний. Рис. 37 Данные ДСР образца 6 (0 минут) Рис. 38 Данные ДСР образца 6 (40 дней) Определение 1.8 статических магнитных свойств: Проверка намагниченности и коэрцетивной силы наночастиц в экспериментальном образце В ходе работы изучали поведение образцов во внешнем магнитном поле (рис.39) и определяли магнитные характеристики полученных частиц – коэрцитивную силу и намагниченность насыщения (таблица 5). Таблица 5. Магнитные характеристики наночастиц магнетит-золото (образцы 1-5) Образец № Мs, э.м.е./г Hc, Э Магнетит-золото 1 61 38 Магнетит-золото 2 59 38 Магнетит-золото 3 59 38 Магнетит-золото 4 58 39 Магнетит-золото 5 58 35 Магнетит-кремний 61 39 6 Магнетит-кремний 59 38 Магнетит-кремний 57 38 Магнетит-кремний 58 37 Магнетит-кремний 58 38 Магнетит-углерод 56 34 7 8 9 10 12 Рис. 39 Петли гистерезиса (слева) и их увеличенные около нуля области (справа) для образцов магнетит-золото 1-5 Рис. 40 Петли гистерезиса (слева) и их увеличенные около нуля области (справа) для образцов магнетит-кремний и магнетит-углерод 6-12. По результатам изучения магнитных свойств было обнаружено, что все образцы 1-12 являются ферримагнетиками с коэрцитивной силой 35-47 Э и намагниченностью насыщения 59-62 э.м.е./г Fe3O4. Таким образом, неорганическая оболочка на поверхности магнетита не оказывает влияние на намагниченность насыщения и на коэрцитивную силу. 1.9 Определение динамических магнитных свойств: Проверка релаксивности наночастиц в экспериментальном образце Для образцов 1-12 магнетит-золото, магнетит-кренмий и магнетит-углерод определяли релаксивность in vitro при 25°С и силе поля 7Т. Было установлено, что исследованные образцы существенно уменьшают время Т2-релаксации протонов воды; ослабление сигнала коррелирует с концентрацией частиц в растворе. Для образцов магнетита представленные в таблице были получены величины R2-релаксивности 6 (рис. 41), что превышает аналогичные величины существующих контрастных агентов на основе МНЧ оксидов железа. Можно сделать вывод, что покрытие неорганической оболочкой не приводит к существенному влиянию на способность наночастиц магнетита уменьшать время Т2-релаксации протонов воды за счет создания вокруг себя неоднородного магнитного поля, что коррелирует также с отсутствием влияния оболочки на параметры петли гистерезиса. Таблица 6. Данные релаксивности образцов Образец № R2, 1/моль/с Магнетит-золото 1 226 Магнетит-золото 2 232 Магнетит-золото 3 220 Магнетит-золото 4 218 Магнетит-золото 5 201 Магнетит-кремний 193 Магнетит-кремний 125 Магнетит-кремний 132 Магнетит-кремний 121 Магнетит-кремний 98 Магнетит-углерод 56 6 7 8 9 10 12 Рис. 41 зависимость скорости релаксации от концентрации Fe 2 ВЫБОР ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ОБРАЗЦОВ НАНОДИСПЕРСНОГО ОКСИДА ЖЕЛЕЗА В ОБОЛОЧКЕ ИЗ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛОВ ВОЗМОЖНОСТИ ДЛЯ ДАЛЬНЕЙШЕГО ПРИМЕНЕНИЯ ИХ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ОПУХОЛЕЙ МЕТОДОМ МРТ В ходе второго этапа работы были исследованы материалы синтезированные в первом этапе: 11 образцов магнетита покрытого неорганической оболочкой. Исследования были направлены на изучение физико-химических свойств образцов с целью определения оптимальных образцов для дальнейших биологических исследований. Исследования стабильности показали устойчивость большинства образцов, но наилучшие показатели были у образцов магнетит-золото 1,2 и магнетит-кремний 6. Эти образцы также показали хорошие результаты по магнитным характеристикам. Таким образом, по результатам физико-химиечских исследований были выбраны три образца: 1. Наночастицы магнетит-золото размером 22±3 нм образец 1 2. Наночастицы магнетит-золото размером 26±3 нм образец 2 3. Наночастицы магнетит-кремний размером 9±1 нм образец 6 Следует отметить, что на выбор образцов также влияет выбор методики синтеза образца. Методика должна позволять получать образцы в необходимых количествах, быть простой и доступной, а также экономичной. Данные качества присутствуют у выбранных образцов, что подтверждает выбор. 3 РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ НАНЕСЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКОЙ ОБОЛОЧКИ НА ОБРАЗЦЫ НАНОДИСПЕРСНОГО ОКСИДА ЖЕЛЕЗА В ОБОЛОЧКЕ ИЗ НЕОРГАНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Вследствие высокой удельной намагниченности и возможности функционализации поверхности, магнитные наночастицы на основе оксида железа являются перспективным материалом для разработки опухоль селективных МРТконтрастирующих агентов. Наночастицы ядро-оболочка являются перспективными биоматериалами, благодаря возможности комбинирования свойств нескольких материалов в одной частице. Так, например, использование магнетита в качестве ядра для материалов типа ядро-оболочки позволяет избежать недостатки, при этом использование в качестве оболочки золота обеспечивает коллоидную стабильность, простоту функционализации и биосовместимость. Благодаря сродству серы к золоту поверхность наночастиц магнетит-золото легко функционализируется серосодержащими органическими лигандами. Одним из преимуществ покрытия магнитных частиц золотой оболочкой является простота дальнейшей функционализации поверхности, в первую очередь, за счет образования прочной связи золота с серой, и соответственно, связи с тиольной, дисульфидной группой. В качестве возможного лиганда содержащего функциональную группу могут выступать как низко, так и высокомолекулярные лиганды содержащие фрагмент для связывания с поверхностью, а также активный центр. Нами были меркаптоуксусная рассмотрены кислота, в качестве потенциальных меркаптоундекановая кислота, лигандов липоевая – и полиэтиленгликоль с тио- и карбокси- функциональными группами. Для сравнения были получены образцы со всеми лигандами. Для получения 1% раствор лиганда смешивают 1:1 (объемные доли) с раствором наночастиц магнетит-золото. В результате были получены 4 раствора, для определения оптимального динамического лиганда были проведены светорассеивания, был следующие определен измерения: дзета-потенциал стабильность в течении длительного времени (более 1 недели). методом частиц, Стабильность наночастиц определяется размером по данным динамического светорассеивания. Оптимальным размером является размер до 100-120 нм, а также необходимо сохранение проанализированы размера наночастицы в течение длительного функционализированные времени. Были меркаптоуксусной кислотой (рис.42 и 43) меркаптоундекановой (рис. 44 и 45 ) липоевой (рис. 46 и 47) и тио-полиэтиленгликоль (рис. 48 и 49 ). Рис. 42 Наночастицы, функционализированные меркаптоуксусной кислотой (1 день) Рис. 43 Наночастицы, функционализированные меркаптоуксусной кислотой (7 день) Рис. 44 Наночастицы, функционализированные меркаптоундекановой кислотой (1 день) Рис. 45 Наночастицы, функционализированные меркаптоундекановой кислотой (7 день) Рис. 46 Наночастицы, функционализированные липоевой кислотой (1 день) Рис. 47 Наночастицы, функционализированные липоевой кислотой (7 день) Рис. 48 Наночастицы, функционализированные ПЭГ-кислотой (1 день) Рис. 49 Наночастицы, функционализированные ПЭГ-кислотой (7 день) Как видно из графиков эксперименты показали, что стабильными являются только образцы с полиэтиленгликолем и липоевой кислотой, что подтверждается литературными данными об образовании монослоев на поверхности золота. По данным дзета-потенциала и ДСР (-5 мВ, -11мВ и 110 нм, 240 нм соответственно) бифункциональный полиэтиленгликоль является оптимальным лигандом, тогда как другие лиганды приводят к образованию крупных агрегатов не пригодных для биологических исследований. Для стабилизации золотых частиц широко используется их покрытие тиополиэтиленгликолем (ПЭГ, SH-PEG). Он может применяться и для стабилизации магнитно-золотых наночастиц, в виде индивидуального покрытия или в смеси с другим лигандом. Однако более практически значимым является использование его бифункциональных производных, так например меркапто-PEG-кислоты с молекулярной массой 500-5000 г/моль, которое, помимо повышения растворимости и стабильности частиц, позволяет использовать карбоксильную группу для образования ковалентной связи с аминогруппами биомолекул, обладающих требуемыми функциональными свойствами. В ходе второго этапа работы была проведена оптимизация и разработка методики нанесения полиэтиленгликоля на серосодержащего поверхность бифункционального наночастиц производного магнетит-золото. В ходе эксперимента варьировалась концентрация и соотношение наночастиц магнетитзолото и высокомолекулярного лиганда. Было показано, что оптимальным является использование следующего соотношения. В реакцию вводили раствор наночастиц магнетит-золото и раствор полиэтиленгликоля (1мг/мл) в объемном соотношении 1:1. Данное соотношение позволяет полностью заменить цитрат на поверхности наночастиц магнетит-золото на серосодержащее производное полиэтиленгликоля. Образцы 1 и 2 магнетит золото были введены в реакцию функционализации в результате были получены образцы 1Р и 2Р. ζ-потенциалы наночастиц до и после функционализации были отрицательными (в среднем, -40 и -25 мВ, соответственно, см. таблицу 7). До функционализации это объясняется наличием цитрат-ионов на поверхности золотой оболочки, которые серосодержащими пропорционален обеспечивают лигандами количеству и лиганда ее стабилизацию; диализа после отрицательный (меркапто-кислоты), покрытия ζ-потенциал связавшегося с поверхностью. Таким образом, можно сделать вывод, что во всех случаях функционализация лигандом прошла успешно. Таблица 7 Образец ζ-потенциал Образец 1 -37±4 Образец 2 -48±4 Образец 1Р -19±4 Образец 2Р -39±3 Для определения количества серосодержащего лиганда, способного связаться с поверхностью наночастиц Fe3O4@Au, проводили термогравиметрический анализ образцов 1 и 2 до и после функционализации меркаптополиэтиленгликолевой кислотой в интервале температур от 40 до 600°С (рис. 50). Для образцов 1, 2 и полученных при их модификации SHPEGCOOH образцов 1Р и 2Р, был проведен термогравиметрический анализ (рис.50). Суммарная потеря массы на 14% в интервале температур 200-600°С для образца 1 (рис.50,а) и на 3% в аналогичном интервале для образца 2 (рис.50,б) соответствует разложению стабилизирующей оболочки из цитрат-анионов. Потеря массы на 22% в интервале температур 200400°С для образца 1Р (рис.50,в) и на 75% в том же интервале температур для образца 2Р (рис.50,г) соответствует разложению меркапто-ПЭГ-кислоты, связанной с поверхностью частиц. Рис. 50. ТГ-кривые для образца 1 до функционализации (а) и после функционализации (в), для образца 2 до функционализации (б) и после функционализации (г) магне Таким образом, была предложена оптимальная методика модификации поверхности наночастиц ковалентно серосодержащим бифункциональным органическим лигандом. В случае образцов магнетит-кремний модификация является более сложным процессом. Нами было предложено проведение реакции карбодиимидного синтеза непосредственно на поверхности наночастиц магнетит-кремний. Амино группа на поверхности вводится в реакцию карбодиимидного синтеза с карбоксильной группой дикарбоксиполиэтиленгликоля, предварительно активированной. В качестве карбодиимидного реагента были проанализированы различные реагенты карбодиимидного синтеза, такие как дициклогексилкарбодиимид в присутствии диметиламинопиридина, N-(3-диметиламинопропил)-N′- этилкарбодиимид гидрохлоридом и N-гидроксисукцинимид и другие. Реакция была проанализирована на образцах в отсутствии наночастиц по реакции кислоты и амина. Выходы реакции по методу хроматомасспектрометрии составили 35% и 78% соответственно. Таким образом был выбран оптимальный метод модификации. На первой стадии в реакцию вступает дикарбоксиполиэтиленгиколь с N-(3диметиламинопропил)-N′-этилкарбодиимид гидрохлоридом и N- гидроксисукцинимидом, после активации к раствору добавляют предварительно выдержанные в УЗ наночастицы магнетит-силан. Для удаления избытка реагентов проводится диализ. О связывании полиэтиленгликоля с поверхностью наночастиц, а следовательно о функционализации свидетельствует изменение потенциала с положительного (аминированные наночастицы) + 23 mV на нулевой или отрицательный – карбокси группы полиэтиленгликоля на поверхности наночастиц 5 mV. Таким образом был получен образец 6Р на основе образца 6. Оптимизированные методики представлены в документе «МЕТОДИКА НАНЕСЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКОЙ НАНОДИСПЕРСНОГО ОКСИДА ОБОЛОЧКИ ЖЕЛЕЗА В НА ОБРАЗЦЫ ОБОЛОЧКЕ НЕОРГАНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ» М1 – М2 от 3 марта 2015 года. ИЗ 4 РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНЫХ РЕГЛАМЕНТОВ СИНТЕЗА ГИБРИДНЫХ БИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МАГНИТНЫХ НАНОМАТЕРИАЛОВ (ГБМН) В ходе второго этапа на основании исследованных физико-химических свойств, а также на основании оптимальных синтетических характеристик были выбраны образцы магнетита в неорганической оболочке для получения ГБМН: три образца – магнетит-золото 22±3 нм, магнетит-золото 26±3 нм и магнетит-кремний 9±1 нм. Структура ГБМН следующая – ядром частицы является магнетит, покрытый оболочкой из неорганического материала (золото, кремний), поверхность наночастицы функционализирована (покрыта) бифункциональным лигандом. Лиганд должен иметь в своем составе одну функциональную группу для связывания с наночастицей, а другую для связывания с активным центром, отвечающим за адресную доставку. Также лиганд должен обеспечивать коллоидную стабильность наночастицы. В качестве оптимального лиганда был выбран бифункциональный полиэтиленгликоль с активной карбоксильной группой. Для образцов магнетит-золото и магнетит-кремний были разработаны методики синтеза на первом этапе работ (М1 и М2, М6), которая и была выбрана в качестве основы для регламента для синтеза неорганической основы для образцов, как оптимальная и эффективная. Далее по разработанной методике «МЕТОДИКА НАНЕСЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКОЙ ОБОЛОЧКИ НА ОБРАЗЦЫ НАНОДИСПЕРСНОГО ОКСИДА ЖЕЛЕЗА В ОБОЛОЧКЕ ИЗ НЕОРГАНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ» от 3 марта 2015 года наночастицы магнетит-золото и наночастицы магнетит-кремний были покрыты оболочкой лиганда (полиэтиленгликолем, содержащим карбоксильную группу, и тио группу – в случае магнетит-золото). Данные методики были проведены повторно (5 повторов) для получения достоверных сходящихся результатов. Показателем воспроизводимости являются сходимые результаты ПЭМ, ДСР и поверхностного заряда (дзета-потенциал). Гибридные бифункиональные магнитные наноматериалы (ГБМН) схематично имеют следующее строение (рис. 51 и 52 ) Рис 51 схематичное строение ГБМН магнетит-кремний-ПЭГ-СООН Рис 52 схематичное строение ГБМН магнетит-золото-ПЭГ-СООН В ходе разработки регламентов синтеза ГБМН были установлены технические показатели и нормы необходимые для классификации и установления подлинности объектов испытания (ГБМН). Для всех образцов материалов (3) была разработана на основании методик, а также с учетом возможностей и условий масштабирования синтеза Химическая схема производства ГБМН. В случае наночастиц магнетит-золото-ПЭГ-СООН (материал 1 и 2) схема состоит из трех основных этапов на первом – синтез наночастиц магнетита (ТП.1. Синтез наночастиц магнетита) по схеме представленной на рис. 53 Рис. 53 Схема получения наночастиц магнетита Далее наночастицы магнетита покрывают оболочкой золота, в зависимости от соотношения регентов и исходных наночастиц магнетита (его размера) были получены два типа наночастиц магнетит-золото (основа для материала 1 и 2). Согласно разработанному регламенту ТП.2. Синтез наночастиц магнетит-золото осуществляется по схеме представленной на рис. 54 Рис. 54 Схема синтеза нч магнетит-золото Так как было изучено, что наночастицы получаются с примесью исходных наночастиц магнетита в качестве необходимого этапа была выделена очистка: ТП.3. Очистка наночастиц магнетит-золото (рис. 55), проходящая за счет хроматографической очистки наночастиц за счет различных сорбционных свойств магнетита и золота (рис. 56). Рис. 55 Схема очистки Рис. 56 Структура очистки Заключительный этап, непосредственно вытекающий из стадии очистки – функционализация наночастиц магнетит золото не выносится в отдельный пункт регламента и технологической схемы, так как не отделим синтетически от этапа очистки. Наночастицы очищенные сорбируются на носителе и затем раствор с лигандом для функионализации смывает наночастицы – переводит в раствор. В качестве основы модификации была использована методика функционализации разработанная на 2 этапе проекта. Таким образом, синтез ГБМН – магнетит-золотоПЭГ-СООН осуществляется в три последовательные стадии. В случае наночастиц магнетит-кремний-ПЭГ-СООН (материал 3) схема состоит из трех основных этапов. На первом этапе получают наночастицы магнетита (ТП1) по реакции сооосаждения солей железа (II) и (III) раствором аммиака (рис. 57) FeCl2 + 2FeCl3 + 8NH4OH = Fe3O4 + 8NH4Cl + 4H2O Рис. 57 Схема реакции получения нч магнетита Далее полученные и предварительно промытые и высушенные наночастицы покрывают оболочкой силана для стабилизации и возможности функционализации поверхности. Реакцию проводят в этаноле с аминопропилтриэтоксисиланом (рис. 58) Рис. 58 Реакция аминирования Аминированные функионализируют наночастицы магнетит-кремний дикарбоксиполиэтиленгликолем ковалентно в условиях карбодиимидного синтеза в присутствии карбодиимидных реагентов (рис. 59). ТП.3 Функционализация наночастиц магнетит-кремний полиэтиленгликолем по реакции карбодиимидного синтеза НООС-ПЭГ-СООН EDC, NHS Рис. 59 Схема реакции получения ГБМН Ходе разработки регламентов синтеза была изучена и представлена технологическая (поэтапная) и аппаратурная схема производства и спецификация оборудования для каждого этапа. Разработаны оптимальные Установки для каждого этапа получения ГБМН Так, например, для ГБМН Магнетит-кремний-ПЭГ-СООН синтез на первом этапе протекает в реакторе схема которого предсталена на рис.60 и на двух последовательных этапах по схеме на рис. 61. 6 7 4 5 8 31 11 2 9 3 2 6 7 4 5 1 0 1 8 9 Рис. 60 Схема реактора этап 1 4 31 2 5 6 7 11 8 9 3 2 4 1 5 6 7 1 0 8 9 Рис. 61 Схема реактора Этап 2и 3 Следует отметить, что в ходе разработки регламентов были представлены полные характеристики сырья, вспомогательных материалов и полупродуктов, как качественные, так и количественные по результатам количественных рассчетов на основании проведенных экспериментов был сведен Материальный баланс для всех трех типов материалов. Нигде не было неучтенных потерь. Важной частью разработки регламентов являлось соблюдения параметров режима безопасности технологического процесса. Все возможные явления и необходимый контроль производства и управление технологическим процессом были изучены и учтены. Также полностью были охарактеризованы Переработка и обезвреживание отходов производства. Таким образом, в ходе работы по этапу были разработаны регламенты лабораторного получения трех ГБМН магнетит-золото-ПЭГ-СООН (с ядром магнетит-золото 22 нм), магнетит-золото-ПЭГ-СООН (с ядром магнетит-золото 26 нм), магнетит-кремний-ПЭГ-СООН (с ядром магнетита 9 нм). НАРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОБРАЗЦОВ ГБМН В КОЛИЧЕСТВЕ, ДОСТАТОЧНОМ ДЛЯ ДАЛЬНЕЙШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ По разработанному регламенту в соответствии с техническим заданием был осуществлен синтез наночастиц магнетит-золото (размером 22 ±3 нм и 26±3 нм) и наночастиц магнетит-кремний (размером 9±1 нм) и покрытие их оболочкой полиэтиленгликоля. Таким образом были получены три материала: магнетит-золото-ПЭГ-СООН (материал 1), магнетит-золото-ПЭГ-СООН (материал 2) и магнетит-кремний-ПЭГ-СООН (материал 3) в количестве 50 мг, 50 мг и 200 мг соответственно. Данных количеств достаточно для проведения дальнейших испытаний. Наработка образцов подтверждена актами о наработке от 10 мая 2015 г. 6 ИССЛЕДОВАНИЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ (IN VITRO) ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОБРАЗЦОВ ГБМН НА КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ ЧЕЛОВЕКА Исследования цитотоксичности проводились на базе Общества с ограниченной ответственностью Научно-производственной фирмы «БиоКлиникум», руководитель Е.В. Трушкин (индустриальный партнер). В ходе второго этапа были получены три образца ГБМН, которые были исследованы на двух клеточных линиях LNCaP и РС-3 (клетки рака предстательной железы человека) (рис. 62). Рис. 62 клетки LNCap Рис. 63 клетки PC-3 Под цитотоксичностью понимают появление патологических изменений в клетках при действии физических, химических и биологических агентов. В зависимости от силы и мишени воздействия возможна широкая гамма изменений, ограниченная с одной стороны цитостатическим эффектом, нарушающим прохождение клетки по клеточному циклу, а с другой стороны – цитоцидным эффектом, ведущим клетку к гибели. В случае агентов для МРТ диагностики цитотоксичность клеток должна быть минимальна, так как основным является диагностика без токсичского воздействия. В качестве контроля был использован МТТ тест (рис. 64 ) Рис. 64 Постановка МТТ теста MTT-тест — колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. НАДФ-H-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты могут, при определенных условиях, отражать количество жизнеспособных клеток. Эти ферменты способны восстанавливать тетразолиевый краситель 3-(4,5- диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид в нерастворимый формазан, который имеет пурпурное окрашивание (рис. 65). Тетразолиевые красители могут также быть использованы для измерения цитотоксичности (потери живых клеток) или цитостатической активности (сдвиг от пролиферации к состоянию покоя) потенциальных лекарственных агентов и токсичных веществ. Рис. 65 Реакция для постановки МТТ-теста Постановка МТТ-теста: Подсчет клеток производится с помощью камеры Горяева. Далее клетки разводились в среде до конечной концентрации 80 тыс./мл для LNCaP и 50 тыс./мл для РС-3 в ванночке для 8-канальной пипетки. Затем клетки раскапывались в 96-луночные планшеты по 100 мкл в лунку (рис.63). Через 1 сутки к клеткам добавляли МНЧ. В качестве контролей к клеткам добавляли деионизированную воду в соотношении вода: среда культивирования = 1:5, либо ДМСО (1:3). Клетки инкубировались с МНЧ в течение 48 часов. Приготовление раствора МТТ: МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид) разводится на PBS в концентрации 5 мг/мл. В каждую лунку с клетками добавляется по 13 мкл раствора МТТ. 96-луночное плато помещается в СО2инкубатор, пока не выпадут синие кристаллы формазана (~ 45 мин для данных клеток). По завершении инкубации с МТТ необходимо тщательно удалить среду из каждой лунки, стараясь не повредить клетки. Среда удаляется с помощью дозатора по желобку. После удаления среды культивирования добавляется 60 мкл ДМСО в каждую лунку для растворения кристаллов формазана. Желательно поставить планшеты на планшетный шейкер для получения раствора однородного цвета (можно аккуратно помешать планшеты, держа их руками). После растворения гранул формазана снимаются данные оптической плотности на спектрофотометре (используемая длина волны 570 нм). МТТ-тест основан на наличии прямой корреляции между числом жизнеспособных клеток и интенсивностью образования в клетках кристаллов формазана. Ферменты дыхательной цепи митохондрий в живых клетках способны преобразовывать водорастворимый МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид) желтого цвета в водонерастворимые синие кристаллы формазана. Поскольку в мертвых или погибающих клетках формазан не образуется, метод МТТ-тестирования используется для определения цитотоксичности веществ. Постановка МТТ-теста предполагает оценку зависимости продукции формазана (растворенного и эстрагированного из клеток органическими растворителями) от числа жизнеспособных клеток в образце путем определения оптической плотности на спектрофотометре. Чем больше оптическая плотность образца (за счет большого количества экстрагированного формазана), тем больше жизнеспособных клеток. Таким образом, метод показывает корреляцию между оптической плотностью и процентом жизнеспособных клеток. При этом метод не учитывает интенсивность митоза (в митотических клетках изменяется метаболизм) и возможные гетерогенности в отдельных клетках исследуемого образца. На рис.66 представлены результаты исследования токсичности материалов ГБМН на основе магнетит-кремний наночастиц (материал 3) и наночастиц магнетитзолото (материал 1 и 2). Рис.66 Результаты МТТ-теста для ГБМН (материал 3, 1, 2) на клетках LNCaP (слева) и PC-3 (справа) Исследованные образцы были нетоксичны в диапазоне 0,075 – 1,5 мкг/мл по магнетиту (>90% выживших клеток по сравнению с контролем); исключение составлял образец 1 в концентрации 0,75 – 1,5 мкг/мл по магнетиту, который приводил к снижению выживаемости клеток до 65-75%). Как наблюдается по рис. 66 материалы 3 и 2 являются низкотоксичными. Данные результаты свидетельствуют о перспективности использования данных образцов в дальнейших биологических испытаниях. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе второго этапа работ были осуществлены физико-химические исследования экспериментальных образцов наночастиц магнетит-золото, магнетит кремний и магнетит-углерод. Были изучены закономерности структура/строение – свойства, показаны магнитные свойства, а также изучены перспективные возможности использования образцов в качестве МРТ контрастных агентов. В результате экспериментов был проведен выбор трех оптимальных образцов – потенциальных гибридных бифункциональных магнитных наноматериалов. Для дальнейшей функционализации поверхности органическими материалами были разработаны методики покрытия органической оболочкой наночастиц магнетит-золото с полиэтиленгликоля, использованием а также бифункционального магнетит-кремний с производного использованием дикарбоксиполиэтиленгликоля и карбодиимидных реагентов. В ходе второго этапа разработаны и представлены лабораторные регламенты синтеза гибридных бифункциональных магнитных наноматериалов и по ним наработаны образцы в необходимом для дальнейших исследований количествах. Внебюджетные средства были использованы на исследование цитотоксичности препаратов на двух клеточных линиях человека Официальный сайт, на котором в соответствии с рекомендациями к МУ размещены сведения о ходе выполнения проекта http://istina.msu.ru/reports/10619497. Работы этапа выполнены в полном объеме.