Министерство образования и науки Российской Федерации –––––––––––––––––––––– Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Калмыцкий государственный университет» ВВЕДЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИЮ Учебное пособие для студентов высших учебных заведений основной образовательной программы 020400.62 «Биология», профиль «Биоэкология» Элиста 2013 2 УДК615.К075.8) ББК 30.16я73 С148 Рецензенты: Арилов А.Н. д.с/х. н., профессор, директор Калмыцкого НИИ сельского хозяйства РАСХН Моисейкина Л.Г. – д.б.н., профессор ФГБОУ ВПО «Калмыцкий университет» Биотехнология: Учебник. Сост.: Г.Э.Настинова; «КалмГУ» Элиста, Изд-во:КалмГУ 2013 - с (илл.) ФГБОУ ВПО В учебном пособии представлены основные направления биотехнологии, её значение в жизни человека, достижения, проблемы и перспективы. Учебное пособие ставит своей целью раскрыть научные, социальные и этические аспекты развития биотехнологии, способствовать формированию собственного мнения о фактах биотехнологического внедрения в повседневную жизнь. Пособие предназначено для студентов высших учебных заведений основной образовательной программы 020400.62 «Биология», профиль «Биоэкология» Утверждено методической комиссией факультета педагогического образования и биологии 3 ПРЕДИСЛОВИЕ Биотехнология проникает во все области хозяйства: сельское хозяйство, пищевая промышленность, медицина, биоэнергетика, охрана окружающей среды и т.д. и оказывает все большее влияние на многие стороны жизни человека. В связи с эти в классических университетах биотехнологию следует рассматривать как специальную дисциплину при подготовке биологов, профессиональная деятельность которых может быть связана как с работой в образовательных учреждениях, так и в различного рода лабораториях сельскохозяйственной, медицинской, пищевой направленности. Введение Государственного образовательного стандарта профессионального образования (ФГОС 3) ориентирует на активизацию роли студентов в образовательном процессе путем увеличения его самостоятельной и творческой работы, подлежащей оценке в рамках учебного процесса. Настоящие методические указания будут способствовать лучшему пониманию дисциплины, умению разобраться в большом многообразии учебников, учебных пособий и специальной литературы и отражают методику преподавания и контроля знаний по курсу Биотехнологии в Калмыцком госуниверситете. Дисциплина «Введение в биотехнологию» имеет своей целью дать студенту целостные представления о современном состоянии и перспективах развития биотехнологии как направления практической деятельности человека, имеющем в своей арсенале биотехнологические объектов (клетки микроорганизмов, растений, животных и т.п.) или молекул (нуклеиновые кислоты, белки-ферменты, углеводы, липиды в индивидуальном виде или в виде их смеси, комплексов и пр.) для использования в промышленном производстве, здравоохранении, экологической защите. При этом предполагается, что студенты имеют подготовку по разделам химии, биохимии и молекулярной биологии, общей биологии и микробиологии. Программа дисциплины составлена так, что в ходе изучения предмета, студент не только знакомиться с содержанием дисциплины, но, и закрепляет свои знания по фундаментальным наукам. Описание основных направлений применения биотехнологических методов в конкретной деятельности человека должно дать студенту целостное представление в практическом значении изучаемого предмета. Данное пособие включает в себя основные разделы биотехнологии, задания для самостоятельной работы и тесты, позволяющие контролировать степень усвоения материала студентами. Предполагается, что студенты самостоятельно более глубоко изучат различные вопросы биотехнологии, представят их в виде сообщений и презентаций, используя дополнительную специальную литературу, Интернет-ресурсы, а также современные информационные технологии. 4 Раздел 1 ПРЕДМЕТ И ЗАДАЧИ БИОТЕХНОЛОГИИ 1.1. Предмет биотехнологии Биотехнология – это название одной из древнейших сфер деятельности человека, в современном понимании – это наука о практическом использовании достижений биологии. Современная биотехнология – это интеграция естественных и инженерных наук позволяющая наиболее полно реализовать возможности живых организмов для производства продуктов питания, лекарственных препаратов, решения проблем в области энергетики и охраны окружающей среды. Современная биотехнология тесно стыкуется с рядом научных дисциплин, осуществляя их практическое применение или же являясь их основным инструментом (рис. 1). Физиология – наука о функциях растительного и животного организмов. Некоторые белки и вторичные метаболиты могут быть получены только путем культивирования клеток эукариот. Растительные клетки могут служить источником ряда соединений - атропин, никотин, алкалоиды, сапонины и др. Генетика – наука о законах и механизмах наследственности. Ее достижение используется в области генной инженерии. Клетки животных и человека также продуцируют ряд биологически активным соединений. Например, клетки гипофиза - липотропин, стимулятор расщепления жиров, и соматотропин - гормон, регулирующий рост. Экология – наука о связях живых организмов с окружающей среды. Микробиология – наука, изучающая микроорганизмы, их строения, функции, взаимосвязи; позволяет улучшать традиционные технологии и создавать новые. Достижения в области микробиологии лежат в основе развития двух разделов биотехнологии: генной и биологический инженерии. Микробиологическая промышленность в настоящее время использует тысячи штаммов различных микроорганизмов. В большинстве случаев они улучшены путем индуцированного мутагенеза и последующей селекции. Это позволяет вести широкомасштабный синтез различных веществ. Молекулярная биология и биохимия – науки, изучающие молекулярные основы структуры и функций клеток. Данные этих наук используется во всех разделах биотехнологии. В молекулярной биологии использование биотехнологических методов позволяет определить структуру генома, понять механизм экспрессии генов, смоделировать клеточные мембраны с целью изучения их функций и т.д. Конструирование нужных генов методами генной и клеточной инженерии позволяет управлять 5 наследственностью и жизнедеятельностью животных, растений и микроорганизмов и создавать организмы с новыми полезными для человека свойствами, ранее не наблюдавшимися в природе. Иммунология – наука, изучающая биологические механизмы самозащиты организма от любых чужеродных веществ. Благодаря достижениям в области иммунологии создаются новые технологии для диагностики и лечения заболеваний, производства и применения лекарственных препаратов. биохимическая технология технология пищевой промышленности химическая технология БИОТЕХНОЛОГИЯ механическая технология электроника микробиология биохимия генетика Рис.1 Связь биотехнологии с другими науками 1.2. История биотехнологии Технологии приготовления пищевых продуктов с использованием биологических объектов были известны с глубокой древности. Человек использовал биотехнологию многие тысячи лет: люди занимались пивоварением, пекли хлеб. Усовершенствовались способы хранения и переработки продуктов путем ферментации (производство сыра, уксуса, соевого соуса), производилось мыло из жиров, изготавливались простейшие лекарства, спиртные напитки, перерабатывались отходы. Термин "биотехнология" становится общепринятым примерно с конца 70-х годов 20 века, а до этого, для обозначения наиболее тесно связанных с биологией разнообразных технологий, использовали такие названия, как прикладная микробиология, прикладная биохимия, технология ферментов, биоинженерия, прикладная генетика и прикладная биология. История развития биотехнологических процессов III тыс. до использование дрожжей для получения хлеба, пива, вина; н.э. Луи Пастер установил, что микроорганизмы играют ключевую роль в 1857 г. процессах брожения, и показал, что в образовании разных продуктов участвуют разные микроорганизмы; Грегор Мендель открыл законы наследственности; 1865 г. Роберт Кох разработал метод чистых культур, гарантирующий, что в 1875 г. посевном материале будут содержаться только клетки определенного вида; 6 1925 г. 1940 г. 1953 г. 1961 г. 1963 г. 1970 г. 1972 г. 1975 г. 1976 г. 1977 г. 1978 г. 1980 г. 1983 г. 1996 г. 1997 г. 1977 г. 1988 г. 1990 г. 1990 г. 1994-1995 гг. 1997 г. 2003 г. 2004 г. 2005 г. Надсон Г.А., Филиппович Г.С. установили возможность искусственного мутагенеза микроорганизмов (грибов) под влиянием рентгеновского облучения; Флеминг, Флори, Чейни организовали промышленное производство антибиотиков; Джеймс Уотсон и Фредерик Крик открыли структуру ДНК в виде двойной спирали; установлена структура инсулина; учрежден журнал «Biotechnology and Bioengineering»; Ниренберг расшифровал генетический код, который оказался одинаковым и для бактерий, и для человека; осуществлён синтез биополимеров по установленной структуре; выделена первая рестрикционная эндонуклеаза; - осуществлён синтез ДНК; Берг разработал технологию рекомбинантных ДНК; синтезирован полноразмерный ген транспортной РНК; получены моноклональные антитела; разработаны методы определения нуклеотидной последовательности ДНК; Гилберт У., Максам А. опубликовали метод быстрого определения последовательности ДНК; фирма «Genentech» выпустила человеческий инсулин, полученный с помощью Е. соli; - синтезированы фрагменты нуклеиновых кислот; - разрешена к применению в Европе первая вакцина для животных, полученная по технологии рекомбинантных ДНК; Гордон Дж. получил первую трансгенную мышь (был введен ген тимидинкиназы вируса герпеса); гибридные Ti - плазмиды применены для трансформации растений; ежегодный объем продаж первого рекомбинантного белка (эритропоэтина) превысил 1 млрд долларов; Уильмут Я. клонировал первое млекопитающее – овцу Долли. Исследования генома человека: секвенирован первый ген человека (ген, кодирующий белок хорионный соматотропин); создание международного проекта «Геном человека», поставившего своей целью полное секвенирование ДНК человека, в СССР научный совет по геномной программе возглавил академик А.А. Баев; международную организацию «Геном человека» возглавил российский академик А.Д. Мирзабеков; официально начаты работы над проектом «геном человека»; опубликованы подробные генетические и физические карты хромосом человека; клонировано млекопитающее из дифференцированной соматической клетки; расшифрован геном (набор генов, присущий организму) человека, содержащий приблизительно 30 тысяч генов и три миллиарда «букв» молекул ДНК. британские ученые заявили о клонировании человека; полностью расшифрован геном человека. 1.3. Области применения современной биотехнологии Возможности использования биологических технологий в современном мире гораздо больше, чем с древности. В настоящее время можно обозначить 7 ряд отраслей народного хозяйства и деятельности человека, потребности которых обеспечиваются биотехнологией. В таблице 1 указаны направления, развивающиеся на основе биотехнологии и продукты, получаемые с ее помощью. Таблица 1 Основные направления биотехнологии Отрасль Примеры Сельское хозяйство Материаловедение Производство химических веществ Энергетика Контроль за состоянием окружающей среды Пищевая промышленность Медицина Производство белково-витаминных концентратов. Селекция, клонирование и генетическая инженерия животных и растений. Использование антибиотиков для лечения животных и птиц. Производство вакцин. Производство биоинсектицидов. Применение гормонов и других стимуляторов роста Получение новых штаммов микроорганизмов. Сохранение генофонда растений и животных с помощью замораживания клеток в жидком азоте. Выщелачивание руд, дальнейшее изучение и контроль биоразложения. Производство биополимеров. Получение органических кислот, аминокислот, антибиотиков. Производство ферментов для использования в составе моющих средств. Культивирование микроводорослей в качестве продуцентов химических веществ – внеклеточных метаболитов. Увеличение потребления биогаза, крупномасштабное производство этанола как жидкого топлива Очистка отходов различных производств, токсических веществ. Улучшение методов тестирования, прогнозирование превращения отходов с помощью микроорганизмов. Создание биологических фильтров из корней растений, очищающие сточные воды от тяжелых металлов. Создание новых методов переработки и хранения пищевых продуктов, получение пищевых добавок, использование белка, синтезируемого одноклеточными организмами. Применение ферментов для усовершенствования диагностики, создание датчиков на основе ферментов, использование микроорганизмов и ферментов при производстве сложных лекарств (например, стероидов), синтез новых антибиотиков, применение ферментов в терапии. Получение вторичных метаболитов, в первую очередь лекарственных препаратов; 1.4. Основные разделы биотехнологии 8 Биотехнология как самостоятельная наука начала развиваться в начале XX века, когда были сделаны первые шаги в выращивании изолированных клеток и тканей растений или животных. На схеме даны основные разделы современной биотехнологии. Разделы Биотехнологии Генетическая инженерии Технологии основаны на получении гибридных ДНК и введении их клетки бактерий, растений и животных Клеточная инженерия Технологии основаны на возможности выращивания тканей и клеток in vitro, на слиянии соматических (неполовых) клеток или их протопластов. Биологическая инженерия Технологии основаны на изучении биологических особенностей клеток и внедрении компьютерных методов контроля технологических режимов, позволяющих максимально реализовывать полезные свойства клеток 1.4.1. Клеточная инженерия животных Первые удачные эксперименты по культивированию клеток животных были проведены в 1907 году Р. Гаррисоном. Предложенные им метод культивирования клеток в сгустке лимфы с добавлением эмбриональных экстрактов используется и в настоящее время. В 1960 году обнаружили, что соматические клетки мышей при культивировании на питательной среде могут сливаться, образуя жизнеспособные гибридные клетки. Это стало началом развития клеточной инженерии животных клеток. Гибридизации соматических клеток позволяет определять последовательность генов в молекуле ДНК и их роль (картирование генов), выяснять механизмы образования и роста злокачественных опухолей. Ее используют для регуляции работы генов в онтогенезе, при создании, при создании гибридов, селекции и т.д. 1.4.2. Клеточная инженерия растений В 1902 году Г. Габерландт первым четко сформулировал мысль о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений, но его собственные опыты были неудачными. Благодаря удачному выбору объектов исследований и тщательному подбору состава питательных подбору состава питательных сред в 1932 – 1934 годах XX века Р. Готре и Ф. Уайт достигли первых успехов в выращивании изолированных тканей растений. 9 Г. Фехтинг выяснил, что свойство полярности присуще даже самым маленьким фрагментам ткани и предположил, что этим свойством обладает каждая отдельная клетка. 1.4.3. Генетическая инженерия Генетическая (генная) инженерия начала развиваться с 1973 года, когда американские исследователи Стэнли Коэн и Энни Чанг встроили в бактериальную плазмиду участок ДНК лягушки. Затем эту трансформированную плазмиду вернули в клетку бактерии, которая стала синтезировать белки лягушки, а также передавать лягушачью ДНК своим потомкам. Таким образом, был найден метод, позволяющий встраивать чужеродные гены в геном определенного организма. Первым продуктом, полученным с помощью генной инженерии, стали лекарственные препараты. Введя соответствующие гены, ученые «научили» клетки бактерий синтезировать инсулин, а затем и интерферон, что значительно увеличило и удешевило производство этих лекарств. 1.5. Состояние биотехнологии в разных странах Развитие биотехнологии определяется как успехами в области фундаментальных наук (физиологии, биохимии, генетики, микробиологии), а также уровнем производства соответствующей техники и оборудования. Сельскохозяйственные биотехнологии заметно влияют на развитие экономики отдельных стран и мировой экономики в целом. Объём рынка биотехнологий в 2008 г. составил 216 млрд. долл., ежегодный рост около 8%. Однако, как прогнозируют специалисты, к 2013 г. объём мирового рынка биотехнологий будет оцениваться в 315 млрд. долл., что превысит показатель 2008 г. на 41%. Американский рынок биотехнологий занимает большую долю в мировом рынке – 57,9%1. Ведущая роль в области биотехнологии принадлежит США и Японии. Значительные успехи достигнуты в ФРГ, Франции, Англии. В этих странах программы по производству продуктов, получаемых методами новейшей биотехнологии, рассматриваются как наиболее перспективные и получают большую финансовую поддержку. Фирмы, специализирующиеся в области биотехнологии, могут быть отнесены к четырем категориям: Специализированные биотехнологические фирмы, опирающиеся, в основном, на технологию рекомбинантных ДНК; Крупные, обычно международные фирмы, занятые добычей нефти, выделяют на развитие биотехнологии часть своих исследовательских и производственных ресурсов. Заинтересованы в получении пищевых продуктов, химических веществ, переработке сельскохозяйственной продукции, развитии фармакологической промышленности; 10 Более мелкие фирмы, специализирующиеся в выпуске препаратов для медицины, продуктов ферментации; Фирмы, поставляющие оборудование для биотехнологической промышленности, по данным федерального управления оценки биотехнологии США на 2006 год в стране насчитывалось 500 фирм, которые могут реализовать на рынке более 800 видов продукции. Фирмами страны разрабатывается 81 наименование лекарственных препаратов и вакцин, полученных биотехнологическими методами, из них 97 новых препаратов проходят клинические испытания на человеке. Быстрый рост биотехнологии в США обусловлен притоком капитала из других стран. Среди промышленно развитых стран в Японии отмечаются самые высокие темпы развития биотехнологии. Интерес проявляют к биотехнологии более 275 фирм, 187 из них заняты научноисследовательскими работами совместно с государственными университетами, институтами, лабораториями. Предполагается, что биотехнология будет использоваться в 91 отрасли, включая сельское хозяйство, рыбное, лесоводство, пищевую химию, переработку природных ресурсов, энергетику, медицину, производство агрохимикатов, электронное машиностроение. Следует отметить, то, что частные фирмы в Японии вкладывают в НИР больше средств, чем государственный сектор. Министерством сельского хозяйства, лесоводства и рыбоводства получены значительные успехи в выполнении программы исследований в области белковой инженерии. Созданы новые технологии конструирования белка на молекулярном уровне, производства ферментов, вакцин для животных и др. В результате выполнения работ по программе «Разработка эффективной технологии получения семян и саженцев с использованием культуры тканей» практически все садово-ягодные культуры оздоровлены. В работе принимали участие 25 японских фирм. В Японии производится и поступает на рынок инсулин, гормон роста человека, интерферон, различные моноклональные диагностические наборы. Наряду с США, Японией и ФРГ входит в тройку ведущих держав с наиболее мощным научно-исследовательским потенциалом и занимает лидирующее положение в области биотехнологии среди государств Западной Европы. На проведение биотехнологических исследований в ФРГ направлены усилия более 300 фирм. В том числе в биотехнологические разработки включились 10 крупных концернов, такие как автомобильные, машиностроительные, электротехнические. Необходимо отметить, что интерес к развитию различных направлений биотехнологии отмечается во всех развитых и развивающихся странах. Примером интенсивного развития биотехнологии является Китай. На 2005 год в этой стране насчитывалось 75 университетов и колледжей, специализирующихся в биотехнологии, свыше 200 институтов, 11 осуществляющих научно-исследовательские работы в этой области. Китай занимает лидирующее положение в мире по производству антибиотиков, выпуская 35 их видов. Ежегодно Китай экспортирует 3 тыс. т витамина С. Успешно развивается производство моноклональных тел: с 1979 года их получено около 50 видов. Большое место биотехнологии уделяется в пищевой промышленности и сельскохозяйственном производстве. Популярными трансгенными культурами, применяемыми американскими фермерами в течение последнего десятилетия, были кукуруза, хлопок, соя и рапс. Обращаясь к дальнейшему развитию рынка сельскохозяйственной биотехнологии, авторы доклада перечислили группы трансгенных растений и животных, которые могут появиться на рынке в течение десятилетия: • ГМ-растения с улучшенными пищевыми свойствами (например, соя, обогащённая жирной кислотой омега-3); • растения, используемые в животноводстве в качестве кормов (с большим содержанием аминокислот в некоторых компонентах корма); • культуры, устойчивые к засухе и другим неблагоприятным воздействиям климата; • культуры, устойчивые к вредителям и болезням; • культуры, выращиваемые для производства фармацевтических препаратов, таких как вакцины и антитела; • культуры, выращиваемые для использования в промышленном производстве (культуры с повышенным содержанием крахмала, культуры для получения биотоплива); • трансгенные животные, получаемые для использования в качестве пищи, для производства фармацевтических препаратов и промышленного сырья (например, разведение трансгенных коз для получения сыворотки из козьего молока, производство удобрений с пониженным содержанием фосфора). Получают дальнейшее развитие традиционные биотехнологические производства витаминов, антибиотиков и другие, основанные на использовании микроорганизмов. В последние годы проводится большая работа по созданию биотехнологических центров, задачей которых является разработка и применение методов для ускоренного создания новых форм и сортов растений. Во многих лабораториях Университетов и Научно-исследовательских институтов проводятся исследования по генной инженерии, клеточной инженерии, по оптимизации получения моноклональных тел и их использованию. 1.6. Проблемы биологической безопасности 12 Во всем мире разгораются дискуссии по – поводу биологической безопасности для человека, животных и окружающей среды генетически измененных (модификационных) организмов (ГМО), в частности продуктов питания. Эти проблемы волнуют не только ученых, но и все слои населения. Существуют стандарты безопасности условий, способов производства и новых видов продукции. С развитием и внедрением биотехнологических методов во многих странах были созданы подотчетные обществу организации, контролирующие такие методы и производства. Например, в Великобритании контроль за работой с рекомбинантными ДНК осуществляется специальной правительственной Организацией здравоохранения и безопасности. Особенно тщательно проверке должны подвергаться медицинские препараты, продукты, потребляемые в животноводстве и, особенно, в пищевой промышленности. Влияние ГМО на животных. В институте питания РАМН, где проводили испытания трансгенной сои на крысах, выяснили, что даже у пятого поколения крыс, питавшихся этой соей, не было найдено никаких заболеваний. Однако, по данным Социально – экологического союза, крысы, которых кормили ГМО, не давали потомства. Генетически модифицированные (ГМО) продукты. В Америке и в Западной Европе под давлением общественности стали маркировать продукты, изготовленные с применением генетически измененных (трансгенных) растений. Высказывания известных ученых России о ГМО: доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Кузнецов Владимир Викторович: «Чтобы доказать наличие или отсутствие концерогенного… или мутагенного эффекта, требуются десятки и десятки лет. Пока еще не было времени, чтобы провести такие исследования. Это позволяет нам считать трансгенные продукты питания потенциально опасным для человека» 13 доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Бутенко Раиса Георгиевна: «… Возможности манипулирования генами растений в настоящее время интересны для фундаментальных исследования … для глубокого проникновения в молекулярную и клеточную биологию растительной клетки… трудно сказать, можно ли сейчас снабжать фермеров семенами трансгенных растений. Возможно, надо обратить внимание на побочные изменения растений. Пока неизвестно, будут ли такие изменения влиять на организм животных и человека» доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН Скрябин Константин Георгиевич: «Россия не может существовать без биотехнологии… В мире ни одного факта, что биотехнология опасна» доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН Шелуха Виктор Степанович: «По признанию зарубежных специалистов, в России создана одна из самых лучших систем контроля и регуляции пищевой продукции, полученной из трансгенных источников. Мы проводим почти двухгодичные медико-генетические, медико-биологические и технологические исследования этой продукции». Главное: 14 - Биотехнология – это интеграция естественных и инженерных наук, позволяющая наиболее полно реализовать возможности живых организмов для производства продуктов питания, лекарственных препаратов, ля решения проблем в области энергетики и охраны окружающей среды. - Разделы биотехнологии – биологическая инженерия, клеточная инженерия, генная инженерия. - Клеточная инженерия основана на возможности выращивания клеток и тканей in vitrо и их способности к соматической гибридизации. - Генная инженерия основана на получении гибридных молекул ДНК и введении этих молекул в клетки других организмов. - Биологическая инженерия основана на изучении биологических особенностей клеток и внедрении компьютерных методов контроля технологических режимов, позволяющих максимально реализовывать полезные свойства клеток. Контрольные вопросы: 1. Биотехнология: предмет, разделы, связь с другими науками. 2. Чем обусловлена потребность в биотехнологии? 3. Назовите основные направления биотехнологии в различных отраслях народного хозяйства. 4. Приведите историю развития биотехнологических процессов. 5. Какие требования предъявляются к промышленным штаммам микроорганизмов? 6. Назовите представителей четырех групп микроорганизмов, широко применяемых в биотехнологических процессах. 7. Какие вещества в настоящее время синтезируются с помощью микроорганизмов? 8. Обоснуйте целесообразность использования микроорганизмов для производства белка. 15 Раздел 2 ОСНОВЫ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ 2.1. Понятие культуры изолированных клеток и тканей Метод выращивания изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получил название культурных изолированных тканей. Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевами тканями. Культуры изолированных клеток и тканей Каллусные Каллусная ткань образуется в результате повреждения на целых растениях, а также в стерильной культуре на эксплантах. Возникновение каллуса связано с неорганизованным делением (пролиферацией) дифференцированных клеток. Опухолевые Растительные опухоли имеют бактериальное или вирусное происхождение. Превращение растительных клеток в опухолевые связано с проникновением в их ДНК бактериальной клетки, так называемой Ti-плазмиды, которая значительно изменяет свойства клетки. 2.2. Использование культуры изолированных клеток и тканей Помимо фундаментальных исследований метод культуры изолированных тканей широко используется в сельском хозяйстве и промышленном производстве. Клеточные культуры обладают рядом преимуществ в сравнении с традиционным растительным сырьем (дикорастущими и выращиваемым на плантациях растениями): - независимость от внешних условий - оптимизация и стандартизация условий выращивания - автоматизация и компьютеризация процессов - возможность выращивания исчезающих видов растений Примером может служить массовое клональное микроразмножение плодоовощных и декоративных растений, а также их оздоровление от вирусных и других инфекций. С помощью культуры in vitro можно расширить возможности селекционной работы: получать клоны клеток, а затем и растения с запрограммированными свойствами. Благодаря способности клеток синтезировать в культуре вторичные метаболиты, возникла новая отрасль промышленности, осуществляющая биологический синтез веществ, необходимых человеку. 16 Рис. 2. Способ выращивания растений из клеток образовательной ткани, помещённых в питательную среду 2.3. Условия культивирования изолированных тканей и клеток Культивирование фрагментов ткани или органа растения – эксплантов, а тем более отдельных клеток, требует соблюдения полной асептики. Микроорганизмы, которые могут попасть в питательную среду, выделяют токсины, тормозящие рост клеток и приводящие культуру к гибели. Поэтому все манипуляции с клетками и тканями при культивировании in vitro проводят с соблюдением определенных правил асептики в ламинаре – боксе воздуха, или в асептических комнатах. Асептика достигается подачей пропущенного через фильтры стерильного воздуха, направленного из ламинар – бокса наружу, на работающего. Чистая посуда, предварительно завернутая в бумагу или фольгу, инструменты, бумага, вата, стерилизуются сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160 градусов течение 1,55 – 2 часов. На поверхности растительных тканей всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация, которая достигается путем обработки участков растений, из которых будут выделять экспланты, дезенфицирующими веществами (перекись водорода, сулема). Для работы с биологическим материалом необходимы следующие составляющие: - Чистая посуда - Стерильная питательная среда - Оптимальная освещенность - Оптимальная температура 17 - Оптимальная влажность - Аэрация 2.4. Питательные среды Культивирование изолированных клеток и тканей происходит на многокомпонентных средах. Они могут существенно различаться по своему составу, однако в состав всех сред обязательно входят следующие необходимые растениям группы веществ: макроэлементы, микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны. В питательную среду могут быть добавлены эндоспермы незрелых зародышей (кокосового ореха, конского каштана и других растений), пасока некоторых деревьев, различные экстракты (солодовый, дрожжевой), томатный сок. Введение их в среду дает интересные результаты, но такие эксперименты трудно воспроизводимы, так как действующий компонент, как правило, точно неизвестен. 2.5. Тип клеточных культур В зависимости от способа и условий культивирования можно выделить несколько типов культур клеток и тканей. Каллусная культура. Если культивирование происходит поверхностно на агаризованной питательной среде, то образуется каллусная ткань. Она имеет четко выраженные структуры, но может различаться по плотности. Происхождение и условия выращивания определят, будет ли каллусная ткань рыхлой, средней плотности или плотной. Суспензионная культура. Существует также суспензионная культура клеток, которая выращивается в жидкой питательной среде, так называемое глубинное культивирование. Получение клеточных суспензий возможно как из каллусных тканей, так и непосредственно из экспланта. Для получения суспензионных культур предпочтительнее брать каллусы рыхлого типа. Постоянное встряхивание является необходимым условием культивирования клеточных суспензий. Клеточные суспензии играют в биотехнологии значительную роль. Они могут быть использованы для получения изолированных протопластов, которые применяют в клеточной селекции; при введении чужеродных ДНК и в других процессах. Клеточные суспензии культивируются в больших количествах для получения вторичных метаболитов, выявления новых веществ, выращивания клеточной биомассы. Культура одиночных клеток. Большой интерес представляет культура одиночных клеток. Она применяется в клеточной селекции для отбора 18 гибридных клеток и их клонирования, а также для генетических и физиологических исследований. 2.6. Общая характеристика каллусных клеток Каллусная клетка обладает целым рядом свойств, общих со всеми растительными клетками. Это онтогенез клеток, устойчивость к тем или иным неблагоприятным факторам внешней среды и другие свойства. Вместе с тем у каллусных клеток во время их культивирования появляются свои индивидуальные особенности, такие как физиологическая асинхронность, генетическая гетерогенность и некоторые другие. Онтогенез. Онтогенез каллусной клетки аналогичен развитию любой растительной клетки. Он включает в себя деления (эмбриональная фаза), рост растяжением (фаза растяжения), дифференцировку (фаза дифференциации), старение и гибель клетки. Физиологические особенности. Культивируемые каллусные клетки и ткани сохраняют многие физиологические особенности, свойственные клеткам растениям, из которого они были получены. Сохраняются, например, такие свойства, как морозостойкость, устойчивость к факторам внешней среды (температура, засоление, фотопериодическая реакция), а главное, хотя и в разной степени, – способность к синтезу вторичных метаболитов. Например, культура клеток корневища валерианы, так же как и растение, синтезирует валтрат – действующее вещество валериановых капель и некоторых других лекарств. Однако в культуре валтрат синтезируется в 5 раз интенсивнее, чем в самом растении. Физиологическая асинхронность. Физиологическая асинхронность заключается в том, что каждый момент времени клетки находятся в разных фазах роста: один делятся, другие растут, а третьи уже стареют. Поэтому общее физиологическое старение всей популяции каллусных клеток приято оценивать по состоянию большинства клеток. Генетическая гетерогенность. Другое важное свойство клеток соматической популяции – нестабильность генома и генетическая гетерогенность. Генетически стабильным считаются только клетки меристематических тканей. В клетках остальных тканей при культивировании могут возникать полиплоидия, анеуплоидия, хромосомные аберрации, генные мутации. Однако нельзя рассматривать генетическую гетерогенность как недостаток. Скорее, это необходимое условие существования популяции клеток, основа для их адаптации к изменившимся условиям существования. Гормонненазависимость. При длительном культивировании практически у всех тканей может возникать специфическое свойство гормоннезависимости, то есть автономности по отношению к ауксинам и цитокининам. Эти ткани могут расти на среде без гормонов, что делает их 19 похожими на опухолевые клетки и резко отличает от нормальных каллусных тканей. Внешне же такие гормоннезависимые ткани ничем не отличаются от каллусных. Клетки, которые в процессе культивирования приобрели свойство автономности от присутствия в среде грмонов, называются «привыкшими». Ткани, образованные такими «привыкшими» клетками, называются «химическими опцхолями» в отличие от растительных или генетических опухолей. 2.7. Изолированные протопласты Изолированные протопласты являются одним из наиболее ценных объектов в биотехнологии. Они позволяют исследовать различные свойства мембран, а также транспорт веществ через плазмолемму. Главное преимущество этого объекта состоит в том, что в изолированные протопласты достаточно легко вводить генетическую информацию из органелл и клеток других растений, прокариотических организмов и клеток животных. Получение и культивирование изолированных протопластов. Впервые протопласты были выделены Дж. Клеркером в 1892 году при изучении плазмолиза в клетках листа телореза (Stratiotes aloides) во время повреждения ткани. Изолированные протопласты можно культивировать. Обычно для этого используют те же среды, на которых растут изолированные клетки и ткани. Сразу же после удаления ферментов у протопластов в культуре начинается образование клеточной стенки. Протопласт, регенерировавший стенку, ведет себя как изолированная клетка - способен делиться и образовывать клон клеток. Главное: - Каллусные клетки – это ткани, возникшие путем неорганизованного деления клеток растений. - Асептика является главным условием выращивания каллусных тканей. - Обязательными компонентами питательных сред являются углеводы, гормоны, макро- и микроэлементы, витамины. - Генная инженерия основана на получении гибридных молекул ДНК и введении этих молекул в клетки других организмов. - Дедифференцировка – это возвращение специализированных неделящихся клеток к пролиферации и неорганизованному росту. - Характерные свойства каллусных клеток – физиологическая асинхронность, генетическая гетерогенность и гормоннезависимость. Контрольные вопросы: 1. Что такое клеточная инженерия? 20 Что такое тотипотентность? С какой целью используется клеточная инженерия? Что такое каллус? Какие основные требования предъявляются к выращиванию изолированных клеток и тканей на питательных средах? 6. Что такое экспланты? 7. Что такое дедифференцировка? 8. Какие типы культур клеток и тканей вам известны? 9. Какие свойства исходного растения сохраняют каллусные ткани? 10. Какие характерные для каллусных клеток свойства вы знаете? 11. Каким образом может идти развитие каллусной ткани? 12. Что такое морфогенез? 13. Что такое органогенез? 14. Что такое соматический эмбриогенез? 15. Что такое клональное микроразмножение растений? 2. 3. 4. 5. 21 Раздел 3 ПОЛУЧЕНИЕ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ 3.1. Понятия первичные и вторичные соединения В результате различных химических реакций во всех клетках живых организмов накапливаются продукты первичного и вторичного обмена, или первичные и вторичные метаболита. Продукты первичного обмена. Углеводы, белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, липиды. Эти вещества образуются во всех живых организмов в процессе их роста и развития: Липиды используются для получения для получения различных масел. Белки нашли применения в производстве колбасных изделий. Продукты вторичного обмена. Алкалоиды используются при получении лекарств Стероиды и терпеноиды используются в качестве биостимуляторов Фенолы используются в качестве антиоксидантов, пищевых красителей, пищевых добавок. 3.2. Распространение вторичных соединений Продукты вторичного обмена среди представителей различных царств живой природы распределены неравномерно. Они найдены у всех микроорганизмов, высших растений и некоторых животных. Особенно богаты вторичными метаболитами высшие растения. Продукты вторичного обмена содержаться во всех их видах и во всех органах – в листьях, стеблях и корнях. Алкалоиды. Алкалоиды – это вторичные соединения, в состав которых входит азот. В переводе с латинского алкалоид означает щелочь. Большинство алкалоидов оказывают физиологическое воздействие на организм животных и человека. Алкалоиды широко распространены в растениях и микроорганизмах. Их можно разделить на три класса: - Истинные алкалоиды (N-метил-3,6-диокси-7,8-дидегидро-4,5эпоксиморфинан) - Протоалкалоиды (Актинидин) - Псевдоалкалоиды (Демасцеин) Фенольные соединения. Фенольным соединением является вещество, в котором гидроксильная (ОН) группа непосредственно соединена с атомом углерода бензольного кольца. Фенольные соединения 22 Оксибензойные кислоты В растениях семейства орхидных синтезируются ванилиновая, салициловая, сиреневая и некоторые другие оксибензойные кислоты. Оксибензойные кислоты найдены во всех растениях. Кумарины Кумарин обнаружен в растениях вида Melilotus (Донник). Кумарины – кристаллы с запахом свежескошенного сена, используются в парфюмерии. Флавоноиды Флавоноиды – наиболее распространенные соединения. Многие из них являются пигментами, т.е. придают окраску растительным тканям. В плодах лимона обнаружен мирецетин. Терпеноиды. Терпеноиды – это соединения с различным числом углеродных атомов, являющиеся производными основной разветвленной С5единицы. Ещё в 1887 году немецкий ученый Отто Валлах высказал мысль о том, что все терпеноиды возникают из изопренов. Польский ученый Лавослав Ружичка в 1953 году выдвинул гипотезу о путях синтеза терпеноидов, сформулировал её в изопреновых правилах. Эти правила послужили основанием для выделения терпеноидов в отдельный класс соединений. - Ментол был впервые выделен из растений рода мята (Mentha). Ментол применяется как раздражающе средство при заболеваниях периферической нервной системы. - Изопрен. Каучук применяется для производства автомобильных шин и напольных покрытий. - Авенастерин был впервые выделен из зерен овса (Avena). Авенастерин применяется для очистки масел, для изготовления декоративной косметики. - Бетулапренолы были впервые выделены из листьев березы (Betula). Бетаин – лекарство, применяемое при диспепсии, гепатит, как дополнение к диетотерапии. Большинство терпеноидов называют по тому растительному источнику, из которого они впервые были выделены. Систематическая номенклатура терпеноидов употребляется гораздо реже. Распределение вторичных соединений и их роль в жизнедеятельности клетки. Известно, что образование многих вторичных продуктов обмена происходит только в определенных органах и только на определенных стадиях живого организма. Образование фенольных соединений, придающих окраску тканям (антоцианов), происходит у растений только на стадии формирования цветков. Выделение феромонов (пахучих фенольных соединений) увеличивается по мере взросления животного. 23 Преимущества использования клеточных культур растений для получения вторичных соединений. Клеточная биотехнология получения активных веществ обладает рядом преимуществ по сравнению с использованием традиционного растительного сырья: - получение биомассы клеток не зависит от климата, сезона, погоды, почвенных условий; - можно оптимизировать и стандартизировать условия выращивания клеточных культур, синтезирующих нужные метаболиты; - процесс получения биомассы клеток можно полностью автоматизировать; - получение необходимых веществ практически не наносит ущерба живой природе. 3.3. Вторичные соединения в клеточных культурах растений Практически все вещества вторичного обмена (алкалоиды, терпеноиды, фенолы и др.) могут синтезироваться в клеточных культурах растений. Воробейник в культуре in vitro образует в 10 раз больше красителя шиконина, чем само растение. Факторы, влияющие на накопление вторичных соединений в клеточных культурах. На образование вторичных метаболитов влияют: - состав питательной среды, на которой выращиваются клеточные культуры, в том числе углеводы, гормоноподобные соединения и предшественники; - длительность и интенсивность освещения; - действие мутагенов; - клеточная селекция (отбор наиболее продуктивных клеток). - Углеводы. Повышение концентрации углеводов в среде способствует увеличению накопления вторичных метаболитов в клеточных культурах. - Гормоны. Использование различных гормонов синтетического происхождения позволяет регулировать образование вторичных соединений. - Предшественники. Добавление к питательной среде веществ, являющихся предшественниками вторичных метаболитов, ускоряет процесс образования конечного продукта. - Свет. Выращивание культур в световых условиях приводит к образованию в клетках хлоропластов и значительному повышению накопления вторичных соединений. - Селекция. Отбор клеток с повышенным содержанием вторичных соединений (в данном случае антоцианов) позволяет получить культуры с высоким содержанием искомых веществ. - Мутагены. Воздействие мутагенами способствует получению культур, способных к сверхпродукции вторичных метаболитов. 24 Биотехнологические подходы при получении продуктов микробиологического синтеза. Микроорганизмы (бактерии и дрожжи) образуют вторичные продукты обмена, однако их состав и количество беднее по сравнению с растениями. Накопление вторичных соединений в процессе микробиологического синтеза зависит от возраста микроорганизмов, состава среды, температуры и других факторов. Основными требованиями для получения вторичных метаболитов из микробиологического штамма являются: - хорошая скорость роста в ферментах; - стабильность роста; - максимальное использование питания из среды культивирования; - минимальный синтез побочных соединений; - высокий выход продукта и быстрее его накопление. Главное: - Продукты биотехнологии можно разделить на продукты первичного и вторичного обмена. - Первичные соединения – это вещества, образуемые во всех клетках растений в процессе их роста и развития. - Вторичные соединения – это вещества, имеющие ограниченное распространение в пределах отдельных групп живых организмов. - Алкалоиды – это вторичные соединения, которые содержат азот. - Фенольным соединением является вещество, в котором гидроксильная (ОН) группа непосредственно соединена с азотом углерода бензольного кольца. - Терпеноиды – это соединения с различным числом углеродных атомов, являющиеся производным основной разветвленной С5-единицы. - Терпеноиды, как и фенольные соединения, представляют собой многочисленную группу веществ вторичного метаболизма. Контрольные вопросы: 1. Понятия первичные и вторичные соединения. 2. Распространение вторичных соединений. 3. Алкалоиды. Фенольные соединения. Терпеноиды. 4. Распределение вторичных соединений и их роль в жизнедеятельности клетки. 5. Преимущества использования клеточных культур растений для получения вторичных соединений. 6. Вторичные соединения в клеточных культурах растений. 7. Биотехнологические подходы при получении продуктов микробиологического синтеза. 25 Раздел 4 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ (ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ) 4.1. Генетическая инженерия и ее применение Генетическая (генная) инженерия является наиболее интенсивно развивающейся областью биотехнологии она основана на молекульрнобиологических, иммунохимических и биохимических методах, позволяющих путем операций в пробирке (in vitro) переносить генетическую информацию из одного организма в другой, придавая ему новые уникальные свойства. Генетическая инженерия находит широкое практическое применение в различных отраслях народного хозяйства: - Сельское хозяйство – внедрение биологических методов защиты растений; - Микробиологическая промышленность – производство интенсивных штаммов микроорганизмов; - Фармакологическая промышленность – расширение спектра лекарственных средств; - Пищевая промышленность – производство новых, высокоактивных ферментных препаратов. 4.2. Основная технология генетической инженерии В основе генетической инженерии лежит технология получения рекомбинантной ДНК. Эта технология включает ряд последовательных экспериментальных процедур, в ходе которых осуществляется перенос ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) одного организма в другой. Технология получения рекомбинантной молекулы ДНК: I этап: выделение вектора: 1.1. для внедрения какого – либо гена в клетку – реципиент (принимающую клетку) используют небольшую молекулу ДНК, которая обладает способностью проникать в эту клетку. Такую молекулу называют вектором. Чаще всего это молекула ДНК фага, вируса или плазмидная. 1.2. ДНК – вектор извлекают из клетки и линеаризуют (разрезают) в таком месте, куда можно будет встроить ген донора. II этап: выделение молекулы донорной ДНК: 2.1. из организма – донора нужных генов – выделяют молекулу донорной, или клонируемой, ДНК, которая содержит нужную последовательность генов. 2.2. донорную ДНК гидролизуют ферментами в нужных местах, вырезая участок с необходимым геном и отделяя его от других частей молекулы ДНК – донора. 26 III - ДНК получение рекомбинантной ДНК и её трансформация. 3.1. вектор соединяют («сшивают, легируют») с вводимым геном донора. Образуется рекомбинантная ДНК. 3.2. новая молекула ДНК, содержащая встроенные ген, вводится в клетку хозяин (реципиент). Для этого используют специальные приемы: прогревание, добавление некоторых веществ и т.д. 3.3. в клетке-хозяине рекомбинантная ДНК реплицируется (воспроизводится) и передается потомкам. Введение рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина называется трансформацией. Организмы, содержащие фрагменты чужеродной ДНК, называют трансгенными. 4.3. Ферменты в генной инженерии Важная роль в проведении генно-инженерных работ принадлежит ферментам, участвующим в формировании рекомбинантных ДНК. Основные ферменты Рестриктазы Это ферменты способные узнавать специфические последовательности (4-6 нуклеотидов) ДНК и расщеплять их в строго определенных местах. Когда два разных образца ДНК обрабатывают одной и той же рестриктазой, а затем смешивают эти образцы, то благодаря комплиментарному спариванию фрагментов разных образцов могут образовываться новые комбинации генов – рекомбинантные ДНК. ДНК- лигазы Осуществляют «сшивание» (связывание) фрагментов ДНК, образуемых в процессе репликации за счет образования фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. Бактериальная ДНК-лигаза склеивает разрывы, образовавшиеся за счет «липких концов», лигаза фага Т-4 соединяет двунитевые фрагменты ДНК, содержащие разные концы. Лигазы являются второй по важности в генетической инженерии группой ферментов. Помимо рестриктаз и ДНК – лигаз в генно-инженерных работах используются и другие ферменты: Ревертаза ДНК полимераза РНК – ДНК - и РНКзависимая ДНК полимеразы - полимераза обладают общим (ревертаза), свойством вести функция матричный которой связана синтез с синтезом ДНК нуклеиновых на матрице кислот в мРНК. направлении 5 – Терминальная трансфераза Нуклеаза Способна наращивать на концах ферментов ДНК однонитевые участки путем последовательного присоединения нуклеотидных остатков из этих дезоксинуклеозидтрифосфатов, которые добавляются в реакционную смесь. Ее Это большой класс ферментов, расщепляющих молекулы нуклеиновых кислот. Имеются нуклеазы, расщепляющие одно - или 27 3 штрих. используют для создания на соединяемых фрагментах ДНК искусственных липких концов. двуцепочечные ДНК или РНК путем отщепления по одному нуклеотиду или небольших олигонуклеотидов 4.4. Векторы, используемые для клонирования ДНК Объединение разных генов в молекуле ДНК бесполезно, если вновь образованные рекомбинантные ДНК не будут реплицироваться в клетке – хозяине. Таким образом, ели одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, то другая должна содержать информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК. Чтобы решить эту проблему, используют клонирующие векторы («вектор от латинского vector – переносчик) Клонирующие векторы должны иметь малый размер, хорошую проницаемость в клеточной мембране, способность размножаться в клетке реципиента, а также иметь такую область в молекуле ДНК, в которую можно встроить фрагмент чужеродной молекулы ДНК. Чаще всего в качестве векторов используют фага (вирусы бактерий) или плазмиды. С помощью фаговых векторов удается клонировать участок ДНК до 25 тыс. пар нуклеотидов. Искусственно сконструированные векторы могут переносить до 45 тыс. пар нуклеотидов. Плазмиды – небольшие внехромосомные кольцевые молекулы ДНК, которые стабильно передаются потомству бактериальных клеток независимо от хромосомной ДНК. В генетической инженерии плазмиды используются для клонирования нужных генов. Самые мелкие плазмиды кодируют одиндва белка среднего размера, крупные плазмиды могут кодировать множество ферментов, необходимых для работы целой последовательности биохимических реакций. Плазмиды с молекулярной массой более 100 х 106 обнаружены только у грамотрицательных бактерий, в частности, у видов и Pseudomonas и Agrobacterium. Молекулярная масса плазмид грамположительных бактерий лишь в отдельных случаях превышает 40 х 106. Есть плазмиды с широким кругом хозяев, поэтому с их помощью можно осуществлять перенос генов между неродственными видами. Были получены мутантные плазмиды, рекомбинантные, конструированы плазмиды-векторы. Часто в плазмидах содержаться гены деградации ксенобиотиков, устойчивости к антибиотикам. У растений часто применяется Ti – плазмида Agrobactirium tumefaciens. 28 4.5. Гены и их получение Основной единицей наследственности любого организма являются гены. Они представляют собой участки молекулы ДНК, расположенной в хромосоме. Гены определяют все характерные признаки и свойства живых организмов. При половом размножении образуется рекомбинантная ДНК, которая содержит генетическую информацию обоих родителей. Генная инженерия позволяет создать организмы с новыми наследственными признаками. Для достижения этого необходимо встроить (клонировать) природный или искусственно синтезированный ген в вирусы, бактериальную плазмиду или любые другие векторные системы, а затем перенести в геном хозяина – реципиента таким образом, чтобы встроенный ген сохранял способность экспрессировать белок. Процесс разделения геномной ДНК на элементы и введение этих элементов в клетки – хозяева называется созданием геномной библиотеки (банка клонов, банка генов). Один из способов создания геномной библиотеки ДНК состоит в обработке донорной ДНК рестриктазой. Гидролиз проводят в мягких условиях, чтобы происходило лишь частичное расщепление. В результате образуются фрагменты разных размеров, некоторые фрагменты могут оказаться слишком крупными. В таком случае разрушение производят, используя другую рестриктазу. Полная библиотека содержит весь геном данного организма. При рестрикции ДНК образуется смесь разнообразных фрагментов, и после их лигирования с векторной ДНК возникает множество различных комбинаций. Необходимо уметь распознавать те реципиенты клетки, которые содержат ДНК с нужной нуклеотидной последовательностью. Для этого используют различные системы скрининга (поиска генов). В простейшем случае один ген сдержит информацию о структуре одного белка, в более сложном – о нескольких белках. Информация о генах, их положении в геноме и методах получения важна для генетической инженерии. 4.6. Транскрипция Информация в генах, кодирующих белки (структурных генах), расшифровывается в ходе двух последовательных процессов: синтеза РНК (транскрипции) и синтеза белка (трансляции). Эти процессы обеспечивают правильный перевод, зашифрованный в ДНК генетической информации с языка нуклеотидов язык аминокислот. Последовательность аминокислот в белке задет его структуру и функции. Когда у клетки возникает способность в каком – то белке, то включается транскрипция соответствующего 29 структурного гена, а когда такая потребность исчезает, транскрипция выключается. Транскрипция начинается со связывания РНК – полимеразы с промотором. Далее последовательно копируется весь структурный ген (кодирующая область) – от первого нуклеотида до последнего – с образованием матричной РНК (мРНК). В клетке первичная РНК подвергается модификации, в результате которой участки, соответствующие нитронам, вырезаются с помощью ферментов. Экспрессия структурных генов осуществляется под строгим контролем регуляторных систем, запускающих транскрипцию только в том случае, когда возникает потребность в определенном белке. У эукариот в большинстве структурных генов кодирующие области (экзоны) чередуются с некодирующими областями (интронами). Экзонные последовательности сшиваются друг с другом «торец в торец» (сплайсинг) с образованием функциональной иРНК. Этот процесс называется сплайсингом или процессингом РНК. Экзон – это кодирующая (несущая информацию) область гена. В клетке первичная РНК подвергается модификации, в результате которой участки, соответствующие интронам, вырезаются с помощью ферментов. Экспрессия структурных генов осуществляется под строгим контролем регуляторных систем, запускающих транскрипцию только в том случае, когда возникает потребность в определенном белке. Трансляция – это синтез белков на матричной РНК (мРНК); он происходит при участии транспортной РНК (тРНК), ферментов и различных белковых факторов. 4.7. Трансляция Трансляция начинается со связывания малой рибосомной субъединицей. Затем происходит комплементарное спаривание первого кодона мРНК с антикодоном инициаторной транспортной РНК, несущей метионин. К образовавшемуся комплексу присоединяется большая рибосомная субъединица и образуется комплекс инициации, готовый к синтезу полипептидной цепи. После образования инициаторного комплекса активируется следующий кодон матричной РНК. Он спаривается с антикодоном транспортной РНК, несущей соответствующую аминокислоту, закодированную в триплете. Первая аминокислота в полипептидной цепи, метионин, соединяется со следующей с помощью пептидной связи и отщепляется от транспортной РНК. 30 Свободная транспортная РНК покидает рибосому. Рибосомный комплекс перемещается вдоль молекулы матричной РНК, и комплекс транспортной РНК с присоединенными аминокислотами занимает освобожденное место. Следующий кодон матричной РНК становится активированным и спаривается с соответствующим антикодоном транспортной РНК, несущим следующую аминокислоту. Эти события повторяются до тех пор, пока рибосома не дойдет до конца. 4.8. Введение генов в бактерии и их экспрессия Для введения генов в бактерии фрагменты геномной ДНК изменяют, удаляя их них некодирующие области и участки соседних генов: 1 этап: - Для введения генов в клетки прокариот подбирают соотвееетствующий вектор, способный приникнуть в клетку реципиента. Чаще всего используют ДНК фага или плахмиду бактерий. - Плазмиду разрезают рестриктазой для образования «липких концов». - При необходимости производят надстройку концов ДНК у вектора, чтобы они были комплементарны концам ДНК вводимого гена. 2 этап: - ДНК донора разрушают рестриктазами для выделения генов. - Для введения генов в бактерии ДНК изменяют, удаляя из них некодирующие области и участки соседних генов. - При объединении в одном растворе ДНК вводимого гена и ДНК вектора комплиментарные концы «слипаются» и образуются водородные связи. С помощью ДНК-лигазы сшивают цепи гибридной ДНК. 3 этап: -Образованная гибридная молекула вводится в клетку бактерииреципиента. -У прокариот структурный ген представляет собой непрерывный участок молекулы ДНК, а включение и выключение транскрипции обеспечивается дополнительными факторами транскрипции, которые связываются с соответствующими участками ДНК. 4.9. Экспрессия генов в дрожжах Дрожжевые клетки удобно использовать для получения разнообразных продуктов промышленного назначения. Преимуществами дрожжей по сравнению с бактериями является их рост на дешевых субстратах и высокая генетическая стабильность при промышленном культивировании. Экспериментировать с дрожжевыми клетками легко и потому, что они имеют 31 сравнительно малый размер генома и короткое время регенерации (несколько часов). В качестве объекта для клонирования и экспрессии рекомбинантных ДНК чаще всего используют Saccharomyces cerevisiae. 4.10. Методы получения трансгенных животных Развитие методов генной инженерии, позволяющих целенаправленно создавать новые ДНК-носители генетической информации и встраивать их в геном клетки, которая могла бы дать начало клеткам зародышевой линии, открывает новые перспективы в генетической модификации животных. Методы получения трансгенных животных Микроинъекции Яйцеклетки выделяют из самок-доноров, у которых была индуцирована гиперовуляция и проведено спаривание с самцами. Трансгенную конструкцию инъецируют в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйцеклетки имплантируют «суррогатной» матери, которая производит на свет мышат – основателей трансгенной линии. Вирусный Эмбрион, обычно находящийся на стадии восьми клеток, инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. Самки, которым был имплантирован эмбрион («суррогатные матери»), производят на свет трансгенное потомство. Для идентификации мышат несущих трансген в клетках зародышевой линии, проводят ряд скрещиваний. Эмбриональный Эмбриональные стволовые клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши. Их трансфицируют вектором, несущим трансген, культивируют и идентифицируют трансфицированные клетки методом позитивнонегативной селекции или ПЦР. Популяцию трансфицированных клеток вновь культивируют и вводят в бластоцисты, которые затем имплантируют в матку «суррогатных матерей» Скрещивая животныхоснователей, несущих трансген в клетках зародышевой линии, можно получить трансгенных мышей. 4.11. Клонирование овцы методом переноса ядра Клонирование овцы Долли в 1996 году Яном Уилмутом и его коллегами в Рослинском институте в Эдинбурге вызвало бурную реакцию во всем мире. Долли была зачата из клетки молочной железы овцы, которой уже давно не было в живых, а её клетки хранились в жидком азоте. Методика с помощью, которой была создана Доли, известна под названием «перенос 32 ядра», т. е. из неоплодотворенной яйцеклетки было удалено ядро, а вместо него помещено ядро из соматической клетки. В эксперименте, описанном, было проведено слияние 277 яйцеклеток с удаленными ядрами и клеток молочной железы в стадии покоя. Образовалось 29 эмбрионов, из которых только один (Долли) развился до жизнеспособного плода. Рис. 3. Ян Уилмут с овечкой Долли Клонирование овцы Долли из ядра дифференцированной клетки и трех других овец из ядер эмбриональных клеток удалось осуществить благодаря переносу ядер из клеток, находящихся в стадии покоя (G0), и, возможно, особенностями эмбриогенеза этого животного. Дело в том, что в течение первых трех делений зиготы овцы – длящихся несколько суток – происходит только репликация ДНК, ни один из генов не экспрессируется. Предполагается, что за это время введенная ДНК освобождается от специфичных для клетки регуляторных белков, а соответствующие гены эмбрионального развития связывается с инициаторными эмбриональными белковыми факторами из цитоплазмы яйцеклетки. 1 этап: - Из эпителия молочной железы выделяют клетки. - Клетки разделяют, отмывают и выращивают в суспензионной культуре. - Индуцируется их переход в фазу покоя (G0). 2 этап: - Яйцеклетка - Из материнской яйцеклетки микропипеткой удаляется ядро. 3 этап: - Осуществляется слияние клеток в фазе покоя и яйцеклеток, лишенных ядра. 33 - До прохождения ранних стадий эмбриогенеза (это можно проводить в яйцеводе или в полностью искусственных условиях in vitro) выращивают восстановительную яйцеклетку. - Зародыш вводят в матку суррогатной матери, где и происходит дальнейшее развитие. - Клонированная овца Долли. В декабре 1998 года стало известно об удачных закончившихся попытках клонирования крупного рогатого скота, когда японцам И.Като, Т. Тани и сотрудникам удалось получить 8 здоровых телят после переноса 10 реконструированных эмбрионов в матку коров-реципиентов. 4.12. Трансгенные растения Способность к вегетативному размножению отличает организм растений от организма высших животных, что заметно облегчает осуществление трансгеноза. Многие клетки растений, например, клетки зародыша на ранних стадиях его развития, покоящиеся клетки меристем кончиков побегов и корней, а также сосудистых тканей камбия, находятся в недетерминированном состоянии и, попадая под влияние внешних воздействий, могут дифференцироваться с образованием клеток любых типов, а также давать начало новым растениям. Перенос в питательную среду таких недетерминированных клеток может приводить к их полной дедифференцировке и формированию в культуре недифференцированной ткани каллуса. Такие клетки могут стабилизироваться в жидких суспензионных культурах, и расти неограниченно долго. Из недифференцированных тканей многих видов растений можно легко регенерировать целые растения. Процесс получения трансгенных растений начинается с введения требуемых генов в недифференцированные клетки таким образом, чтобы они интегрировались в хромосомы. Введение чужеродных генов в клетки растений облегчается, если их клеточные стенки удаляют с помощью гидролитических ферментов - пектиназы и (или) целлюлазы, что приводит к образованию протопластов. Чужеродные гены, находящиеся в составе векторных плазмид, вводят в протопласты одним из стандартных способов с использованием эндоцитоза, стимулированного полиэтиленгликолем, электропорации, микроинъекций или бомбардировки микрочастицами, нагруженными векторной ДНК. После этого протопласты в течение нескольких дней культивируют на питательной среде для восстановления клеточных стенок и образующиеся клетки-трансфектанты используют для регенерации целых растений. 34 Рис.4. Увеличение относительной площади выращивания трансгенных культур в развивающихся странах Основным направлением применения трансгеноза для генетической модификации культурных растений является повышение их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, в частности вирусам и гербицидам. Метод защиты растений от вирусов с помощью трансгенов предложен В. Шибальским в 1988 г. Сущность метода заключается во введении в геном растений трансдействующих доминантных летальных генов или, по терминологии Шибальского, "антигенов", которые кодируют измененные мутациями белки вирусов, существенные для их воспроизводства, и путем конкурентного замещения соответствующих белков вируса дикого типа прерывают его размножение. С использованием такого подхода удалось получить очень высокую устойчивость растений к вирусу Х картофеля (PVX). В этом случае в ген репликазы PVX с помощью направленного мутагенеза вводили мутации, сопровождающиеся заменой аминокислот в консервативном участке полипептидной цепи репликазы, ассоциированном с ее каталитическим сайтом. Для экспрессии мутантного трансгена в растениях табака были характерны внутриклеточное накопление инактивированной репликазы и появление высокой устойчивости растений к заражению вирусом PVX. Более 97% территории, занятой ГМ растениями, приходится всего на 7 стран: США, Канаду, Бразилию, Аргентину, Китай, Индию и Австралию. Площади возделывания основных трансгенных растений представлены на рис. 35 Рис. 5. Площади возделывания основных трансгенных растений Еще один подход к получению трансгенных растений, устойчивых к вирусам, основан на введении в них трансгенов, экспрессирующих в клетках моноклональные антитела, направленные против вирусных белков. С использованием такого метода создали эффективную систему защиты растений от вируса морщинистой мозаики артишока (AMCV) . Для этого сначала получили панель моноклональных антител к вирусу AMCV и отобрали гибридомы, продуцирующие антитела, которые взаимодействуют с консервативными участками белка оболочки вируса. Трансгенные растения сорго, устойчивые к гербицидам, получали бомбардировкой незрелых эмбрионов на стадии зиготы микрочастицами золота (диаметр частиц – 1,5-3,0 мкм). В таком случае микрочастицы погружали в раствор экспрессирующего вектора, высушивали и "выстреливали" в клетки-мишени, добиваясь при этом высоких результатов трансфекции. Упаковка рекомбинантных ДНК в липосомы позволяет защитить генетический материал от разрушающего действия нуклеаз, находящихся в клетках. Липосомы – это сферические образования, состоящие из фосфолипидов. Для введения ДНК в клетки растений наиболее пригодны липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина. Для получения протопластов их обрабатывают веществами, ингибирующими синтез клеточной стенки. После слияния гибридные протопласты помещают в среду, в которой нет ингибитора синтеза клеточной стенки, и клетки начинают нормально развиваться. Микроиньекции ДНК в протопласты осуществляются микроиглой диаметром 2 мкм. Метод электропорации предполагает создание специальных пор в клеточной мембране реципиентной клетки с помощью пульсирующего 36 электрического поля. Через эти поры в клетку могут входить ДНК, РНК, белки и пр. Иногда используют векторы на основе ДНК-содержащих вирусов растений. Бомбардировка микрочастицами, или метод биологической баллистики, основан на «вбрасывании частиц вольфрамата (диаметр 0,6-1,2 мкм) в клетки суспензионных или каллусных культур с напылением на них ДНК-вектора с генетической конструкцией. В качестве вектора для переноса генов в растения используется Tiплазмида Agrobacterium tumefaciens – почвенной бактерии, вызывающей корневой рак у двудольных растений. Ti-плазмида способна встраиваться в растительные хромосомы и переносить гены, необходимые для трансформации растительных клеток в двудольные растения. Главное: - Генетическая (генная) инженерия позволяет путем операций в условиях in vitrо переносить генетическую информацию из одного организма в другой, используя для этого функционально активные генетические структуры – рекомбинантные дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК). - Рекомбинантные (или гибридные) ДНК образуются при объединении фрагментов ДНК, выделенных из различных организмов. - В создании рекомбинантных ДНК участвуют различные ферменты: рестриктазы, ДНК-лигазы, ревертазы, ДНК-полимеразы. - Генная инженерия основана на получении гибридных молекул ДНК и введении этих молекул в клетки других организмов. - Векторы – это молекулы ДНК, способные соединяться с чужеродной ДНК, переносить ее в другую клетку и обеспечивать репликацию (воспроизведение). В качестве векторов в генно-инженерных работах чаще всего используют ДНК плазмид и вирусов. - Основной единицей наследственности организма является генучасток молекулы ДНК, находящийся в хромосоме. - Процесс синтеза соответствующих генов зависит от работы промотора-участка молекулы ДНК, с которым связывается РНК-полимераза. - Экспрессия генов в бактериальных клетках регулируется уровнем ДНК, РНК, белка. - Трансгенных животных получают благодаря ретровирусным векторам, микроиньекциям ДНК, модифицированным эмбриональным стволовым клеткам, переносу генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом и клонированию с помощью переноса ядра. - Для получения трансгенных растений используют Ti-плазмид почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes, векторы на основе вирусов, производят бомбардировку микрочастицами, прямое введение генов в протопласты растений, микроиньекции, электропорацию и слияние липосом. 37 Контрольные вопросы: 1. Что такое вектор? 2. Что можно использовать в качестве векторов? 3. Какими свойствами должен обладать вектор? 4. Чем обусловлена популярность плазмидных векторов? 5. Что происходит в результате трансформации? 6. Каким образом проводят идентификацию клеток, содержащих реципиентные гены? 7. Какие методы, повышающие эффективность экспрессии чужеродных генов, чаще всего используются? 8. Клонирование в бактериях. 9. Что такое челночный вектор? 10. Клонирование в дрожжах. 11. Клонирование в клетках животных. 12. Расскажите о технологии микроинъекции ДНК. 13. Что такое трансгенный организм? 14. Что такое мозаики в трансгенных линиях? Чем обусловлено это явление? 15. С какой целью получают трансгенных животных? 16. С какой целью получают трансгенные растения? 38 Раздел 5 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ (ПРИМЕНЕНИЕ) 5.1. Генетическая инженерия и ее возможности для практики Использование методов генетической инженерии уже сегодня дает возможность диагностировать, а в недалеком будущем и лечить наследственные заболевания людей, вести поиск путей лечения СПИДа и онкологических заболеваний. Изменения функциональной активности генов приводит к значительному повышению образования белка в E. Coli. Объединение субъединицы А дифтерийного токсина и гормона А человека позволило создавать препарат, токсичный для клеток меланомы. Создание бактериального штамма Pseudomonas putida, способного разрушать камфару, октан, ксилол и нафталин. Получение новых штаммов микроорганизмов, способных расти на дешевых субстратах (молочная сыворотка и целлюлозосодержащие отходы. 5.2. Продукты генной инженерии в производстве Методы генетической инженерии позволяют конструировать новые гены с заданными свойствами и вводить их практически в любую хромосому организма. Работа этих генов приводит к образованию определенного типа соединений, которые используются в различных областях народного хозяйства. Основные области народного хозяйства, использующие продукты генной инженерии Фармакология Проведение диагностики заболеваний с помощью ферментов, вакцинации вирусными антигенами; лечение наследственных, заболеваний при помощи индивидуальных генов; лечение и Пищевая промышленность Создание ароматических и пищевых добавок на основе аминокислот, витаминов, ароматических веществ, вторичных соединений; производство сахара при переработке целлюлозы; производство искусственных Химическая промышленность Получение промежуточных продуктов химических технологий, в частности ароматических и алифатических веществ; технологические процессы при участии ферментов; производство Сельское хозяйство Использование кормовых добавок с аминокислотами и витаминами; лечение животных при помощи антибиотиков; применение инсектицидов против насекомыхвредителей; использование симбиотических 39 профилактика заболеваний антибиотиками, стероидами, аминокислотами, витаминами и др. соединениями. подсластителей на основе коротких пептидов. этанола при переработке целлюлозы. систем растений с микроорганизмами, способствующими лучшей фиксации азота; получение урожая от трансгенных растений с улучшением качествами, питательной ценностью. 5.3. Получение вакцин методами генной инженерии Вакцина – препарат, получаемый из микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности и применяемый для активной иммунизации людей. Основные виды вакцин Аттенуированные (живые ослабленные) Вакцина, приготовленные из специально ослабленных культур, неспособных вызвать заболеваний, но способных размножаться, называют живыми вакцинами. В некоторых случаях в качестве живых вакцин можно использовать генетически модифицированные (рекомбинантные) микроорганизмы (бактерии или вирусы). У патогенного микроорганизма удаляют гены, ответственные за вирулентность. Способность вызывать иммунный ответ при этом сохраняется, а выращивание в чистой культуре исключает возможность спонтанного восстановления целого гена. Убитые Убитыми вакцинами называются такие вакцины, которые содержат неповрежденные патогенные микроорганизмы. Антитела, вырабатываемые в ответ на их введение, связываются с поверхностными белками патогенного организма и запускают иммунный ответ. Субъединичные (химические) Вакцины, содержащие лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма, называются субъединичными; для их разработки с успехом используется технология рекомбинантных ДНК. Например, введение очищенных поверхностных белков вируса (белков капсида или внешней оболочки вируса) приводит к выработке в организмехозяине антител против данного вируса. Широкое распространение инфекционных заболеваний среди людей (грипп, оспа, гепатит) и животных (бешенство) приводит к необходимости 40 использования вакцин для повышения иммунитета организма к действию патогенов, вызывающих эти заболевания. В последнее десятилетие, с развитием технологии рекомбинантных ДНК, появилась возможность создавать новое поколение вакцин методами генной инженерии. - Противогерпетические вакцины - Использование модифицированного гена вируса герпеса gD HSV -1 позволяет получать антитела и создавать эффективные противоящурные вакцины - Противотуберкулезные вакцины - Противохолерная вакцина на основе Vibrio cholerae - У которой изменен ген, ответственный за синтез холерного токсина - Получение противосальмонеллезных вакцин на основе бактерии Salmonella Использование Leishmania major для получения противолейшманиозной вакцины. 5.4. Молекулярная диагностика заболеваний Большинство методов диагностики инфекционных и генетических заболеваний основано на обнаружении в крови больного человека или животного специфических антител, образующихся в ответ на действие антигенов. Получение моноклональных антител является результатом культивирования изолированных клеток млекопитающих. За разработку метода моноклональных антител – одного из самых важных методических достижений в медицинской биологии в 70-е годы Цезарю Мильштейну и Георгу Кёлеру в 1984 году была присуждена Нобелевская премия. Эту премию они разделили вместе с иммунологом Н.Ёрне. Принцип получения и применения моноклональных антител При традиционном методе иммунизации для получения антисывороток с высоким содержанием антител необходимо использовать антиген высокой степени чистоты и в большом количестве. Не во всех случаях удается получить чистый антиген. В результате животному вводится гетерогенная смесь биополимеров, поэтому в полученной антисыворотке необходимых антител будет лишь определенная доля. Кроме того, каждый лимфоцит и его клон синтезирует только один тип антител. Таким образом, гетерогенность антител в иммунной сыворотке определяется и функционированием гетерогенных по составу β-лимфоцитов. В целом разнообразие антител, которые вырабатывает организм животного, определяется как 107. К сожалению, лимфоциты не растут вне организма – в условиях in vitro , но индуцировать их к такому росту можно в результате слияния с миеломными клетками. Миеломы – это злокачественные новообразования иммунной системы, которые развиваются в результате неконтролируемой пролиферации одной линии лимфоцитов. 41 Клетки млекопитающих не имеют клеточной стенки, поэтому осуществить их слияние между собой относительно несложно. Разработаны различные методы слияния клеток. Первый из них основан на использовании инактивированного вируса Сендай. Этот вирус относится к группе парамиксовирусов, его вирион покрыт липидсодержащей оболочкой, сливающейся с мембраной клетки-хозяина и обеспечивающей проникновение вируса в клетку Вирус способствует слиянию, связываясь одновременно с мембранами двух клеток. Кроме того, для слияния используют и химические вещества: ионы кальция, лизолецитин, ПЭГ (полиэтиленгликол). Образовавшиеся гибридные клетки отбирают на селективном фоне. Мильштейном был использован следующий принцип получения гибридных клеток – гибридом (рис.6). при наличии ПЭГ производится слияние нормальных лимфоцитов из иммунизированных животных и клеток миеломы. Миеломные клетки должны быть генетически маркированы с тем, чтобы они погибали на определенной селективной среде. Например, они могут быть недостаточны по одному из ферментов пуринового обмена - ГПВРТ, а селективная среда содержит амноптерин, блокирующий синтез нуклеотидов; Продукт слияния помещают на селективную среду, где выживают только гибридные клетки, так как нормальный лимфоцит привносит в гибридому недостающий фермент, а миелома – фактор неограниченного роста в культуральных условиях; Выжившие гибридомы проверяют на способность синтезировать антитела определенной специфичности; Проводят клонирование, получая из каждой необходимой гибридной клетки клоны. Клоны размножают. 42 Рис. 6. Метод получения гибридных клеток – гибридом по Мильштейну Антитела, производимые такими клонами, называют моноклональными потому, что они синтезируются потомками единственной В-клетки, ставшей "бессмертной" благодаря гибридизации с опухолевой миеломной клеткой. Моноклональные антитела используют в диагностике, при установлении характеристик тканей и органов, предназначенных для трансплантации. Таблица 2. Возможные способы применения моноклональных антител 43 Область медицины Анализ Диагностика Иммунодиагностика Иммуноочистка Терапия Способ применения Структурные зонды для идентификации специфических особенностей на поверхности клеток 1. Наборы реактивов для диагностики беременности. Выявление эстрогенных рецепторов для диагностики некоторых форм рака молочной железы 2. Моноклональные антитела используются для диагностики различных инфекционных заболеваний – холеры, краснухи; злокачественных опухолей человека и животных. 3. При установлении характеристик тканей и органов, предназначенных для трансплантации. 1. Точное определение количества специфических антигенов 2. Для изучения распределения антигенов в срезах тканей при идентификации клеток разных типов, особенно патологически измененных. Очистка антигенов, например, интерферона Направленный перенос токсинов в раковые клетки, инактивация ядов, пассивная иммунизация, лечение аутоиммунных болезней 5.5. Генетические болезни человека и генная терапия В самом общем смысле под генной терапией соматических клеток человека понимают коррекцию специфического наследственного заболевания путем введения в клетку-мишень функционального экспрессирующего гена. Клонированный «терапевтический ген» кодирует белок, корректирующий генетический дефект. Ген доставляется к клеткам определенной ткани пациента с наследственным заболеванием и экспрессируется в них. При идеальной системе доставки обеспечивается высокая эффективность поглощения «терапевтического гена» клеткамимишенями, минимальное внутриклеточное разрушение его при транспорте в ядро и поддержание уровня экспрессии, достаточного для облегчения состояния больного. Генная терапия: - Перенос гена. Для исправления генетического дефекта «терапевтический ген» переносят в изолированные клетки с помощью ретровирусных векторов или других систем доставки. - Наращивание клеток. Отбирают и наращивают генетически «исправленные» клетки. 44 - Введение клеток пациенту. При этом не развивается нежелательного иммунного ответа, но сама процедура является весьма дорогостоящей и трудоемкой. - Получение клеток от больного. Использование собственных клеток пациента (аутологичных клеток) гарантирует, что после инфузии или трансплантации у него не разовьется иммунные ответ. - Культивирование клеток. Клетки реципиента культивируются в питательной среде. 5.6. Промышленный синтез белков Рекомбинантные микроорганизмы используются для промышленного получения разнообразных белков в биореакторах (ферментерах). Часто для получения хозяйственно ценных продуктов используют бактерию E. coli с введенной в нее рекомбинантной ДНК, несущей определенный ген с заданными свойствами (например, ген гемоглобина или ген инсулиноподобного фактора роста человека). Промышленная ферментация и получение очищенного продукта – это процесс многоступенчатый. Инсулин человека был первым "генно-инженерным" белком, полученным с помощью такой технологии в начале 80-х годов. Было установлено, что около 1-2% населения страдает диабетом. Из них приблизительно 20% нуждается в инъекциях инсулина – гормона, который выделяют из поджелудочной железы животных: коров и свиней. Однако инсулин животных отличается от инсулина человека по аминокислотным последовательностям. При инъекции такого инсулина человеку в крови накапливаются антитела. Поэтому, естественно, самым подходящим для лечения является инсулин человека. Получить такой препарат удалось при использовании технологии рекомбинантной ДНК. На рис. 7 приведена схема получения инсулина человека на основе технологии рекомбинантной ДНК, разработанная фирмой Eli Lilly and Co в США. Первоначально был произведен синтез гена А-цепи инсулина и отдельно гена β-цепи. Каждый из этих генов был встроен в ген βгалактозидазы плазмиды, введенные затем в бактериальные клетки Е. со11. В питательную среду для роста бактерий была добавлена лактоза, которая индуцировала синтез β-галактозидазы, а вместе с ней и А- и В-цепей инсулина. После лизиса бактерий и обработки бромцианом, который расщепляет белки по остатку метионина, цепи инсулина отделяют от βгалактидазы. После очистки А- и В-цепей их объединяют, и образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков бактерии Е. со11, токсинов и др. побочных продуктов, а по физическим свойствам идентичен инсулину из поджелудочной железы 45 человека. Во время тестирования не было зафиксировано аллергических реакций, и данный препарат был рекомендован для массового производства. Прошли клинические испытания и поступили в продажу другие коммерческие препараты, полученные с помощью методов генетической инженерии – интерферон (рис. 8). Рис. 7. Схема получения инсулина человека на основе технологи рекомбнантных ДНК (Millеr, Baxter, 1980) 46 Рис. 8. Коммерческие препараты соматотропина и биотропина, полученные с помощью генной инженерии В следующих разделах будут рассмотрены примеры использования технологии рекомбинантных ДНК у высших растений. Приведенные примеры развивающихся направлений биотехнологии, в основном, касались использования в различных процессах микроорганизмов. В последнее десятилетие интенсифицируются исследования по генетике соматических клеток млекопитающих и высших растений. Разработка и применение методов культивирования изолированных клеток открывает возможность вовлекать их в систему биотехнологических процессов Главное: - Продукты генно-инженерного производства используются в фармакологии, пищевой и химической промышленности, а также в сельском хозяйстве. - Методы генной инженерии применяют для получения субъединичных (содержащих отдельные компоненты патогенного организма) или аттенуированных (приготовленных с использованием ослабленных микроорганизмов) новых поколений вакцин, используемых при лечении различных заболеваний. - Моноклональные антитела и ДНК-зонды используются в диагностических целях, в том числе в судебной экспертизе. - Первым лекарственным препаратом, произведенным бактериями, был инсулин, полученный в результате введения в бактерии гена инсулина человека. Впервые инсулин получили из бактериальных клеток в 1982 году. Препарат используют для лечения сахарного диабета у людей. 47 - Генно-инженерные подходы позволили получить «супербациллу», расщепляющую большинство углеводородов нефти. - Генная терапия основана на переносе нового генетического материала в клетки организма человека для достижения терапевтического эффекта. - Процесс синтеза соответствующих генов зависит от работы промотора – участка молекулы ДНК, с которым связывается РНКполимераза. - Проведение генно-инженерных работ регулируется строгими правилами, разработанными национальным институтами здравоохранения США и федеральным законом России, принятым в 1996 году. Контрольные вопросы 1. Методы биотехнологии рекомбинантных ДНК. Рестрикция ДНК. 2. Методы биотехнологии рекомбинантных ДНК Методы секвенирования ДНК. 3. Методы биотехнологии рекомбинантных ДНК. Гибридизация и использование ДНК-зондов. 4. Методы биотехнологии рекомбинантных ДНК Клонирование ДНК. Типы векторов. 5. Клонирование и экспрессия генов в эукариотических клетках. 6. Использование генетической инженерии в животноводстве. 7. Генноинженерный метод получения инсулина. 8. Генноинженерный метод получения соматотропина. 9. Генноинженерный метод получения интерферона. 10.Методы получения трансгенных растений. 11. Результаты и перспективные направления генной инженерии растений. 12. Экологические проблемы, порождаемые трансгенными организмами. 48 Раздел 6 БИОТЕХНОЛОГИЯ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ 6.1. Клональное микроразмножение Одна из основных особенностей живых организмов – способность к размножению. Существует два основных способа размножения: половое и бесполое. Для каждого из них характерно значительное разнообразие форм. Способы размножения Половое Половое размножение – размножение, при котором новый организм развивается из зиготы, образующейся в результате оплодотворения, т.е. слияния мужской и женской половых клеток. Вегетативное Вегетативное размножение – образование нового организма из части материнского. Таким образом могут размножаться микроорганизмы, почти все растения и некоторые животные (губки, мшанки, кишечнополостные, простейшие). Клональное Клональное микроразмножение – получение in vitro неполовым путем организмов, генетически идентичных исходному. Бесполое Бесполое размножение характеризуется отсутствием полового процесса; такое размножение свойственно одноклеточным и многоклеточным растительным и животным организмам. 6.2. Применение клонального микроразмножения в растениеводстве Термин «клон» (по-гречески klon – черенок) был предложен в 1903 г. Вебером для вегетативно размножаемых растений. Предполагается, что отпрыски растения, размножаемого неполовым путем, лишь части (клоны) материнской особи, идентичные ей и между собой. Клонирование подразумевает организмы, полученные из единичных клеток посредством митотических делений. Клональное микроразмножение – это использование техники «in vitro» для быстрого неполового получения растений, идентичных исходному. Для массового получения оздоровленных растений необходимо, чтобы быстрое клональное микроразмножение новых и уже существующих сортов стало крупномасштабным процессом. Среди растений этот способ впервые применили для размножения орхидных. Теперь размножают многие декоративные растения. Микроклональное размножение позволяет получить из одной чешуи луковицы лилии сорта Red Carpet до 105 новых растений за 6 месяцев. Большая часть гербер, которые продаются в цветочных магазинах, получена 49 путем клонирования. Одно растение герберы за год при клональном микроразмножении дает до одного миллиона новых генотипически и фенотипически сходных растений. При обычных способах размножения можно получить только 50-100 растений. В селекции клональное микроразмножении применяют для сохранения в культуре новых перспективных сортов, особенно полученных in vitro. Создание нужного для селекционера количества копий уникальных генотипов е требует больших масштабов. Периодически пересаживая микрочеренки, микрклубни или другие органы растений на свежую питательную среду, можно достаточно долго сохранять в культуре in vitro растения с необходимым генотипом. Клональное микроразмножение используется также для быстрого получения больших количеств безвирусного материала с дальнейшей посадкой в грунт. Растения, полученные из меристем, во многих случаях свободны от вирусов. Клональное микроразмножение таких растений и их тестирование на отсутствие вирусов позволили получить оздоровленный посадочный материал. Таким способом размножают ценные сорта картофеля, земляники, лилий, избавленные от вирусной инфекции. Клональное микроразмножение помогает в сохранении редких и исчезающих видов растений. Технология размножения редких растений и их возвращения в природные экосистемы еще нуждается в разработке. Клональное микроразмножение применяют также ускорения размножения и селекции древесных растений. В Италии, благодаря черенкованию пазушных побегов in vitro, за год выращивают более миллиона подвоев персиковых деревьев. Таким же образом клонируют гвинейскую масличную пальму, многие породы хвойных деревьев (ель, сосна, лиственница, секвойя). С помощью клонального размножения отдельных экземпляров взрослых растений необычной формы и расцветки, например, ели в виде шара, «плакучие», золотистого цвета и т.д. 6.3. Технология клонального микроразмножения Для получения клонов можно использовать любую клетку, ткань или орган растения. Вызывая последовательно дедифференцировку клеток экспалнта и вторичную дифференцировку каллусных клеток, можно добиться регенерации растения. Однако проще и удобнее использовать для клонирования меристематические ткани, так как они обладают генетической стабильностью и позволяют получать оздоровленные растения. Реализовать тотипотентность in vitro можно индукцией в каллусных тканях или культивируемых клетках цепи событий. Это образование меристематических очагов; развитие на их основе зачатков стеблевых апексов; появление 50 побегов, которые после укоренения развиваются в целое растение (индукция побегов). - Необходимо получить хорошо растущую стерильную культуру, в которой на эксплантах (кусочках листа) формируется большое количество почек. - При размножении полученной культуры почки отделяют от экспланта и рассаживают на новую питательную среду, где побег укореняется и растет. - Чтобы укоренившиеся побеги адаптировались к почвенным условиям, необходимо поддерживать определенную влажность (создание «тумана»), температуру и т.д. - Извлеченные из сосудов растения выращиваются в почве. 6.4. Некоторые способы клонального микроразмножения растений Большинство методов клонального микроразмножения основаны на использовании меристематических тканей. В растении существует несколько типов меристематических тканей: верхушечные меристемы стебля и корня, пазушные меристемы, камбий. Технология микроклонального размножения растений с помощью выращивания верхушечных меристем проходит в стерильных условиях на среде с фитогормонами и цитокининами. Образуется большое количество почек, каждая из которых при пересадке на свежую питательную среду, дает начало новому растению. Чаще всего активируют развитие пазушных меристем путем удаления верхушечной меристемы побега, так как фитогормоны, вырабатываемые верхушечной меристемой, тормозят развитие пазушных меристем. При удалении верхушечных меристем из пазушных образуются побеги, которые черенкуют и пересаживают на новую питательную среду для укоренения. Новообразование меристемы в стебле растения возможно при ранении. Происходит дедифференциация клеток, возвращающая их в состояние, близкое к эмбриональному. Эти клетки снова приобретают способность к делению. На этой способности основано вегетативное размножение растений. Апикальная (конечная) меристема корня отличается от верхушечной меристемы тем, что собственные инициальные клетки делятся очень редко, составляя покоящийся центр. Объем меристемы увеличивается за счет производных. Интенсивное деление клеток покоящегося центра происходит под действием мутагенных факторов, облучения и т.д. 6.5. Оздоровление растений Большинство культивируемых растений, особенно размножающихся 51 вегетативно, постоянно подвергаются инфекциям, вызываемым вирусами и патогенными микроорганизмами. Заболевание растений приводит к уменьшению урожайности и снижению его качества. Установлено, что у растений, свободных от патогенов, урожайность может быть увеличена на 300%. Т.о. из-за вирусных болезней погибает от 10 до 50% урожая сельскохозяйственный растений. Вирусы быстро распространяются по проводящей системе растений. В меристеме е нет, поэтому клетки меристематических тканей растений обычно не содержат вирусов. Связывают это с возможными причинами. - Вирусы в растении распространяются по сосудистой системе, которая не развита в меристеме. - Репликация вирусов ингибируется эндогенными, метаболически активными веществами ауксиновой природы, которые синтезируются в зонах делящихся клеток. Один из методов оздоровления растений, который широко применяется для многих культур, - клональное микроразмножение с использованием культуры апикальных меристем. В 1948 году были получены свободные от вирусов растения георгина путем размножения их отрезками побегов, вычлененных из инфицированных растений (Holmes, 1948). В 1949 году Лимассе и Корнюэ выявили, что во многих случаях меристематические ткани растений не содержат вирусов. Было обнаружено, что в инфицированном растении содержание вирусов снижается по направлению к верхушке, а собственно меристема может быть полностью свободна от вирусной инфекции. Собственно апикальная меристема - это конус активно делящихся клеток высотой 0.1 мм и шириной 0.25 мм (рис.). В практической работе трудно вычленять экспланты такого размера без повреждения. Другая трудность заключается в слабой индукции маленьких эксплантов к регенерации растений. Поэтому для культивирования иногда используют экспланты размером до 1 мм, имеющие несколько листовых примордий, которые являются источником синтеза фитогормонов, индуцирующих развитие растения. В каждом конкретном случае размер экспланта должен быть оптимальным, чтобы растение могло регенерировать, но в то же время не содержать вирусов. Морель и Мартин в 1952 году предложили проводить оздоровление растений, выращивая их из культивируемых in vivo меристем. Они срезали 100 мкм верхушки меристем георгина и культивировали на питательной среде. Были выращены свободные от вирусов проростки, которые сами не укоренялись, поэтому их прививали на здоровые укорененные растения. И при выращивании верхушечной меристемы с 2-3 зачатками листьев можно получать генетически однородные безвирусные растения в большом количестве. Но в то же время, чем больше размер фрагмента ткани, тем легче 52 из него образуется растение, хотя вероятность присутствия вируса в его тканях увеличивается. Рис. 9. Получение растений свободных от вирусов через культуру апикальных меристем 1 - инфицированные вирусом растения, 2 – сегменты стебля с узлами, вычленение апикальной меристемы, 3 – культивирование, 4 – растения, регенерировавшие из апикальной меристемы, 6 – тестирование растений на присутствие вирусов, 7 – размножение растения, свободного от вируса в культуральных условиях, 8 – размножение свободных от вирусов растений в теплице. После тепловой обработки материнских растений можно вычленять относительно большие экспланты, так как вирусы в меристеме инактивированы. Во многих случаях тепловая обработка улучшает развитие растений, регенерирующих из меристем. Метод культуры апикальных меристем получил развитие для получения растений, свободных не только от вирусов, но и от микоплазмы, бактерий, грибов (рис. 9). В некоторых случаях для уничтожения инфекции приходится подвергать растения температурой или химической обработке, а уже потом выделять меристему и получать из нее здоровье растение – регенерат. 53 Культивирование in vitro сочетают с термо- и химиотерапией. Методы оздоровления от вирусов разработаны и применяются для многих овощных культур (картофеля, аспарагуса, цветной капусты, хрена, чеснока и др.), цветочных (гладиолуса, георгина, гвоздики, антурии, хризантемы, нарцисса, ириса и др.), плодовых и ягодных (яблони, малины, крыжовника, садовой земляники и др.). Необходимо подчеркнуть, что как правило, растения инфицированы не одним вирусом, а несколькими. Поэтому говорить об оздоровлении растения от определенного вируса можно лишь после тестирования материала. Основной принцип инактивации вирусов при прогревании растений основан на подборе условий таким образом, чтобы вирус был инактивирован, а ткани растения-хозяина не повреждались. Обработку проводят горячей водой (если почки спящие) или горячим воздухом (при наличии активно растущих почек). Температура обработки при постепенном повышении в первые дни - 35-40°С; продолжительность – от нескольких минут до нескольких недель при относительной влажности 85-95. Например, для удаления вирусов у гвоздики необходима термообработка при 380С в течение 2 месяцев. Однако многие вирусы термостабильны. Например, у картофеля только вирус скручивания листьев инактивируется при тепловой обработке. Поэтому для оздоровления растений часто используют культивирование изолированных меристем, как без термообработки, так и в сочетании с термообработкой. В последнем случае проводят прогревание или растений до эксплантации меристем, или меристем во время. 6.6. Селекция растений Методы клеточной инженерии позволяют значительно ускорить и облегчить традиционный процесс селекции. Биотехнологии позволяют также скрещивать растения, которые в обычных условиях не скрещиваются. Методы селекции растений: Изолированные завязи Слияние протопластов Дальнородственные гибриды создаются следующими методами: 1. Выращивание в стерильных условиях семяпочек одних видов растений рядом с пыльцой растений других видов. 2. Соматическая гибридизация. Благодаря этому методу можно осуществлять любые скрещивания. Действием препаратов, разрушающих клеточную стенку, получают протопласты. Слияние протопластов с образованием гибридных клеток происходит в присутствии полиэтиленгликоля. Продукты слияния протопластов культивируют ни 54 питательных средах с осмотическими стабилизаторами, при этом они образуют новую клеточную стенку, осуществляют ряд последовательных делений и превращаются в колонии каллусных клеток. После этого их переносят на среду для регенерации, где происходит образование зачатков стеблей, корней, а затем и регенерация химерного растения. 6.7. Фиксация молекулярного азота Процесс восстановления молекулярного азота и образования аммиака – единственный процесс, превращающий свободный азот атмосферы в доступную для растений и животных форму. Этот процесс называется азотфиксацией. Способность к азотфиксации присуща только некоторым прокариотным микроорганизмам. Свободно живущие анаэробные бактерии. В 1893 году С.Н. Виноградский выделил и описал азотфиксирующую анаэробную бактерию Clostridium pasterianum. Позже были открыты другие анаэробные азотфиксирующие бактерии. У всех таких бактерий азотфиксация происходит под действием одного ферментного комплекса – нитрогеназы, состоящей из двух белков: Fe- белка и MoFe-белка. Оба белка инактивируются кислородом, поэтому для фиксации азота необходимы анаэробные условия. Кроме того, процесс азотфиксации требует много энергии. Ассоциированные и свободноживущие аэробные бактерии. Помимо клостридий в почве обитают азотфиксирующие аэробные бактерии рода Azotobacter, почвенные цианобактерии, а также архебактерии и некоторые другие группы бактерий, а в реках, озерах, морях азот фиксируют некоторые фотосинтезирующие бактерии. Чтобы ферменты нитрогеназного комплекса не инактивировались кислородом, они располагаются в специальных органеллах (у цианобактерий) или в специальных клетках с очень плотной оболочкой (у азотобактера). Перспективным считается повышение активности азотфиксации бактерий рода Azospirilla, ассоциированных со злаками, и создание более тесных связей между ними. Симбиотические бактерии. В древнейшие времена азотфиксирующий симбиоз между грибами и цианобактериями привел к образованию лишайников. В наше время 55 наиболее активными азотфиксаторами считаются клубеньковые бактерии рода Rizobium, образующие клубеньки на корнях, в симбиозе с бобовыми растениями. Имеются и другие примеры симбиотической фиксации азота, например в клубеньках на корнях ольхи (образованных ею в симбиозе с актиномицетами рода Frankia). Некоторые тропические растения образуют клубеньки на листьях, например цианобактерии с папоротником Azolla или тропическим растением Gunnera. Ассоциация растительных клеток и клеток цианобактерий в культуре Введение азотфиксирующих цианобактерий в культуру растительных клеток могло бы решить проблему фиксации азота. Оказывается, что в смешанных культурах каллуса табака и цианобактерий формировались побеги табака с участками сине-зеленого цвета, где локализовались цианобактерии. Образовалась устойчивая ассоциация растительной и бактериальной клеток. Азотфиксирующие цианобактерии обеспечивали рост растительных клеток в суспензионных и каллусных смешанных культурах на питательных средах, не содержащих азот. Растения, регенерированные из таких смешанных культур, могли расти даже на чистом песке, так как клетки цианобактерий, находящиеся в растении, снабжали их необходимыми соединениями азота. К сожалению, такие ассоциации получены только для немногих растений. 6.8. Некоторые методы, увеличивающие продуктивности растений Внедрение хлоропластов Введение высокоэффективных хлоропластов одних растений в изолированные протопласты других может способствовать активации фотосинтеза и повышению продуктивности последних. Ассоциации с цианобактериями Фотосинтезирующие цианобактерии могут образовывать ассоциации с растительными клетками в культуре in vitro и снабжают эти клетки углеводами. При использовании питательных сред, в которых отсутствуют сахара, а, следовательно, нет источников углеводов, оказалось, что прирост растительных клеток в культуре может быть обеспечен за счет усвоения клетками растений продуктов фотосинтеза цианобактерий. Главное: - Клональное микроразмножение – это неполовое размножение с помощью метода культуры тканей; оно позволяет получать популяции, все клетки которой идентичны одной исходной клетке. - Клон – большое число клеток или молекул, идентичных исходной клетке. Клональное микроразмножение применяется для сохранения перспективных сортов растений. 56 - Клональное микроразмножение применяется для получения и размножение безвирусного материала. - Клональное микроразмножение применяется для быстрого размножения новых сортов. - Применение методов биотехнологии в селекции ускоряет процесс селекции. - Применение методов биотехнологии в селекции увеличивает генетическое разнообразие за счет дальнородственного скрещивания. - Применение дальнородственого скрещивания часто приводит к появлению аномальныз признаков. Контрольные вопросы: 1. Что такое меристематические ткани? 2. Что такое клональное микроразмножение? 3. Применение клонального микроразмножения в растениеводстве. 4. Технология клонального микроразмножения. 5. Некоторые способы клонального микроразмножения растений. 6. Оздоровление растений. 7. Селекция растений и биотехнология. 8. Фиксация молекулярного азота. 9. Методы биотехнологии, увеличивающие продуктивности растений 57 Раздел 7 ИММОБИЛИЗОВННЫЕ ФЕРМЕНТЫ 7.1. Понятие инженерная энзимология Все встречающиеся в природе организмы содержат ферменты (биокатализаторы), функцией которых является проведение и регуляция химических реакций, необходимых для жизни. Энзимология – раздел молекулярной биологии и биохимии, изучающий свойства, строение и механизмы действия ферментов. Основная задача инженерной энзимологии состоит в создании новых перспективных технологий на основе использования ферментов. Ферменты применяются во многих областях: - в пищевой промышленности – для выпечки хлеба, переработки молочных продуктов, осветления соков и т.д. - в медицине – для производства лекарственных препаратов - в животноводстве – ля повышения усвояемости кормов, а также для ускорения процесса силосования и улучшения питательных свойств силоса - в растениеводстве – для защиты растений от насекомых – вредителей . 7.2. Источник ферментов Ферменты выделяют из клеток всех видов живых организмов, но традиционным источником служили растения. Синтез ферментов клетками культуры ткани ввиду сложности и дороговизны не получил широкого распространения, хотя он и позволяет получить большое количество необходимого вещества в десятки, а иногда и в сотни раз быстрее, чем путем выделения из живых организмов. В настоящее время ферменты получают преимущественно из бактерий, так как они примерно в сто раз дешевле ферментов, выделенных их клеток растений и животных. 7.3. Иммобилизованные ферменты Выделяемые из клеток свободные ферменты имеют ряд недостатков: ни растворимы в воде, во время выделения или при хранении могут потерять свою активность; кроме того, их порой трудно отделить от продуктов реакции. В последнее время были найдены пути преодоления этих сложностей – получены водонерастворимые формы, так называемые иммобилизованные (связанные) ферменты. Иммобилизация фермента – это метод, позволяющий связать молекулу фермента с природными или синтетическим носителем. Носитель не 58 смешивается с раствором реагентов, но позволяет ферменту взаимодействовать с ними, в результате чего и образуются необходимые вещества. Наиболее распространенным способом получения иммобилизованных ферментов является ковалентное связывание. Иммобилизованные ферменты обладают существенным преимуществами по сравнению с традиционными ферментативными препаратами. Они стабильны и долго сохраняют свою активность, легко отделяются от реакционной среды, что повышает качество получаемой продукции. Кроме того, иммобилизованные ферменты технологичны, что определяется возможностью вести биотехнологический процесс непрерывно, регулировать скорость реакции и выход продукта. 7.4. Инвертаза (сахараза) Фермент инвертаза расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу, его получают из пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces carsbergensis). Инвертный сахар кристаллизуется медленнее, чем сахароза, поэтому его применяют при изготовлении продуктов, в которых кристаллизация нежелательна, - в полужидких начинках конфет, в ликерах, сиропах, в искусственном мёде. Получаемая с помощью инвертазы фруктоза оказывает благоприятное действие на организм больного человека. Фруктоза применяется в питании людей, больных диабетом. Её расщепление не зависит от инсулина, что способствует нормализации синтеза гликогена в организме. Фруктоза улучшает усвоение препаратов, содержащих железо, поэтому её можно использовать при лечении анемии, вызванной недостатки ионов железа в организме. Фруктоза улучшает состояние людей, страдающих сердечной недостаточностью. Фруктоза предотвращает накопление жира в печени. Фруктоза снижает заболеваемость кариесом. 7.5. Лактаза Лактаза – фермент, который расщепляет лактозу и глюкозу. Лактоза с трудом усваивается животными организмами, не сбраживается хлебопекарными дрожжами. Слабая растворимость лактозы мешает переработке молока. Применение иммобилизованной лактазы позволяет получать концентрированные молочные продукты, избегать добавления химических стабилизаторов в мороженное, увеличить питательность смесей для детского 59 питания. Ферментативный гидролиз лактозы в молочной сыворотке позволяет применять ее в качестве корма для животных и птицы. 7.6. Применение иммобилизованных ферментов в медицине Иммобилизованные ферменты используют в качестве лечебных препаратов, если из-за отсутствия собственного фермента организм е может сам избавиться от токсических веществ. Введение чужеродных ферментов в обычном растворимом виде может не дать положительных результатов, так как эти ферменты неустойчивы и, кроме того, могут вызвать аллергическую реакцию. Иммобилизация повышает стабильность фермента, а также препятствует его взаимодействию с иммунной системой организма. Уреаза. В аппарате «искусственная почка», предназначенном для освобождения крови от мочевины и других шлаков, используется фильтрационная колонка с иммобилизованной уреазой. Уреаза разлагает мочевую кислоту с образованием углекислоты и аммиака. Стрептокиназа. Для растворения тромбов в кровеносных сосудах используют иммобилизованную стрептокиназу. 7.7. Другие области применения иммобилизованных ферментов - Перерабатывающая промышленность. В результате ферментативного гидролиза целлюлозы получается глюкоза, которая добавляется в корм животным. - Пищевая промышленность. Осветление фруктовых соков происходит с помощью иммобилизованных ферментов. - Химическая промышленность. 1. Иммобилизованные ферменты участвуют в получении из перекиси водорода кислорода, который необходим для превращения латекса в губчатую резину. 2. Добавление ферментов в стиральные порошки, позволяют удалять застарелые, а также масляные и жировые пятна. - Текстильная промышленность. Из обрезков шкур с помощью иммобилизованных ферментов извлекают шерсть, которая используется для производства тканей. - Кожевенная промышленность. С помощью иммобилизованных ферментов со шкур удаляют волосяной покров и смягчают кожу после дубления. Главное: - Иммобилизация фермента – это метод, позволяющий ковалентно связать молекулу фермента с природным или синтетическим носителем. 60 - Иммобилизованные ферменты обладают целым рядом преимуществ по сравнению с естественными ферментами. Они стабильны, долго сохраняют свою активность, легко отделяются от продуктов реакции. - В медицине иммобилизованная уреаза применяется для освобождения крови от шлаков, а стрептокиназа – для растворения тромбов. - В пищевой промышленности пектиназы служат для осветления фруктовых соков, лактаза – для получения высококонцентрированных молочных продуктов, инвертаза – для изготовления искусственного меда, амилазы – для производства сахаристых веществ, улучшения качества хлеба. - Бактериальные протеазы используются в химической, кожевенной и текстильной промышленности. Контрольные вопросы 1. Что включает понятие «антигены»? 2. Какие способы усиления иммунного ответа существуют? 3. Какие методы используют для облегчения доставки лекарственного препарата к месту его действия? 4. Что такое гибридомная технология? 5. Каковы области применения моноклональных антител? 6. Из чего состоит молекула антитела? 7. Какие виды вакцин существуют? 8. Каковы особенности получения сывороток? 61 Раздел 8 ПИЩЕВАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ 8.1. Введение в пищевую микробиологию Вообразите себе мир, в котором нет ни пышного хлеба, ни ароматного сыра, ни освежающего пива, ни борща со сметаной… Тоска? А ведь такой безвкусный мир мог существовать, если бы хлебопекам и сыроделам, квасникам и пивоварам не помогали микроорганизмы. В общем, не зря ученые говорят: эволюция человека - это эволюция способов приготовления пищи. Пытаясь запасти еду впрок, древние люди обнаружили, что свойства ее со временем меняются. Молоко приобретает освежающей кисловатый вкус, фруктовый сок, побулькав обильной пеной, вдруг начинает возбуждать веселье, а из смеси муки с водой, забытой до утра в теплом месте, однажды получились гораздо более пышные лепешки. Люди стали искать и находить способы обработки пищи, дающие ей новый вкус или способность долго хранится. Самую лучшую закваску удачливые кулинары тщательно сохраняли. Они и не подозревали, что отбирают активные сообщества микроорганизмов, находя оптимальные методы их культивирования. Так возникла отрасль пищевой промышленности – пищевая биотехнология. Сегодняшняя пищевая биотехнология изучает способы приготовления пищи с использованием бактерий и дрожжевых грибов. Это, прежде всего, древние отрасли: виноделие, пивоварение, хлебопечение, сыроделие, сквашивание молока, фруктов и овощей. В современной пищевой биотехнологии найдено применение и самим микроорганизмам, и их ферментам. Например, при изготовлении вкусовых добавок уксуса, соевого соуса, различных белковых экстрактов. 8.2. Хлебопечение Хлеб является обязательным компонентом питания человека. В древности хлеб представлял собой смешанную с водой и выпеченную муку. Революционную роль в хлебопечении сыграли применение заквасок для получения рыхлого теста. Производство хлеба особенно тесно связано с применением ферментов. Издавна применяли солод, потом – комплекс препаратов из грибов Aspergillus awamori и Aspergillus orysae, в которых содержаться ферменты: амилаза, мальтаза, дескриназа, протеолитические ферменты. При концентрации соли 0,8 % и выше (по отношению к массе муки) она может угнетать газообразование дрожжей, снижается рост и кислотонакопление молочнокислых бактерий. 62 В хлебопекарной промышленности применяется ряд ферментативных препаратов. Это α-амилаза, глюкоамилаза, мальтогеннная амилаза, а также протеолитические (протеаза), цитолитические (гемицеллюлоза, ксиланаза), липолитические (липаза), окислительные (липоксигеназа, глюкозооксидаза) ферментные препараты. При использовании ферментов увеличивается содержание сахаров, повышается газообразующая способность муки, ускоряется кислотонакопление, интенсифицируются процессы развития дрожжей, улучшается вкус и аромат изделия, хлеб дольше не черствеет. Ферментативные гиролизаты фруктовых выжимок используют в качестве частичной замены части сахара и фруктового пюре при приготовлении печенья. В готовых изделиях увеличивается количество редуцирующих сахаров и ароматических веществ, улучшается структура. Добавление жира в количестве не более 5 % к массе муки не влияет на деятельность микроорганизмов. При увеличении количества жира до 10% и более он обволакивает клетки бактерий и дрожжей и активность их снижается. Для расширения ассортимента хлебобулочных изделий, повышения их пищевой ценности используют нетрадиционные виды сырья, вторичные продукты консервного производства (томатные, яблочные, цитрусовые выжимки, и т.д.). Это сырье содержит наряду с витаминами и микроэлементами до 10% пектина, гемицеллюлозы и целлюлозы, которые оказывают лечебно-профилактическое действие, способствуя нормализации обмена веществ и улучшению работы пищеварительного тракта. Применение ацидофильной закваски в сочетании с высоким уровнем аминокислот эффективно для улучшения качества изделий с крепкой клейковиной, при ускоренных технологиях приготовления теста, а также при выработке батонов и сдобных изделий с высоким содержанием и жира. При добавлении сахара до 5% к массе муки активность дрожжей и молочнокислых бактерий возрастает, газообразование увеличивается. При добавлении 10% - скорость газообразования такая же, как и в тесте без сахара. А при добавлении 20% сахара деятельность дрожжей и молочнокислых бактерий угнетается. Современные достижения в области биотехнологии позволили создать закваски на основе отбора микроорганизмов с заранее заданными свойствами, полученных в результате гибридизации, мутагенеза, индукции и адаптации. Отбор микроорганизмов производится с учетом назначения той или иной пшеничной закваски. Например, получение микробиологически чистой продукции (антибиотической действие на спорообразующую и грибную микрофлору), придание изделиям защитных свойств благодаря обогащению β-каротином и витаминами группы В, увеличение пищевой ценности в результате повышения содержания незаменимых аминокислот и т.д. 63 В состав муки входят белки, крахмал, липиды и небольшой количество минеральных веществ. Крахмал – основной компонент пшеничной муки – под действием ферментов разлагается с образованием сахаров. Газообразующая способность муки связана с сахарами, из которых при брожении образуется углекислый газ, создающий мелкопористую структуру хлеба. Газоудерживающая способность (сила муки) – способность образовывать рыхлое эластичное тесто – обусловлена количеством и качеством белков клейковины. Белки ржи при соединении с водой не образуют клейковину, а переходят в состояния вязкого коллоидного раствора. Слизи (гумми), содержащие в ржаной муке, вступают в соединение с белками и также препятствуют слипанию частиц клейковины. Кроме того, в ржаной муке содержится значительное количество альфа-амилазы, которая расщепляет сахара с образованием декстринов, придающих тесту липкость. В ржаном тесте разрыхляющими агентами являются главным образом газообразующие и кислообразующие гетероферментные молочнокислые бактерии и в меньшей степени гомоферментные молочнокислые бактерии (в соотношении 1:2). Роль дрожжей в ржаном хлебе невелика. Молочнокислые бактерии образуют не только молочную кислоту, но и углекислый газ, который способствует разрыхлению теста. Кроме того, они создают до 34% летучих кислот, придающих хлебу вкус и аромат. Для дрожжей заключается в биологическом разрыхлении теста двуокисью углерода, которая выделяется в процессе спиртового брожения, а также в образовании этанола и других продуктов реакции, участвующих в формировании вкуса и аромата хлебных изделий. В хлебопекарном производстве применяются дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Это крупноклеточные овальные дрожжи, адаптированные к повышенной кислотности теста и к его кислообразующей микрофлоре. Хлеб выпекают в печах при температуре 2100 С. В начале выпечки объем теста увеличивается. Это вызвано тем, что при нагревании расширяются пузырьки углекислого газа и воздуха в тесте, выделяется углекислый газ, находившийся в тесте в растворенном состоянии, а при температуре 790 С переходит в газообразное состояние спирт – второй продукт брожения, что также увеличивает объем теста. Молочнокислые бактерии, окисляя сахара, образуют молочную кислоту и создают в тесте кислую среду, которая способствует росту дрожжей и предохраняет тесто от размножения посторонних микроорганизмов. Для создания высокой кислотности при замесе из ржаной муки используют закваску, содержащую молочнокислые бактерии и дрожжи в соотношении 80:1. Следовательно, в отличие от пшеничного хлеба, тесто которого образуется в основном за счет спиртового брожения, в образовании 64 теста из ржаной муки основная роль принадлежит молочнокислым бактериям. После того как тесто созрело, т.е. процессы брожения закончились, тесто делят на куски, формируют и оставляют на некоторое время для расслойки при температуре 35-400 С. В это время происходит восстановление нормальной структуры теста, нарушенной делением и формовкой; идет брожение. С помощью лигаз можно без изменения вкусовых качеств увеличить содержание ненасыщенных жирных кислот, моно- и диглицеридов, что приведет к улучшению пищевой ценности готовых изделий. При этом интенсифицируется брожение теста, улучшаются его свойства, повышается объем хлеба, пористость и формоустойчивость изделий, увеличивается срок сохранения их свежести. Пропионовая и муравьиная кислоты, синтезируемые пропионовыми бактериями, ингибируют развитие споровых бактерий, и накапливает значительные количества витамина В12. Это витамин участвует в процессе кроветворения, поэтому применение данной закваски имеет двойное значение: предотвращение развития в хлебе микробиологической инфекции и обогащение его витамином В12 с целью повышения биологической ценности хлеба. С точки зрения современной биотехнологии культура дрожжей Saccharomyces cerevisiae, участвующая в процессе брожения, достаточно хорошо изучена в генетическом отношении и является хорошим объектом для генно-инженерных манипуляций. в эту культуру уже клонированы гены альфа-амилазы и β-галактозидазы. 8.3. Виноделие и пивоварение Виноделие – одна из старейших технологий, применяемых человечеством. Вино образуется при сбраживании виноградного сусла (сока) винными дрожжами. В процессе брожения сахар, содержащий в соке, разлагается дрожжами с образованием спирта и углекислого газа. Процесс брожения ведут периодическим способом в больших емкостях. В конце брожения перед переливкой все сахара окислены, ферментативная активность прекращается, дрожжи отмирают, их клетки распадаются (автолиз), фенольные соединения окисляются и выпадают в осадок. По окончании брожения вино сливают с осадка, фильтруют и разливают в бутылки или бочки. При хранении и выдержке в вине происходят сложные В пивоварении принимают участие два вида дрожжей. Saccharomyces cereviseae производят верховое брожение, т.е. дрожжи находятся в верхней части объема и при этом сбраживают 30% моносахаридов. Saccharomyces carlsbergensis участвуют в низовом брожении, они хорошо оседают и сбраживают 60% сахаров. После гидролиза крахмала ячменным солодом пивное сусло содержит мальтозу, глюкозу, мальтотриозу, мальтотетрозу и декстрины. Первые три используются пивными дрожжами с образованием темного пива (содержащего декстрины и мальтотетрозу). В светлом пиве декстринов нет. В настоящее время созданы пивные дрожжи, способные разлагать декстрины с образованием светлого пива. 65 биохимические процессы. Их условно делят на стадии: образование и формирование вина, созревание вина, старение вина, распад и отмирание вина. 8.4. Получение спирта Луи Пастер (1822-1895 гг.) К 1861 году Пастер показал, что образование спирта, глицерина и янтарной кислоты при брожении в анаэробных условиях, может происходить только в присутствии микроорганизмов, часто специфичных. Он установил, что брожение вызывают дрожжи, запасая при этом энергию. Спиртовое брожение – это реакция разложения: С6Н12О6=2СН3СН2ОН+»СО2. 8.5. Получение соков Для получения соков используют ферментные препараты с цитолитической и протеолитической активностью. С их помощью получают соки, пюре, экстракты, препараты пектина. Для мацерации тканей с сохранением структуры клеток используют ферменты. При этом важна способность препарата к расщеплению межклеточного вещества при сохранении структуры клеток. Сиропы, полученные из ферментированных цитрусовых соков, стабильны в течение года. Для получения препаратов пектина, используемых кондитерами, выжимки плодов обрабатывают целлюлазами и пектиназами в кислой среде при нагревании до 45 – 500 в течение часа. Для получения из трав лечебных или вкусовых экстрактов растительный материал обрабатывают циторезилином с сахаром в течение 4 66 часов при 45 – 550 С. При этом количество экстракта возрастает в полтора – два раза по сравнению с простым отжимом. Из облепиховых выжимок после обработки пектофосфитидином получают гидролизат с высоким содержанием белка, аминокислот, сахаров. Его используют как пищевую витаминную добавку. Для получения антоцианового красителя, применяемого в пищевой промышленности, ягоды аронии разрушают целлюлозой при 500С с течение 2 часов, после чего пигмент экстрагируют водно – спиртовым раствором. Для получения пюре используют вторичное сырье (выжимки), где структура клеток уже разрушена. После обработки ферментами фрукты растирают, и получается однородная масса. Из ягод, содержащих большое количество пектина, трудно выделить много сока. Такие ягоды подвергают обработке пектофосфитидином, который переводит пектин в растворимую форму. 8.6. Молочно - кислое брожение Для получения молочнокислых продуктов используется способность различных микроорганизмов сбраживать молоко с образованием молочной кислоты. Пропионовокослое брожение вызывают пропионовые бактерии (Propionibacterium shermanii и другие). Они образуют пропионовую кислоту, уксусную кислоту и углекислый газ. Продукты пропионовокислого брожения придают приятный вкус швейцарскому сыру. В Европе и Америке продукты спиртового брожения молока встречаются крайне редко. Зато они широко распространены в национальной кухне Японии, Кавказа, Средней Азии. Частичное спиртовое брожение происходит при образовании кумыса. Молочнокислое брожение вызывают молочнокислые бактерии родов Lactobacillus) L. casei, L. bulgaricus, L. lactis, L. helveticus) и Streptococcus (St. thermophillus, St. lacticus, St. cremosus). При развитии Escherihia coli, энтерококков, гнилостных бактерий родов Bacillus и Clostridium на молочнокислых продуктах (например, твороге) происходит белков с образованием газа и прогорканием. Образование лимонной кислоты является побочным продуктом роста лактобацилл: Lactobacillus dextranicum, L. citrivorum. Помимо лимонной кислоты образуется небольшое количество глюконовой и щавелевой кислот. Продукты лимоннокислого брожения дают приятный вкус и аромат сметане, сливочному сыру. Маслянокислое брожение вызывают анаэробные бактерии Clostridium и Pseudomonas. Продукты, в которых произошло масляное брожение, горьки на вкус. 67 8.7. Молочные продукты И.И. Мечников (1855-1916 гг.), Нобелевская премия, 1908 г. В начале ХХ века И.И. Мечников установил, что молочнокислые бактерии создают в кишечнике кислую среду, препятствуя тем самым развитию гнилостных бактерий, отрицательно влияющих на жизнь человека. Многокомпонентные закваски. - Кефир. Для получения кефира молоко раньше засеивали «кефирными зернами» («кефирные грибки»), содержащими Lactobacillus casei и Saccharomyces cereviseae и некоторые другие молочнокислые бактерии. Сейчас используют специальные закваски. - Кумыс. Кобылье молоко для приготовления кумыса сбраживается стрептококками и дрожжами путем смешанного молочнокислого и спиртового брожения. Продукт обладает иммунным свойствами против возбудителей туберкулеза. - Ацидофильно-дрожжевое молоко. В пастеризованное молоко вносят закваску из ацидофильных бактерий и дрожжей типа Saccharomyces lactis. Ацидофильное-дрожжевое молоко получается в результате смешанного молочного и спиртового брожения. Мезофильные стрептококки. - Творог. Белковый кисломолочный продукт, получаемый сквашиванием молока с последующим удалением сыворотки. Основные микроорганизмы – Lactobacillus lactis, L. cremoris, L. diacetylactis, L. dextranicum. - Простокваша обыкновенная. Простоквашу получают заквашиванием молока смесью из стрептококков, кавказской палочки и молочнокислых дрожжей. - Сметана. Для изготовления сметаны сливки сквашиваются молочнокислыми бактериями Lactobacillus lactis, L. cremoris, L. diacetylactis. 68 Добавление к ним культуры лейконосток (Leuconostoc citrovarum и Leuconostoc dextranicum) приводит к ароматизации сметаны. Термофильные молочнокислые бактерии. - Йогурт. Для получения более плотной консистенции необходимо повысить содержание сухих веществ. Это делается длительным упариванием до уменьшения объема в 2-3 раза или добавлением сухого молока. В качестве закваски для йогурта используют смесь термофильного стрептококка и болгарской палочки. - Ряженка. Чтобы получить ряженку; сначала производят топление молока повышенной жирности (6-8%) при 92-950 С. После охлаждения вносят закваску молочнокислого стрептококка. - Варенец. Для получения варенца производят топление молока обычной жирности (3,2%) при 92-950 С. После охлаждения в молоко вносят закваску термофильного молочнокислого стрептококка и болгарскую палочку в соотношении к стрептококку от 1:4 до 1:10. Мезофильные и термофильные молочнокислые стрептококки. - Сметана пониженной жирности. Сметана пониженной жирности готовится с помощью специальных штаммов термофильных стрептококков, увеличивающих вязкость получаемого продукта. - Сметана пониженной жирности. Для выработки творога пониженной жирности применяют штаммы термофильных стрептококков, образующих невязкие сгустки. - Сметана пониженной жирности. Напитки жирности приготовляют с помощью заквасок из мезофильных и термофильных стрептококков, обладающих умеренной кислотообразующей способностью. Ацидофильные палочки и бифидобактерии. - Ацидофильное молоко. Ацидофильное молоко – продукт сквашивания пастеризованного молока чистыми культурами ацидофильных бактерий. - Ацидофилин. Вырабатывают из пастеризованного молока с помощью ацидофильной палочки, мезофильных молочнокислых стрептококков и симбиотической кефирной закваски в равных соотношениях. - Ацидофильная паста. Получают из ацидофильного молока, отпресовывая часть сыворотки в творожных сепараторах. 8.8. Квашение овощей Рассмотрим процесс квашения овощей на примере капусты. Главный принцип метода – создание благоприятных условий для молочнокислых бактерий и подавление бактерий гнилостных. Кочаны очищают от верхних листьев, вырезают кочерыжки, измельчают и перетирают с солью. Под слиянием концентрированного раствора соли происходит плазмолиз клеток с выделением сока, в которой попадают бактерии с листьев. 69 Брожение происходит в анаэробных условиях при температуре 20-210 С в течение нескольких дней. Вначале происходит бурное размножение гетероферментативных молочнокислых бактерий. Они образуют молочную кислоту в качестве основного продукта, а также уксусную кислоту, этиловый спирт, манит и углекислоту. Когда количество кислоты в капусте достигнет 0,7-1% начинается бурный рост гомоферментативных молочнокислых бактерий (Lactobacterium plantarum). Они сбраживают сахара с образованием молочной кислоты. По достижении 2%-ной кислотности гомоферментативные молочнокислые бактерии заканчивают размножение. Емкость с капустой переносят в прохладное место, где может продолжаться брожение за счет дрожжей рода Sacharomyces, придающих капусте специфической аромат. 8.9. Получение белка Основные компоненты пищи человека – белки, жиры, углеводы; из них наиболее дефицитны белки –2/3 населения земного шара страдает от недостатка белка в пище. Каждый тип белка как источник питания имеет 2 основные характеристики: перевариваемость и сбалансированность по аминокислотному составу (наличие незаменимых аминокислот). Идеальным является белок куриного яйца и казеин молока. Компромиссом может служить белок микробной массы. Разработана технология получения таких белков из отходов растениеводства. Из биомассы отдельных штаммов получают белок, Сбалансированный по аминокислотному составу и нуклеиновым компонентом. Принципиально новое направление – использование фотоавтотрофных и хемолитотрофных организмов, для которых источником углерода является углекислота. К ним относятся сине-зеленые водоросли рода Spirulina, получающие энергию света, и водородные бактерии, которым дает энергию реакция окисления водорода. Животные белки дороги и трудно перевариваются. У них иной, чем у человека, аминокислотный состав. Зачастую в животных белках нет нужных аминокислот. В растительных белках нет семи незаменимых аминокислот, без которых не могут строиться белки человека (лизин, триптофан, метионин, цистеин, Валин, лейцин и изолейцин), особенно дефицитен лизин. Дрожжевой белок дешев, так как получается из отходов пищевых производств, он богат лизином и треонином. Его целесообразно использовать с белками зерновых культур, особенно бобовых. Недостаток дрожжевого белка – высокий уровень нуклеиновых кислот, трудно выводимых из организма. Поэтому для применения в рационе человека требуется специальные процессы разрушения и денуклеотизации. 70 8.10. Получение аминокислот, органических кислот и витаминов Аминокислоты. Все более ухудшающиеся экологические условия создают для населения планеты новую тяжелую проблему – выживание. Одновременно к этой проблеме добавляются такие факторы, как бедность, плохое питание, неуверенность в завтрашнем дне, стрессы. Хорошо изучено благоприятное действие аминокислотных смесей на иммунную систему и различные органы. Помимо этого аминокислоты заменяют насыщенные белком пищевые продукты, недоступные для большинства населения низкоразвитых стран. Таким образом, аминокислоты становятся в настоящее время одним из важнейших факторов выживания населения Земли. Все 20 аминокислот хорошо изучены (методы их синтеза давно подробно описаны) и являются составными элементами белков или мономерами для построения природных полипептидов. Известно также, что эти соединения существуют в виде оптических изомеров. При этом надо отметить, что аминокислоты в белках находятся в L- и D-формах (Ь,0стереоизомеры), причем биологически активны в основном L-формы, а Dстереоизомеры могут быть даже токсичными. Все аминокислоты делятся на незаменимые и заменимые, в зависимости от того, синтезируются они в организме человека или нет. Их можно получить как из природных продуктов (главным образом, при гидролизе белков растения), так и путем химического, микробиологического или ферментативного синтеза. Химический анализ дает продукты, которые требуют дальнейшей обработки; микробиологический и ферментативный синтезы позволяют получить оптические чистые аминокислоты. Приблизительно половина из 20 аминокислот являются незаменимыми, а остальные, соответственно, заменимыми. Незаменимые аминокислоты имеют широкий спектр применения как в сельском хозяйстве (кормовые балансирующие добавки), так в пищевой (биологически активные добавки) и медицинской (лекарственные препараты и смеси для парентерального питания) промышленности. В сельском хозяйстве аминокислоты используются для балансировки кормов по аминокислотному составу, чтобы в организм животных и птиц они поступали в том соотношении, в каком они находятся в белках этих животных и птиц. Введение аминокислот в корма обеспечивает максимальную скорость синтеза белка и, соответственно, рост биомассы животного. Это очень важно в случае «скороспелого» животноводства, свиноводства и птицеводства. В питательные продукты для человека также можно добавлять незаменимые аминокислоты. Это целесообразно делать или по медицинским показаниям, или в силу каких-либо соображений, когда человек питается только растительной пищей (растительными белками). Эту пищу можно 71 оптимизировать и улучшить ее питательные свойства, сбалансировав ее по аминокислотному составу путем добавления туда лизина, треонина, метионина (например, в пищу для вегетарианцев). Кроме того, что аминокислоты имеют огромное значение для нашей пищи, они также широко используются и в традиционной клинической практике. Аминокислоты получили широкое применение в парфюмерной и фармацевтической промышленности, в пищевой – в качестве усилителей вкуса (глицин добавляют как подсластитель, натриевая соль глутаминовой кислоты имеет мясной вкус), они используются как пищевые добавки для обогащения растительных белков (лизин, треонин, триптофан). В настоящее время аминокислоты получают методами: • биологическим (применение гидролиза белоксодержащих субстратов); • химическим (тонкий органический синтез); • химико-энзиматическим (энзиматическая трансформация химически синтезированных предшественников аминокислот с образованием биологически активных L-изомеров); • микробиологическим (получение L-аминокислот). Древнейший способ получения аминокислот — кислотный, щелочной или ферментативный гидролиз белоксодержащих субстратов (мясо, молоко и т.д.). При высокой температуре белок расщепляется на соответствующие аминокислоты или фрагменты, состоящие из нескольких аминокислот. При этом образуется смесь аминокислот и пептидов. Извлечение из этой смеси какой-либо определенной аминокислоты — довольно сложная, но, тем не менее, выполнимая задача. Само по себе сырье (мясо и белок молока — казеин) — дорогостоящий продукт, и этот метод применяется, когда имеют дело с «бросовым» сырьем, т.е. с отходами производства (таким сырьем являются рога, копыта, волосы, перья и пух, состоящие из кератина, в котором содержится очень много серосодержащей кислоты цистеина, и – в небольших количествах — других аминокислот). Следующий способ получения чистых аминокислот – химический синтез. Их синтезируют подобно другим органическим кислотам, это не сложно. Однако в процессе химического синтеза получается смесь D- и Lстереоизомеров (иногда получается и большее количество изомеров), а, как известно, в белках человека биологически активны только L-стереоизомеры аминокислот, поэтому существуют трудности разделения этих изомеров. Кроме того, химическое производство аминокислот, как правило, связано с использованием дорогостоящего оборудования и нередко агрессивных токсических соединений в качестве исходного сырья. Процесс протекает при высокой температуре, требует дорогостоящих катализаторов и как всякое химическое производство сопровождается образованием побочных продуктов, загрязняет окружающую среду, небезопасно и небезвредно для обслуживающего персонала. 72 Тем не менее, некоторые аминокислоты получают химическим синтезом, например глицин, а также D-, L-метионин, D-изомер которого малотоксичен, поэтому медицинский препарат на основе метионина содержит D- и L-формы, хотя за рубежом в медицине используется препарат, содержащий только L-форму метионина. Там рацемическую смесь метионина разделяют биоконверсией D-формы в L-форму под влиянием специальных ферментов живых клеток микроорганизмов. Следующий способ получения аминокислот — химикоэнзиматический. Как видно из названия, этот метод получения аминокислот предполагает два этапа. Сначала химическим методом синтезируется «предшественник» — соответствующая карбоновая кислота, а затем эта карбоновая кислота (обычно в присутствии аммиака) превращается в соответствующую аминокислоту. Эта биотрансформация (биоконверсия) осуществляется ферментами живых клеток. Причем полученные Lстереоизомеры аминокислот сами по себе необходимы для жизнедеятельности этих клеток, т.е. фактически этот способ наполовину биотехнологический. Таким методом получают, например, аспарагиновую кислоту (на основе фумаровой кислоты). Раствор фумаровой кислоты пропускают через колонки, в которых иммобилизованы или ферменты, или клетки микроорганизмов с высокой активностью аспартазы, например, Escherichia coli или Serratia marcesceus; туда же подается аммиак и осуществляется биотрансформация. Химико-энзиматически можно производить практически все аминокислоты, однако из-за дороговизны и сложности получения соответствующих органических кислот-предшественников этот метод не всегда экономически выгоден и в большинстве случаев уступает методу прямого микробиологического синтеза. Четвертый способ получения аминокислот — их прямой микробиологический синтез — целиком основан на использовании биообъектов (т.е. является полностью биотехнологическим). В качестве биообъектов в нем применяются штаммы-продуценты аминокислот. Этим методом аминокислоты чаще всего получают на основе Escherichia coli (кишечная палочка — симбионт человека), Bacillus subtilis (сенная палочка — почвенный микроорганизм) и Corynebacterium glutamicum (почвенный микроорганизм). Для получения аминокислот, органических кислот, ферментов, биологически активных веществ биотехологическими способами используют ауксотрофные мутанты, т.е. штаммы, приобретшие способность к сверхсинтезу нужных нам веществ. Это происходит за счет потери способности синтезировать другие необходимые соединения, которые приходится добавлять в питательную среду. Бактерии для производства аминокислот стали использовать с начала 50-х годов ХХ века. Их штаммы улучшали генетическими методами, выделяя 73 ауксотрофные мутанты и мутанты с измененными регуляторными свойствами. В основе большинства производственных процессов при получении аминокислот лежит регулирование условий среды (изменение концентрации субстрата, рН, ионов металлов, органических добавок), что приводит к синтезу избыточных количеств необходимого продукта. Все эти микроорганизмы на сегодняшний день прекрасно изучены. Известна полная нуклеотидная последовательность всего их генома. Для кишечной палочки разработаны многообразные способы генетического обмена, позволяющие легко комбинировать разные гены и изменять процесс метаболизма. В меньшей степени это относится к Bacillus subtilis, и еще в меньшей степени к Corynebacterium glutamicum. Использование этих микроорганизмов для получения аминокислот основано на их способности самостоятельно синтезировать все 20 аминокислот. Также они являются гетеротрофными бактериями, которые в качестве источника углерода используют органические соединения (углевод или какую-нибудь органическую кислоту), а все остальные компоненты получают из неорганических соединений. Применение микроорганизмов гетеротрофов позволяет существенно сократить по времени процесс ферментации. Так, кишечная палочка в богатой питательной среде делится каждые 20-30 мин, коринебактерии – каждый час. В бедных средах – время регенерации в два раза больше (1 ч для кишечной палочки, 1,5-2 ч для коринебактерии и сенной палочки). Вместе с тем существуют бактерии, так называемые ауксотрофные мутанты — микроорганизмы, которые, с одной стороны, утратили способность самостоятельно синтезировать необходимые для построения всех компонентов своей клетки разные аминокислоты, а с другой – приобрели способность к сверхсинтезу целевой аминокислоты. Такие мутанты получают либо воздействием различных мутагенов физической и химической природы на исходную культуру микроорганизма с последующей селекцией штамма по заранее заданным признакам, либо методами генной инженерии. Так для производства глутамата из гидролизата крахмала, мелассы из сахарного тростника и свеклы используют Corynebacterium и Brewibacterium. Через 48-52 часа после начала культивирования в среде накапливается глутаминовая кислота, которую осаждают известковым молоком и отделяют на ионно-обменных смолах. Из всех аминокислот, вырабатываемых промышленным способом, наибольший объем приходится на глутамат натрия – около 150000 т ежегодное мировое производство. Ежегодное производство другой аминокислоты лизина – 15000 т. Основная роль в производстве этих аминокислот принадлежит японским фирмам. Для получения лизина используют мутанты микрококков, не способные синтезировать серин, но способные к сверхсинтезу лизина. 74 Процесс идет при непрерывном культивировании с периодической подачей питательного раствора. Перечень препаратов на основе аминокислот и их комплексов постоянно растет и расширяется. Очень хорошую перспективу для успешного развития имеют препараты для парентерального пита¬ния, содержащие комплексы аминокислот. Они назначаются, когда питание «естественным» образом противопоказано, так как стимулирует секрецию пищеварительных желез. Например, при остром панкреатите человек не должен ни пить, ни есть, поскольку любая стимуляция секреции может привести к самоперевариванию поджелудочной железы. Тенденция сегодняшнего дня — использование препаратов, содержащих весь комплекс аминокислот (или, по меньшей мере, 18 из них), т.е. в оптимальном для человеческого организма соотношении. В основном это импортные препараты: аминоплазмаль, кетостерил, валин (Германия); аминостерил КЕ (Финляндия); аминосол (Югославия). Некоторые из этих препаратов помимо аминокислот содержат также глюкозу и витамины. Соотношение аминокислот в них оптимальное. В организме человека в зависимости от возраста синтезируются белки соответствующего состава, например аминокислотный состав этих препаратов для детей приближается к составу грудного молока матери, для взрослых он несколько иной. Производство органических кислот можно отнести к числу давних биотехнологических процессов. В 1893 году было налажено производство лимонной кислоты методом ферментации углеводов при участии грибов. В настоящее время в промышленном производстве лимонной кислоты в основном используются Aspergillus niger и Aspergillus wenti. В конце 19 века началось промышленное производство молочной кислоты при участии молочно-кислых бактерий рода Lactobacillus. В качестве исходного сырья используются продукты, содержащие крахмал, сахарозу или молочную сыворотку. Молочную кислоту применяют в пищевой промышленности, в дубильной – для декальцификации кож; а также при производстве пластмасс и в медицине. Кроме лимонной и молочной кислот аналогичными способами производят и другие органические кислоты – яблочную, салициловую, итаконовую (эта кислота идет на производство пластмасс и красителей). Большинство органических кислот, вырабатываемых с помощью микроорганизмов, являются продуктом переработки пищевого сырья, однако в ряде случаев в качестве исходного продукта используют такие вещества, как нафталин (для производства салициловой кислоты), н-парафины (описан способ получения яблочной кислоты при помощи дрожжей из н-парафинов). Для получения рибофлавина используется культура Eremothecium ashbuii (Эримотециум Эшби). Среда должна содержать пониженное количество углеводов и повышенное количество пептона, а также тиамин, биотин, инозит и 5 аминокислот (лейцин, аргинин, метионин, гистидин, 75 тирозин). Рибофлавин накапливается на второй-третий день в виде желтых кристаллов в клетке и после автолиза клеток (на четвертый-пятый день) переходит в раствор. 8.11. Получение новых промышленных биоматериалов с использованием микроорганизмов Биополимеры – это высокомолекулярные соединения (например, нуклеиновые кислоты, полисахариды, липиды), синтезируемые разными организмами. Традиционно производство в промышленных масштабах агара из красных водорослей, альгинатов – из бурых. Эти полисахариды применяются в пищевой, фармацевтической, текстильной промышленности. В дополнение к этому производству разрабатываются и применяются технологии с использованием микроорганизмов. Синтез полимеров в одних случаях происходит вне бактериальной клетки, например, декстранов у Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus. Большая часть полисахаридов синтезируется внутри клетки. В настоящее время осуществляется промышленное производство таких микробных полисахаридов как ксантан, декстран, альгинаты, геллановая смола и др. продукты. Ксантан – первый микробный полисахарид, производимый в промышленных масштабах с 1967 года. Ксантан синтезируется микроорганизмами Xanthomonas campestris при росте на глюкозе, сахарозе, крахмале. Ксантан обладает высокой вязкостью при небольших концентрациях в широком диапазоне рН, на эти свойства не влияют температура и наличие солей. Это позволяет использовать данное вещество в качестве смазочного материала и при добыче нефти. В последнем случае ксантан необходим для повышения выхода нефти как агент, контролирующий вязкость жидкости при наличии поверхностно-активных веществ и углеводородов, закачиваемых в нефтеносные пласты. С 1969 года ксантан начали использовать в пищевой промышленности для улучшения вкусовых свойств консервированных и замороженных продуктов. Декстран в промышленном производстве получают выращиванием Leuconostoc mesenteroides, на сахарозе. Декстраны используют в медицине в качестве заменителя плазмы для увеличения объема крови; при лечении ожогов. Микробные альгинаты получают в промышленных масштабах, выращивая Azotobacter в условиях избытка углерода. Микробные альгинаты начинают вытеснять получаемые из морских водорослей (например, Laminaria spp.). Альгинаты в пищевой промышленности используют в качестве загустителей. 76 Геллановая камедь получается методом аэробной ферментации при участии Pseudomonas elodea. Геллан заменяет агар в микробиологии как компонент питательной среды. Предполагается такая замена и в пищевой промышленности. Главное: - Для получения органических кислот, аминокислот, ферментов, биологически активных веществ биотехологическими способами необходимо подобрать активные штаммы и условия культивирования, оптимальные для накопления данного вещества; активизировать ферменты, участвующие в его синтезе, и подавить ферменты, тормозящие процесс. Основные характеристики белка как источника питания – перевариваемость и сбалансированность по аминокислотному составу (наличие незаменимых аминокислот). Идеальным является белок куриного яйца и казеин молока. - Брожение – это процесс анаэробного расщепления органических веществ под влиянием микроорганизмов или выделенных ими ферментов. За счет брожения микроорганизмы получают энергию, необходимую им для роста. - При спиртовом брожении из одной молекулы глюкозы получается две молекулы спирта, две молекулы углекислоты и 117 джоулей энергии, запасаемой дрожжами. - При сквашивании овощей (капусты, огурцов, помидоров, яблок) первостепенным является создание благоприятных условий для развития молочнокислых бактерий и подавление гнилостных микроорганизмов. - Молочнокислые бактерии, содержащиеся в кисломолочных продуктах, создают в кишечнике кислую среду, препятствуя развитию гнилостных бактерий. - Особенности разных молочных продуктов определяются различными микроорганизмами, участвующими в сбраживании молока. Контрольные вопросы 1. Биотехнология и пищевая промышленность. 2. Совершенствование путей переработки сельскохозяйственных продуктов. 3. Новые разновидности пищевых продуктов. 4. Охарактеризуйте биологический метод получения аминокислот. 5. Охарактеризуйте химический метод получения аминокислот. 6. Охарактеризуйте химико-энзиматический метод получения аминокислот. 7. Охарактеризуйте микробиологический метод получения аминокислот. 5. Получение витаминов в биотехнологическом процессе. 77 6. Биотехнологическое производство органических кислот. 7. Какие микроорганизмы являются продуцентами лимонной кислоты? 8. Какие микроорганизмы являются продуцентами молочной кислоты? 9. Какие микроорганизмы являются продуцентами биополимеров (ксантана, декстрана и т.д.)? 10. Где применяются биополимеры (ксантан, декстран и т.д.)? 78 Раздел 9 БИОТЕХНОЛОГИЯ В ЭНЕРГЕТИКЕ 9.1. Введение в биотехнологическую энергетику Необходимость разработки новых и эффективных способов производства энергетических носителей и восполнения сырьевых ресурсов стала особенно актуальной в последние два десятилетия из-за острого дефицита сырья и энергии в глобальном масштабе и повышения требований к экологической безопасности технологий. В этой связи стало интенсивно развиваться новое направление биотехнологии – биоэнергетика, разрабатывающая эффективные и экологически безопасные технологии получения и преобразования энергии. За историю развития человеческого общества потребление энергии в расчете на одного человека возросло более чем в 100 раз. Через каждые 10-15 лет мировой уровень потребления энергии практически удваивается. В то же время запасы традиционных источников энергии: нефти, угля, газа истощаются. Кроме того, сжигание ископаемых видов топлива приводит ко все нарастающему загрязнению окружающей среды. Неиссякаемым источником энергии на Земле является Солнце. Каждый год на поверхности Земли с Солнца поступает 3х1024 Дж энергии. В то же время разведанные запасы нефти, угля, природного газа и урана, согласно оценкам, эквиваленты 2,5х1022 Дж. Иными словами, менее чем за одну неделю Земля получит от Солнца столько энергии, сколько ее содержится во всех земных запасах. Ежегодно в процессе фотосинтеза образуется свыше 170 млрд. тонн сухого вещества, а количество энергии, связанной в нем, более чем в 20 раз превышает сегодняшнее годовое энергопотребление. Растительный покров Земли содержит свыше 1 800 млрд. тонн сухого вещества, образованного в процессе фотосинтеза лесными, травяными и сельскохозяйственными экосистемами. Существенная часть энергетического потенциала биомассы потребляется человеком. Для сухого вещества простейшим способом превращения биомассы в энергию является сжигание, в процессы которого выделяется тепло, преобразуемое далее в механическую или электрическую энергию. Сырая биомасса также может быть преобразована в энергию в процессе биометаногенеза. Принципиально возможно освоение солнечной энергии, падающей на поверхности морей и океанов. При этом в первичном процессе преобразование солнечной энергии происходит за счет синтеза биомассы фитопланктона; вторичный процесс представляет собой конверсию биомассы в метан и метанол. Научные и специальные аналитические исследования последнего десятилетия приводят к выводу, что наиболее эффективнее и перспективнее методы крупномасштабного (промышленного) преобразования солнечной энергии основаны на использовании биосистем. 79 Среди этих методов – достаточно хорошо освоенные биологические технологии превращения биомассы в энергоносители в процессе производства спирта. Растения накапливают солнечную энергию в процессе фотосинтеза, и люди пытаются использовать этот природный источник энергии. Принципиально новые разработки ориентированы на модификацию и повышение эффективности фотосинтеза, создание биотопливных элементов, получение фотопровода, биоэлектокатализ. Традиционные биотехнологии дают также возможность повышения нефтеотдачи, улучшения качества угля за счет десульфуризации. Разрабатываются также метода получения углеводородов непосредственно их микроорганизмов и водорослей. 9.2. Получение спирта Замена дефицитного бензина иными видами топлива является актуальной проблемой современности. Особенно остро вопрос стоит в странах Америки и Западной Европы. Использование этанола в чистом виде или в смеси с бензином (газохол) снижает загрязнение окружающей среды, поскольку при его сгорании образуется лишь углекислота и вода. Спиртовой брожение – самая старая отрасль биотехнологии – имеет готовые технологические системы и развитую промышленную базу. Этанол является ценным сырьем для химической промышленности. Сырье. Сырьем для процессов спиртового брожения могут быть разнообразные биомассы, имеющие в своем составе шести - и пятиуглеродные сахара в виде мономеров. Сахаросодержащим материалами являются сахарная свекла, кормовая патока, отходы сахарного тростника. Моносахариды, такие как глюкоза, сахароза и некоторые другие, содержащие в тростниковой или свекловичной мелассе, легко вовлекаются в реакции спиртового брожения, не требуя сложной обработки и подготовительных операций. Для регионов с умеренным климатом, обладающих большими массивами лесов, желательно использование древесных отходов. Помимо отходов лесопиления и деревообработки можно использовать также солому, торф, тростник. Использование древесины в качестве сырья для производства этанола требует ее предварительной подготовки, включающей механическое разрушение содержащегося в ней лигнинцеллюлозного комплекса, гидролиз сравнительно легко гидролизуемой фракции целлюлозы. Сырьем для процессов спиртового брожения могут быть биомассы, имеющие в своем составе сахара в виде полимеров, включая крахмалсодержащие (зерно, картофель). Эти полимерные соединения 80 требуют предварительного гидролиза до мономеров. В настоящее время более широкое признание получил ферментативный гиролиз крахмала. С этой целью используются такие гидролитические ферменты, как α- и βамилазы, поллуланазы как в иммобилизованном, так и в свободном состоянии, а также в сочетании друг с другом. Сырьем для процессов спиртового брожения может быть биомасса специально выращенных или собранных пресноводных и морских растений и водорослей. Взаимосвязь ферментов, производимых различными организмами, подбор разлагающих культур очень важны для использования водорослей в качестве субстрата. Микроорганизмы. Традиционно для конверсии углеводов в этанол используются дрожжи, прежде всего родов: Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Kluyveromyces. Для биотехнологических целей выведена раса дрожжей Saccharomyces cerevisia ХII, жизнедеятельность которой продолжается, даже когда объемная доля этанола в культуральной жидкости достигает 10-11%. Промышленность осваивает и другие виды дрожжей родов: Schizosaccharomyces, Candida, Kluyveromyces, которые могут использовать субстраты, не характерные для дрожжей рода Saccharomyces, например ксилозу (Candida). Мезофильные бактерии рода Zumomonas (Zumomonas mobilis и Z. anaerobica) (topt 30-400) обладают в несколько раз более интенсивным метаболизмом, чем дрожжи. Характерная черта бактерий рода Zumomonas состоит в том, что они способны перерабатывать в этанол и углекислый газ не только гексозы, но и другие сахара. Выход этанола при этом увеличивается в 1,5-2 раза. Эти бактерии также сбраживают глюкозу, фруктозу и сахарозу с большей скоростью, чем дрожжи, и в отличие от дрожжей способны длительно расти анаэробно. Группа термофильных этанолообразующих бактерий – Clostridium thermocellum, Cl. thermohydrosulphuricum, Thermoanaerobacter ethanolicus (topt 60-650) – отличает рядом особенностей. Имеющиеся в ней микроорганизмы с целлюлозолитической активностью способны трансформировать растительные углеводные полимеры прямо в этанол. Бактерии этой группы расщепляют целлюлозу и гемицеллюлозу, так что отпадает необходимость предварительного разложения целлюлозы. Они способны сбраживать субстраты с высокой скоростью, устойчивы к нагреванию, которое увеличивает летучесть этанола (облегчая его отгонку из ферментера) и повышает растворимость субстратов. Наконец, они обладают самой большой скоростью роста из пока известных микробов, разлагающих целлюлозу. 9.3. Промышленное получение спирта 81 При периодическом процессе свежевыращенные организмы вносят в субстрат для сбраживания. После завершения сбраживания субстрата клетки продуцента отделяют и для нового цикла получают, свежую порцию посевного материала. Недостаток процесса – высокая стоимость. Использование бактерий Zymomonas mobilis повышает продуктивность и экономический выход. Перспективно применение биореакторов с клетками продуцентов, иммобилизованными на различных носителях, (алюминиевые шарики, пористые керамические носители, полимеры, полые волокна). Это позволяет повысить концентрацию клеток в биореакторе для ускорения биоконверсии субстрата с повышением выхода этанола. Снижается ингибирующее действие этанола на продуцент, и расширяется устойчивость к изменениям температуры, кислотности и других факторам среды. При использовании этанола для улучшения качества бензина необходимо его обезвоживание. В вакуумных реакторах культивирование микроорганизмов и дистилляцию этанола проводят при пониженном давлении, в этом случае этанол кипит при низких температурах, допускающих рост клеток. Кроме того, обезвоживание спирта может достигаться добавлением растворителя. При получении газохола в качестве экстрагента этанола применяют непосредственно бензин. Обезвоживание спирта может быть достигнуто применением сжиженных газов, например углекислоты. При завершении процесса брожения концентрация спирта в бражке составляет 6-12%. Дистилляция дает водно-этанольную смесь с содержанием 96% этанола. Эту смесь можно использовать в качестве топлива для двигателей внутреннего сгорания. Широко используемые в настоящее время биореакторы имеют в своем составе систему отделения биомассы от культуральной жидкости или отделения и очистки этанола, в первую очередь на основе применения мембранной микрофильтрации, ультрафильтрации или диализа. Чем выше конечная концентрация спирта, тем менее энергоемка стадия перегонки. Так, при 5%-ной концентрации спирта траты пара для получения 96%-го спирта составляют свыше 4 кг/л; при содержании спирта в бражке около 10% эта величина снижается до 2,25 кг/л. - Из одной тонны древесины получается 170-180 л этанола и 40 кг биомассы дрожжей - Из одной тонны зерна ржи получается 270 л этилового спирта - Из одной тонны картофеля можно произвести 100 л этилового спирта - Углекислый газ используют в жидком (газирование напитков) или твердом (сухой лед) видах - Биомасса дрожжей в дальнейшем используется для комбикормов - Сивушные масла в дальнейшем используются в химической индустрии. 82 9.4. Биометаногенез Метаногенез – один из древнейших процессов, производимый бактериями с Архея до наших дней. Такие бактерии называют архебактериями и оценивают их возраст в 3.0 -3.5 млрд. лет. Архебактерии отличаются от прокариотических микроорганизмов отсутствием муреина в клеточной стенке, специфическим нуклеотидной последовательностью рибосомальной РНК, наличием специфических компонентов метаболизма. Биометаногенез или метановой брожение – давно известный процесс превращения биомассы в энергетически ценный материал (метан). Открыт данный процесс в 1776 г. А. Вольтой, который установил наличие метана в болотном газе. Сырье для производства биогаза: различная растительная биомасса, несъедобные части сельскохозяйственных растений - отходы древесины сырье с высоким содержанием целлюлозы, трудно поддающиеся методам переработки, эффективно сбраживается и трансформируется в биогаз - отходы перерабатывающей промышленности - специально выращенные культуры, такие как водяной гиацинт, гигантские бурые водоросли - жидкие отходы сельскохозяйственных ферм - промышленные и бытовые стоки и ил очистных сооружений - мусор городских свалок Метаногенез – I фаза. В производстве биогаза как нигде в других производствах, важны не отдельные чистые виды микроорганизмов, а их косорции. Они обладают более высокой биодеградационной активностью, чем отдельные виды и штаммы микроорганизмов. Именно состав микроорганизмов в консорции определяет эффективность разложения тих или иных видов сырья. Первая стадия метанового брожения – кислотная – осуществляется различными микроорганизмами, способными к спиртовому, маслянокислому, пропионовому, ацетонобутиловому и другим видам брожения (энтеробактерии, клостридии, стрептококки, лактобациллы). Активную роль в деструкции органической массы играют целлюлозоразрушающие микроорганизмы. От их наличия и активности зависит разложение наиболее трудноразлагаемых компонентов сырья. В превращении органических кислот в уксусную кислоту важную роль играют ацетогены – специализированная группа анаэробных бактерий. Это, прежде всего клостридии, в частности Clostridium thermoaceticum. Они превращают органические кислоты в уксусную кислоту, водород и окислы 83 углерода. Ацетогенная стадия процесса наиболее тесно связана со второй основной фазой образования биогаза – уже собственно с образованием метана. Установлено, что некоторые метаногенные бактерии при понижении концентрации водорода в среде до определенного уровня перестраиваются на ацетоногенный метаболизм. Метаногенез II фаза. Метаногены широко распространены и активно участвуют в деструкции органических веществ с образованием биогаза в анаэробных зонах: в морских осадах, болотах, речных и озерных илах. Все известные метанобразующие бактерии могут получать энергию в результате окисления водорода, восстанавливая углекислоту до метана являются автотрофами и используют для роста только смесь водорода и углекислоты, другие, являясь гетеротрофами, используют муравьиную и уксусную кислоты, а также метанол и метиламины. 4 СН3ОН ––> 3СН4+СО2+2Н2О 4НСООН ––> СН4+3СО2+2Н2О Метаногены – облигатные анаэробы, среди которых имеются галлофилы, мезофиллы, и термофилы. Некоторые из них способны к росту в соленых водоемах и даже в насыщенном растворе соли. Развиваются они в кислой среде при температуре от 4 до 970 и даже до 2500С. 9.5. Промышленное получение биогаза Процессы биометаногенеза применяются в промышленности для получения биогаза – заменителя природного газа. Метаногенный консорциум, применяемый в промышленности, несмотря на сложность своего состава, обладает достаточно надежной авторегуляцией, дающей эффективные результаты при получении биогаза. Метанотенк простейшей конструкции Простейшей конструкцией метанотенка является обычная бродильная яма в грунте с фиксированным объемом газа. Очень важно обеспечить достаточное, но слабое перемешивание. Обычно время сбраживания отходов составляет около 5-14 суток. Растительные отходы перерабатываются дольше (20 суток и более) Аппараты второго поколения Аппараты второго поколения (для разбавленных субстратов) имеют конструкцию, обеспечивающую высокий выход биогаза (до 4-5 м3 в сутки на 1 м3 объема реактора) за счет почти полной (90-95%) биоконверсии отходов – в основном пищевой и микробиологической промышленности. Работа при повышенных температурах требует затрат энергии для начального прогрева 84 биореактора во время его запуска, но скорость процесса в 2-3 раза выше по сравнению с мезофильными условиями. Двухстадийная установка В двухстадийных установках разделены стадии метаногенеза. В первом аппарате происходит процесс анаэробного разложения органики с образованием кислот, окислов углерода и водорода (кислотная стадия). Полученная бражка поступает во второй аппарат, в котором происходит процесс образования метана. В такой системе можно независимо варьировать условия ферментации (скорость протока рН, температуру) в каждом аппарате с учетом создания оптимальных условий для развития микроорганизмовдеструкторов в первом и метаногенов во втором. Применение такой биосистемы позволяет интенсифицировать процесс в 2-3 раза. 80% метана 16% СО2 5% азот,водород,этан,пропан, сероводород Рис. 10. Состав биогаза Состав газа меняется в зависимости от состава исходного сырья и условий протекания процесса в биореакторе. Основным компонентом биогаза является метан (80-85%). Помимо метана биогаз содержит СО2 (1520%) и небольшие количества азота, водорода и других газов. Примеси водорода, этана, этилена и пропана улучшают топливные характеристики биогаза, в то время как присутствие сероводорода и SO4 снижают его качество. Неочищенный биогаз используют как заменитель природного газа в быту для обогрева жилищ и приготовления пищи; в качестве топлива в 85 стационарных установках, вырабатывающих электроэнергию. После преварительной очистки его применяют как горючее для двигателей внутреннего сгорания. Рис. 11. Биогазовая установка Использование газа Метанобразующие бактерии превращают в метан до 90-95% используемого углерода и только около 5-10% включают в образование биомассы. Благодаря этому до 80-90% исходной органической массы, перерабатываемой в процессах сбраживания и метаногенеза, превращается в биогаз. Из 1 кг отходов можно получить до 1 л биогаза за сутки. При утилизации и переработке навоза сельскохозяйственных ферм можно полностью обеспечить потребности в энергии комплекса из 30 голов крупного рогатого скота или 500 свиней, а анаэробная переработка навоза от 4090 голов крупного рогатого скота позволяет обеспечить топливом поселок из 300 небольших домов. Использование твердого остатка Образующийся в процессах мутаногенеза жидкий или твердый шлам вывозится на поля и используется в качестве удобрений, так как при термофильном процессе патогенные энтеробактерии, энтеровирусы, а также паразитарные популяции практически полностью погибают. Твердый остаток процесса может быть использован также в качестве исходного сырья для 86 получения ряда биологически активных соединений химического гидролиза или микробиологического синтеза. в процессах 9.6. Повышение нефтеотдачи Нефть – это смесь органических веществ. Состав ее сильно различается в разных скважинах и в процессе эксплуатации скважины. Более легкие фракции добываются в начале разработки месторождения, потом остаются более тяжелые, и добыча нефти замедляется. Для «облегчения» состава нефти предлагали вводить в нее консорцию микроорганизмов, разлагающих тяжелые фракции. К таким микроорганизмам относятся артробактерии, псевдомонады, иногда дрожи (Candida) и близкие им организмы. 9.7. Десульфуризация углей Сера в углях присутствует как в виде пирита, так и в виде сложных ароматических соединений. При сгорании сернистых углей в атмосферу выбрасываются ядовитые вещества. Это становится причиной кислотных дождей. В связи с использованием в промышленности тонкоизмельченного угля возникла возможность удалить серу, как экологически вредную примесь, путем окисления FeS2 бактериями. При измельчении руда обрабатывается водным раствором, содержащим культуру Aciditiobacillus ferroxidans, при рН 1-2 в течение 5-8 суток. Клетки окисляют железо и серу, как уже было показано раньше, и переводят их в подвижное (растворимое) состояние. С помощью A. ferroxidans из углей за 5-8 суток извлекается до 97% пиритной серы. Очищенные от серы угли экологически менее вредны, т.к. при сгорании не образуются оксиды серы. Поэтому они имеют более широкий спектр применения. Для извлечения серы, содержащейся в органических соединения, делаются попытки использовать гетеротрофные бактерии и мицелиальные (низшие) грибы. 9.8. Жидкие углеводороды В водоемах с пресной и солоноватой водой в умеренных и тропических широтах обитает гигантская одноклеточная водоросль Botriococcus bruanii. Зеленая водоросль может содержать от 15-75% углеводородов. Водоросль Botriococcus bruanii, как оказалось, достаточно широко распространена в природе, встречается в самых разных местах: от солоноватых озер Австралии до водохранилищ в окрестностях Лондона. Обнаруженные в прошлом Австралии высохшие остатки этой водоросли под названием «коорнангит» явились даже поводом для возникновения 87 своеобразной «нефтяной лихорадки». Сходные породы (остатки углеводород – продуцирующей водоросли) время от времени обнаруживает в различных частях света – в районе оз. Мозамбик в Африке, в Казахстане в районе оз. Балхаш («балхашит»). Водоросль Botriococcus braunii встречается в двух разновидностях – красная и зеленая, потому что ее хлоропласты имеют различную окраску, обусловленную наличием пигментов в виде хлорофиллов всех типов, а также каратинов и их окисленных производных. В составе клеточной оболочки водоросли – помимо жира, белков, углеводов и внутреннего целлюлозного слоя – обнаружен слой, состоящий, состоящий из окисленных полимеров каротинов и каротиноидных веществ. В неблагоприятных условиях роста, например при дефиците ионов магния, в среде, концентрации углеводородов в клеточной стенке достигает 70-75%. Эти углеводороды, «ботриококкцены», накапливаются водорослью в клеточной стенке в процессе роста. Зеленая водоросль синтезирует линейные углеводороды с нечетным числом углеводородных атомов в цепи (С25-С31) бедна ненасыщенными связями. Красная разновидность синтезирует линейные углеводороды с четным числом углеводородных атомов в цепи (С34-С38) с несколькими ненасыщенными связями. Извлечь углеводороды без разрушения клеток можно центрифугированием биомассы водоросли, в ходе которого углеводороды «вытекают» из клеток. Используют эти углеводороды в фармацевтической промышленности. Клетки модно вновь поместить в среду, где созданы условия для аккумуляции углеводородов. В водоемах с пресной и солоноватой водой в умеренных и тропических широтах обитает гигантская одноклеточная зеленая водоросль Botriococcus braunii. Она может содержать от 15 дл 75% углеводородов. 9.9. Биологическое получение водорода Водород рассматривается в качестве главного энергоносителя будущего, в ряде отношений превосходящего основные современные энергоносители – нефть и природный газ. По прогнозам экспертов, энергетическая система будущего столетия будет «водородной», то есть основанной на применении двух энергоносителей – электричества и водорода, наиболее удобного для использования на транспорте и в промышленных технологиях. Преимущества водорода как источника энергии: - теплотворная способность водорода достаточно высока – в 2.8 раза выше бензина - водород легко транспортируется и аккумулируется в различных фазовых состояниях - в газообразном состоянии водород не токсичен 88 - экологическая чистота: водород сгорает без дыма и копоти, единственным продуктом его сгорания является вода. Особо перспективным представляется получение водорода с использованием солнечной энергии, в том числе из воды, которая является наиболее дешевым и доступным субстратом. Запасы воды в мировом океане составляют 1,3Х1018 т. То есть весьма значительны. Разработки последних лет представлены различными биосистемами, включающими хлоропласты растений, ферредоксин и бактериальные гидрогеназы. Хлоропласты шпината и бактериальные структуры, содержащие гидрогеназы и ферредоксин в качестве переносчика электронов, способны образовывать водород после облучения видимым светом. При этом вода – субстрат фотолиза – присутствует в избытке, то есть исходное сырье не лимитировано. Источник энергии – в данном случае это солнечный свет – также неограничен. Хлоропласты, выделенные из шпината, в присутствие ферредоксина, как искусственного переносчика элетронов и бактериального экстракта, содержащего фермент гидрогеназу, способны продуцировать водород. В смеси с хлоропластами гидрогеназы хемоавтотрофных водородоокисляющих бактерий катализируют протекание процесса образования водорода длительное время, если используется в качестве низкомолекулярного переносчика электронов медиатор. При этом стабильность процесса зависит, главным образом, от состояния хлоропластов. В принципе любая растительная фотосистема, использующая гидрогеназы, способна продуцировать водород. Целью исследований является разработка искусственных систем, действующих по схеме естественных водорослевых или бактериально-растительных систем. Перспективное и разрабатываемое в настоящее время направление – это получение водорода на основе растущих микробных популяций хемосинтезурующих организмов. Среди хемотрофных микроорганизмов в качестве продуцентов водорода привлекают внимание виды, способные расти на достаточно доступных и дешевых субстратах. Например, культура клостридий Cl. perfringens, сбраживая различную органику, способна продуцировать и десятилитровом аппарате до 23 л водорода в час. Создание крупномасштабной системе на такой основе не должно представлять затруднений, поскольку уже разработаны и внедрены в промышленность процессы получения ацето-бутилового брожения с использованием клостридий. Более перспективными продуцентами водорода являются фототрофные микроорганизмами, так как образование ими водорода связано с процессами поглощения энергии света с процессами поглощения энергии света и может повысить эффективность использования солнечной радиации. С наибольшей скоростью водород выделяют некоторые пурпурные бактерии. В качестве 89 субстратов пурпурные бактерии используют различные органические соединения, которые они разлагают с образованием углекислоты и водорода. Например, при разложении 1 г лактата пурпурные бактерии образуют до 1 350 л водорода. При этом бактерии поглощают красные и инфракрасные лучи, которые не используются никакими другими фотосинтезирующими организмами. Важным обстоятельством является способность пурпурных бактерий продуцировать водород при использовании не только органических соединений, но также тиосульфта и других восстановленных соединений серы. В качестве субстрата возможно применение некоторых отходов, включая навоз. Эффективность продукции водорода при этом составляет до 50 кг водорода на 1 квадратный метр в год. Наиболее выгодным для микробиологического получения водорода является использование фототрофных организмов, способных к биофотолизу воды, то есть использующих воду в качестве донора электронов при фотосинтезе. Интересны в этом плане азотфиксирующие цианобактерии, способные выделять водород на свету в аэробных условиях с одновременным образованием кислорода. В культуре цианобактерии получено устойчивое выделение водорода со скоростью 30-40 мл водорода в час. Для получения фотоводорода разрабатыватся различные, в том числе и многокомпонентные, биосистемы, содержащие, например, лиофилизированные клетки цианобактерий и пурпурных бактерий, цианобактерий и водоросли и т.д. как двух компонентную видообразующую систему можно рассматривать систему бобовых растений, имеющих клубеньки с азотфиксирующими бактериями. К аналогичному симбиотическому сообществу можно отнести комплекс из водного папоротника Azolla и цианобактерии. Однако до практического применения таких биосистем еще достаточно далеко. 9.10. Биотопливные элементы и биоэлектрокатализе Перспективным методом превращения химической энергии топлива в электрическую энергию является создание топливных элементов, представляющих собой электрохимические генераторы тока. В основе процесса – происходящее на электродах электрохимические генераторы тока. В основе процесса – происходящее на электродах электрохимическое окисление топлива и восстановление окислителя (кислорода), при этом генерируется электрохимический потенциал, соответствующий свободный энергии процесса окисления водорода до воды: 2Н2⟶2Н++4 е О2+4Н++4е⟶2Н2О; Степень преобразования химической энергии в электрическую в топливных элементах высока – до 80%. Определенные перспективы обещают 90 применение, а конструкциях топливных элементов биологических систем – ферментов или микробных клеток. Весьма эффективны биотопливные элементы на основе анаэробных микроорганизмов, способных сбраживать огромное разнообразие соединений. В таком биотопливном элементе функционируют катод и биоанод, содержащий микробные клетки. Субстрат, выполняющий роль топлива, перерабатываются микроорганизмами в отсутствие кислорода. В этих системах возможно применение различных, в том числе доступных и недорогих, субстратов, включая промышленные и сельскохозяйственные отходы. Перенос электронов с топлива на электрод возможен с помощью иммобилизованных ферментов. Применение иммобилизованных ферментов вместо микробных клеток обещает сделать процессы трансформации энергии химических связей в электрическую энергию более выгодными. Примерами могут служить системы на основе окисления метанола в уксусную кислоту с участием алкогольдегирогеназы; муравьиной кислоты в углекислоту с участием формиатдегидрогиназы, глюкозы в глюконовую кислоту с участием глюкозооксидазы. Главное: - Один из путей решения глобальной проблемы биотрансформации продуктов фотосинтеза – получение этанола из растительной массы с помощью микробов. - Биометаногенез или метановое брожение – давно известный процесс превращения биомассы в энергетически ценный продукт (метан). - В производстве биогаза важны не отдельные чистые виды микроорганизмов, а их консорции. Они обладают более высокой способностью к биодеградации, чем отдельные виды и штаммы микроорганизмов. Именно состав микроорганизмов в консорции определяет эффективность разложения тех или иных видов сырья. - Процессы биометаногенеза применяются в промышленности для получения биогаза – заменителя природного газа. Метаногенный консорциум, применяемый в промышленности, несмотря на сложность своего состава, обладает достаточно надежной авторегуляцией, позволяющей эффективно использовать его при получении биогаза. - Активация микробиологической деятельности нефтяного пласта достигается введением в пласт аэрированной воды и небольшого количества минеральных солей азота и фосфора в определенном режиме. Образующиеся в пласте продукты микробного метаболизма: газы, органические кислоты и другие соединения – способствуют увеличению подвижности нефти и ее вытеснению из вмещающих пород. - Бензин, керосин и другие углеводороды пока получают чаще всего из нефти, однако в перспективе возможно использование некоторых 91 микроорганизмов и водорослей, способных синтезировать значительное количества углеводородов в клетке. - Сера в угле присутствует как в виде пирита, так и виде сложных ароматических соединений. В связи с использованием в промышленности тонкоизмельченного угля возникла возможность удалить серу как экологически вредную примесь путем окисления сульфида железа бактериями. После измельчения руда обрабатывается водным раствором, содержащим культуру тиобацилл. Клетки окисляют железо и серу и переводят их в подвижное (растворимое) состояние. - Перспективные и разрабатываемые направления – это получение водорода на основе растущих микробных популяций хемосинтезирующих микроорганизмов. Среди хемосинтезирующих микроорганизмов в качестве продуцентов водорода привлекаю внимание виды, способные расти на достаточно доступных и дешевых субстратах. - Перспективным подходом для превращения химической энергии топлива в электрическую является создание так называемых топливных элементов – электрохимических генераторов тока. В основе процесса лежит происходящее на электродах электрохимическое окисление топлива и восстановление окислителя (кислорода). При этом генерируется электрохимический потенциал, соответствующий свободный энергии процесса окисления водорода до воды. - Новой областью технологической биоэнергетики и частью инженерной энзимологии является биоэлектрокатализ. Цель этого направления – создание высокоэффективных преобразователей энергии на основе иммобилизованных ферментов. Важнейшей проблемой при этом является сопряжение ферментативной и электрохимической реакций, то есть обеспечение активного транспорта электронов с активного центра фермента на электрод. Недавние исследования показали, что этого можно достичь несколькими путями. Контрольные вопросы 1. Сущность биотехнологической энергетики. 2. Основные виды сырья для получения спирта. 3. Микроорганизмы, используемые для конверсии этанола. 4. Промышленное получение спирта. 5. Биометаногенез. 6. Сырье для производства биогаза: 7. Метаногенез – I фаза. 8. Метаногенез II фаза. 9. Промышленное получение биогаза. 10. Метанотенки. 11. Использование газа. 12.Использование твердого остатка. 13. Повышение нефтеотдачи 92 14. Десульфуризация углей 15. Жидкие углеводороды 16. Биологическое получение водорода 17. Биотопливные элементы и биоэлектрокатализе. 93 Раздел 10 ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ 10.1. Введение Еще в 1914 году был разработан процесс минерализации органических отходов, который осуществляется сложной смесью микроорганизмов. Позже были внедрены различные технологии переработки стоков и отходов сельскохозяйственного производства смешанной микрофлорой с получением биогаза, состоящего, в основном, из метана и СО2. Биогаз сжигают в тепловых машинах, приводящих в действие электрогенераторы. Многие тысячи простейших реакторов были построены в Индии, Африке, Китае. Отрабатываются и используются методы биологической переработки промышленных отходов. Во многих случаях эти методы сочетают наряду с биологической очисткой химическую и физическую обработку. Таким способом пользуются в целлюлозно-бумажной промышленности при производстве красителей, для удаления сточных вод нефтяной промышленности и т.д. 10.2. Интенсивная очистка сточных вод Цель очистки сточных вод – удаление из них взвешенных и растворимых органических и неорганических соединений до концентраций, которые не превышают заранее регламентированные (ПДК). Общегородские сооружения включают несколько ступеней очистки: первичную (механическую), вторичную (биологическую), полную (доочистку). Биологическая очистка бытовых сточных вод производится в аэробных или анаэробных условиях. Анаэробная очистка сточных вод с образованием метана рассмотрена в главе «Биотехнология в энергетике». Сточные воды в городах чаще очищают аэробным способом. Биофильтры представляют собой сооружения со сплошными стенками и двойным дном: верхнее дно, в виде решетки. И нижнее, сплошное. В биофильтрах клетки микробов находятся в неподвижном состоянии на поверхности пористого носителя. Отстоянные сточные воды периодически равномерно орошают поверхность биофильтра. Просачиваясь через фильтрующий материал, они контактируют с биопленкой, органические вещества сорбируются на поверхности микробных клеток и окисляются в процессе микробного метаболизма. На разных уровнях биофильтрата создаются свои ценозы микробов, которые порой резко отличаются по составу. Это вызвано тем, что по мере прохождения сточной воды через биофильтр за счет жизнедеятельности предыдущего ценоза меняется 94 характеристика органических загрязнений воды, попадающей на следующий уровень. Аэробная биофильтрация Бактерии населяют всю массу биологической пленки и минерализируют органические вещества. В верхней части развивается микрофлора, усваивающая легкие соединения с большой скоростью. Зеленые и сине-зеленые водоросли разрастаются в верхних слоях биофильтра несколько глубже орошаемой зоны (0-10 см.) они продуцируют кислород и фитонциды. Ниже, на глубине 10-59 см, обитают диатомовые водоросли, которым не нужен свет, но требуется кислород. По мере дальнейшего продвижения воды происходит потребление все более трудноусвояемых компонентов смеси и развиваются бактерии, разлагающие высокомолекулярные соединения. Простейшие, обитающие в нижних слоях, питаются бактериями. В нижних слоях биологического фильтра располагается зона червей. Черви прорывают ходы между частицами шлака, разрыхляют биологическую пленку и тем самым облегчают доступ в нее кислорода. 10.3. Интенсивная очистка сточных вод Поля фильтрации – это специально подготовленные участки земли, предназначенные только для целей очистки. На них подается максимально возможное количество жидкости. Это участки с хорошо дренированными легкими песчаными почвами. Отведенная на них сточная вода медленно фильтруется через грунт. Возможности почвы к самоочищению не беспредельны. По этой причине сточные воды для данного метода необходимо разбавлять трех- и пятикратными объемами технической и хозяйственной питьевой воды для отделения содержащих в ней взвешенных веществ. Поля орошения – это участки земли, предназначенные для очистки сточных вод и выращивания сельскохозяйственных растений; вода на них подается по мере необходимости. Сточные воды, предварительно осветленные, подаются в специальные борозды, просачиваются в почву, где и происходит окисление органических веществ почвенными микроорганизмами. Процесс самоочищения воды осуществляется в этих случаях за счет жизнедеятельности различных групп почвенных организмов – бактерий, низших грибов, водорослей, простейших, червей и членистоногих, а также бактериальной флоры сточной жидкости. Основные процессы протекают в верхних слоях почвы (0-40 см). Биологические пруды – это искусственные водоемы, похожие на естественные, глубиной около 1 м, последовательно соединенные друг с другом. Сточная вода из биофильтратов или аэротенков поступает в пруды, 95 проходит через них и дочищается. В биологических прудах колонии микроорганизмов свободно перемещаются в воде. Кислород поступает через поверхность и в результате фотосинтеза водорослей. Концентрация органического вещества должна быть не слишком высокой, иначе увеличиться количество микроорганизмов, будет потреблен весь кислород, начнут преобладать анаэробные процессы, и произойдет вторичное загрязнение воды. Пруды заселяют зеркальным карпом и разводят уток, которые не допускают образования плесени, закрывающей поверхность пруда. Жидкость, очищенная в прудах, имеет высокую призрачность, не содержит обильный планктон. 10.4. Очистка жидких стоков промышленных предприятий Подсчитано, что за последние 100 лет промышленность выбросила в окружающую среду миллионы тонн ртути, мышьяка, никеля, кобальта, цинка и других веществ. Промышленные сточные воды настолько разнообразны по своему составу, что в каждом конкретном случае требуют индивидуальных способов очистки. Основные трудности здесь связаны с наличием соединений, не поддающихся переработке. Эту проблему удастся решить, используя микроорганизмы, которые приобрели способность разрушать такие соединения. 1. К вредным токсикантам относятся соли тяжелых металлов, мышьяк, цианиды, фенолы, анилин, пестициды и другие вещества, ингибирующие активность ферментных систем, связывающие кислород или другим образом нарушающие жизненные процессы. 2. Кислоты и щелочи изменяют реакцию природной среды, в результате чего нарушается равновесие в живых системах. 3. Поверхностно – активные вещества попадают в природные водоемы и образуют пены на их поверхности. Эти вещества очень опасны, так как стойки по своим химическим свойствам и не разрушаются при воздействии микроорганизмов. 4. Промышленные сточные воды в зависимости от отрасли имеют различный химический состав. Например, в целлюлозно-бумажной промышленности сбрасывают стоки с высокой концентрацией органических веществ; в стоках гальванических предприятий содержаться большие количества тяжелых металлов, в навозе свиноводческих ферм – медь. 5. Указанные методы обычно комбинируют с биологическими методами очистки: обработкой воды в аэробных условиях активным илом или анаэробной ферментацией. Для предупреждения выбросов в окружающую среду вредных веществ специально подбирают и адаптируют культуры микроорганизмов, которые – обычно в иммобилизованном виде в биофильтре – утилизируют фенол, кислоты и т.д. 96 6. В других биофильтрах селективно сорбируют их сточных вод металлы адсорбцией на полисахаридах или с помощью отселектированных микроорганизмов. Многие микроорганизмы способны накапливать металлы больших количествах селекция в этом направлении и применении новых генно-инженерных методов позволяют получать формы, активно аккумулирующие металлы. 7. Есть множество примеров использования селекционных штаммов для очистки специфических промышленных стоков. Для удаления цианидов из стоков используют грибы Stemphulium loti, Gloeocercospora sorghi. Эти виды способны трансформировать цианиды в формамид, используя фермент цианидгидратазу. 8. Окисление сульфидов до сульфатов в жидких стоках проводят автотрофными бактериями Thiobacillus denitrificans, иммобилизованными в геле. Процесс происходит в анаэробном биофильтре. В гель включают также СаСО3 для поддержания буферности. 9. Окисление сероводорода и других недоокисленных соединений серы может происходить с участием разных серных бактерий. В аэробных условиях окисление производят бесцветные серобактерии и тионовые бактерии, в анаэробных – фотосинтезирующие пурпурные и зеленые бактерии. 10.5. Переработка твердых отходов Наиболее простым техническим решением проблемы твердых отходов при весьма низких финансовых затратах является их захоронение. Но этот способ экологически бесперспективен: на десятки лет занимаются огромные площади, идет загрязнение окружающей среды. 1. В крупных городах большую экологическую проблему представляют твердые отходы. Ежедневно каждый городской житель в среднем выбрасывает 2-3 кг различных отходов, половина которых – бумага и упаковочные материалы. 2. Коммунальные отбросы размещают на свалках, где не происходит их полного разложения. Наиболее простым техническим решением проблемы твердых отходов при весьма низких затратах является их захоронение. Органическое вещество в таких захоронениях разлагается достаточно медленно – до 30-50 лет. 3. В начальной стадии переработки твердых отходов преобладают аэробные процессы, в ходе которых наиболее легко разрушаемые молекулы используются беспозвоночными (клещами, червями, равноногими, нематодами), низшими грибами и микроорганизмами. 4. На следующей стадии происходит разложение таких макромолекул, как лигноцеллюлозы, лигнины, танины и меланины, которые способны только к медленной биодеградации. Продолжительность этого периода сильно варьируется и частично зависит от предобработки. Высокая 97 температура (до 80%) и присутствие антибиотиков микробного происхождения приводят к гибели или инактивации патогенных микроорганизмов и вирусов, личинок насекомых и семян растений. Температура используется как индикатор работы свалки. 5. Через некоторое время кислород поглощается аэробной микрофлорой, накапливается СО2 и начинается деятельность анаэробной микрофлоры, образующей метан, а затем и метаногены. В зависимости от местных условий через несколько месяцев или через год наступает стабильное метановое брожение, и в выделяющемся газе содержится 50-55% СН4, около 40% СО2 и 5% N2. Использование газа, образующегося на свалках, имеет огромные перспективы, так как его можно получать в больших количествах. Однако в настоящее время он не находит сбыта, представляет собой только отход и создает неудобства в эксплуатации свалок. Газ, образующийся на свалке, предлагается извлекать с помощью труб из полиэтилена. После удаления конденсата и пыли этот биогаз можно использовать как топливо. 6. Альтернативной этому методу является орошение с рециркуляцией (повторным использованием) фильтрующихся вод. В этом случае свалка используется как анаэробный биофильтр. Действие вод заключается в увеличении влажности и перемещении этих вод сквозь толщу отходов, что ускоряет процесс биодеградации. Действие рециркуляции вод усилится, если перед повторным орошением регулировать рН, давать дополнительно питательные вещества и активные культуры микроорганизмов. Рециркуляция воды с помощью распыления ускоряет испарение, улетучивания низкомолекулярных органических соединений. 10.6. Биодеградация нефтяных загрязнений Промывка корабельных трюмов, аварии на танкерах, сброс отработанных нефтепродуктов т утечки нефти в море – серьезная проблема загрязнения. Разливы нефти являются катастрофой для всего живого. Скорость разложения нефти зависит от ее дисперсности, температуры среды, концентрации кислорода, наличия азота и фосфора для микробной биодеградации. В поглощении и разрушении углеводородов участвуют дрожжи, парафинокисляющие бактерии и псевдомонады. Дрожжи – наиболее активные поглотители углеводородов. Углеводороды проникают внутрь клетки дрожжей через микроканальца в клеточной стенке. В клетки микобактерий и близких им форм парафинокисляющих бактерий углеводороды проникают, растворяясь в липидной фракции оболочки. Некоторые псевдомонады имеют плазмиды разрушения ароматических углеводородов. Как правило, они расщепляют углеводороды с помощью ферментов, выделяемых клеткой или расположенных на клеточной стенке. 98 Образующиеся вещества используются клетками как источник углерода и энергии. 10.7. Биодеградация ксенобиотиков Биодеградация органических соединений в среде – полная минерализация, частичное разрушение или детоксикация, которая может быть достигнута путем всего лишь одной модификации структуры молекулы. 1. К трудноразлагаемым веществам относят: хлорпроизводные углеводороды, нафталины, эмульгаторы, азокрасители, полиароматические углеводороды, бензпирен, полистирол. Судьба ксенобиотика зависит как от его внутренних особенностей (устойчивости к различным воздействиям, растворению в воде, размера и разряда молекулы, летучести), так и от внешних факторов (рН, фотоокисления, выветривания). 2. Шины, изготовленные из стирол-бутадиеновой резины, частично разлагаются микроорганизмами при тонком предварительном измельчении. Но антизонаты, антиоксиданты и ускорители вулканизации существенно замедляют биодеградацию. При удалении ингибитора полимеризации из технологии изготовления шин полистирол разрушается соответствующим сообществом микроорганизмов. Для успешного разложения ксенобиотиков их структура должна быть близкой к природным веществам. 3. В сообществе микроорганизмов создаются идеальные условия для обмена генетической информацией за счет переноса плазмид между микроорганизмами. Часто именно в плазмидах кодируется информация о синтезе ферментов, разрушающих ксенобиотики. Микроорганизмы, растущие на одном субстрате (ксенобиотике, превращают его в источник питания для других членов сообщества. Таким образом, микробное сообщество осуществляет совместную «метанбиологическую атаку» на субстрат – ксенобиотик. 4. Образцы из нескольких мест на свалках культивируют в течение нескольких месяцев, постепенно увеличивая концентрацию ксенобиотика. Если в сообществе микроорганизма со свалок имеются организмы, способные к деградации ксенобиотика, они начинают активно развиваться. В дальнейшем из наиболее активных вариантов удается выделить активные штаммы с плазмидами инактивации данного ксенобиотика. 5. Токсичность пестицидов утрачивается уже на первой стадии их преобразования. Для этого успешно можно использовать такие внеклеточные ферменты, как гидролазы, эстеразы, ациломидазы, фосфоэстеразы. Описаны гидролазы для деградации некоторых пестицидов. Ферменты в виде аэрозолей можно использовать для удаления пестицидов с поверхностей установок, реакторов и тары. 6. Моющие средства подразделяются на «жесткие» и «мягкие». Созданные в 50-е годы анионные «жесткие» моющие средства (алкилбензолсульфонаты) с разветвленными алкильными цепями 99 накапливались в окружающей среде в значительных количествах. Сейчас в быту используются неионные моющие вещества, содержащие 30% поверхностно – активных веществ, а также отбеливатели, пенообразователи, ферменты и антикоррозийные добавки. Такие составы разлагаются проще. 7. Для уничтожения некоторых особо опасных вредителей, видимо, еще долго будут применяться яды. Чтобы осуществить биодеградацию ядохимикатов, в них предполагается вносить микродобавки (специально подобранные микробные сообщества) для быстрейшей ликвидации самого вредного агента после его позитивного воздействия на вредителя. 10.8. Восстановление плодородия почв Интенсификация сельскохозяйственного производства сильнее всего сказывается на уменьшении содержания гумуса, что ведет к деградации почвы. 1. Повышенное внесение удобрений и ядохимикатов приводит к быстрому истощению почвы, уменьшению содержания гумуса, засорению почвы ядами. Но фоне недостатка гумуса в почвах снижается эффективность применения минеральных удобрений и усиливается вымывание минеральных веществ. 2. Избытки минеральных удобрений, а также пестициды, гербициды и инсектициды усваиваются из почвы растениями и переходят в продукты питания. Увеличение содержания нитратов в фруктах и овощах опасно для здоровья человека, так как нитраты в организме преобразуются в нитриты и ядовитые нитрозамины. 3. Биотехнологические способы очистки почв заключаются во внесении комплекса микроорганизмов – деструкторов ядохимикатов. Хорошее влияние оказывает также запахивание соломы, способной удалить фунгициды и усиливающей микробиологические процессы образования гумуса. Рециркуляция органических материалов, например соломы, препятствует процессу накопления химикатов. 4. При восстановлении нарушенных почв желательно шире использовать органические удобрения – компосты на основе навоза, жидких стоков ферм, ила, очистных сооружений, способствующие восстановлению гумусового слоя почвы. При отсутствии гумусового слоя на отвалах, состоящих из песчаных почв, в первые годы рекомендуется возделывать бобовые культуры, что способствует восстановлению экосистемы. 10.9. Самоочищение водоемов Воды и почва населены огромным количеством разнообразных микроорганизмов. Поэтому в них постоянно происходит разложение 100 органических веществ, что приводит к самоочищению водоемов и почвы от многих веществ. Количественными показателями загрязненности воды служат микробное числа, колититр, колииндекс. Сильно загрязненная вода – свыше 10 000 клеток кишечной палочки в 1 л, удовлетворительно – 10 клеток в 1 л, хорошая питьевая вода – 3 бактерии в 1 л и меньше. Главное: - Очистка бытовых сточных вод производится в аэробных или анаэробных условиях. - Схема очистки сточных вод предприятий должна максимально использовать очищенные сточные воды для повторного водоснабжения и обеспечивать минимальный сброс сточных вод в естественные водоемы. - Промышленные сточные воды настолько разнообразны по своему составу, что в каждом конкретном случае требуют индивидуальных способом очистки. Основные трудности здесь связаны с наличием соединений, не поддающихся переработке. - ПДК – предельно допустимая концентрация – регламентированное предельное количество загрязняющих веществ в единице объема воздуха или воды, которые при длительном применении не вызывает отклонений в состоянии экосистемы и населяющих ее организмов. ПДК различна для веществ и различных объектов окружающей среды. - Наиболее простым техническим решением проблемы твердых отходов при низких финансовых затратах является их захоронение. Но этот способ экологически бесперспективен: занимаются десятки лет огромные площади, идет загрязнение окружающей среды. Более перспективный, но дорогой способ – компостирование. - Разливы нефти ведут к экологической катастрофе. Имеющиеся препараты для очистки воды и почвы решают проблему лишь частично. - Биодеградация органических соединений в среде – это полная минерализация, частичное разрушение или детоксикация, которая может быть достигнута путем всего лишь одной модификации структуры молекулы. - Достижения агробиотехнологии, в конечном счете, способствуют не только увеличению производства продуктов, но и получению их с минимальной нагрузкой на агроэкосистемы и с минимальными отрицательными последствиями для нее. - Интенсификация сельскохозяйственного производства сильнее всего сказывается на уменьшение содержания гумуса, что ведет к деградации почвы. Для нормального функционирования почвы необходимо систематическое внесение органических веществ. - Вода и почва населены огромным количеством разнообразных микроорганизмов. Поэтому в них постоянно происходит разложение органических веществ. Тем не менее, требуется постоянный контроль за экосистемами, чтобы вовремя заметить накопление токсических веществ. 101 Контрольные вопросы 1. Экологическая биотехнология и ее задачи. 2. Каков общий вклад биотехнологии в решение современных экологических проблем? 3. Что собой представляют биотехнологические отходы? 4. Какие существуют схемы по очистке твердых, жидких и газообразных отходов? 5. Производство биогаза. 6. Производство этанола. 7. Какие микроорганизмы ведут биометаногенез и на каких средах их выращивают? 8. Расскажите о работе метантенков. 9. Расскажите о трех стадиях биометаногенеза. 10.Для чего используется биоэтанол? 11.Какие субстраты используются для получения биоэтанола? 12.Каким образом можно достичь снижения себестоимости биоэтанола? 13.Какие виды загрязнения поверхностных и подземных вод вы знаете? 14.Какие методы очистки сточных вод вы знаете? 15.Что такое аэротенк, как он функционирует? 16.Что такое отстой сточных вод, на какие виды он подразделяется. 17.Использование отстоя сточных вод. 18.Какие основные виды микроорганизмов присутствуют в «активном иле»? 19.По каким направлениям можно совершенствовать биотехнологическое производство в плане экологической безопасности? 102 Раздел 11 БИОГЕОТЕХНОЛОГИЯ 11.1. Введение в биогидрометаллургию Биогидрометаллургия – это наука о получении металлов с помощью микроорганизмов. Другое направление биогидрометаллургии – сорбция металлов, то есть их выделение из разбавленных растворов, главным образом с помощью микроорганизмов. Важность этого направления связана с увеличением объемов промышленных стоков, содержащих металлы, а также с истощением мировых запасов руды. Все большее внимание привлекает биосорбция металлов из морской воды, содержащей почти все химические элементы. Чаще всего под биогидрометаллургией понимают выщелачивание металлов из руды с помощью микроорганизмов, окисляющих сульфиды металлов. На практике руду поливают растворами, содержащими микроорганизмы. Это можно делать и в месте залегания руды (подземное выщелачивание), и на специальных площадках (кучное выщелачивание), и в специальных емкостях (чановое выщелачивание). 11.2. История биогидрометаллургии Экстракции металлов из минералов, концентрирование и извлечение металлов из растворов представляет собой важный аспект микробиологической технологии с применением микроорганизмов Первые шаги в биологическом выщелачивании металлов из сульфидной руды были сделаны еще на Кипре около 2 600 лет назад. Немецкий ученые Георг Агрикола в своем классическом труде «О царе металлов» (De Re Metallica) описал технологию выщелачивания. В конце ХIХ века С.Н. Виноградский, исследуя, нитчатые серобактерии (Beggiatoa) и железобактерии (Leptothrix ochracea), пришел к выводу, что бактерии могут получать энергию за счет химических реакций окисления неорганических соединений. Серобактерии окисляют сероводород до серы и серной кислоты, а железобактерии закись железа окисляют до окиси. В 1902 г. голландский ботаник и микробиолог Мартин Бейеринк выделил автотрофный микроорганизм Thiobacillus thioparus, окисляющий серу и целый ряд ее соединений в среде с высоким показателем рН. В настоящее время работы по биогидрометаллургии активно проводятся под руководством члена-корреспонлента РАН Г.И. Каравайко в Институте микробиологии имени С.Н. Виноградского. 11.3. Микроорганизмы важные в биогидрометаллургии 103 Хемолитотрофные бактерии, широко распространенные в природе, обладают способностью получать энергию в процессе окисления соединений серы и железа. Литотрофные бактерии присутствуют в средах, имеющих низкое значение рН, содержащих руды различных металлов, двухвалентное железо и восстановленные соединения серы. Тиобациллы – это небольшие грамотрицательные палочки, автотрофы и строгие аэробы, растущие в кислой среде. В качестве источника энергии они используют неорганические соединения серы, а углерод получают из углекислоты воздуха. Тиобациллы обитают в местонахождениях сульфидных и серных руд. Другой важный в биогидрометаллургии организм, это встречающийся в рудных водах, - Leptospirillum ferrooxidans. Это грамотрицательная спирилла, строгий автотроф. Получает энергию света за счет окисления Fe2+ и FeS2. Источником углерода для нее также служит углекислота. В угольных шахтах Пенсильвании найдены ацидитиобациллы. Это подвижные грамотрицательные палочки, морфологически гетерогенные. Для их роста и развития требуются небольшие количества органических веществ с уровнем рН от 1,9 до 5,9. В гидротермальных подводных кратерах широко распространены сульфобациллы. Это грамотрицательные спорообразующие неподвижные бактерии с очень тонкой клеточной стенкой; аэробы. Сульфобациллы растут в кислой среде при повышенной температуре (50-950С). Для выращивания в лабораторных условиях нуждаются в дрожжевом экстракте. Термоацидофильные археи – древнейшие бактерии на Земле. Стенки их сферических клеток не содержат пептидогликана. Эти бактерии тоже аэробы. Они растут в кислой среде при высокой температуре (до 96 0С). Для выращивания в лабораторных условиях нуждаются в дрожжевом экстракте. К археям относятся бактерии семейства Ferroplasmataceae. У них плеоморфные клетки без пептидогликана в клеточной стенке. Ферроплазмы развиваются в кислой среде, оптимальная температура для роста 35-450С. Для выращивания в лабораторных условиях нуждаются в дрожжевом экстракте. Окисляют двухвалентное и сульфиды. Все сульфатредуцирующие бактерии – аэробы т.е. автотрофы. Они получают энергию за счет химических реакций окисления соединений серы, а источником углерода для них служит углекислый газ. 11.4. Выщелачивание цинка Окисление цинка бактериями – прямой окислительный процесс. При этом окисляются сульфидные минералы с образованием сернокислого цинка. Активность бактериального выщелачивания цинка их сульфидных минералов возрастает в присутствии пирита и трехвалентного железа. 104 Thibacillus thiooxidans, Thibacillus ferrooxidans, Thibacillus thoparus окисляют сульфиды цинка прямым окислением, т.е. независимо от присутствия железа. ZnS+2O2⟶ZnSO4 Труднее всего из цинковых руд окисляется вюрцит. Сфалерит окисляется быстрее, чем вюрцит, но медленнее, чем марматит. Бактериальное окисление марматита в 20 раз активнее его химического окисления трехвалентным железом. 11.5. Кучное и подземное выщелачивание меди Методы извлечения меди из пород, содержащих минералы, путем обработки их кислыми растворами используются много веков. Однако механизм функционирования бактерий в этом процессе был вскрыт только в середине прошлого столетия. В 1947 году из шахтных дренажных вод была выделена бактерия Tiоbacillus, которая участвует в переводе меди из рудных минералов в раствор. Штаммы этой бактерии являются катализаторами окисления двухвалентного железа по типу окисления пирита: Бактериально-химическое выщелачивание цветных металлов проводят из отвалов бедной руды (кучное) и из рудного тела в месте залегания (подземное). Цветные металлы получают обычно в результате непрямого окисления руды с участием бактерии иона Fe3+, который образуется в результате жизнедеятельности бактерий. Часто в ходе непрямого окисления образуется элементарная сера, которая может непосредственно окисляться бактериями до серной кислоты. В течение прошлого столетия методы «выщелачивания» для получения меди усовершенствовались технически и применялись, в частности, в США. Процесс выщелачивания используется для получения меди из бедных руд или отвальных материалов, которые накапливаются при крупномасштабной открытой разработке руды. Для индукции выщелачивания отвал, иногда достигающий в высоту 300 метров, смачивают подкисленной серной кислотой до рН 1.5-3.0. Этот раствор, или «выщелачиватель», создает благоприятную среду для размножения ацидофильных бактерий, распространенных в сульфидных рудах. Необходимо аэрирование выщелачивающего раствора путем подачи воздуха внутри породы. Этапы выщелачивания меди: 1. Поверхностное выщелачивание металлов производиться из отходов горнодобывающей промышленности или побочных бедных руд, переработка которых обычными способами невыгодна. 2. Для выщелачивания в отвалах измельченная руда обычно укладывается на водонепроницаемое наклонное основание. Выщелачивающая жидкость 105 (после регенерации) насосами подается наверх. Там она распыляется по поверхности и, стекая вниз, фильтруется через слой руды. 3. Кислая среда способствует активности Thibacillus ferrooxidans. Раствор, прошедший через слой породы и содержащей извлеченный бактериями металл, собирает внизу. 4. Далее раствор, стекающий из отвалов, направляется для извлечения металла. 5. Извлечение проводят, применяя простое осаждение или электролиз; иногда используют более сложные методы. 6. Отработанные выщелачивающие растворы регенерируются в окислительных прудах и вновь подаются отвалы. Двухвалентное железо, обычно присутствующее в рудах, окисляется бактериями. Одновременно сера окисляется до серной кислоты: 4FeSO4+O2+2H2SO4 ⟶ 2Fe2(SO4)3+2H2O S8+12O2+8H2O ⟶ 8H2SO4 Образовавшийся ион трехвалентного железе служит сильным окисляющим агентом, переводящим раствор многие минералы, например халькозин: Cu2S+2Fe2 (SO4)3 ⟶ 2CuSO4+4FeSO4+S0 Образовавшееся двухвалентное железо и сера снова окисляются бактериями до трехвалентного железа и серной кислоты. 11.6. Бактериальное вскрытие золота Три четверти запасов золота сосредоточено в виде вкраплений внутри кристаллических решеток сульфидных минералов: арсенопирита (FeAsS) и пирита (FeS2). Для извлечения золота необходимо окислить сульфидные минералы, другими словами разрушить решетку. Разрабатываемая технология обезвреживания циансодержащих стоков, включающая их бактериальной окисление. В первичном выщелачивании принимают участие бактерии Thibacillus thiooxadans, Thibacillus ferrooxadans. Для получения концентрата руду выщелачивают при рН 2-3 и температуре 20-350С. Бактерии окисляют Fe2+ и S0 до конечных продуктов: 4Fe2++O2+H+=4Fe3++2H2O S0+4H2O = SO42-+8H++6е Концентрат измельчают и смешивают с рабочим раствором в соотношении 1:5. Эту смесь помещают в каскад реакторов, снабженных мешалками и системой аэрации. Бактерии растворяют сульфиды тяжелых металлов. При этом мышьяк переходит в арсениты, которые легко «уходят» в 106 слабом растворе кислоты. За 90-96 часов 95% мышьяка переходит в нетоксичную форму: FeAsS+Fe2SO43-+1,5H2O + 0,75O2 = 3FeSO4 + S0+H3AsO3 Для получения золота из продуктов бактериального окисления используется способ цианирования в присутствии ионообменных смол. Уровень извлечения золота достигает 93%. В промышленных условиях в переработке золото-мышьяковых концентратах участвуют сложные бактериальные сообщества. Это Leptospirillum ferrooxidans, Acidithiobacillus caldus и Sulfobacillus, окисляющие двухвалентное железо до трехвалетного: 4Fe2++O2+H+ = 4Fe3++2H2O Предлагается в дальнейшем заменить эту стадию микробиологической сорбцией золота. С помощью микроскопических грибов можно полностью доизвлекать золото из производственным вод. Биомасса по степени сорбции растворенных благородных металлов приближается к лучшим сорбентам. Растворы, содержащие мышьяковую и мышьяковистую кислоты, поступают на осаждение мышьяка известняком, при этом образуются практически нерастворимые осадки арсенатов кальция. Концентрация ионов мышьяка в растворе снижается до 0,05 мг/л, т.е. до безопасной концентрации. 11.7. Выщелачивание урана Для экстракции урана бактерии применяются реже, в основном, для извлечения остаточного урана на уже выработанных площадях или из отвалов. Уран добывают в основном из таких минералов, как ураноторит, уранинит, где он содержится в четырехвалентном состоянии. Для его выщелачивания U4+ должен быть окислен в U6+, соединения которого растворимы в H2SO4. Промышленное бактериально-химическое извлечение урана из руды практикуется в Канаде, ЮАР и Португалии. Процесс проводят по той же схеме, что и подземное или кучное выщелачивание меди. Уран содержится в рудах в основном в четырехвалентном состоянии, в виде соединений, нерастворимых в серной кислоте. Для выщелачивания четырехвалентный уран должен быть окислен в шестивалентный. В урановых рудах присутствует пирит, который является источником трехвалентного железа при бактериальном окислении урана. Окисление урана производится при участии тиобацилл главным образом Thiobacillus ferrooxidans 107 Руды орошаются слабыми растворами серной кислоты, содержащим ионы трехвалентного железа в качестве окислителя. Бактерии косвенно участвуют в растворении урана, обеспечивая постоянную регенерацию трехвалентного железа. Из растворов уран извлекается классическим способом использованием ионообменных смол. 11.8. Биосорбция металлов из растворов Многие микроорганизмы и водоросли способны накапливать металлы в больших количествах. Микроорганизмы, помимо включения в цитоплазму, способны также сорбировать металлы на поверхности клеточных стенок и связывать метаболитами в нерастворенные формы. Этот процесс концентрирования металла микроорганизмами может происходить одним из следующих способов: 12. . внеклеточное накопление металлов (участвующих или не участвующих в нормальном метаболизме) путем связывания или осаждения их на клеточной стенке или мембранах; 2) внутриклеточное накопление нужных для метаболизма металлов (например, К, Fе, Мg,Мо, следы Сu, Ni); 3) внутриклеточное накопление относительно больших количеств несущественных для метаболизма металлов (например, Со,Ni, Cu,Сd, Аg) с помощью механизмов, служащих для нормального метаболизма металлов. Например, поверхностное накопление урана может осуществляться дрожжами Saccharomyces. Связанный уран легко удаляется, и дрожжи можно использовать повторно. Такой же механизм накопления свинца у бактерий. После введения металла в среду происходит его быстрое связывание с клеточной поверхностью, а затем – медленный перенос металла в цитоплазму клетки. Вторая стадия энергозависима, протекающая при активном дыхании, блокируется дыхательными ядами. Селекция микроорганизмов, способных эффективно накапливать металлы, дает возможность использовать их для удаления загрязняющих ионов из сточных вод, образующихся в горнодобывающей промышленность Главное: Способностью получать энергию в результате окисления восстановительных соединений серы и железа обладают хемолитотрофные бактерии. - Хемолитотрофные бактерии окисляют неорганические субстраты и получают энергию по электрохимическим (коррозионным) механизмам. 108 - Образование пленки серы на поверхности минералов подавляет их дальнейшее окисление. Бактерии, удаляя эту пленку, способствует постоянному окислению многих минералов. - Бактериальное выщелачивание цветных металлов при участии Fe3+, которое происходит в результате жизнедеятельности бактерий, называется непрямым окислением. - Процесс извлечения металлов из концентратов с использованием бактерий осуществляется в специальных аппаратах и называется чановым. - Многие микроорганизмы и водоросли способны накапливать металлы в больших количествах. - Микроорганизмы, помимо включения в цитоплазму, способны также сорбировать металлы на поверхности клеточных стенок, связывать метаболитами в нерастворенные формы, а также переводить в летучую форму. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Контрольные вопросы Сущность биогидрометаллургии. История биогидрометаллургии. Микроорганизмы важные в биогидрометаллургии. Окисление железа и серы. Выщелачивание цинка. Кучное и подземное выщелачивание меди. Этапы выщелачивания меди. Бактериальное вскрытие золота. Выщелачивание урана. Биосорбция металлов из растворов. 109 Раздел 12 КРИОСОХРАНЕНИЕ Генофонд и факторы, влияющие на него Генофондом называют заложенную в организмы генетическую информацию, определяющую их рост и развитие. Некоторые факторы, влияющие на генофонд организмов: - УФ-радиация - Тяжелые металлы - Отходы промышленности Воздействие каждого из этих факторов может вызывать изменения биологических свойств организмов и даже приводить к его исчезновению. В настоящее время экологическая обстановка на нашей планете оказывает значительное влияние на генетический аппарат многих животных организмов. Некоторые виды находятся под угрозой исчезновения. В связи с этим проблема сохранения генофонда растений и животных приобретает особое значение. 12.2. Традиционные средства сохранения генофонда Сохранение разнообразия форм жизни – важнейшая проблема современного человечества. Уже давно доказано, что устойчивость сообщества тем выше, чем число составляющих его видов. Поэтому сохранение биоразнообразия является единственным механизмом обеспечения стабильности жизни на Земле. - Заповедники - Ботанические сады - Коллекция семян растений Традиционные способы не лишены недостатков. Так, заповедники не дают полной гарантии сохранения всех видов растений, произрастающих на их территории. В ботанических садах обычно сохраняется только определенные виды растений или отдельные их представители. Все это делает необходимым создание новых способов для сохранения разнообразия генофонда растительных и животных организмов, а также человека. 12.3. Сохранение генофонда растений в условиях in vitro Разработка методов культивирования клеток и тканей в условиях in vitro позволила использовать их для сохранения генофонда различных объектов. - Коллекция каллусных культурных растений 110 - Коллекция растений в пробирках - Коллекция суспензионных культур растений При работе с растущими коллекциями необходимо поддерживать без изменений состава питательных сред, размер присаживаемых культур, длительность культивирования, а также условия выращивания (температуру, влажность, освещенность). Растущие коллекции постоянно оцениваются по ряду параметров (рост, жизнеспособность клеток, митотическая активность, содержание вторичных соединений и др.). Сравнение штаммов сразу по нескольким признакам может быть облегчено использованием компьютерных программ. 12.4. Депонирование коллекций растительных клеток in vitro В настоящее время интенсивно разрабатываются способы так называемого «депонирования» коллекций, то есть методов, позволяющих удлинить период между пересадками культур. Это связано с тем, что периодическое субкультивирование клеточных культур растений трудоемко и требует значительных затрат как на выполнение работ, так и на приготовление питательных сред для культивирования. Методы, используемые для депонирования - Выращивание культур при низких положительных температурах (10 10 С) и слабой интенсивности освещения (до 50 люкс). - Добавление к среде осмотиков (маннита, сорбита, или повышенных концентраций сахарозы). - Снижение атмосферного давления (до 0,5 мм рт. ст.) - Внесение в питательную среду веществ, тормозящих рост культур, например абсцизовой кислоты (5-10 мг/л) или ССС (хлорхолинхлорида; 2 г/л). - Гипоксия (выращивание под слоем минерального масла для уменьшения доступа кислорода). Депонирование коллекции растительных культур могут расти без пересадок не менее 1 года и даже больше. В ряде случаев удачным является одновременное использование нескольких подходов, например выращивание при низкой температуре и в присутствии веществ, тормозящих рост клеток. 12.5. О криосохранении и его возможностях Криосохранение – один из наиболее перспективных способов сохранения генофонда высших растений и животных. Оно позволяет хранить органы, ткани и клетки в замороженном состоянии при температуре жидкого азота (-1960С). Хранимый в этих условиях материал остается генетически стабильным и не подвержен изменениям, которые происходят с организмами при хранении обычными способами. 111 12.6. Теоретические вопросы криобиологии Основными критическими моментами криобиологии являются образование льда внутри и вне клеток организма и их дегидратации (обезвоживание). Образование внеклеточного и внутриклеточного льда. Снижение температуры окружающей среды ниже точки замерзания раствора приводит к его переохлаждению, образованию льда вокруг клеток и возникновению центров кристаллизации. Вода выходит их клеток и замерзает на поверхности внешнего льда. Образование внутриклеточного льда обычно повреждает клетки, и только в случае формирования очень маленьких кристаллов льда они могут в дальнейшем выжить. Витрификация клеток. Витрификация это затвердевание жидкости в аморфном состоянии даже при наличии в ней центров кристаллизации. Витрификация наблюдается при высоких скоростях охлаждения организмов и для ее снижения к клеткам добавляют криопротекторы (сахара, глицерин, поливинилпирролидон и др.), а также увеличивают барометрическое давление. 12.7. Технология криосохранения При криосохранении (криоконсервации) клетки переходят в состояние глубокого анабиоза и после длительного пребывания в нем возвращаются в обычное (нормальное) состояние. Основные этапы криосохранения Предварительное культивирование клеток или организмов Устойчивость организмов к воздействию температур зависит от состава среды культивирования, стадии роста, количества клеток и температуры выращивания. Расфасовка подготовительного материала в контейнеры Для замораживания и хранения подготовленных клеток или организмов используют разнообразные типы контейнеров. Расфасовку проводят в стерильных условиях. Замораживание по предварительно отработанной программе Используют программное (медленное) и сверхбыстрое замораживание. Программное замораживание может осуществляться со скоростью 1 0 С в минуту. Сверхбыстрое замораживание производят путем непосредственного погружения подготовленного материала в жидкий азот. Перенос в емкости с жидким азотом для долгосрочного хранения Для хранения большинства клеток и организмов удобнее всего использовать жидкий азот (-1960) или его пары (-1500). Оттаивание или размораживание 112 Лучшую жизнеспособность проявляют клетки и организмы при быстром размораживании на водяной бане при температуре 400С. 12.8. Достижения в области криосохранения Живая ткань в любой форме представляет собой незаменимый генетической материал, который требует хранения и последующего использования. Методические достижения в области криобиологии позволяют успешно сохранять живые ткани в течение длительного времени, а затем использовать их в различных биотехнологических целях. Вид замороженных в жидком азоте клеток и живых тканей Животных человека: - опухолевые клетки - мутантные клетки - клетки первичных пересеваемых культур - клетки крови и костного мозга - сперма - человеческий эмбрион Растений: - верхушка побега - зародыш - суспензионные и каллусные культуры - пыльца и пылинки -протопласты Главное: - Генофондом называют генетическую информацию организмов, пределяющую их рост и развитие. - Традиционными средствами сохранения генофонда являются ботанические сады, заповедники, коллекции семян. - Для сохранения генофонда растительных объектов необходима разработка новых способов «депонирования» коллекций. Такие способы позволяют удлинить период между пересадками культур в условиях in vitro. - Криосохранение – это один из наиболее перспективных способов сохранения генофонда высших растений и животных. Он позволяет хранить органы, ткани и клетки в замороженном состоянии при температуре жидкого азота. Хранимый в этих условиях материал остается генетически стабильным. - Критическими моментами при криосохранении тканей являются образование льда в клетках и обезвоживание протоплазмы. - В процессе криосохранения (криоконсервации) клетки переходят в состояние глубокого анабиоза, длительно пребывают в нем, а затем возвращаются в обычное (нормальное) состояние. 113 Контрольные вопросы 1. Генофонд и факторы, влияющие на него. 2. Традиционные средства сохранения генофонда. 3. Сохранение генофонда растений в условиях in vitro. 4. Депонирование коллекций растительных клеток in vitro. 5. Криосохранение и его возможности. 6. Теоретические вопросы криобиологии. 7. Технология криосохранения. 8. Достижения в области криосохранения. 9. Виды замороженных в жидком азоте клеток и живых тканей животных. 10. Виды замороженных в жидком азоте клеток и живых тканей растений 114 Фонд оценочных средств Тема 1. ПРЕДМЕТ И ЗАДАЧИ БИОТЕХНОЛОГИИ 1. Наука, основанная на получении гибридных молекул ДНК и введении этих молекул в клетки других организмов – это… А. Клеточная инженерия. Б. Генетическая инженерия В. Биологическая инженерия 2. Наука, основанная на изучении биологических особенностей клеток и внедрении компьютерных методов контроля технологических режимов, позволяющих максимально реализовать полезные свойства клеток – это… А. Клеточная инженерия. Б. Генетическая инженерия. В. Биологическая инженерия. 3. Наука, основанная на возможности выращивания клеток и тканей in vitro и на их способности к соматической гибридизации – это…. А. Клеточная инженерия. Б. Генетическая инженерия. В. Биологическая инженерия. 4. Могут ли бактерии синтезировать белки лягушки (если соответствующий ген ввести в бактерию)? А. не могут (белки лягушки крупнее) Б. не могут (лягушка относится к экуариотам) В. могут (а почему бы и нет) 5. Чем отличаются соматические клетки животных от соматических клеток растений? А. соматические клетки животных не могут Б. соматические клетки животных не могут размножаться давать начало новому организму В. из соматических клеток животных нельзя получить протопласты. 6. Отрасль хозяйства, которая производит различные вещества на основе использования микроорганизмов, клеток и тканей других организмов – это: А. бионика Б. цитология В. микробиология Г. биотехнология 7. Биотехнология возникла на стыке нескольких наук, таких как: А. медицина, физиология животных, Б. генетика, физиология животных, селекция растений, история биологии селекция растений, история биологии В. генетика, бактериология, вирусология, Г. фармакология, биохимия, молекулярная биология, физиология животных, селекция микробиология, биохимия, растений, история биологии растениеводство 8. Биотехнологические процессы осуществляются за счет использования А. вирусов, дрожжей, плесневых грибов, Б. бактерий, дрожжей, плесневых грибов, водорослей, культур клеток и тканей водорослей, культур клеток и тканей растений и животных. растений и животных. В. бактерий, вирусов, плесневых грибов, Г. бактерий, дрожжей, вирусов, водорослей, водорослей, культур клеток и тканей культур клеток и тканей растений и растений и животных. животных. Д. бактерий, дрожжей, плесневых грибов, вирусов, культур клеток и тканей растений и животных. 9. Какие области применения биотехнологии не относятся к сельскому хозяйству? А. Производство органических кислот. Б. Селекция, клонирование и генетическая 115 инженерия животных и растений. В. Использование антибиотиков для Г. Производство белково-витаминных лечения животных и птиц. концентратов, вакцин, биоинсектицидов. Д. Применение гормонов и других стимуляторов роста. 10. Какие области применения биотехнологии не относятся к производству химических веществ и соединений? А. Производство органических кислот. Б. Получение витаминов, антибиотиков и др. В. Использование ферментов в составе Г. Производство биополимеров. моющих средств. Д. Производство этанола из растительного сырья. 11. Какие области применения биотехнологии не относятся контролю за состоянием окружающей среды? А. Улучшение методов тестирования и Б. Использование микроорганизмов для мониторинга загрязнений окружающей переработки сельскохозяйственных, среды. бытовых и промышленных отходов. В. Выщелачивание руд. 12. Какие области применения биотехнологии не относятся к медицине? А. Использование микроорганизмов при Б. Синтез новых антибиотиков, гормонов и создании и модификации сложных интерферонов. лекарственных средств. В. Применение в медицинской практике Г. Производство органических кислот. ферментов и штаммов микроорганизмов. 13. Какие области применения биотехнологии не относятся к энергетике? А. Производство биогаза. Б. Производство этанола В. Выщелачивание руд. 14. Какие области применения биотехнологии не относятся к пищевой промышленности? А. Создание новых методов переработки и Б. Применение ферментов и пищевых хранения пищевых продуктов. добавок, полученных с помощью микроорганизмов. В. Использование белка одноклеточных. Г. Изучение и контроль биоразложения. Д. Совершенствование спиртового и молочнокислого брожения. 15. Какие области применения биотехнологии не относятся к материаловедению? А. Выщелачивание руд. Б. Изучение и контроль биоразложения. В. Производство этанола из растительного сырья. 16. Первые удачные эксперименты по культивированию клеток животных в сгустке лимфы с добавлением эмбриональных экстрактов были проведены… А. в 1917 году Р. Гаррисоном Б. в 1907 году Р. Гаррисоном. В. в 1907 году Геккелем. 17. В 1960 году обнаружили, что соматические клетки мышей при культивировании на питательной среде могут сливаться, образуя жизнеспособные гибридные клетки. Это стало началом развития… А. генной инженерии. Б. клеточной инженерии животных клеток. В. физиологии животных. 18. Первыми продуктами, полученным с помощью генной инженерии, стали… 116 А. Пищевые добавки. Б. Сельскохозяйственные вакцины животных. В. Лекарственные препараты для человека. 19. Ведущая роль в области биотехнологии принадлежит… А. США и Китаю. Б. ФРГ и Японии. В. США и Японии. 20. Наряду с США и Японией в тройку ведущих держав с наиболее мощным научноисследовательским потенциалом в области биотехнологии входит… А. Англия. Б. Китай. В. ФРГ. 21. Наиболее популярные трансгенные культуры, применяемые американскими фермерами в течение последнего десятилетия… А. пшеница, рожь, рис, тростник. Б. кукуруза, хлопок, соя и рапс. В. овес, пшеница, тростник, кукуруза. 22. К возможностям гибридизации соматических клеток не относится… А. Производство белково-витаминных Б. определение последовательности генов в концентратов, вакцин, биоинсектицидов. молекуле ДНК. В. выяснение механизмов образования и Г. регуляция работы генов в онтогенезе. роста злокачественных опухолей. Д. создание гибридов и селекции. 23. Кто и в каком году выявил минимальный объем растительной ткани, способный образовывать каллус? А. С. Рехингер в в 1863 году. Б. С. Рехингер в в 1893 году. В. Г.Габерландт в в 1893 году. Г. Р.Готре в 1893 году. 24. Специфическая ориентация процессов и структур в постранстве, приводящая к возникновению морфологических различий растений называется… А. тотипотентность Б. полярность В. наследственность Г. изменчивость. Тема 2. ОСНОВЫ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ 1. Культура изолированных клеток и тканей может быть использована? А. при фундаментальных научных Б. для селекционной работы исследованиях В. для хлебопечения Г. для получения вторичных метаболитов 2. В океане обнаружена губка, подавляющая рост патогенных грибов. Как лучше всего применить ее для борьбы с грибными заболеваниями? А. выявить ген, ответственный за Б. построить океанариум и выращивать образование данного вещества; ввести его губку в оптимальных условиях геном дрожжей и получить активное вещество с помощью дрожжей. В. получить данное вещество с помощью Г. собирать организмы на дне океана, культуры ткани губки размалывать и применять Д. определить структуру данного вещества и синтезировать химическим путем 3. Что не является условием культивирования каллусных культур? А. Стерилизация питательной среды. Б. Стерилизация воздуха в комнате. В. Стерилизация поверхности растения – Г. Стерилизация посуды. экспланта. Д. Стерилизация лаборанта. 4. Что не является условием культивирования каллусных культур? 117 А. В питательную среду добавляют сахар (глюкозу) В. В питательную среду добавляют K2HPO4 Б. В питательную среду добавляют NH4NO3 Г. В питательную среду добавляют набор микроэлементов Д. В питательную среду добавляют абсцизины 5. Выберите условия освещения для культивирования каллусных культур? А. Освещение хорошее Б. Освещение слабое В. Освещение среднее 6. Выберите температурные условия культивирования каллусных культур? А. Температура 250С Б. Температура 180С В. Температура 320С 7. Выберите условия влажности для культивирования каллусных культур? А. Влажность 900С Б. Влажность 600С В. Влажность 300С 8. Выберите условия аэрации для культивирования каллусных культур? А. Аэрация высокая Б. Аэрация низкая В. Аэрация средняя. 9. Какой формы протопласт? А. как амеба Б. круглой В. эллипсоидной Г. квадратной Д. треугольной 10. Технологический воздух для биотехнологического производства стерилизуют… А. антибиотическими веществами. Б. УФ-облучением. В. нагреванием. Г. радиацией в малых дозах. Д. фильтрованием. 11. В качестве экспланта при микроклональном размножении лучше использовать органы, содержащие… А. паренхиму. Б. меристему. В. продящие пучки. Г. паренхиму с проводящими пучками. 12. Пионером метода клонального микроразмножения, показав, что ткани растений in vitro способны к корнеобразованию, является… А. Матес. Б. Уэбстер. В. Морель. Г. Уотсон. 13. Открытие формирования каллуса при заживлении ран у растений было сделано… А. немецким энциклопедистом Дугамелем. Б. французским энциклопедистом Дугамелем. В. французским энциклопедистом Г. французским энциклопедистом Динером. Денвером. Д. итальянским энциклопедистом Дугамелем. 14. Клеточная теория была сформулирована.. А. Шлейденом (1838). Б. Шлейденом (1828). В. Шлейденом (1848). Г. Шванном (1829). Д. Шванном (1839). 15. Автором термина тотипотентность является… А. Дугамел. Б. Шлейден. В. Шванн. Г. Габерландт. Д. Фехтинг. 118 16.Наличие полярности у фрагментов стеблей выявил… А. Дугамел. Б. Шлейден. В. Шванн. Г. Гебель. Д. Фехтинг. 17. Впервые определил минимальные размеры эксплантов, пр которых происходило деление клеток… А. Дугамел. Б. Шлейден. В. Шванн. Г. Рехингер Д. Фехтинг. 18. Впервые асептические условия культивирования тканей растений применил в своих работах… А. Дугамел. Б. Шлейден. В. Шванн. Г. Габерландт. Д. Фехтинг. 19. Впервые серию экспериментов по культивированию изолированных зародышей крестоцветных на растворе минеральных солей и сахарозы провел … А. Дугамел. Б. Шлейден. В. Шванн. Г. Ханниг Д. Фехтинг. 20. Практическое применение метода культуры изолированных зародышей было реализовано в 1925 г. в работах… А. Дугамела. Б. Фехтинга В. Габерландта. Г. Лайбаха Д. Фехтинга. 21. Настоящая история развития метода культуры изолированных тканей растений начинается с работ известных ученых… А. Дугамела и Фехтинга Б. Габерландта и Готре. В. Уайта и Готре. Г. Лайбаха и Фехтинга. Д. Фехтинга и Уайта. 22. Фитогормон ауксин был открыт … А. в 1920 г. Вентом. Б. в 1926 г. Венгом. В. в 1926 г. Уайтом. Г. в 1926 г. Вентом. Д. в 1920 г. Фехтингом. 23. В 1954 г. Готре издал каталог растений, ткани которых выращивались в культуре. Этот список включал …. А. 140 растений. Б. 1400 растений. В. 145 растений. Г. 142 растения. Д. 42 растения. 24. Сотрудник лаборатории Скуга Миллер в 1955 г. отделил от дрожжевой ДНК активный стимулятор клеточного деления и назвал его… А. ауксином Б. кинетином В. гиббереллином Г. тимином Д. триптофаном 25. Впервые эксперименты, показавшие возможность индуцировать деление отдельной изолированной клетки и образование из неё каллусной ткани показали… А. Скуг и Миллер в 1954 г. Б. Мьюир и Хильдебрандт в 1954 г. В. Мьюир и Хильдебрандт в 1944 г. Г. Васил и Хильдебрандт в 1954 г. Д. Райнерт и Стьюард в 1965 г. 26. Каллусная ткань 119 А. гетерогенна Б. гомогенна В. моногенна Г. полигенна 27. Культура протопластов получила развитие начиная с работ, выполненных в Нотингемском университете в Англии в 1960 г…. А. Вентом. Б. Уайтом. В. Фехтингом. Г. Коккингом 28. Свойство тотипотентности растительной клетки лежит в основе получения… А. биологически активных веществ Б. растений-регенерантов В. гибридных растений Г. полиплоидных растений 29. Термин «протопласты» применяют для обозначения структур, которые образуются… А. после полного удаления органоидов Б. после полного удаления клеточной клеток растений, микроорганизмов, стенки у клеток растений, животных. микроорганизмов, животных. В. после полного удаления мембран Г. после полного удаления клеточной растений, микроорганизмов, животных. стенки у клеток растений. 30. Протопласты растительных клеток были впервые выделены… А. ферментативно Б. механически В. гидролитически Г. случайно 31 . Протопласты растительных клеток энзиматическим путем впервые выделил… А. Сэлтон Б. Коккинг В. Клеркер Г. Саймон 32. При механическом выделении протопластов клетки погружают в … А. плазмолитик Б. фермент В. воду Г. спирт 33. Для разрушения клеточной стенки растений впервые использовали фермент… А. пектиназу Б. целлюлазу В. амилазу Г. гидролазу 34. В настоящее время для разрушения клеточной стенки растений используют препараты ферментов… А. пектиназ и целлюлаз Б. целлюлаз и гидролаз В. амилаз и пектиназ Г. гидролаз и пектиназ 35. После фильтрации инкубационной смеси на фильтре остаются… А. протопласты Б. клеточные осколки В. кусочки растительной ткани Г. митохондрии 36. При выделении протопластов из суспензионных культур оптимальна стадия роста … А. стационарная Б. деградации клеток В. латентная Г. поздняя логарифмическая 37. При химическом методе слияния протопластов действующей силой служит… А. полиэтиленгликоль Б. постоянное электрополе В. переменное электрополе Г. магнитное притяжение 38. При слиянии протопластов видоспецифичность… А. характерна Б. не характерна В. сначала характерна, затем не характерна Г. сначала не характерна, затем характерна 39. В соматическом гибриде оба партнера имеют цитоплазматический статус… А. равный Б. не равный В. в соотношении 1:2 Г. в соотношении 2:1 40. Наиболее подходящая стадия развития пыльников для культивирования – 120 А. одноклеточные микроспоры или в Б. многоклеточные микроспоры течение первого митоза В. мейоз Г. другое 41. Гаплоидные растения… А. фертильны Б. стерильны В. сначала фертильны, затем стерильны Г. сначала стерильны, затем фертильны 42. В культуре пыльцы появление диплоидных растений … А. возможно Б. невозможно В. сначала возможно, затем невозможно Г. сначала не возможно, затем возможно 43. В экзосимбиотических ассоциациях Rhizobium с клетками бобовых растений бактероиды… А. образуются Б. не образуются В. сначала образуются, затем не образуются Г. сначала не образуются, затем образуются 44. Свободноживущие азотфиксаторы в ассоциациях с растительными клетками нитрогеназную активность… А. обнаруживают Б. не обнаруживают В. сначала обнаруживают, затем не Г. сначала не обнаруживают, затем обнаруживают обнаруживают 45. Для растительных клеток оптимальна рН среды культивирования… А. 1.5 - 2.5 Б. 5.0 - 5.5 В. 6.5 - 7.0 Г. 9.0 - 10.0 46. Впервые успешное культивирование растительных тканей на синтетических питательных средах осуществили… А. Роббинс и Котте Б. Уайт и Готье В. Хеллер и Нич Г. Уотсон и Крик 47. Нормальные клетки растений от опухолевых морфологически А. отличаются Б. не отличаются В. сначала отличаются, затем не Г. сначала не отличаются, затем отличаются отличаются 48. Преимущество растительного сырья, получаемого при выращивании культур клеток перед сырьем, получаемым из плантационных или дикорастущих растений: А. большая концентрация целевого Б. меньшая стоимость; продукта; В. стандартность; Г. более простое извлечение целевого продукта. 49. Ауксины – термин, под которым объединяются специфические стимуляторы роста: А. растительных тканей; Б. актиномицетов; В. животных тканей; Г. эубактерий. 50. Технологический воздух для биотехнологического производства стерилизуют: А. нагреванием; Б. фильтрованием; В. облучением. 51. Гибридизация протопластов возможна, если клетки исходных растений обладают: А. половой совместимостью; Б. половой несовместимостью; В. совместимость не имеет существенного значения. Тема 3. ПОЛУЧЕНИЕ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ 1. Какие соединения можно отнести к числу первичных? А. белки Б. терпеноиды 121 В. органические кислоты Г. фенольные соединения Д. жиры 2. Какие соединения нельзя отнести к числу первичных? А. терпеноиды Б. фенольные соединения В. белки Г. жиры Д. углеводы 3. Какие соединения можно отнести к числу вторичных? А. белки Б. углеводы В. жиры Г. терпеноиды Д. фенольные соединения 4. Какие соединения нельзя отнести к числу вторичных? А. терпеноиды Б. фенольные соединения В. белки Г. стероиды Д. углеводы 5. Особенно богаты вторичными метаболитами А. микроорганизы Б. животные В. растения Г. животные и растения Д. человек 6. Продукты вторичного обмена содержат: А. только листья Б. только стебли В. только корни Г. листья и стебли Д. все органы (листья, стебли, корни). 7. Продуктами первичного обмена являются: А. фенолы, белки, липиды, нуклеиновые Б. углеводы, белки, липиды, нуклеиновые кислоты кислоты В. углеводы, стероиды, липиды, Г. углеводы, белки, терпеноиды, нуклеиновые кислоты нуклеиновые кислоты Д. углеводы, белки, липиды, алкалоиды 8. Продуктами вторичного обмена являются: А.липиды, алкалоиды, терпеноиды, Б. фенолы, углеводы, терпеноиды, стероиды стероиды В. фенолы, алкалоиды, белки, стероиды Г. фенолы, алкалоиды, терпеноиды, стероиды Д. фенолы, алкалоиды, терпеноиды, нуклеиновые кислоты 9. Алкалоиды используются в получении: А. биостимуляторов Б. лекарств В. антиоксидантов, пищевых красителей, пищевых добавок 10. Стероиды и терпеноиды используются в получении: А. биостимуляторов Б. лекарств В. антиоксидантов, пищевых красителей, пищевых добавок 11. Фенольные соединения используются в получении: А. биостимуляторов Б. лекарств В. антиоксидантов, пищевых красителей, пищевых добавок 12. Липиды используются при производстве А. различных масел Б. разнообразных сахаров В. колбасных изделий 122 13. Углеводы используются при производстве А. различных масел Б. разнообразных сахаров В. колбасных изделий 14. Белки используются при производстве А. различных масел Б. разнообразных сахаров В. колбасных изделий 15. К алкалоидам не относятся А. истинные алкалоиды Б. протоалкалоиды В. псевдоалкалоиды Г. мезоалкалоиды Д. аутоалкалоиды 16. К фенольным соединениям не относятся А. оксибензойные кислоты Б. кумарины В. флавоноиды Г. лимарины Д. ванилины 17. К терпеноидам не относится А. ментол Б. изопрен В. авенастерин Г. эргостерол Д. бетулапренол 18. К преимуществам клеточной биотехнологии получения активных веществ по сравнению с использованием традиционного сырья не относят: А. получение биомассы клеток не зависит Б. можно оптимизировать и от климата, мезона, погоды, почвенных стандартизировать условия выращивания условий клеточных структур, синтезирующих нужные метаболиты В. процесс получения биомассы клеток Г. процесс получения одних активных можно полностью автоматизировать веществ можно перепрофилировать на другие Д. получение необходимых веществ практически не наносит ущерба живой природе 19. Воробейник в культуре in vitro образует красителя шиканина чем само растение больше в: А. в 100 раз Б. в 10 раз В. в 1000 раз Г. в 50 раз Д. в 30 раз 20. На образование вторичных метаболитов не влияет: А. состав питательной среды, на которой Б. длительность и интенсивность выращиваются клеточные культуры, в том освещения числе углеводы, гормоны и предшественники В. действие мутагенов Г. белки, жиры Д. клеточная селекция (отбор наиболее продуктивных клеток) 21. Отбор клеток с повышенным содержанием вторичных соединений позволяет получить культуры с более: А. чистой продукцией Б. высоким содержанием искомых веществ В. низким содержанием искомых веществ 22. Воздействие мутагенами способствует получению культур, способных к: А. получению более чистой продукцией Б. сверхпродукции вторичных метаболитов вторичных метаболитов 123 В. одновременной продукции разных вторичных метаболитов 24. Какие факторы способствуют усилению синтеза вторичных соединений в клеточных культурах растений? А. освещение Б. гормоны В. ультрафиолетовое излучение Г. мутагены Д. дополнительное увлажнение 25. Отметьте наиболее эффективный современный способ получения винкамицина, образуемого барвинком… А. выращивание растений на обычном поле Б. выращивание растений в оптимальных условиях (в оранжерее) В. получение винкамицина с помощью Г) выявление гена, ответственного за культуры ткани барвинка образование винкамицина, введение его в геном дрожжей и получение винкамицина с помощью дрожжей. Д. определение структуры винкамицина и синтез его химическим путем 26. Отметьте положительные моменты способа получения винкамицина, образуемого барвинком при выращивании в обычном поле… А. Небольшие затраты Б. независимость от погодных условий В. Независимость от дорогостоящих Г. Полный контроль за производство веществ (гормоны, ростовые вещества) препарата Д. Возможность получения чистого продукта. 27. Отметьте положительные моменты способ получения винкамицина, образуемого барвинком при выращивании в оранжерее... А. Небольшие затраты Б. Независимость от погодных условий В. Возможность получения чистого Г. Низкая цена продукта Д. Вырождение культуры исключено 28. Отметьте положительные моменты способ получения винкамицина, образуемого барвинком с помощью культуры ткани… А. Небольшие затраты Б. независимость от погодных условий В. Независимость от дорогостоящих Г. Возможность получения чистого веществ (гормоны, ростовые вещества) продукта. Д. Низкая цена. 29. Отметьте положительные моменты способа выявления гена ответственного за образование винкамицина, введение его в геном дрожжей и получение винкамицина с помощью дрожжей .. А. Небольшие затраты Б. Низкая цена В. Независимость от дорогостоящих Г. Возможность получения чистого веществ (гормоны, ростовые вещества) продукта. Д. Вырождение культуры исключено 30. Отметьте положительные моменты способа определения структуры винкамицина и синтеза химическим путем… А. независимость от погодных условий Б. Независимость от дорогостоящих веществ (гормоны, ростовые вещества) В. Небольшие затраты Г. Низкая цена Д. не требуются работники высокой квалификации 124 31. Какие условия нельзя обеспечить способом получения винкамицина, образуемого барвинком при выращивании в обычном поле… А. Небольшие затраты Б. независимость от погодных условий В. Независимость от дорогостоящих Г. Полный контроль за производством веществ (гормоны, ростовые вещества) препарата Д. Низкая цена 32. Какие условия нельзя обеспечить способом получения винкамицина, образуемого барвинком при выращивании в оранжерее... А. Небольшие затраты Б. независимость от погодных условий В. Независимость от дорогостоящих Г. Полный контроль за производство веществ (гормоны, ростовые вещества) препарата Д. получение новых семян Тема 4. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ (ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ) 1. Что является основой генетической инженерии? А. создание рекомбинантной ДНК. Б. выделение хромосом . В. выделение ДНК из организма. Г. получение плазмид. Д. расщепление ДНК на фрагменты. 2. Какие ферменты необходимы для конструирования рекомбинантных ДНК? А. рестриктазы. Б. ДНК-лигазы. В. инвертазы. Г. гидроксилазы. 3. Отметьте векторы, которые наиболее часто используются при проведении генноинженерных работ… А. плазмиды. Б. вирусы. В. бактерии. Г. дрожжи. 4. Какое определение неверно? А. ген –это участок молекулы ДНК, Б. ген – это участок молекулы ДНК, расположенный в хромосоме. расположенный в хлоропласте. В. ген – это участок молекулы ДНК, Г. ген- это участок молекулы ДНК, расположенный в митохондрии. расположенный в оболочке. 5. Какие методы используют для получения трансгенных животных А. инфицирование ретровирусами. Б. макроиньекции В. трансформированные стволовые клетки. Г. использование Ti-плазмид. Д. прямое введение генов в протопласт. 6. Какие методы используют для получения для получения трансгенных растений? А. инфицирование ретровирусами. Б. микроиньекции. В. трансформированные стволовые клетки. Г. использование Ti-плазмид. Д. прямое введение генов в протопласт. 7. Какие соединения образуются в процессе транскрипции? А. синтез аминокислот. Б. синтез ДНК. В. синтез РНК. Г. синтез белков Д. синтез углеводов 8. Какие соединения образуются в процессе в процессе трансляции? А. синтез аминокислот. Б. синтез ДНК. В. синтез РНК. Г. синтез жиров. Д. синтез белков. 9. Кольцевая молекула ДНК характерна для клетки: А. бактериальной. Б. растительной. В. животной. Г. грибной. 10. Собственную ДНК имеют: А. хлоропласты. Б. лизосомы. 125 В. рибосомы. Г. эндоплазматическая сеть. 11. Клонирующие векторы должны иметь А. крупный размер Б. хорошую проницаемость в клеточной мембране В. не способность размножаться в клетке Г. малый размер реципиента Д. плохую проницаемость в клеточную мембрану 12. Фермент лигаза используется в генетической инженерии поскольку… А. осуществляет сшивание фрагментов Б. катализирует включение вектора в ДНК, образуемых в процессе репликации за хромосому клеток хозяина. счет образования фосфоэдифирных связей между соседними нуклеотидами В. катализирует замыкание пептидных Г. скрепляет вектор с оболочкой клетки мостиков в пептидогликане клеточной хозяина. стенки. Д. катализирует ковалентное связывание углеводно-фосфорной цепи ДНК гена с ДНК вектора. 13. Субстратами рестриктаз, используемых в генной инженерии, являются… А. гетерополисахариды. Б. полисахариды. В. белки. Г. гомополисахариды. Д. нуклеиновые кислоты. 14. Прямой перенос чужеродной ДНК в протопласты возможен с помощью… А. гибридом. Б. трансформации. В. микроинъекции. Г. культивирования протопластов на соответствующих питательных средах Д. упаковки в липосомы. 15. Функцией нуклеаз является А. сшивание фрагментов ДНК, образуемых Б. расщепление молекул нуклеиновых в процессе репликации за счет образования кислот, путем отщепления по одному фосфоэдифирных связей между соседними нуклеотиду или небольших нуклеотидами олигонуклеотидов В. наращивание на концах фрагментов ДНК однонитевых участков, путем последовательного присоединения нуклеотидов 16. Функцией теминальных трансфераз является А. сшивание фрагментов ДНК, образуемых Б. расщепление молекул нуклеиновых в процессе репликации за счет образования кислот, путем отщепления по одному фосфоэдифирных связей между соседними нуклеотиду или небольших нуклеотидами олигонуклеотидов В. наращивание на концах фрагментов ДНК однонитевых участков, путем последовательного присоединения нуклеотидов 17. Функцией рестриктаз является А. сшивание фрагментов ДНК, образуемых Б. расщепление молекул нуклеиновых в процессе репликации за счет образования кислот, путем отщепления по одному фосфоэдифирных связей между соседними нуклеотиду или небольших 126 нуклеотидами олигонуклеотидов В. узнавание специфических последовательностей (4-6 нуклеотидов) ДНК и расщепление их в строго определенных местах 18. ДНК И РНК полимеразы обладают общим свойством вести А. матричный синтез нуклеиновых кислот в Б. матричный синтез нуклеиновых кислот в направлении 3→5 направлении 5→3 В. матричный синтез ДНК в направлении 3→5 19. Функция ревертазы или РНК –зависимой полимеразы связана с А. синтезом ДНК на матрице мРНК Б. синтезом РНК на матрице ДНК В. синтезом РНК на матрице мРНК 20. К достоинствам использования дрожжевых клеток для получения разнообразных продуктов промышленного назначения не относится А. они имеют сравнительно малые размер Б. высокая генетическая стабильность при генома культивировании В. короткое время регенерации Г. длительное время регенерации Д. рост на дешевых субстратах 21. В качестве объекта клонирования экспрессии рекомбинантных ДНК чаще всего используют А. Saccharomyces lactis Б. Saccharomyces cereviseae В. Salmonella Г. Streptococcus lactis 22. К методам получения трансгенных животных не относится А. макроиньекции Б. вирусный В. микроиньекции Г. бактериальный Д. эмбриональный 23. Для введения ДНК в клетки растений наиболее пригодны липосомы, состоящие А. из фосфатидилсерина Б. из холестирина В. из фосфатидилсерина и холестирина 24. Для получения трансгенных растений используют рекомбинантные ДНК упакованные в А. хлоропласты Б. митохондрии В. липосомы 25. Рекомбинантные или гибридные ДНК образуются при объединении фрагментов ДНК А. выделенных из одного и того же Б. выделенных из различных организмов организма В. синтезированных химическим путем Тема 5. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ (ПРИМЕНЕНИЯ) 1. Какое из приведенных определений является правильным? А. гибридомы – это клетки, полученные Б. гибридомы – это клетки, полученные путем слияния опухолевых клеток с путем слияния протопластов с нормальными клетками животного или нормальными клетками животного или растения растения В. гибридомы – это клетки, полученные Г. гибридомы – это клетки, полученные путем слияния паренхимных клеток с путем слияния яйцеклеток с нормальными нормальными клетками животного или клетками животного или растения растения 127 2. Методы диагностики заболеваний основаны на обнаружении в крови больного человека или животного специфических А. аминокислот Б. ДНК В. антител Г. рибосом Д. плазмид 3. Выделите продукты генной инженерии не используемые в фармакологии – А. ферменты Б. пищевые добавки В. гормоны Г. искусственные подсластители Д. пищевые красители 4. Выделите продукты генной инженерии не используемые в пищевой промышленности А. пищевые красители Б. пищевые добавки В. ферменты Г. белки Д. гормоны 5. Какие соединения являются продуктами микробиологического производства на основе генно-инженерных технологий? А. гормоны Б. органические кислоты В. интерфероны Г. аминокислоты Д. этанол 6. Что происходит с нуклеиновыми кислотами, попадающими в организм человека вместе с продуктами питания? А. проникают в клетки эпителия кишечника Б. разлагаются экзонуклеазами и там встраиваются в обмен веществ В. ничего не происходит Г. в продукте питания нуклеиновые кислоты обычно не содержатся 7. РНК-зависимая ДНК-полимераза иначе называется А. лигаза Б.ревертаза В.полимераза 8. Фермент, который осуществляет связывание фрагментов ДНК. А. лигаза Б.ревертаза В.полимераза 9. Фермент, который осуществляет синтез ДНК на матрице ДНК. А. лигаза Б.ревертаза В.полимераза 10. Фермент, который сокращает двойную спираль ДНК с обоих концов. А. нуклеаза Б.ревертаза В.полимераза 11. Преимуществами генно–инженерного инсулина являются А.А. высокая чистота продукта Б. Б. меньшая аллергенность В. В. высокая активность Г. Г. большая стабильность Д. Д. меньшая токсичность 12. К преимуществам получения видоспецифических для человека белков путём микробиологического синтеза не относится А. простота оборудования Б. экономичность В. качество сырья Г. снятие этических проблем Д. стабильность производства 13. Трансгенные организмы получают путем ввода чужеродного гена в А. соматическую клетку Б. яйцеклетку В. сперматозоид Г. митохондрии 128 14. Год, когда впервые показана роль нуклеиновых кислот в передаче наследственной информации А. 1940 Б. 1944 В. 1953 Г. 1957 Д. 1961 15. Год, когда была создана модель двойной спирали ДНК А. 1940 Б. 1944 В. 1953 Г. 1957 Д. 1941 16. Первым объектом генной инженерии стала А. E.coli Б. S.cerevisae В. B.subtilis Г. Candida utilis Д. Chlorella 17. Год рождения генной инженерии А. 1971 Б. 1972 В. 1973 Г. 1974 Д. 1981 18. С помощью методов генной инженерии нельзя … А. провести генетическую паспортизацию. Б. диагностировать генетические заболевания. В. создавать ДНК-вакцины. Г. получить побеги из каллуса растений. Д. проводить генотерапию различных заболеваний. 19. Ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК называются … А. рестриктазы. Б. лигазы. В. полимеразы. Г. транскриптазы. Д. обратные транскриптазы. 20. Ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК называются … А. полимеразы. Б. рестриктазы. В. обратные транскриптазы. Г. лигазы. Д. транскриптазы. 21. Ферменты, синтезирующие ДНК на матрице РНК называются … А. транскриптазы. Б. обратные транскриптазы. В. полимеразы. Г. рестриктазы. Д. лигазы. 22. Ферменты, соединяющие фрагменты ДНК называются … А. лигазы. Б. полимеразы. В. рестриктазы. Г. обратные транскриптазы. Д. транскриптазы. 23. Впервые рестриктаза, которая расщепляла неметилированную ДНК была выделена… А. в 1968 г. Мезельсоном и Юанем. Б. в 1961 г. Мезельсоном и Юанем. В. в 1954 г Мезельсоном и Уайтом. Г. в 1968 г. Юанем. Д. в 1946 г.Мишером и Юанем. 24. Впервые ДНК-полимераза была выделена Корнбергом с сотрудниками в 1958 году из … А. E. coli. Б. S.cerevisae В. B.subtilis Г. Candida utilis Д. Chlorella 129 25. Причина невозможности непосредственной экспрессии гена человека в клетке прокариот: А. высокая концентрация нуклеаз; Б. невозможность репликации плазмид; В. отсутствие транскрипции; Г. невозможность сплайсинга. 26. Прямой перенос чужеродной ДНК в протопласты возможен с помощью: А. микроинъекции; Б. трансформации; В. упаковки в липосомы; Г. культивирования протопластов на соответствующих питательных средах. 27. Субстратами рестриктаз, используемых генным инженером, являются: А. гомополисахариды; Б. гетерополисахариды; В. нуклеиновые кислоты; Г. белки. 28. Ген маркер» необходим в генетической инженерии: А. для включения вектора в клетки хозяина; Б. для отбора колоний, образуемых клетками, в которые проник векто В. для включения «рабочего гена» в вектор;Г. Г. для повышения стабильности вектора. 29. Понятие «липкие концы» применительно к генетической инженерии отражает: А. комплементарность нуклеотидных Б. взаимодействие нуклеиновых кислот и последовательностей; гистонов; В. реагирование друг с другом 8Н-групп с Г. гидрофобное взаимодействие липидов. образованием дисульфидных связей; 30. Поиск новых рестриктаз для использования в генетической инженерии объясняется: А. различиями в каталитической Б. различным местом воздействия на активности; субстрат; В. видоспецифичностью; Г. высокой стоимостью. 31. Успехи генетической инженерии в области создания рекомбинантных белков больше, чем в создании рекомбинантгных антибиотиков, что объясняется: А. более простой структурой белков; Б. трудностью подбора клеток хозяев для биосинтеза антибиотиков; В. большим количеством структурных Г. проблемами безопасности генов, включенных в биосинтез производственного процесса. антибиотиков; 32. Фермент лигаза используется в генетической инженерии поскольку: А. скрепляет вектор с оболочкой клетки Б. катализирует включение вектора в хозяина; хромосому клеток хозяина; В. катализирует ковалентное связывание Г. катализирует замыкание пептидных углеводно-фосфорной цепи ДНК гена с мостиков в пептидогликане клеточной ДНК вектора; стенки. 33. Биотехнологу «ген-маркер» необходим: А. для повышения активности Б. для образования компетентных клеток рекомбинанта; хозяина; В. для модификации места взаимодействия Г. для отбора рекомбинантов. рестриктаз с субстратом; 34. Ослабление ограничений на использование в промышленности микроорганизмов-рекомбинантнов, продуцирующих гормоны человека, стало возможным благодаря: А. совершенствованию методов изоляции Б. повышению квалификации персонала, генно-инженерных рекомбинантов от работающего с рекомбинантами; 130 окружающей среды; В. установленной экспериментально слабой Г. экспериментальному подтверждению жизнеспособности рекомбинанта; обязательной потери чужеродных генов. 35. Вектор на основе плазмиды предпочтительней вектора на основе фаговой ДНК благодаря: А. большому размеру; Б. меньшей токсичности; В. большей частоты включения; Г. отсутствия лизиса клетки хозяина. 36. Для того чтобы искусственно получать человеческий инсулин методами генной инженерии в промышленных масштабах, необходимо: А. ввести бактериальный инсулин в Б. искусственно синтезировать инсулин в организм человека биохимической лаборатории В. выращивать культуру клеток Г. ввести ген, отвечающий за синтез поджелудочной железы человека, инсулина в бактерии, которые начнут отвечающей за синтез инсулина синтезировать человеческий инсулин 37. Назовите соединения, которые все производят с помощью методов генетической инженерии А. овестин, инсулин, соматотропин Б. инсулин, соматотропин, интерферон В. тироксин, соматотропин, интерферон Г. инсулин, тироксин, овестин Д. овестин, соматотропин, интерферон Тема 6. БИОТЕХНОЛОГИЯ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ 1. Укажите, какие микроорганизмы применяются (или могут применяться) для азотного питания пшеницы? А. Clostridium Б. Azospirillum В. Azotobacter Г. Azola 2. Укажите, какие микроорганизмы применяются (или могут применяться) для азотного питания кукурузы? А. Clostridium Б. Azospirillum В. Azotobacter Г. Azola 3. Укажите, какие микроорганизмы применяются (или могут применяться) для азотного питания гороха? А. Clostridium Б. Azospirillum В. Azotobacter Г. Azola 4. Укажите, какие микроорганизмы применяются (или могут применяться) для азотного питания риса? А. Clostridium Б. Azospirillum В. Azotobacter Г. Azola 5. Для проведения исследований необходимы клетки с синхронным делением. Какой способ лучше применить? А. Небольшое скопление (часть каллусной Б. Выделение отдельной клетки культуры) В. Пересев культуры на свежую воду Г. Из каллусной культуры это сделать невозможно Д. использовать измельченные ткани растений 6. Для проведения исследований необходимы клетки с синхронным делением, что для этого требуется? А. Свежая питательная среда Б. Микроманипулятор В. Микроскоп Г. Создание тумана Д. Пониженная температура 131 7 . Для проведения исследований необходима генетически неоднородная клеточная культура. Можно ли ее получить из каллусной ткани и какой тип ткани выбрать? А. только недавно полученную (свежую) Б. очень старую В. лучше вообще не пытаться 8. Выберите те биотехнологии, которые можно используются в сельском хозяйстве России. А. применение генетически измененных Б. применение ядохимикатов растений В. распыление бактериальных препаратов Г. внесение бактериальных препаратов в для борьбы с насекомыми почву Д. получение технического этанола из растительных отходов 9. Культура клеток бактерий называется: А. порода Б. штамм В. сорт Г. вид 10. Наличие целлюлозной клеточной стенки характерно для: А. бактериальной клетки Б. животной клетки В. растительной клетки Г. все ответы верны 11. Клетки животных, в отличие от клеток растений, не имеют: А. пластид Б. клеточной мембраны В. митохондрий Г. рибосом 12. Клетки животных относят к группе эукариотных, так как они имеют: А. хлоропласты Б. плазматическую мембрану В. оболочку Г. ядро 13. Какие клетки образуются путем мейоза: А. мышечные Б. эпителиальные В. половые Г. нервные 14. Стимулятором роста растений являются: А. ризотрофин. Б. азотоспитиллы. В. гибберелловая кислота. 15. Термин «клон» был предложен А. в 1900 году Веббером Б. в 1903 году Вебером В. в 1903 году Габерландтом 16. Клональное микроразмножение – это А. использование техники «in vivo» для Б. использование техники «in vitro» для быстрого неполового получения растений, быстрого неполового получения растений, идентичных исходному идентичных исходному В. использование техники «in vitro» для быстрого полового получения растений, идентичных исходному 17. Размножение, при котором новый организм развивается из зиготы, образующейся в результате оплодотворения, т.е. слияния мужской и женской половых клеток называется А. Вегетативное Б. Клональное В. Половое Г. Бесполое 18. Образование нового организма из части материнского. Таким образом могут размножаться микроорганизмы, почти все растения и некоторые животные (губки, мшанки, кишечнополостные, простейшие), таким размножением называется А. Половое Б. Вегетативное В. Клональное Г. Бесполое 132 19. Получение in vitro неполовым путем организмов, генетически идентичных исходному, называется А. Половое Б. Вегетативное В. Клональное Г. Бесполое 20. Размножение характеризуется отсутствием полового процесса; такое размножение свойственно одноклеточным и многоклеточным растительным и животным организмам А. Половое Б. Вегетативное В. Клональное Г. Бесполое 21. Клональное микроразмножение не используется А. для массового получения оздоровленных Б. для сохранения в культуре новых растений перспективных сортов В. для сохранения редких и исчезающих Г. для ускорения размножения селекции растений древесных растений необычной формы Д. для ускорения роста растений 22. Генетической стабильностью обладают А. меристематические ткани Б. паренхима В. ксилема Г. флоэма 23. Для клонального микроразмножения преимущественно используют А. пазушные меристемы Б. камбий В. верхушечные меристемы стебля и корня 24.Для уничтожения инфекции растения подвергают А. температурной обработке Б. химической обработке В. облучения УФ - светом Г. облучение ИК – светом Д. обработке мутагенами 25.Технология микроклонального размножения с помощью выращивания верхушечных меристем проходит в стирильных условиях на среде с фитогармонами А. гиббереллинами Б. цитокининами В. ауксинами 26. К методам селекций растения не относятся А. изолированные завязи Б. изолированные эмбрионы В. слияние протопластов 27. Дальнородственные гибриды можно создать с помощью А. соматической гибридизацией (слиянием Б. половым путем протопластов) В. слияние ядер 28. Способность к азотфиксации присуща А. всем растениям Б. только бобовым В. только некоторым прокариотным микроорганизмам 29. В 1893 году С.Н. Виноградский выделил и описал А. азотфиксирующую аэробную бактерию Б. азотфиксирующую анаэробную бактерию Clostridium pasterianum Clostridium pasterianum В. азотфиксирующую анаэробную бактерию Clostridium thermoaceticum 30. Помимо клостридий в почве обитают азотфиксирующин аэробные бактерии А. рода Azotobacter, почвенные Б. рода Azotobacter, почвенные цианобактерии и архебактери цианобактерии, архебактерии и фотосинтезирующие бактерии В. почвенные цианобактерии, архебактери и 133 фотосинтезирующие бактерии 31. Наиболее активными азотфиксаторами считаются клубеньковые бактерии А. рода Azotobacter Б. рода Rhizobium В. Clostridium Тема 7. ИММОБИЛИЗОВАННИЕ ФЕРМЕНТЫ 1. Раздел молекулярной биологии и биохимии изучающей свойства, строения и механизмы действия ферментов называется А. эмбриология Б. энзимология В. цитология 2. Ферменты применяются в пищевой промышленности А. для производства лекарственных Б. для выпечки хлеба, производства пива препаратов В. для повышения качества и усвояемости Г. для защиты растений от насекомых кормов вредителей Д. для переработки молочных продуктов, осветления соков 3. Ферменты применяются в медицине А. для производства лекарственных Б. для выпечки хлеба, производства пива препаратов В. для повышения качества и усвояемости Г. для защиты растений от насекомых кормов вредителей Д. для переработки молочных продуктов, осветления соков 4. Ферменты применяются в животноводстве А. для производства лекарственных Б. для выпечки хлеба, производства пива препаратов В. для повышения качества и усвояемости Г. для защиты растений от насекомых кормов вредителей Д. для переработки молочных продуктов, осветления соков 5. Ферменты применяются в растениеводстве А. для производства лекарственных Б. для выпечки хлеба, производства пива препаратов В. для повышения качества и усвояемости Г. для защиты растений от насекомых кормов вредителей Д. для переработки молочных продуктов, осветления соков 6. Какие силы действуют при иммобилизации ферментов? А. ионные взаимодействия Б. адсорбция В. водородные связи 7. Какие аппараты работают (или могут работать) с использованием иммобилизованных ферментов? А. искусственная почка Б. искусственное сердце В. биофильтр для очистки сточных вод 8. Экономическое преимущество биотехнологического производства, основанного на иммобилизованных биообъектах, перед традиционным обусловлено… А. многократным использованием Б. более дешевым сырьем биообъекта В. меньшими затратами труда Г. ускорением производственного процесса Д. стабильностью процесса 134 9. Технология, основанная на иммобилизации биообъекта, уменьшает наличие в лекарственном препарате таких примесей, как… А. механические частицы Б. следы органических растворителей В. следы тяжелых металлов Г. белки Д. следы низкомолекулярных соединений 10. Целями иммобилизации ферментов в биотехнологическом производстве являются… А. повышение стабильности Б. повышение селективности В. повышение удельной активности Г. расширение субстратного спектра Д. многократное использование 11. Иммобилизация индивидуальных ферментов ограничивается А. высокой лабильностью фермента Б. принадлежностью фермента к лигазам В. наличием у фермента субъединиц Г. наличием у фермента кофермента Д. принадлежностью фермента к гидролазам 12. Для растворения тромбов в кровеносных сосудах используют иммобилизованную… А. стрептокиназу Б. галактозидазу В. уреазу Г. энтерокиназу 13. Целями иммобилизации ферментов в биотехнологическом производстве являются: А. повышение удельной активности; Б. повышение стабильности; В. расширение субстратного спектра; Г. многократное использование. 14. Активирование нерастворимого носителя в случае иммобилизации фермента необходимо: А. для усиления включения фермента в Б. для повышения сорбции фермента; гель; В. для повышения активности фермента; Г. для образования ковалентной связи. 15. Иммобилизация индивидуальных ферментов ограничивается таким обстоятельством, как: А. высокая лабильность фермента; Б. наличие у фермента кофермента; В. наличие у фермента субъединиц; Г. принадлежность фермента к гидролазам. 16. Иммобилизация целых клеток продуцентов лекарственных веществ нерациональна в случае: А. высокой лабильности целевого продукта Б. использования целевого продукта только (лекарственного вещества); в инъекционной форме; В. внутриклеточной локализации целевого Г. высокой гидрофильности целевого продукта; продукта; 17. Иммобилизация клеток продуцентов целесообразна в случае, если целевой продукт: А. растворим в воде; Б. не растворим в воде; В. локализован внутри клетки; Г. им является биомасса клеток; 18. В настоящее время ферменты получают преимущественно из А. клеток растений Б. клеток животных В. бактерий 19. Иммобилизованные ферменты А. растворимы в воде Б. не растворимы в воде В. частично растворимы 20. К основные преимуществам иммобилизованных ферментов по сравнению с традиционными ферментными препаратами не относятся 135 А. стабильность Б. долго сохраняют активность В. легко отделяются от реакционной среды Г. водонерастворимые Д. водорастворимые 21. Фермент инвертаза расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу, его получают А. из пивных дрожжей (Saccharomyces Б. из дрожжей (Saccharomyces lactis и cerevisiae и Saccharomyces carsbergensis) Saccharomyces carsbergensis) В. из дрожжей (Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces lactis) 22. Применение иммобилизованной лактазы позволяет получать: А. концентрированные молочные продукты Б. увеличить питательность смесей для и избегать добавления химических детского питания стабилизаторов в мороженное В. применять ее в качестве корма для Г. применять ее в качестве лекарства в животных и птицы медицине Д. применять ее для производства пива 23. Ферментативный гидролиз лактозы в молочной сыворотке А. позволяет применять ее в качестве корма Б. применять ее в качестве лекарства в для животных и птицы. медицине В. применять ее для производства пива 24. Иммобилизованные ферменты применяются в перерабатывающей промышленности для А. гидролиза целлюлозы и получения Б. осветления фруктовых соков глюкозы в качестве корма для животных и птиц В. получения из перекиси водорода кислорода, необходимый для превращения латекса в губчатую резину 25. Иммобилизованные ферменты применяются в текстильной промышленности для А. гидролиза целлюлозы и получения Б. извлечения шерсти из обрезков шкур глюкозы в качестве корма для животных и птиц В. получения из перекиси водорода кислорода, необходимый для превращения латекса в губчатую резину 26. Иммобилизованные ферменты применяются в пищевой промышленности для А. гидролиза целлюлозы и получения Б. осветления фруктовых соков глюкозы в качестве корма для животных и птиц В. получения из перекиси водорода кислорода, необходимый для превращения латекса в губчатую резину 27. Иммобилизованные ферменты применяются в химической промышленности для А. гидролиза целлюлозы и получения Б. осветления фруктовых соков глюкозы в качестве корма для животных и птиц В. получения из перекиси водорода кислорода, необходимый для превращения латекса в губчатую резину 28. Иммобилизованные ферменты применяются в кожевенная промышленности для 136 А. гидролиза целлюлозы и получения Б. удаления волосяного покрова и глюкозы в качестве корма для животных и смягчения кожи после дубления птиц В. получения из перекиси водорода кислорода, необходимый для превращения латекса в губчатую резину 29. Иммобилизованные ферменты применяются в химической промышленности для А. гидролиза целлюлозы и получения Б. осветления фруктовых соков глюкозы в качестве корма для животных и птиц В. добавления ферментов в стиральные порошки Тема 8. ПИЩЕВАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ 1. Ассоциации молочнокислых бактерий с дрожжами называются: А. сусло. Б. закваска. В. солод. 2. В основе квашения овощей лежит: А. молочнокислое брожение Б. уксуснокислое брожение. В. спиртовое брожение. 3. Для производства кефира необходимы: А. дрожжи. Б. лактобактерии. В. дрожжи и лактобактерии. 4. Уксуснокислое брожение вызывается бактериями рода: А. стрептобактерии. Б. лактобактерии. В. ацетобактер и глюконобактер. 5. Уксус в основном используется: А. в пищевой промышленности. Б. для изготовления лаков. В. в фармацевтической промышленности. 6. Предварительным этапом получения уксуса является: А. получение молочной кислоты. Б. получение этанола. В. получение бутанола. 7. Немецкий способ получения уксуса является: А. быстрым. Б. медленным. В. средней скорости. 8. Основным сырьем для производства лимонной кислоты является: А. картофель. Б. меласса. В. целлюлоза. 9. Глубинный способ получения лимонной кислоты основан на: А. использовании «бродильных камер». Б. использовании чанов. В. использовании ферментаторов. 10. Гриб Aspergillus niger используют для получения: А. лимонной кислоты. В.лимонной кислоты и глюконовой кислоты. Б. глюконовой кислоты. 11. Гриб Aspergillus itaconicus применяют для получения: А. лимонной кислоты. Б. итаконовой кислоты. В. глюконовой кислотты. 12. Витамины поступают в организм: А. с пищей. Б. вырабатываются кишечными бактериями. 137 В. с пищей и вырабатываются кишечными бактериями. 13. Какой витамин получают только микробиологическим синтезом?: А. рибофлавин. Б. В2. В. цианкобаламин – В12. Г. А. Д. аскорбиновая кислота – С. 14. Если при получении глюконовой кислоты нейтрализацию среды при закислении проводят мелом, то получают: А. натрия глюконат. Б. кальция глюконат. В. гипс. 15. Культивирование микроорганизмов при различных видах брожения ведут в основном при: А. 20 - 35C. Б. 10 - 12C. В. 45 - 55C. 16. В основе пивоварения лежит: А. уксуснокислое брожение. Б. молочнокислое брожение. В. спиртовое брожение. Г. масляно-кислое. 17. Для получения вин используют: А. молочнокислые бактерии. Б. актиномицеты. В. дрожжи. Г. уксуснокислые бактерии. 18. Получение хлебопекарных дрожжей проводят при условии: А. сильной аэрации. Б. без доступа воздуха. В. сначала аэрация, затем без доступа Г. сначала без доступа воздуха, затем воздуха. аэрация. 19. Бактерии семейства Lactobacteriaceae вызывают А. спиртовое брожение. Б. маслянокислое брожение. В. молочнокислое брожение. Г. уксуснокислое брожение. 20. Карбонат кальция добавляют в питательную среду для роста молочнокислых бактерий для: А. нейтрализации среды. Б. очищения среды. В. стерилизации среды. Г. подкисления среды. 21 Молочнокислые бактерии встречаются: А. в почве. Б. в воде. В. в молоке и молочных продуктах. Г. в муке. 22. В России, Украине сырьем для производства этанола является: А. рис, ячмень, овес Б. тростниковая меласса, свекловичная меласса. В. свекловичная меласса, пшеница, Г. ячмень, пшеница, рис. картофель 23. Пророщенное зерно (солод) добавляют в крахмальное сырье для: А. гидролитического расщепления крахмала Б. получения уксуса до глюкозы В. чистоты продукта Г. для придания окраски. 24. В получении каких веществ дрожжи играют важную роль? А. лимонная кислота Б. черный хлеб В. рибофлавин Г. сметана д. пиво 25. В получении каких веществ дрожжи играют важную роль? А. уксус Б. пиво В. белый хлеб Г. творог 138 Д. сметана 26. В получении каких веществ бактерии играют важную роль? А. лимонная кислота Б. сметана В. рибофлавин Г. пиво Д. белый хлеб 27. В получении каких веществ дрожжи играют важную роль? А. творог Б. белый хлеб В. черный хлеб Г.творог Д.сметана 28. Лимонную кислоту получают с помощью? А) стептобактерий В) грибов Б) дрожжей Г) кишечной палочки 29. Процессы молочнокислого брожения наиболее важны при? А. пивоварении Б.получении сметаны В. получении уксуса Г. получении масла Д. замесе белого хлеба 30. Процессы молочнокислого брожения наиболее важны при? А. солении огурцов Б. замесе черного хлеба В. получении лимонной кислоты Г. получении творога Д. получении кумыса 31. Процессы спиртового брожения важны при? А. пивоварении Б получении сметаны В. получении спирта Г получении масла Д. солении огурцов 32. Какие микроорганизмы чаще всего применяются для получения аминокислот? А. пектинолитические грибы Б. винные дрожжи В. ауксотрофные мутанты бактерий Г. другие 33. Какие процессы лежат в основе ферментативного получения соков? А. брожение Б. гниение В. окисление Г. гидролиз Д. синтез 34. Некоторыми объектами микробиотехнолоии являются: А. растения. Б. животные. В. бактерии. 35. Одним из преимуществ микроорганизмов как биообъектов является: А. малые размеры. Б. «простота» организации генома. В. большая распространенность. 36. Микроорганизмы, хорошо переносящие холод называются: А. мезофиллы. Б. термофилы. В. психрофилы. 37. Супертермофилы - это организмы: А. хорошо переносящие холод. Б. переносят температуру до 100ºС. В. переносят температуру выше 100ºС. 38. По сравнению с растительными и животными клетками, микроорганизмы: А. размножаются быстрее. Б. размножаются медленно. В. скорость размножения средняя. 39. Более легкую приспособляемость к среде обитания имеют: А. клетки растений. Б. клетки животных. В. микробы. 40. Ключевым промежуточным продуктом при брожении является: 139 А. пируват. Б. вода. В. молочная кислота. 41. В результате спиртового брожения образуется: А. бутанол. Б. этанол. В. ацетон. 42. Спиртовое брожение вызывают: А. дрожжи. Б. бактерии. В. дрожжи и бактерии. 43. Как действует кислород на процесс брожения: А. подавляет его. Б. стимулирует его. В. никак не влияет. ТЕМА 9. БИОТЕХНОЛОГИЯ В ЭНЕРГЕТИКЕ 1. Какие процессы в метаногенезе являются промежуточными и в конечном итоге ведут к образованию метана? А. полное окисление углеводов Б. маслянокислое брожение В. уксуснокислое брожение Г. образование лизина Д. разложение целлюлозы 2. В метанотенк поместили слишком много древесных стружек. Выберите действия, в результате которых метаногенез ускорится. А. энергичное перемешивание Б. добавление водорода В. добавление активного ила из метатенка, Г. добавление сернокислого аммония где давно уже перебраживает солома Д. добавление воды 3. Какие микроорганизмы можно использовать для получения водорода? А. метилотрофы Б. метанотрофы В. ацетогены Г. цианобактерии Д. дрожжи Е. красные водоросли 4. Биогаз – это смесь, состоящая из … А. 55 % метана, 40 % углекислого газа, 1 % Б. 65 % метана, 30 % углекислого газа, 1 % сероводорода и незначительных примесей сероводорода и незначительных примесей азота, кислорода, водорода и угарного газа азота, кислорода, водорода и угарного газа В. 60 % метана, 35 % углекислого газа, 1 % сероводорода и незначительных примесей азота, кислорода, водорода и угарного газа. 5. Биометаногенез – сложный микробиологический процесс, в котором органическое вещество разлагается в анаэробных условиях до… А. метана и кислорода. Б. метана и диоксида углерода. В. Метана и сероводорода. 6.Для получения биогаза нельзя использовать… А. отходы животноводства и Б. полимерные материалы. растениеводства. В. испорченные продукты. Г. стоки крахмалоперерабатывающих предприятий, жидкие отходы сахарных заводов. Д. бытовые отходы, сточные воды городов. 7 Оптимальными условиями процесса биометаногенеза являются… А. температура от 80 до 100 ºС и значения Б. температура от 30 до 60 ºС и значения рН рН от 6 до 8. от 6 до 8. В. температура от 30 до 60 ºС и значения рН от 2 до 4. 140 8. Получение биогаза широко применяют в … А. США, Китае, Японии. Б. Индии, Китае, Японии. В. Индии, Китае, России. 9. В анаэробном процессе биометаногенеза выделяют несколько последовательных стадий. Сколько их? А. две. Б.три. В.четыре. 10. Основное преимущество биогаза состоит в том, что он является … А. экономичным. Б. возобновляемым источником энергии. В.экологичным. 11. В зависимости от температуры протекания процесса метановые бактерии разделяют на… А. мезо- и термофильные. Б. мега- и термофильные. В. мезо- и термолабильные. 12. Биогаз в основном состоит из: А. СН4 и SОЗ Б. С02 и Н2О В. Н2Р04 и СН4 Г. СО2 и СН4 Д. Н2Р04 и СО2 13. Выделите продукт среди нижеперечисленных, который не является биотопливом А. Метан Б. Рапсовое масло В. Этиловый спирт Г. Метиловый спирт 14. «Гидролизный» спирт получают при сбраживании: А. глюкозы. Б. картофеля. В. древесины. Г. камыша. 15. Ацетон и бутанол получают в результате: А. спиртового брожения Б. ацетонобутилового брожения В. пропионового брожения Г. уксуснокислого брожения 16. В качестве источника энергии спирт используется: А. Бразилии, США, странах ЕС. Б. Бразилии, США, Китае. В. Бразилии, России, Китае. Г. России, Китае, странах ЕС. 17. В мировом производстве первое место занимает производство спирта из сахарного тростника А. Бразилия, Россия. Б. США, Россия. В. Китай, Япония. Г. Бразилия, США. Тема 10. ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ 1. Можно ли купаться в биологическом пруду? А. да, и очень приятно, там вода теплая Б. нет, там плохо пахнет В. нет, там могут быть патогенные бактерии Г) да, там вода очищена 2. Зооглеи это А. один из компонентов активного ила Б. сообщество бактерий, покрытых общей слизистой оболочкой В. иммобилизованные бактерии и Г. симбиоз организмов, покрытых общей водоросли оболочкой 3. Может ли активный ил содержать тяжелые металлы? А. да Б. нет В. не всегда 4. Можно ли применять биофильтры для очистки газов? А) да Б) нет В. не всегда 141 5. Укажите допустимое количество кишечных палочек в 1 литре московской водопроводной воды. А. 1 Б. 10 В. 100 Г. много 6. Где наблюдается самая сильная минерализация органических веществ при самоочищении водоемов? А. в зоне сильной загрязненности Б. в зоне средней загрязненности В. в зоне слабой загрязненности 7. При каких способах переработки может образовываться болотный газ? А. анаэробное сбраживание отходов в Б. аэробная переработка сточных вод в метантенках аэротенках В. биокомпостирование твердых отходов Г. захоронение твердых бытовых отходов. Д. в биологических прудах 8.Цель очистки сточных вод – А. удаление из них взвешенных и Б. удаление из них взвешенных и растворимых органических соединений растворимых органических и неорганических соединений В. удаление из них взвешенных и растворимых неорганических соединений 9. В биофильтрах клетки микробов находятся в А. подвижном состоянии на поверхности Б. неподвижном состоянии на поверхности пористого носителя пористого носителя В. неподвижном состоянии на поверхности плотного носителя 10. Зеленые и сине-зеленые водоросли разрастаются в А. нижних слоях биофильтра Б. верхних слоях биофильтра В. средних слоях биофильтра Тема 11. Биогеотехнология 1. Подберите кислотные условия (рН) для культивирования бактерии Sulfolobus: А. 1.0 Б. 2.0 В. 3.0 Г. 4.0 Д. 5.0 2. Подберите кислотные условия (рН) для культивирования бактерии Thiobacillus ferrooxidans: А. 1.0 Б. 2.0 В. 3.0 Г. 4.0 Д. 5.0 3. Подберите кислотные условия (рН) для культивирования бактерии Acidianus brierleyi А. 1.0 Б. 2.0 В. 3.0 Г. 4.0 Д. 5.0 4. Подберите кислотные условия (рН) для культивирования бактерии Sulfobacillus А. 1.0 Б. 2.0 В. 3.0 Г. 4.0 Д. 5.0 6. Подберите кислотные условия (рН) для культивирования бактерии Metallosphaera А. 1.0 Б. 2.0 В. 3.0 Г. 4.0 142 Д. 5.0 7. Подберите температурные условия для культивирования бактерий Sulfolobus: А. 700С Б. 600С В. 500С Г. 400С 0 Д. 30 Е. 200С 8. Подберите температурные условия для культивирования бактерий Thiobacillus ferrooxidans: А. 700С Б. 600С 0 В. 50 С Г. 400С Д. 300С Е. 200С 9. Подберите температурные условия для культивирования бактерий Acidianus briefly: А. 700С Б. 600С 0 В. 50 С Г. 400С Д. 300С Е. 200С 10. Подберите температурные условия для культивирования бактерий Sulfobacillus: А. 700С Б. 600С В. 500С Г. 400С 0 Д. 30 С Е. 200С ТЕМА 12. КРИОСОХРАНЕНИЕ 1. Какой фактор из указанных, может привести к оскудению генофонда Земли? А. лес Б. человек В. токсины растений Г. хищные животные 2. Какие явления недопустимы при криосохранении? А. сохранение обмена веществ Б. обезвоживание протоплазмы В. сохранение генетического материала Г. образование льда Д. таяние льда 3. Факторы, не влияющие на генофонд организмов: А. УФ-радиация Б. Тяжелые металлы В. Отходы промышленности Г. Дефицит микроэлементов Д. Дефицит белка 4. К традиционным средствам сохранения генофонда не относятся А. Заповедники Б. Ботанические сады В. Коллекция семян растений Г. Лесопарки Д. Фруктовые сады 5. К приемам сохранения генофонда растений в условиях in vitro не относиться А.Коллекция каллусных культурных Б. Коллекция растений в пробирках растений В. Коллекция суспензионных культур Г. Ботанические сады растений Д. Коллекция семян растений 6. К методам, используемых для депонирования коллекций растительных клеток in vitro не относится А. Выращивание культур при низких Б. Добавление к среде осмотиков (маннита, положительных температурах (1-100С) и сорбита, или повышенных концентраций слабой интенсивности освещения (до 50 сахарозы). люкс). В. Повышение атмосферного давления (до 5 мм рт. ст.) 143 7. К методам, используемых для депонирования коллекций растительных клеток in vitro не относятся А. Внесение в питательную среду веществ, Б. Аэрация (выращивание под слоем тормозящих рост культур, например минерального масла для уменьшения абсцизовой кислоты (5-10 мг/л) или ССС доступа кислорода). (хлорхолинхлорида; 2 г/л). В. Добавление к среде осмотиков (маннита, сорбита, или повышенных концентраций сахарозы). 8. К методам, используемых для депонирования коллекций растительных клеток in vitro не относятся А. Выращивание культур при высоких Б. Добавление к среде осмотиков (маннита, температурах (40-100С) и слабой сорбита, или повышенных концентраций интенсивности освещения (до 50 люкс). сахарозы). В. Снижение атмосферного давления (до 0,5 мм рт. ст.) 9. Криосохранение – это А. один из наиболее перспективных Б. древний способ сохранения генофонда способов сохранения генофонда высших высших растений и животных. растений и животных. В. не используемый способ сохранения генофонда высших растений и животных. 10. Криосохранение позволяет хранить органы, ткани и клетки в замороженном состоянии А. при температуре жидкого азота (-1960С). Б. при температуре жидкого азота (-1260С). В. при температуре жидкого азота (-1360С). 144 Терминологический словарь 1. Агробиотехнология (см. Биотехнология сельскохозяйственная). 2. Аквакультура - разведение и выращивание рыбы, других водных животных (моллюсков, ракообразных) и растений (водорослей) с целью получения товарной продукции и пополнения их запасов в естественных водоемах. 3. Антибиотики (лат. «anti» - против + греч. «bios» — жизнь) — вещества природного или полусинтетического происхождения, подавляющие рост живых клеток, чаще всего прокариот или простейших (в т.ч. бактерий, вирусов и др.). 4. Антибиотики ветеринарные - ветеринарные формы антибиотиков. В нашей стране наиболее часто используются тетрациклины, гризин, бацитрацин и витамицин. 5. Бактериофаг (сокр. Фаг) - вирус, инфицирующий бактерию. Его видоизмененные формы используются как клонирующие векторы. 6. Биобезопасность (см. Биологическая безопасность). 7. Биобензин - разновидность биотоплива: смесь бензина с этиловым или бутиловым спиртом. 8. Биобутанол - разновидность биотоплива; бутиловый спирт, получаемый биотехнологическим способом из сахарного тростника, свеклы, кукурузы, пшеницы, маниоки, целлюлозы и др. 9. Биоводород - водород, полученный из биомассы. 10. Биовыщелачивание - восстановление металлов из руды путем использования микроорганизмов. 11. Биогаз - газ, получаемый метановым брожением биомассы (смесь CH4 и CО2). 12. Биогеотехнология - использование геохимической деятельности микроорганизмов в горнодобывающей промышленности. 13. Биогидрометаллургия - извлечение металлов из сырья с использованием химических реакций в водных растворах. 14. Биодатчик (см. Биосенсор). 15. Биодеградация - процесс, при котором органические вещества разрушаются ферментами, вырабатываемыми живыми организмами. 16. Биодизель - биотопливо на основе растительных или животных жиров (масел), а также продуктов их этерификации. 17. Биозавод (см. Биорефайнери). 18. Биоизвлечение - использование микроорганизмов для извлечения ценных материалов (металлов или органических соединений) из сложных смесей. 19. Биоимплант - протез, сделанный из биосинтетического материала. 20. Биоиндустрия (см. Биотехнология промышленная). 21. Биоиндустрия в сельском хозяйстве (см. Биотехнология сельскохозяйственная). 22. Биоинженерия - направленная модификация свойств живых организмов, осуществляемая на генетическом и/или эпигенетическом уровне. Применяется к микроорганизмам, растениям и животным. 23. Биоинформатика (син. - «Вычислительная биология») - биологическая дисциплина, занимающаяся исследованием, разработкой и применением вычислительных методов (в т.ч. компьютерных) и подходов для расширения использования биологических, поведенческих или медицинских данных. 24. Биокластер объединение предприятий, поставщиков оборудования, комплектующих, специализированных производственных и сервисных услуг, научно-исследовательских и образовательных организаций в сфере биотехнологий, связанных отношениями территориальной близости и 145 функциональной зависимости в процессе производства и реализации товаров и услуг. 25. Биоконверсия — преобразование одного химического соединения в другое живыми организмами (отличается от обработки ферментами, фиксированными клетками или действия химических процессов). 26. Биологическая безопасность (сокр. Биобезопасность) - сохранение живыми организмами своей биологической сущности, качеств, системообразующих связей и характеристик, предотвращение широкомасштабной потери биологической целостности. 27. Биологически активные вещества (БАВ) - общее название веществ, имеющих выраженную физиологическую активность. 28. Биологические средства защиты растений - организмы, микробиологические препараты и иные биологические средства, применяемые для борьбы с вредными для сельскохозяйственных культур организмами. 29. Биологическое разнообразие (сокр. Биоразнообразие) - разнообразие жизни во всех ее проявлениях, представленное тремя уровнями: генетическое разнообразие (разнообразие генов и их вариантов - аллелей), разнообразие видов, разнообразие экосистем. 30. Биомасса - совокупная масса растительных и животных организмов, присутствующих в биогеоценозе в момент наблюдения; возобновляемые источники органического материала, который может быть использован в качестве топлива и для промышленного производства. 31. Биомасса инактивированная - стерилизованная биомасса (кормовые дрожжи, грибной мицелий и др.). 32. Биоматериал - 1) материал из живых тканей; 2) синтетический или естественный материал, используемый в медицинском устройстве или в контакте с биологическими системами. 33. Биомедицина - собирательный термин, обозначающий направление на стыке двух наук - медицины и биологии. В ее основе лежит использование для решения медицинских проблем идей и технологий, разработанных в биохимии, иммунологии, клеточной биологии и других биологических науках. 34. Биомедицинские технологии - технологии, используемые в биомедицине. 35. Бионанотехнология (см. Нанобиотехнология). 36. Бионефть – биотопливо второго поколения, синтезируемое из биомассы путем глубокой химической переработки (на основе пиролиза). 37. Биопестицид - соединение, которое убивает организмы в результате специфического биологического действия, а не как химические яды. 38. Биопластик (или органический пластик) - форма пластика, производимого из возобновляемой биомассы (растительных масел, кукурузы и др.) - Имеется биодеградируемая разновидность. 39. Биопленки - слой микроорганизмов, развивающихся на поверхности полимерного материала. 40. Биополимеры — класс полимеров, встречающихся в природе в естественном виде, входящих в состав живых организмов: белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды. 41. Биопрепарат - любой медицинский препарат, происходящий из живых организмов или их продуктов. 42. Биопродукты — материалы, химикаты и энергия, получаемые из возобновляемых биологических источников. 146 43. Биореактор - устройство, осуществляющее перемешивание культуральной среды в процессе микробиологического синтеза. Различают механические, аэрлифтные и газо-вихревые биореакторы. 44. Биорегион (син. - «Экорегион») - территория с инфраструктурой, основанной на биоэкономике и экологических принципах. 45. Биоремедиацня - комплекс методов очистки вод, грунтов и атмосферы с использованием биологических агентов - метаболического потенциала биообъектов: растений, грибов, насекомых, червей и других организмов. 46. Биоресурсы - совокупность биоценозов (биот, биотических комплексов) из известных видов жизни на Земле (≈ 2 млн. единиц) и еще не открытых видов (более 10 млн. видов). 47. Биорефайнери (англ. «biorefinery») - биозавод; предприятие, осуществляющее конверсию биомассы и производящее топливо, энергию и химические вещества в полном цикле. 48. Биосенсор (син. - «Биодатчик») - устройство, в котором чувствительный слой, содержащий биологический материал, непосредственно реагирующий на присутствие определенного компонента и генерирующий соответствующий сигнал. 49. Биотехнологическое приборостроение - отрасль, занимающаяся приборами для биотехнологии. 50. Биотехнология (технология живых систем) - комплексное научно-практическое направление, разрабатывающее вопросы применения естественных и инженерных наук для технологического использования живых организмов, клеток, их частей и молекулярных аналогов для производства товаров и услуг. 51. Биотехнология «белая» - производство биотоплив, ферментов и биоматериалов для различных отраслей промышленности. 52. Биотехнология ветеринарная - часть сельскохозяйственной биотехнологии, предметной областью которой является использование биотехнологии для лечения животных. 53. Биотехнология «зеленая» - разработка и внедрение в агрокультуру генетически модифицированных растений. 54. Биотехнология «красная» - производство биофармацевтических препаратов (протеинов, ферментов, антител) для человека, а также коррекция генетического кода. 55. Биотехнология лесная - раздел биотехнологии, занимающийся сохранением и ускоренным воспроизводством лесных биоресурсов. 56. Биотехнология медицинская - раздел биотехнологии, занимающийся производством биофармацевтических препаратов, изделий медицинского назначения, продуктов лечебного питания (см. также «Биотехнология «красная»). 57. Биотехнология морская - раздел биотехнологии, занимающийся вопросами изучения гидробионтов, переработки морепродуктов, разведения промысловой морской фауны и флоры в марикультуре. 58. Биотехнология пищевая (пищевая биоиндустрия) - раздел биотехнологии, занимающийся разработкой теории и практики создания пищевых продуктов общего, лечебно-профилактического назначения и специальной ориентации. 59. Биотехнология прикладная - раздел биотехнологии, осуществляющий практическое приложение достижений этой науки. 147 60. Биотехнология природоохранная (биотехнология экологическая) - раздел биотехнологии, занимающийся решением экологических проблем биотехнологическими методами. 61. Биотехнология промышленная - практическая ветвь биотехнологии, осуществляющая широкомасштабное производство биопродуктов по всем секторам биотехнологии (медицинскому, пищевому, сельскохозяйственному, энергетическому, экологическому и др.) (см. также «Биотехнология «белая »). 62. Биотехнология сельскохозяйственная - раздел биотехнологии, занимающийся вопросами теории, методологии и практики применения ее достижений в растениеводстве и животноводстве (см. также «Биотехнология «зеленая»). 63. Биотехнопарк - научный парк с акцентом на биотехнологию и инновационные процессы. 64. Биотопливные элементы - источники питания, использующие энергию из живого организма; предназначены для питания имплантируемых медицинских приборов. 65. Биотопливо - топливо из биологического сырья, получаемое, как правило, путем переработки стеблей сахарного тростника или семян рапса, кукурузы, сои и др. Различают жидкое биотопливо (для двигателей внутреннего сгорания - этанол, биодизель), твердое (дрова, солома) и газообразное (биогаз, водород). 66. Биоудобрения - экологически чистые удобрения, получаемые из биогумуса и натуральных органических веществ. 67. Биофармацевтика - наука об исследовании физических и химических свойств биопрепаратов и их дозировок. 68. Биофармацевтическая промышленность (син. - «Биофарминдустрия») - ветвь фармацевтической промышленности, производящая биофармацевтические препараты (протеины, ферменты, антитела). 69. Биоэкономика - экономика, основанная на системном использовании биотехнологии. На Западе принят термин «bio-based economy». 70. Биоэкополис — малое поселение, вписанное в экологически чистый ландшафт, созданное с применением биотехнологических способов ведения аграрного хозяйства, с быстровозводимыми, дешевыми и энергоэффективными домами усадьбами. 71. Биоэнергетика - сфера деятельности по обеспечению энергетических потребностей человека, основанная на принципах или ресурсах живой природы, направленная на сохранение естественного энергетического и материального баланса окружающей природной среды. 72. Биоэтанол - этиловый спирт, получаемый из биомассы путем спиртового брожения органических продуктов, содержащих углеводы, под действием ферментов дрожжей и бактерий. Как моторное топливо используется в виде присадок или в чистом виде. 73. Вакцина - препарат из убитых или ослабленных патогенов или производных антигенных детерминант, который может вызывать формирование антител у организма-хозяина. 74. Генно-инженерно-модифицировапный организм - организм или несколько организмов, любое неклеточное, одноклеточное или многоклеточное образование, способные к воспроизводству или передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с применением методов генной инженерии и содержащие генно-инженерный материал, в том числе гены, их фрагменты или комбинации генов (Федеральный 148 закон от 05.07.1996 № 86-ФЗ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности»). 75. Генная инженерия (генетические модификации) - совокупность методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы (Федеральный закон от 05.07.1996 № 86-ФЗ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности»). 76. Генная терапия (генотерапия) совокупность генно-инженерных (биотехнологических) и медицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека в целях лечения заболеваний (Федеральный закон от 05.07.1996 № 86-ФЗ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности»). 77. Генно-инженерная деятельность деятельность, осуществляемая с использование методов генной инженерии в целях создания генно-инженерномодифицированных организмов (Федеральный закон от 05.07.1996 № 86-ФЗ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности»). 78. Генно-инженерные препараты - препараты разного назначения (медицинские, биологические), получаемые методами генной инженерии. 79. Гидробионты - организмы, обитающие в воде. 80. Гидролизное производство (гидролизная промышленность) – производство, основанное на реакции гидролитического расщепления гликозидных связей полисахаридов биомассы одревесневшего растительного сырья с образованием в качестве основных продуктов реакции моносахаридов, которые подвергаются дальнейшей биохимической или химической переработке, либо входят в состав товарной продукции. 81. Глюкозо-фруктозные сиропы (ГФС) - пищевые продукты, получаемые из крахмала и являющиеся полноценными заменителями сахарозы. 82. Диагностикумы - стандартные наборы реактивов для диагностики. 83. Индустрия живых систем (см. Биотехнология промышленная). 84. Индустрия ианотехнологий - промышленное производство, осуществляемое в наношкале. Представляет собой часть индустрии неживых систем. 85. Индустрия неживых систем - промышленные производства, имеющие дело с неживыми системами и объектами. 86. Клеточные технологии - медицинские технологии с использованием стволовых клеток. 87. Кормовые добавки - белково-витаминные, минеральные и иные добавки, применяемые при недостатке в рационах животных некоторых кормовых ингредиентов. 88. Лизин - незаменимая аминокислота, широко используется в качестве кормовой добавки. 89. Марикультура (лат. «маrе» - «море» + культура) (син. - «Талассокультура», термин на греческой основе) - искусственное выращивание морских промысловых организмов - животных и водорослей - в естественных и искусственных водоемах. 90. Нанобиотехнология (син. - «Бионанотехнология») - создание и использование биомолекул как компонентов нанотехнологии. 91. Наномедицина (греч. «nanos» - «карлик» + «медицина») — комбинированный термин, обозначающий применение нанотехнологии в лечении и диагностике заболеваний. 149 92. Нанотехнология - разработка и использование систем и технических устройств в наношкале. 93. Постгеномные технологии - технологии, возникшие на основе знаний о геномах организмов, в первую очередь, генома человека. 94. Трансгенные организмы - животные, растения, микроорганизмы, вирусы, генетическая программа которых изменена с использованием методов генной инженерии (федеральный закон от 05.07.1996 № 86-фз «о государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности»). 150 Литература 1. Биотехнология – агропромышленному комплексу. М.: Наука, 1989. Биотехнология Принципы и применение./ Под ред. Хиггинса и др. М.: Мир, 1988. 2. Биотехнология. / Под редакцией А.А.Баева М.: Наука, 1984. 3. Биотехнология: учеб. пособие для вузов. В 8 кн. / под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. М.: Высшая школа, 1987. 4. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Изд-во АН СССР, 1964. 5. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.Ф. Клеточная инженерия. М.: Высшая школа, 1987. 6. Глеба Ю.Ю., Зубко М.К. Теоретические и прикладные аспекты клеточной инженерии растений. М.: Наука, 1964. 7. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений. Киев, Наукова Думка, 1985. 8. Егорова, Т.А. Основы биотехнологии: учеб. пособие для высш. пед. учеб. заведений / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. М.: Издательский центр «Академия», 2003. 9. Калинин Ф.М., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры растений в физиологии и биохимии растений. Киев: Наукова Думка, 1980. 10. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение. М.: Наука, 1989. 11. Кефели В.И. Природные ингибиторы роста и фитогормоны. М., Киев: Наукова Думка, 1990. 12. Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. 13. Культура клеток растений. М.: Наука, 1981. 14. Настинова Г.Э.Биотехнология растений. Элиста: Изд-во КалмГУ, 2000. 15. Новости науки и техники. Серия «Биотехнология», реферативный сборник Вып. 5,7,8, 10 М.: ВИНИТИ 16. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений. М.: Наука, 1988. 17. Сассон А. Биотехнология: Свершения и надежды. М.: Мир, 1987. 18. Сельскохозяйственная биотехнология: учеб. / В.С. Шевелуха, Е.А. Калашникова, С.В. Дегтятер и др.: под ред. В.С. Шевелухи. – М.: Высш.шк., 2008. . 19. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев, Наукова Думка, 1986. 20. Сидоров В.А., Пивень Н.М., Глеба Ю.Ю., Сытник К.М.Соматическая гибридизация пасленовых. Киев: Наукова Думка, 1985. 151 ОГЛАВЛЕНИЕ Предисловие 1.Предмет и задачи биотехнологии 1.1. Предмет биотехнологии 1.2. История биотехнологии 1.3. Области применения современной биотехнологии 1.4. Основные разделы биотехнологии 1.4.1. Клеточная инженерия животных 1.4.2. Клеточная инженерия растений 1.4.3. Генетическая инженерия 1.5. Проблемы биологической безопасности Контрольные вопросы 2. Основы клеточной инженерии 2.1. Понятие культуры изолированных клеток и тканей 2.2. Использование культуры изолированных клеток и тканей 2.3. Условия культивирования изолированных тканей и клеток 2.4. Питательные среды 2.5. Тип клеточных культур 2.6. Общая характеристика каллусных клеток 2.7. Изолированные протопласты Контрольные вопросы 3. Получение вторичных метаболитов 3.1. Понятия первичные и вторичные соединения 3.2. Распространение вторичных соединений 3.3. Вторичные соединения в клеточных культурах растений Контрольные вопросы 4. Генетическая инженерия (основные методы) 4.1. Генетическая инженерия и ее применение 4.2. Основная технология генетической инженерии 4.3. Ферменты в генной инженерии 4.4. Векторы, используемые для клонирования ДНК 4.5. Гены и их получение 4.6. Транскрипция 4.7. Трансляция 4.8. Введение генов в бактерии и их экспрессия 4.9. Экспрессия генов в дрожжах 4.10. Методы получения трансгенных животных 4.11.Клонирование овцы методом переноса ядра 4.12. Трансгенные растения. Контрольные вопросы 5. Генетическая инженерия (применение) 5.1. Генетическая инженерия и ее возможности для практики 5.2. Продукты генной инженерии в производстве 5.3. Получение вакцин методами генной инженерии 5.4. Молекулярная диагностика заболеваний 5.5. Генетические болезни человека и генная терапия 3 4 4 5 6 7 8 8 9 9 14 15 15 15 16 17 17 18 19 19 21 21 21 23 24 25 25 25 26 27 28 28 29 30 30 31 31 33 37 38 38 38 39 40 43 152 5.6. Промышленный синтез белков. Контрольные вопросы 7. Иммобилизованные ферменты 44 47 48 48 48 49 50 50 53 54 55 56 57 7.1. Понятие «инженерная энзимология» 57 6. Биотехнология в сельском хозяйстве 6.1. Клональное микроразмножение 6.2. Применение клонального микроразмножения в растениеводстве 6.3. Технология клонального микроразмножения 6.4. Некоторые способы клонального микроразмножения растений 6.5. Оздоровление растений 6.6. Селекция растений 6.7 Фиксация молекулярного азота 6.8. Некоторые методы увеличения продуктивность растений Контрольные вопросы 7.2. Источники ферментов 57 7.3. Иммобилизованные ферменты 57 7.4. Инвертаза (сахараза) 58 7.5. Лактаза 58 7.6. Применение иммобилизованных ферментов в медицине 59 7.7. Другие области применения иммобилизованных ферментов 59 Контрольные вопросы 60 8. Пищевая биотехнология 61 61 61 64 65 65 66 67 68 69 70 75 8.1. Введение в пищевую микробиологию 8.2. Хлебопечение 8.3. Виноделие и пивоварение 8.4. Получение спирта 8.5. Получение соков 8.6. Молочно-кислое брожение. 8.7. Молочные продукты 8.8. Квашение овощей 8.9. Получение белка 8.10. Получение аминокислот, органических кислот и витаминов 8.11. Получение новых промышленных биоматериалов с использованием микроорганизмов Контрольные вопросы 9. Биотехнология в энергетике 76 78 9.1. Введение в биотехнологическую энергетику. 78 9.2. Получение спирта 79 9.3. Промышленное получение спирта 80 9.4. Биометаногенез 82 9.5. Промышленное получение биогаза 83 153 9.6. Повышение нефтеотдачи 86 9.7. Десульфуризация углей 86 9.8. Жидкие углеводороды 86 9.9. Биологическое получение водорода 87 9.10. Биотопливные элементы и биоэлектрокатализ 89 Контрольные вопросы 91 10. Экологическая биотехнология 93 10.1. Введение 93 10.2. Интенсивная очистка сточных вод 93 10.3. Экстенсивная очистка сточных вод 94 10.4. Очистка жидких стоков промышленных предприятий 95 10.5. Переработка твердых отходов 96 10.6. Биодеградация нефтяных загрязнений 97 10.7. Биодеградация ксенобиотиков 10.8. Восстановление плодородия почв 10.9. Самоочищение водоемов Контрольные вопросы 11. Биогеотехнология 98 99 99 101 102 11.1. Введение в биогидрометаллургию 102 11.2. История биогидрометаллургии 102 11.3. Микроорганизмы важные в биогидрометаллургии 102 11.4. Выщелачивание цинка 103 11.5. Кучное и подземное выщелачивание меди 104 11.6. Бактериальное вскрытие золота 11.7. Выщелачивание урана 11. 8. Биосорбция металлов из растворов Контрольные вопросы 105 106 107 108 109 109 109 109 110 110 111 111 112 113 114 119 12. Криосохранение 12.1.Генофонд и факторы, влияющие на него 12.2. Традиционные средства сохранения генофонда 12.3. Сохранение генофонда растений в условиях in vitro 12.4. Депонирование коллекций растительных клеток in vitro 12.5. О криосохранении и его возможностях 12.6. Теоретические вопросы криобиологии 12.7. Технология криосохранения 12.8. Достижения в области криосохранения Контрольные вопросы Терминологический словарь Литература 154
