Модина Мария Александровна - Московский государственный
advertisement
На правах рукописи МОДИНА МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА ПРИ НЕРАЗВИВАЮЩЕЙСЯ БЕРЕМЕННОСТИ 14.00.01 - акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2008 2 Работа выполнена в ГОУ ВПО "Ставропольская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ" Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Гаспарян Сусанна Арташесовна Научный консультант: доктор медицинских наук Василенко Ирина Анатольевна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Хашукоева Асиат Зульчифовна (ГОУ ВПО "Российский государственный медицинский университет") доктор медицинских наук, профессор Сидельникова Вера Михайловна (ФГУ НЦ акушерства, гинекологии и перинатологии Росмедтехнологий им. Кулакова В.И.) Ведущая организация: Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии Министерства Здравоохранения Московской области Защита диссертации состоится «____»___________________ 2008 года в_____часов на заседании диссертационного совета Д.208.041.06 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» Росздрава. Почтовый адрес: 127473, Москва, ул. Делегатская, д.20/1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета (127206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а). Автореферат разослан «____»_________________2008 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Умаханова Мадина Мусаевна 3 Общая характеристика работы Актуальность проблемы Невынашивание беременности является одной из наиболее социально значимых проблем современного акушерства и составляет 20-25%. В I триместре репродуктивные потери обусловлены преимущественно неразвивающейся беременностью (НБ) (45 - 88,6% случаев) [Газазян М.Г. с соавт., 2000; Несяева Е.В., 2005; Серов В.Н. с соавт., 1997; Стрижаков А.Н. с соавт., 2003; Graziosi G.C. et al., 2005; Sotiriadis A. et al., 2005]. Установлено, что остановка развития эмбриона происходит в среднем на сроке гестации 6-8, экспульсия плодного яйца – 10-12 недель. Клинические признаки НБ чаще всего проявляются только через 2-6 недель после прекращения ее развития. В большинстве случаев это связано с временным сохранением жизнеспособности трофобласта после гибели эмбриона [Сидельникова В.М., 2002; Борисова А.И., 1998]. Большинство причин НБ достаточно хорошо изучены, разрабатываются алгоритмы их диагностики и лечения. Специалисты отмечают, что наибольшее значение имеют генетический, инфекционный, эндокринный и аутоиммунный факторы [Баранов В.С. с соавт., 2000; Бочков Н.П., 1997; Радзинский В.Е., с соавт., 2004; Салов И.А., Хворостухина Н.Ф., 2004; Ходжаева З.С. с соавт., 2004; Daiminger A. et al., 2005]. Однако по разным данным в 20-40% случаев причина потери беременности остается не до конца выясненной. Известно, что необходимым условием для успешного развития гестационного процесса является формирование сложной сети сосудов, обеспечивающих перенос газов, питательных веществ и продуктов метаболизма между организмом матери и плодным яйцом. В то же время состояние фето-плацентарной системы при НБ остается одним из мало изученных аспектов проблемы, а имеющаяся информация носит довольно противоречивый характер [Бакотина И.В. с соавт., 2005; Логанат А. с соавт., 4 2004; Милованов А.П., 1999, Стрижаков А.Н. с соавт., 2004; Шубина Т.И., 2004; Morin L. et al., 2005]. Большое внимание детерминированным в последнее формам время тромбофилии и уделяется генетически гипергомоцистеинемии, которые ведут к достаточно выраженным нарушениям гемостаза. По данным литературы наследственные тромбофилии составляют 10-13% среди причин привычной потери беременности и чаще встречаются у беременных с различными акушерскими и тромботическими осложнениями [Доброхотова Ю.Э. с соавт., 2004]. К этой же группе можно отнести наличие антифосфолипидного синдрома (АФС), так как повышенное тромбообразование в сосудах может вызвать гибель плодного яйца. Известно, что при АФС вырабатываются антитела против собственных фосфолипидов, составляющих основу клеточных стенок. Это приводит к нарушению питания эмбриона, а затем и плода и его гибели вследствие образования тромбов в сосудах плаценты [Несяева Е.В., 2004; 2005; Fojtik Z., 2004; Koleva R. et al., 2004; Szodoray P. et al., 2003; Suzuki K., 1999]. Важную роль в системе регуляции агрегатного состояния крови играют тромбоциты, отвечающие за начальный этап гемостаза. Широкий диапазон функциональной активности этих клеток предполагает их участие в обеспечении коагуляции, репарации сосудистой стенки, депонировании и транспорте биологически активных соединений, осуществлении защитных реакций организма [Саидова Р.А.,1998; Федоров Н. А., 1991; Шитикова А.С., 2000; Terzhumanov R. et al., 2004]. В связи с этим изучение особенностей морфофункционального состояния тромбоцитов и эритроцитов в условиях НБ с применением новейших методов компьютерной цитометрии является несомненно актуальным и перспективным. Детализация некоторых аспектов патогенеза неразвивающейся беременности с учетом современных знаний о роли и 5 значении нарушений гемостаза при неразвивающейся беременности открывает пути к повышению эффективности их диагностики и коррекции. Цель исследования. Повысить эффективность ранней диагностики нарушений клеточных факторов гемостаза, приводящих к возникновению неразвивающейся беременности, с использованием критериев витальной оценки морфофункционального статуса тромбоцитов и эритроцитов периферической крови и последующей их коррекции. Задачи исследования 1. Охарактеризовать морфофункциональное состояние клеточного звена гемостаза у женщин с физиологической беременностью в I триместре методом витальной компьютерной морфометрии. Провести сравнительный анализ полученных результатов с аналогичными показателями небеременных женщин. 2. Оценить особенности морфофункционального состояния клеточного звена гемостаза (тромбоцитов и эритроцитов) при неразвивающейся беременности. 3. Сопоставить результаты компьютерной морфометрии тромбоцитов с данными рутинных лабораторных методов исследования сосудистотромбоцитарного звена гемостаза. 4. Оценить эффективность патогенетически обоснованной терапии на восстановление репродуктивного здоровья женщин с неразвивающейся беременностью по влиянию на показатели морфофункционального состояния тромбоцитарного звена системы гемостаза. 5. Предложить алгоритм диагностических мероприятий с использованием морфометрических методов, способствующих оптимизации ранней диагностики гемостазиологических нарушений при неразвивающейся беременности. 6 Научная новизна Получены новые морфофункционального данные по состояния изучению тромбоцитов и витального эритроцитов периферической крови в I триместре физиологической и неразвивающейся беременности. Определена клинико-диагностическая значимость структурных и функциональных нарушений тромбоцитов и эритроцитов при НБ и их роль в генезе невынашивания беременности. Дана количественная оценка влияния антифосфолипидных антител на морфофункциональное состояние тромбоцитов периферической крови. На основании полученных результатов предложена система объективных и информативных критериев для своевременной диагностики НБ и оценки адекватности проводимой патогенетической терапии. Практическая значимость Выявленные изменения морфофункционального статуса клеточного звена гемостаза позволяют предложить наиболее эффективные способы их коррекции, оптимизировать лечебные программы с учетом принципов индивидуализации патогенетической терапии. Экспресс-метод витальной компьютерной морфометрии тромбоцитов апробирован в акушерской практике как скрининговый при комплексном обследовании беременных группы риска. Положения, выносимые на защиту 1. Неразвивающаяся беременность сопровождается наличием выраженного анизоцитоза, пойкилоцитоза и гипохромии циркулирующих эритроцитов, а также снижением уровня спонтанного эритропоэза, морфометрически проявляющихся в изменении размерных параметров и устойчивом преобладании деформированных форм красных клеток. Это 7 оказывает непосредственное влияние на реологические свойства крови и способствует нарушению обменных процессов на уровне капилляров. 2. В условиях неразвивающейся беременности происходит нарушение тромбоцитарного звена гемостаза: изменяется морфологический субстрат клеток; увеличивается гетерогенность популяции в связи с появлением высокого процента макроформ тромбоцитов, повышается уровень активационного статуса и изменяется секреторная активность тромбоцитов. Наиболее выраженные нарушения регистрируются у ВА/АФА позитивных беременных. 3. Морфометрические состояние тромбоцитов показатели и коррелируют отражают с функциональное данными рутинных гемостазиологических исследований, поэтому могут служить объективными критериями нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза при неразвивающейся беременности. Внедрение результатов в практику Основные результаты гинекологического отделения работы внедрены МУЗ «Городская в практику поликлиника врачей №3» (г.Ставрополь), гинекологического отделения МУЗ «Городская поликлиника №6» (г.Ставрополь), женской консультации № 1 МУЗ «Консультативнодиагностическая поликлиника» (г.Ставрополь), Перинатального центра ГУЗ «Краевой Центр СВМП № 1» (г. Буденновск). Результаты и выводы диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры Акушерства и гинекологии ФПО Ставропольской Государственной Медицинской Академии. Публикации Результаты исследований отражены в 8 публикациях (1 статье и 7 тезисах докладов, представленных на 2 международных и 5 отечественных научных форумах). 8 Апробация работы Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на 23 Российской конференции "Морфометрия в диагностике болезней" (Москва, октябрь 2005г), Международном конгрессе «Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний», (Москва, июнь 2005), Международном симпозиуме «Biological Motility: Basic Research and Practice» (Pushchino, May, 2006), I научнопрактической конференции фундаментальные и «Цитометрия прикладные в медицине аспекты» (Москва, и биологии: май, 2008), апробационной комиссии Ставропольской государственной медицинской академии (Ставрополь, сентябрь, 2008). Личное участие автора в разработке проблемы Автором лично было проведено обследование и лечение 95 женщин, освоены методики витальной компьютерной фазово-интерференционной микроскопии лабораторных полученных клеток крови, исследований результатов; проведен в анализ динамике; подготовка результатов математическая иллюстративного клиникообработка материала; публикация основных результатов исследований. Структура и объем и диссертации Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2 глав, суммирующих собственные данные исследования, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиография включает 90 отечественных и 73 зарубежных источников литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 13 таблицами. 9 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования В соответствии с поставленной целью и задачами материалом исследования явились тромбоциты периферической крови 35 беременных с физиологическим течением (ФБ), 40 - с неразвивающейся беременностью в I триместре гестации, а также 20 соматически здоровых женщин репродуктивного возраста: 20 - 35 лет (средний - 28,3±4,1 лет). Были изучены анамнестические данные, включавшие: особенности преморбидного фона, перенесенные и сопутствующие гинекологические заболевания, оперативные вмешательства, менструальную (возраст менархе, особенности менструального цикла и его нарушения), половую и репродуктивную (число беременностей, их течение, исход) функции. Клиническое обследование включало общий осмотр, оценку состояния сердечно-сосудистой, дыхательной, эндокринной, мочевыделительной и пищеварительной систем, состояние молочных желез. Состояние сердца оценивали по результатам электрокардиограммы. Комплекс лабораторных исследований включал: общий анализ крови, мочи, определение групповой принадлежности и резус-фактора, биохимические и гемостазиологические параметры, анализы крови на RW, ВИЧ-инфекцию. В динамике определяли уровни ХГЧ, прогестерона. Исследовали наличие АФА и ВА. Всем беременным проводилось трансвагинальное ультразвуковое исследование с допплерометрией, определяли характер флоры влагалища путем микроскопического исследования мазков, проводили ИФА диагностику внутриутробного инфицирования плода и полуколичественную ПЦР-диагностику транссексуальных инфекций. Всем пациенткам основной группы (неразвивающаяся беременность) проводилось опорожнение полости матки на фоне инфузии свежезамороженной плазмы, по показаниям вводили ингибиторы протеаз (контрикал, трасилол). В послеоперационном периоде назначалась 10 общепринятая антибактериальная, дезагрегантная и/или антикоагулянтная терапия в зависимости от показателей гемостазиограммы. Последующая реабилитация включала методы физиотерапевтического воздействия и комбинированные оральные контрацептивы. В качестве дезагрегантов использовали перорально дипиридамол (курантил) в дозе 75 мг в сутки, ацетилсалициловую кислоту (тромбо-асс) 75125 мг в сутки. Из антикоагулянтов применяли фраксипарин в дозе 0,3 мл (2850 МЕ) подкожно 1 раз в сутки. После опорожнения матки назначали электрофорез с ионами кальция и магнитолазер на низ живота. Далее в течение 3-6 месяцев с контрацептивной целью назначали жанин. Анализ морфофункционального состояния эритроцитов проводили методом витальной компьютерной морфометрии с использованием отечественного фазово-интерференционного комплекса «Цитоскан»: изучали размерные (диаметр, периметр, высота, площадь, объем) показатели отдельных клеток, структуру циркулирующей популяции, морфологические типы эритроцитов. Исследование тромбоцитарного звена гемостаза проводилось на основе данных количества тромбоцитов, АДФ-индуцированной агрегационной активности тромбоцитов, витальной компьютерной морфометрии клеток. Исследование коагуляционного звена гемостаза осуществляли с помощью следующих тестов: определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), тромбинового времени (ТВ), протромбинового индекса, количества фибриногена, тромбоэластографии. АФА определяли иммуноферментным методом с помощью наборов АРА-screen IgG/IgM (DrG Diagnostica). ВА - по удлинению времени свертывания при исследовании бестромбоцитарной плазмы в тестах: активированное время рекальцификации плазмы с каолином; метод D.E.P.Austen, I.L.Rhymes в модификации Л.З.Прудниковой, Т.В.Сайковской (1989) и др. 11 Статистический анализ экспериментальных и клинических данных проводили с помощью алгоритмов среды MatLab и математического пакета "Statistica 6". Стандартная обработка выборок включала подсчет значений средних арифметических величин, ошибок средних, а также величины дисперсии, среднего квадратичного отклонения и анализа асимметричности распределения. Различия между сравниваемыми группами рассчитывали по критериям Вилкоксона-Манна-Уитни, Колмагорова-Смирнова или Стъюдента Уровень значимости устанавливался равным 0,05. Результаты исследования и их обсуждение Возраст обследованных во всех клинических группах колебался от 20 до 35 лет. Подавляющее большинство беременных находилось в активном репродуктивном возрасте (средний возраст 27,5±1,4). Средний возраст беременных основной группы составил 28,3±4,1, в группе сравнения 27,5±3,4 лет; в контрольной группе (небеременные) - 26,8±3,5 лет. У большинства (57,5%) беременных основной группы клинические проявления неразвивающейся беременности отсутствовали: срок задержки погибшего плодного яйца/эмбриона в матке у этих беременных не превышал 1-2 недель. У остальных основными причинами, побудившими обратиться за квалифицированной медицинской помощью, были мажущие выделения из половых путей (22,5%), умеренные боли внизу живота (17,5%), исчезновение ранее имевшихся косвенных признаков беременности (тошнота, рвота, нагрубание молочных желез) (45%). Общие признаки недомогания и субфебрилитет были зарегистрированы у 5% женщин и связаны, преимущественно, с достаточно длительной задержкой погибшего эмбриона (более 4-5 недель). У 85% пациенток отмечалось отставание размеров матки от календарного срока гестации. Анализ структуры экстрагенитальных заболеваний обследованных показал, что острыми респираторными вирусными инфекциями страдали большинство пациенток. Заболевания сердечно-сосудистой системы 12 выявлены у 15 и 5,7% женщин в основной группе и группе сравнения, соответственно. Аппендэктомия была произведена у 22,5 и 20% обследованных, соответственно. Заболевания желудочно-кишечного тракта, печени и желчевыводящих путей отмечены у 22,5 и 12,5% с неразвивающейся и у 17,1 и 5,7% - с прогрессирующей беременностью. Заболевания мочевыделительной системы выявлялись в среднем у 12 и 2,9% обследованных в группах НБ и ФБ, соответственно. Изучение семейного анамнеза показало, что 30% и 11,4% беременных основной группы и группы сравнения имели отягощенную наследственность в виде новообразований половых органов, гиперпластических процессов молочных желез (37,5 и 8,6%), опухолей экстрагенитальной локализации (5 и 2,9%), эндокринопатий – сахарный диабет, ожирение, Фенотипические практически у тиреотоксикоз признаки каждой (42,5 эндокринных второй в и 5,7%, соответственно). нарушений основной группе. наблюдались 12 (30%) с неразвивающейся беременностью имели нарушение жирового обмена II-III степени, что оказалось достоверно реже, чем при прогрессирующей беременности (5,7%). Гирсутизм наблюдался у 7 (17,5%) беременных основной группы. Анализ становления менструальной функции выявил, что у большинства (68%) менархе в среднем наступило в возрасте 12,8±0,4 лет. При этом в основной группе своевременное наступление менархе было лишь у 67,5%, а в группе сравнения – у 88,6%. Нарушения менструального цикла наблюдались у 53,3% обследованных. Более половины (57,5%) с неразвивающейся беременностью страдали олигоменореей, 22,5% - дисменореей, 10% - полименореей. Исследование репродуктивной функции продемонстрировало, что в основной группе у 9 (22,5%) настоящая беременность была первой, у 24 (60%) – имелись в анамнезе неблагоприятные исходы предыдущих беременностей, у 7 (17,5%) – артифициальные аборты и роды. Практически 13 каждая вторая страдала привычным невынашиванием. У 5 (12,5%) в основной группе отмечалось бесплодие, причем у 7,5% - первичное, у 5% вторичное, наступившее после неблагоприятного исхода одной или нескольких беременностей. У 16 (40%) беременных основной группы отмечались гормональнозависимые заболевания, тогда как в группе с физиологической беременностью - наличие лейомиомы матки, эндометриоза, кист яичников, гиперпластических процессов эндометрия выявлено лишь в 14,3% случаев. В структуре гинекологических заболеваний выявлен достаточно высокий показатель воспалительных процессов: 47,5% в основной группе, 14,3% в группе сравнения. У беременных основной группы преобладали кольпит – 22,5%, заболевания шейки матки – 12,5%, сочетанные заболевания – 27,5%. У 13 (32,5%) больных основной группы и 3 (8,6%) группы сравнения имелись указания на наличие инфекций, передающихся половым путем (хламидийная, трихомониаз, кандидозы, микоплазмы, герпес и др.). Установлено, что в 57,5% случаев замирание беременности происходило на сроках 8-10 недель. В результате УЗИ беременных основной группы анэмбриония была выявлена у 37,5% (15 беременных), неразвивающаяся беременность по типу гибели эмбриона – в 62,5% случаев (25 беременных). Практически у 83% больных основной группы неразвивающаяся беременность наблюдалась на фоне структурной неполноценности или отсутствия желтого тела яичника. В группе сравнения у всех беременных зарегистрированы нормальные размеры желтого тела яичника (19-21 мм). В клиническом анализе крови при сравнении показателей различных групп статистически достоверной разницы не выявлено. Изучение функции печени с помощью биохимического анализа крови и печеночных проб у обследованных обеих клинических групп также не выявило значительных изменений. 14 При исследовании мочи в клиническом анализе у 17,5% беременных основной группы патологических изменений не выявлено, у 82,5% имели место лейкоцитурия, умеренная альбуминурия и наличие эритроцитов. Результаты анализа влагалищных мазков у 32,5% с НБ свидетельствовали о II степени чистоты влагалищного секрета, у остальных – III степени. Послеоперационный период после выскабливания у 80,7% протекал без осложнений. В 19,3% случаев были диагностированы гематометра, эндометрит, остатки плодного яйца и др. Выявленные осложнения явились показанием к повторному выскабливанию стенок полости матки и проведению антибактериальной терапии. Всем беременным основной группы были предложены реабилитационные мероприятия, включающие противотромботическую и антиагрегантную терапию, физиотерапевтическое лечение и гормональную контрацепцию. Завершая клиническую характеристику обследованных, можно заключить, что две клинические группы составили беременные, схожие по возрасту, паритету и анамнестическим данным. Исследование морфофункционального состояния эритроцитов продемонстрировало наличие анизоцитоза и выраженного пойкилоцитоза у беременных с НБ: изменение размерных параметров циркулирующих эритроцитов и устойчивое преобладание обратимо (эхиноциты) и необратимо (сфероциты) деформированных форм красных клеток. Анализ состава циркулирующей популяции эритроцитов в контрольной группе показал, что в периферической крови условно здоровых небеременных женщин 80% эритроцитов представлены нормоцитами (клетки с диаметром 8 – 10 мкм), 14% − «макроцитами» (с диаметром более 10 мкм) и 6% − «микроцитами» (диаметр менее 8 мкм). При физиологической беременности (I триместр) количество «нормоцитов» недостоверно снижалось до 72%, а «макро-» и «микроцитов» составляло 24 и 4%, соответственно. 15 Таблица 1. Размерные параметры эритроцитов периферической крови при физиологической и неразвивающейся беременности (М±δ) Индекс Диметр, Периметр, Высота, Площадь, Объем, сферичГруппы 2 (D), мкм (P), мкм (H), мкм (S), мкм (V), мкм3 ности (S/V) КГ 9,3±0,9 27,7±2,5 1,9±0,3 53,5±9,7 42,4±13,7 1,26 (20) ФБ 1,30 9,41,1 29,02,6 1,90,4 55,710,2 43,012,3 (35) НБ 9,01,1 24,81,9 1,80,4 47,69,8 35,310,1 1,35* (40) Примечание: * - достоверно относительно контроля, при p < 0,05 Увеличение макроцитов в условиях физиологической беременности (более чем в 1,5 раза) демонстрирует повышенное содержание молодых незрелых эритроцитов и отражает увеличение уровня активности спонтанного эритропоэза. В условиях неразвивающейся беременности число «микроцитов» составило 6%, «нормоцитов» - 84%, а «макроцитов» - 10%. При НБ содержание различных морфологических типов эритроцитов в циркулирующей популяции составило 62,8, 23,1, 14,1 и 1,0%, дискоцитов, сфероцитов, эхиноцитов и овалоцитов, соответственно. При физиологической беременности отмечалась иная морфологическая картина 70,34,9, 20,53,1, 8,31,1, 0,90,3%. Индекс трансформации у беременных с НБ увеличился до 0,59 (против 0,42 при ФБ, 0,14 – в КГ), что количественно характеризует наличие и степень выраженности пойкилоцитоза. Этот факт достаточно важен, поскольку изменение формы эритроцитов может влиять на их реологические свойства, а, следовательно, и на их жизнеспособность. Кроме того, это приводит к изменению (ухудшению) обменных процессов на уровне капилляров. В процессе идентифицировали исследования 4 тромбоцитарного морфологических типа звена живых характеризующих различную степень их активации (Рис.1). гемостаза тромбоцитов, 16 I II III IV Рис.1 Схема морфофункциональных типов тромбоцитов периферической крови: I – тромбоцит «покоя»; II – тромбоцит с низким уровнем активности; III – высоко активированный тромбоцит; IV – дегенеративно-измененные тромбоцит. У женщин вне беременности во II фазе цикла 63% тромбоцитов представлены клетками «покоя», 21% - тромбоцитами с низким уровнем активации, 12% - высокоактивированных тромбоцитов, 4% - дегенеративноизмененных (Рис.2). При физиологической беременности на сроке гестации 8-12 недель процент тромбоцитов «покоя» снижается до 56; около 28% представлены клетками II типа; 11% относятся к III типу, а число дегенеративноизмененных клеток составляет 5%. В условиях неразвивающейся беременности значительно уменьшается процент тромбоцитов «покоя» (до 49%), увеличивается содержание активированных клеток (32% - II типа; 14% - III типа); 5 % - дегенеративно-измененных тромбоцитов IV типа. Обращает внимание увеличение средних по популяции значений диаметра (на 10% и более), периметра (на 8,5%) и площади (на 11%) циркулирующих тромбоцитов у женщин с прогрессирующей беременностью. При неразвивающейся беременности максимальные средние значения диаметра, периметра, площади и объема тромбоцитов увеличиваются на 19,2, 15,9, 39,1 и 44,4%, соответственно. 17 Рис.2. Соотношение морфологических типов (I, II, III, IV) тромбоцитов периферической крови вне беременности (внутренний круг) при физиологической (средний круг) и неразвивающейся (внешний круг) беременности в I триместре (%). Дискоциты ; эхиноциты 1 класса ; эхиноциты 2 класса ; дегенеративно-измененные тромбоциты . Выявлена выраженная гетерогенность тромбоцитарного звена гемостаза при НБ: выраженная правая асимметрия, свидетельствующая о наличии клеток с увеличенными размерами и высокие значения ИА по всем анализируемым показателям. однонаправленными По-видимому, процессами это связано перепрофилирования с морфо- функционального состояния клеточного звена гемостаза в сторону активации и реализации состояния гиперкоагуляции. Выделена субпопуляция крупных тромбоцитов – макроформ с диаметром более 5 мкм. Установлено, что внутри этой группы - две категории тромбоцитов: с высокими или низкими значениями фазовой высоты и объема при практически соизмеримых величинах диаметра, периметра и площади. Установлено, что у женщин контрольной группы содержание макроформ в циркулирующей популяции не превышает 2%, при физиологической беременности (I триместр) процент макротромбоцитов составляет – 4%, при неразвивающейся беременности количество таких тромбоцитов увеличивается до 7%. 18 Можно предположить, что макроформы представляют собой молодые незрелые мегатромбоциты, процентного содержания осколки в мегакариоцитов. общем пуле Увеличение циркулирующих их клеток свидетельствует об активации процессов тромбоцитопоэза. Различие в оптических параметрах (фазовая высота и объем) этих клеток при равнозначных величинах геометрических параметров (диаметр, периметр и площадь) позволяют предположить, что клетки с более высокой оптической плотностью обладают хорошо сформированным полноценным гранулярным аппаратом и наоборот. Все больные с неразвивающейся беременностью были обследованы на наличие волчаночного антикоагулянта (ВА), антител к фосфолипидам (АФА) и хорионическому гонадотропину (анти-ХГЧ). На основе проведенных исследований основная группа была разделена на 2 подгруппы: ВА/АФАпозитивных (17 пациенток, 42,5%) и ВА/АФА-негативных (23 пациентки, 57,5%). У ВА/АФА-позитивных беременных содержание клеток покоя, активированных (с низким и высоким уровнем активации) и дегенеративных тромбоцитов составило 44,6, 39,4, 13,9 и 2,1%, соответственно. У ВА/АФАнегативных – 55,4, 30,5, 10,9 и 3,2%, соответственно. Установлено, что для ВА/АФА позитивных беременных характерна большая однородность популяции тромбоцитов по величине их диаметра и высоты. (ИА 0,67 и 0,60 против 0,75 и 1,01, соответственно). Остальные показатели гетерогенности клеток в обеих подгруппах являются сопоставимыми. Выявление макроформ тромбоцитов в периферической крови при неразвивающейся беременности в обеих подгруппах показало, что их содержание преимущественно обнаруживается у ВА/АФА позитивных беременных – в среднем 7 % от общего числа тромбоцитов. В подгруппе ВА/АФА негативных беременных процент макротромбоцитов не превышает 3%. 19 При этом у ВА/АФА позитивных беременных преобладают макротромбоциты высокой оптической плотности – 68% от общего числа макроформ. У ВА/АФА негативных беременных гигантские клетки равнозначно представлены тромбоцитами высокой и низкой плотности: 50 и 50% от общего числа. Выявлены достоверные корреляционные взаимоотношения между морфометрическими параметрами тромбоцитов, содержанием различных морфологических типов клеток и наиболее важными показателями агрегатограммы. Для I морфологического типа - тромбоциты «покоя» (дискоциты) – характерно наличие достоверных отрицательных корреляций с величиной максимального наклона амплитуды агрегатограммы при использовании в качестве индуктора АДФ (r=-0,75, p<0,05), а положительных – с активностью факторов протромбинового комплекса (АПК ) (r=0,61, p<0,05). Для II типа – клетки с низкой степенью активации (эхиноциты 1 уровня) установлены достоверные положительные корреляции с максимальной амплитудой агрегатограммы при использовании в качестве индуктора АДФ (r=-0,57, p<0,05). Для тромбоцитов IV морфологического типа – дегенеративноизмененные максимальной клетки – коэффициенты амплитуды, корреляции максимального с величинами наклона амплитуды агрегатограмм, максимального среднего радиуса агрегата при спонтанной агрегации (r=0,61, 0,65, 0,68 соответственно) и теми же показателями и максимальной скоростью образования агрегата при использовании в качестве индуктора коллагена (r=0,59, 0,61, 0,65, 058, соответственно). Для величины среднего диаметра и площади тромбоцитов установлены отрицательные достоверные связи с АПК – активностью факторов протромбинового комплекса (r=0, 75 и 0,63, соответственно). Фазовая высота и объем клеток отрицательно коррелируют с величинами максимальной амплитуды и максимального наклона амплитуды 20 агрегатограмм при использовании в качестве индуктора коллагена (r=0, 65 и 0,63; 0,65 и 0,68, соответственно). Представленные результаты позволяют сделать вывод, что использование компьютерной морфометрии в практическом акушерстве является целесообразным и оправданным, поскольку позволяет в рамках одного метода оперативно оценить индивидуальные изменения размерных показателей каждого тромбоцита, проанализировать структуру популяционного состава клеточного звена гемостаза, выявить уровень функциональной полноценности циркулирующих клеток и охарактеризовать возможные изменения показателей тромбоцитов в традиционных функциональных тромбоцитарных тестах. Все пациентки основной группы были обследованы через 7-10 дней после опорожнения полости матки на фоне проведения дезагрегантной и антикоагулянтной терапии с использованием экспресс-метода витальной компьютерной морфометрии тромбоцитов. Рис.3. Динамика морфометрических показателей тромбоцитов периферической крови у пациенток с неразвивающейся беременностью (показатели размерных параметров клеток контрольной группы приняты за 100%). Показатели вне беременности ; показатели группы НБ до терапии ; показатели группы НБ после терапии 21 После курса лечения в основной группе наблюдалась нормализация морфометрических параметров циркулирующих тромбоцитов. Так, средние в популяции величины диаметра, периметра, площади и объема составили уже 105,2, 103,9, 109,2 и 108,9% по отношению к нормативным величинам против 119,2, 115,9, 139,1, 144,4% до терапии. Фазовая высота, напротив, увеличилась до 95,7% против 83,3% до лечения. Отмечено восстановление активационного статуса тромбоцитов: если до терапии содержание тромбоцитов покоя не превышало 49%, клетки с низким уровнем активности составляли 32%, высоко активированные – 14%, а дегенеративные – 5% (в норме – 63, 21, 12 и 4%), то после проведенного лечения содержание дискоцитов возросло до 58%, процент эхиноцитов 1 и 2 класса составил 24 и 13, дегенеративно измененных тромбоцитов -5%. Следовательно, в противотромботической наблюдается результате терапии нормализация при патогенетически обоснованной неразвивающейся беременности гемостазиологического потенциала. Стабилизация системы гемостаза приводит к нормализации процессов микроциркуляции и гемореологии, что, несомненно, способствует восстановлению репродуктивного здоровья женщин. Использование КФМ при мониторировании состояния беременных позволяет получать оперативный объективный ответ о детальных изменениях клеточного звена гемостаза и поднимает на качественно новый уровень процесс диагностики развития акушерской патологии и оценки эффективности проводимых лечебных мероприятий. В связи с этим нами предложен алгоритм беременностью (Рис.4). обследования пациенток с неразвивающейся 22 Сбор анамнеза Клиническое обследование Функциональное обследование Лабораторное обследование ЯВКА В ЖЕНСКУЮ КОНСУЛЬТАЦИЮ НОРМА Динамическое наблюдение КФМ Нарушение МФС тромбоцитов гемостазиологические генетические иммунологические исследования Лечебные и реабилитационные мероприятия Динамическое наблюдение Рис. 4. Алгоритм обследования беременных с использованием витальной компьютерной морфометрии (КФМ) тромбоцитов периферической крови МФС – морфофункциональное состояние 23 ВЫВОДЫ Для I триместра физиологической беременности характерно 1. незначительное снижение количества коагуляционной способности тромбоцитов, повышение крови, изменение основных размерных параметров клеток (увеличение диаметра, периметра, площади и объема, но снижение их фазовой высоты); повышение уровня активационного статуса тромбоцитов за счет увеличения активированных форм клеток до 39%. При неразвивающейся беременности происходят выраженные 2. нарушения функционирования тромбоцитарного звена гемостаза, которые проявляются в развитии тромбоцитопении, изменении морфологии циркулирующих клеток, резком повышении их функциональной активности (увеличение активированных форм до 46% и более). Наличие антифосфолипидных антител способствует усилению патоморфологических изменений в тромбоцитарном звене гемостаза. При 3. неразвивающейся беременности прогрессирование микроциркуляторных нарушений сочетается с нарушениями в системах гемостаза и эритропоэза, что проявляется в наличии анизоцитоза, пойкилоцитоза, гипохромии, изменении морфометрических параметров циркулирующих эритроцитов, устойчивом преобладании обратимо (эхиноциты) и необратимо (сфероциты) деформированных форм красных клеток до 23 и 14%, соответственно. Выявлены достоверные корреляции между морфометрическими 4. параметрами тромбоцитов, содержанием различных морфологических типов клеток и показателями отрицательно гемостазиограммы: коррелирует с содержание АДФ-агрегацией форм (r=-0,75, покоя p<0,05), положительно – с активностью факторов протромбинового комплекса (r=0,61, p<0,05). Количество активированных форм положительно коррелирует АДФ-агрегацией (r=-0,57, p<0,05). 5. Проведение противотромботической патогенетически терапии у больных обоснованной с неразвивающейся 24 беременностью обеспечивает стабилизацию активационного потенциала тромбоцитов (увеличение содержания форм покоя до 58%, снижение активированных форм до 37%) и эффективную нормализацию их морфометрических параметров: уменьшение геометрических показателей, отражающих популяционный состав, и увеличение оптических, характеризующих состояние грануломера. 6. Экспресс-оценка морфофункционального состояния циркулирующих тромбоцитов, проводимая в ранние сроки (до 6-8 недель), может способствовать своевременному выявлению патоморфологических изменений в системе гемостаза и обеспечить возможность динамического наблюдения за процессом восстановления выявленных нарушений. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. В диагностический стандарт обследования при невынашивании беременности необходимо включать гемостазиологические исследования для определения уровня качественных и количественных нарушений гемостаза; 2. Беременные с выявленными нарушениями сосудисто- тромбоцитарного и гоагуляционного гемостаза относятся к группе высокого риска репродуктивных потерь и акушерских осложнений. 3. В качестве скринингового экспресс-теста при исследовании патологии гемостаза может быть использована компьютерная морфометрия тромбоцитов. Преимуществом метода является минимальный объем крови (до 1-1,5 мл), отсутствие дополнительного необходимости оборудования, применения оперативная оценка реактивов и особенностей морфофункционального состояния клеток. 4. При выявлении признаков АФС беременным следует проводить патогенетически обоснованную профилактику тромботических нарушений под контролем исследования показателей гемостаза. 25 Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Метелин В,Б, Василенко И.А., Власова Е.А., Бабакова С.В., Загузин А.Ю., Модина М.А. Исследование морфофункциональных критериев прижизненной оценки тромбоцитов как клеточных элементов гемостаза // Biological Motility: Basic Research and Practice. Pushchino, 2006. – С.92-93. 2. Василенко И.А., Савушкин А.В., Модина М.А., Лифенко Р.А.Оценка витального морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови при неразвивающейся беременности. // Сб. «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», Москва 2007.– С.248-249. 3. Модина М.А., Чотчаева С.М., Лифенко Р.А., Гаспарян С.А., Савушкин А.В.,Василенко И.А. Оценка состояния тромбоцитарного гемостаза при неразвивающейся беременности. // Материалы конгресса «Мать и дитя» Казань, 2007. - С.192. 4. Василенко И.А., Савушкин А.В., Бычкова И.С., Власова Е.А., Пашкин И.Н., Нестеренко И.В., Гаспарян С.А., Модина М.А., Лифенко Р.А. Исследование гетерогенности и функциональной активности тромбоцитов пациенток с тромбоцитопенией. // Haemotologica. – 2007. - Vol.92,Supp11 (12th congress of EHA, Vienna, Austria 2007). - С.2567. 5. Бычкова И.С., Василенко И.А., Метелин В.Б., Савушкин А.В., Модина М.А. Витальная компьютерная морфометрия тромбоцитов как метод ранней диагностики угрозы тромбозов при АФС. // Сб. «Гемореология и микроциркуляция (от молекулярных мишеней к органным и системным изменениям)», Ярославль, 2007г. – С.119. 6. Чотчаева С.М., Модина М.А., Лифенко Р.А. Применение современных методов компьютерной цитометрии в комплексной диагностике патологической беременности. // Сб.«Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты. (Под ред. Василенко И.А.) Москва, РИАЛТЕКС: 2008. – С.71-73. 7. Гаспарян С.А., Модина М.А., Чотчаева С.М., Лифенко Р.А. Динамика показателей тромбоцитарного звена гемостаза при физиологическом и осложненном течении беременности. // Материалы Второго Международного Конгресса по репродуктивной медицине «Репродуктивное здоровье семьи». Проблемы репродукции. Спец. Выпуск. – 2008. – С.62-63. 8. Кардашова З.З., Власова Е.А., Кастрикина И.С., Лысенко М.А., Модина М.А. Витальная компьютерная морфометрия клеток крови в решении клинико-диагностических задач. // Вестник последипломного медицинского образования.- 2008.- № 3-4. – С.75-77.
