Документ: K384АIR Версия инструкции: 009 НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА СОИ В ПРОДУКТАХ Только для ин витро исследований Номер по каталогу: K384А Версия набора: 009 Производитель: ФООО «Хема», Санкт-Петербург, Дегтярный пер. 8-10 тел./факс (812) 271-24-41, 271-78-70; электронная почта spb@xema.ru, интернет www.xema.ru Введение Определение содержания сои в колбасах и мясных консервах имеет большое значение для разделения этих продуктов на “содержащие сою” и “не содержащие”. Сегодня, не содержащий сои продукт – это продукт, в котором сои менее 1%. В данной тест-системе используются моноклональные антитела мыши к термо-чувствительному эпитопу соевого глобулина. Исследуемый материал Набор предназначен для качественного определения антигена сои в продуктах питания, смывах с производственного оборудования и других видах материала. В мясных консервах и колбасах набор позволяет определять содержание сои до порогового значения в 1%. В состав набора входят контрольные образцы, содержащие 1% сои для двух наиболее часто встречающихся вариантов термической обработки мясопродуктов – 250С (мясные кончервы, тушенка) и 72С (колбасы, сосиски). Набор рассчитан на 96 определений и обеспечивает анализ 46 образцов в дублях. Принцип определения В данной тест-системе используется принцип “сэндвич” иммуноферментного анализа. В лунки полистирольного микропланшета вносят водно-солевой экстракт продукта, содержащего антиген сои. Антиген сои вместе с другими антигенами адсорбируется на поверхности активированного полистирола. Несвязавшийся материал удаляется отмывкой. Далее в лунки вносят моноклональные антитела против соевого глобулина, меченые пероксидазой. После повторной отмывки активность фермента, связанного с поверхностью лунки микропланшета, проявляется и измеряется добавлением хромоген-субстратной смеси, стоп-раствора и фотометрией при 450 нм. Интенсивность цветной реакции прямо пропорциональна количеству антигена в образце. Состав набора: ПРОБНАЯ КОМПЛЕКТАЦИЯ Код Наименование Кол Ед-во цы 1 шт 1 P384А Планшет полистироловый, разделяемый по лункам, максимальной сорбционной емкости 2 N003 Пленка для заклеивания планшетов 2 шт 3 S005Z Таблетка для приготовления экстрагирующего буфера 1 шт 4 C384АZ Набор положительных и отрицательных контролей, содержащих 0 и 1% антигена сои по 1 мл 1 шт 6 S008Z Концентрат отмывочного раствора, 22 мл 1 шт 7 T301Z Конъюгат моноклональных антител мыши против соевого глобулина с пероксидазой , 11 мл 1 шт 8 R051Z 9 R050Z Раствор субстрата - 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ), 11 мл Стоп-реагент, 11 мл 1 1 шт шт 10 K384АIR Инструкция Антиген сои ИФА, русская 1 шт 11 K384АQ Паспорт контроля качества Антиген сои ИФА 1 шт Цвет синий синий Дополнительно необходимые реактивы, не включенные в набор 1. Дистиллированная вода Важные замечания по хранению реагентов и выполнению теста 2 3 4 5 Реагенты сохраняют стабильность в течение 1 месяца после вскрытия флаконов. Не смешивайте и не используйте в одной постановке реагенты разных серий. После использования реагента немедленно закрывайте крышку флакона или пробирки. Внимание: закрывайте каждый флакон своей крышкой. Все компоненты набора должны храниться в холодильнике (+2+8оС). Не замораживайте набор. 1 После вскрытия пакета тщательно заклейте оставшиеся неиспользованными лунки входящей в состав набора пленкой для заклеивания планшетов, чтобы предотвратить воздействие влаги. Это необходимо для сохранения работоспособности набора. 7 Не используйте для отмывки микропланшет растворы, содержащие азид натрия. Азид натрия даже в следовых количествах ингибирует маркёрный фермент пероксидазу, что может привести к заниженному сигналу. 8 Внимание: во время всех инкубаций заклеивайте планшет клейкой лентой. Не допускайте пересыхания лунок микропланшет между стадиями постановки. 9 Все пробы, калибраторы и контрольные образцы желательно ставить в двух параллелях. 10 Отмывка микропланшет может проводиться как вручную, так и с использованием автоматических устройств. Вносите не менее 250 мкл Отмывочного буфера в лунку при каждой отмывке. Задержка при отмывке («замачивание») не требуется. После окончания ручной отмывки резко опрокиньте микропланшет на фильтровальную бумагу для удаления остатков буфера. 11 После остановки реакции с субстратом измеряйте оптическую плотность в течение не более 15 минут. 6 Оборудование Спектрофотометр для микропланшет, способный проводить измерения при длине волны 450 нм в диапазоне от 0 до 3.0 единиц оптической плотности. Инкубатор с температурой 37С Весы лабораторные, точность взвешивания 0,05г ПРОВЕДЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Подготовка реагентов Все реагенты (включая необходимое число распечатанных стрипов) перед использованием должны быть доведены до комнатной температуры (20-25С). Подготовка образцов: *1 Измельчите небольшую порцию исследуемого продукта с помощью ступки или блендера, измельчение проводите до получения однородной массы. Взвесте 1 ± 0.1 г гомогента. Внимание! Тщательно промывайте устройство для измельчения при анализе нескольких образцов для предотвращения перекрестной контаминации! 2* Приготовьте буфер для экстракции. Для этого растворите таблетку в 100 мл дистиллированной воды. *3 Проведите экстракцию антигенов из исследуемых образцов. Для этого добавьте 20 мл буфера к 1 г гомогената. *4 Инкубируйте 5 минут при температуре 20-25С при постоянном интенсивном встряхивании. *5 Центрифугируйте экстракты при 300-500 g в течение 5 минут для удаления нерастворимых частиц. ОТБЕРИТЕ СУПЕРНАТАНТ для постановки реакции (см.ниже). 2 Постановка реакции: Поместите в рамку нужное количество стрипов или лунок из расчета: 8 лунок для контрольных образцов и необходимое количество для исследуемых образцов в 2 повторах. Отметьте лунки, предназначенные для калибровочных проб, контрольных и исследуемых образцов. Внесите в соответствующие лунки по 100 мкл контрольных образцов. В лунки, предназначенные для исследуемых образцов, внесите по 100 мкл супернатанта. ВНИМАНИЕ! Строго соблюдайте последовательность внесения реагентов в лунки! Инкубируйте 60 минут при температуре 37 С *6 *7 *8 Приготовьте отмывочный раствор 21-кратным разбавлением Концентрата S008Z. Готовый отмывочный раствор можно хранить до 2 недель при +2-8С. Отмойте стрипы 3 раза отмывочным раствором. Внесите в лунки по 100 мкл раствора Конъюгата Инкубируйте 30 минут при температуре 37 C. Отмойте стрипы 5 раз Отмывочным раствором. Внесите в лунки 100 мкл раствора Субстрата R051Z Инкубируйте 15 минут при температуре 20-25 C Внесите в лунки 100 мкл Стоп-реагента. Определите оптическую плотность в лунках на фотометре при длине волны 450 нм. Бланк фотометра выставляйте по нулевому калибратору *9 *10 *11 *12 *13 *14 *15 *16 *17 Примеры полученных значений оптической плотности контрольных образцов для данного набора приведены в Паспорте контроля качества. Обработка результатов анализа: 1. 2. 3. Рассчитайте средние значения ОП контрольных образцов, содержащих 0 %, 1 % сои, и неизвестного образца. Вычтите среднюю ОП контрольного образца, содержащего 0% сои из ОП образца с 1% сои и неизвестного образца. Разделите среднюю ОП неизвестного образца на ОП образца с содержанием сои 1%. Если полученное значение К > 1.1, то в образце сои более 1%, если К <0.9, то в образце сои менее 1%. Если 0.9 < К < 1.1, то около 1%. ВНИМАНИЕ! Для расчета содержания сои в колбасах и мясных консервах необходимо использовать разные контрольные образцы. Контроль качества Значения контрольных образцов должны попасть в требуемый диапазон (см. Паспорт контроля качества). 3