Видовой состав эпифитной микрофлоры сельскохозяйственных культур, воздействие эпифитов на растительный организм. Практическое применение активных эпифитных микроорганизмов для направленного регулирования жизнедеятельности растений и повышения их урожайности. Разнообразие эндофитных микроорганизмов, обладающих хозяйственно ценными свойствами, обеспечивающих питание и защиту растений, устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам. Механизмы формирования эндофитной микрофлоры. Роль эндофитных микроорганизмов в регуляции роста и развития растений. эпифитов Lactococcus lactis Lactobacillus acidophilus Большую роль эпифитные микроорганизмы играют при хранении зерна и семян. Показано, что на одном грамме зерна овса в среднем содержалось 0,25х106 микробных клеток. Количество эпифитов на одном грамме зерна пшеницы в значительной мере определялось качеством семян и почвенно-климатическими условиями зоны их формирования. Так с поверхности грамма внешне здоровых семян пшеницы выделялось от 1,36 х108 до 2,05 х108 микробных клеток, а с больных семян того же сорта - от 4,6 х106до 5,0 х107 клеток. При подмокании любого зерна свойственная ему эпифитная микрофлора быстро исчезает. Начинают развиваться разные мицелиальные грибы (плесени), преимущественно представители родов Penicillium и Aspergillus. Последний род преобладает при повышенной температуре (выше 25 °С). Из бактерий на зерне сначала обильно размножаются микрококки, полностью вытесняющие Erwinia herbicola, позднее появляются разнообразные неспорообразующие палочки, а при повышенной температуре — бациллы (Bacillus mesentericus, В. subtilis и др.). Следовательно, по составу микрофлоры зерна можно судить об условиях его хранения. Bacillus mesentericus Bacillus subtilis Посев спорообразующих бактерий из муки, хранившейся с нарушением технологического режима (справа), и контрольной партии (слева) Erwinia herbicola Другой гриб из того же рода — Claviceps paspali — поселяется на травах рода Paspalum (двурядная гречиха и др.), образуя на колосках шаровидные склероции, содержащие токсичные вещества. Отравление, вызываемое грибом у скота, получило название клавицепстоксикоза. Наиболее характерный симптом этого заболевания — расстройство координации движений. Для профилактики клавицепстоксикоза нельзя допускать использование корма, если в нем обнаружены склероции. Специфичные средства лечения токсикоза не разработаны. Claviceps paspali Развитие токсикоза у лошади через 6 часов после поедания склероциев Claviceps paspali Тяжелые заболевания людей могут вызвать грибы рода Fusariит, развивающиеся на вегетирующих или скошенных злаках. Во влажном климате на злаках может паразитировать Fusarium graminearum. Токсин, накапливаемый этим грибом в зерне, вреден для людей и животных. Хлеб, выпеченный из муки фузариозного зерна, вызывает симптомы, близкие к опьянению. Это заболевание получило название «пьяный» хлеб. Токсин гриба содержит глюкозиды и алкалоиды. Отравления людей наблюдаются при употреблении в пищу несвоевременно убранных, перезимовавших под снегом зерновых культур. На них развивается гриб Fusarium sporotrichiella, выделяющий сильный токсин, к которому чувствительны не только люди, но и многие животные. Отравление больным зерном людей сначала называли септической ангиной, так как оно начиналось с признаков, близких по симптомам к ангине. Позднее данный микотоксикоз стали называть алиментарно-токсической алейкией. Болезнь сопровождается склонностью к кровоточивости, резким уменьшением числа лейкоцитов за счет гранулоцитов и другими симптомами алейкии. Из токсина Fusarium sporotrichiella выделен сапонин, который, очевидно, связан с холестерином. В токсине имеются и соединения, относящиеся к стеролам циклопентафенантренового ряда. Поскольку детально токсин пока не изучен, меры специальной профилактики и лечения фузариотоксикозов не разработаны. Фузариоз колоса Fusarium graminearum Корм, пораженный токсичным грибом Stachybotrys alternans, служит причиной тяжелого заболевания животных. К токсину чувствителен и человек. Данное заболевание называется стахиботриотоксикозом . При болезни возникают некрозы слизистой оболочки ротовой полости и последующих отделов пищеварительного тракта животных. Из пищеварительного тракта токсины проникают в центральную нервную систему, вызывая тяжелые поражения мозга. У людей, работающих с таким кормом, также может наблюдаться поражение слизистых оболочек, вызванное этой болезнью. Специфичные средства профилактики и лечения стахиботритоксикоза не разработаны. Первичные признаки стахиботриотоксикоза у лошади. (на третьи сутки после поедания пораженной соломы) При потреблении грубых кормов, на которых развился гриб Dendrodochium toxicum, наблюдается молниеносная гибель лошадей при симптомах расстройства сердечно-сосудистой системы и подавления кровообразования. При слабом отравлении развивается затяжная болезнь с поражением слизистых оболочек рта и кишечника. Попадание спор гриба на слизистые оболочки человека вызывает их воспаление. Описанная болезнь носит название дендродохиотоксикоза. Химическая природа токсина не установлена. Отравления животных кормами могут также вызвать грибы родов Aspergillus ( аспергиллотоксикоз ) , Penicillium (пеницилло-токсикоз) и Mucor (мукоромикоз). Токсины образуют и другие виды грибов, развивающиеся на кормах, поэтому скармливание заплесневевших кормов недопустимо. Работа с ними также опасна, так как споры грибов, содержащие токсичные вещества, попадают в полость рта, дыхательные пути и служат причиной остро протекающих заболеваний человека (зерновая лихорадка и т. д.). Aspergillus niger Поражение кожи и внутреннего уха («ухо пловца») Aspergillus niger Penicillium Mucor Силосование кормов давно используют на практике и силос занимает важное место в рационе сельскохозяйственных животных. На первых порах использовали примитивные силосные ямы, куда вносили свежескошенную траву (нередко грубую, плохо поедаемую в естественном виде жвачными животными). Ямы герметизировали и за счет природной эпифитной микрофлоры происходила твердофазная ферментации травы. Нередко такие ферментации были неудачными из-за нерегулируемости желательной микрофлоры (молочнокислых бактерий) и преобладания гнилостных процессов. предназначен для повышения качества и аэробной стабильности силосованных кормов Интенсифицировать процесс молочнокислой ферментации, оптимизировать соотношение органических кислот в корме Повысить энергетическую питательность корма до 9-9,8 МДж/кг Улучшить органолептические свойства силоса Повысить аэробную стабильность корма на 12-15% Обогатить силос биологически активными веществами Ограничить потери питательных веществ силосуемой массы (дополнительный выход 25-65 кормовых единиц на 1 т силоса) Снизить расход корма на 20% на 1 кг живой массы Норма расхода: 1 л на 15 т силосуемого сырья Увеличить среднесуточные привесы животных на 9-12% Повысить продуктивность лактирующих животных на 5-10% Классическое определение термина «эндофиты» включает в себя микроорганизмы, населяющие внутренние ткани здоровых растений и не приносящие какого-либо вреда хозяину ( Holliday P.A. Dictionary of Plant Pathology. Cambridge University Press, Cambridge, 1989). Буквально «эндофит» переводится «внутри растения», в противоположность к обозначению поверхностной локализации микроорганизмов, называемых эпифитами (или эктофитами). Эндофитные микроорганизмы представлены бактериями, грибами, актиномицетами и включают как комменсалов, так и мутуалистических симбионтов. С расширением числа изучаемых видов растений и применением молекулярно-биологических методов изучения микроорганизмов, существующих в здоровых тканях растений, сведения о биоразнообразии эндофитов постоянно пополняются. Впервые Bejerinck и Van Delden в 1902 году определили , что в клубеньках клевера кроме Rhizobium присутствуют бактерии Agrobacterium radiobacter. Затем были охарактеризованы три рода эндофитов корней клевера: Aerobacter, Bacillus, Flavobacterium. Неризобиальные эндофитные бактерии были обнаружены в корневых клубеньках разных видов бобовых: фасоли, голубиного гороха, диких видов бобовых растений и др. Bejerinck соя люцерна клевер Rhizobium leguminosarum корневые клубеньки у разных видов бобовых фасоль глициния Ткани бобовых растений помимо ризобий населены неклубенькообразующими эндофитами, относящимися к родам: Aerobacter, Aeromonas, Agrobacterium, Bacillus, Chryseomonas, Curtobaclerium, Enterobacter, Erwinia, Flavimonas, Pseudomonas, Sphyngomonas и др. Aeromonas Erwinia Chryseomonas Enterobacter Flavimonas oryzihabitans Agrobacterium radiobacter Curtobaclerium Sphingomonas Flavobacterium Эндофитные бактерии, выделенные из стеблей и семян гороха посевного (Pisum sativum L.) представляли 8 родов: Bacillus (доминирующий), Stenotrophomonas, Microbacterium, Paenibacillus, Kocuria, Staphylococcus, Micrococcus, Actinobacterium. Таким образом, эндомикробиом гороха, в основном, представлен грамположительными бактериями. Штаммы бактерий, показавшие наилучшие агрономически полезные свойства, принадлежат к роду Bacillus. Эндосфера представляет собой наименее изученную нишу. Эндосферные (или эндофитные) бактерии локализуются в растительных тканях, межклетниках и сосудах. Эндофитные микроорганизмы лучше защищены от биотических и абиотических стрессов, чем ризосферные и филлосферные бактерии, при этом среда их обитания богаче питательными веществами. Большая часть эндофитных бактерий относится к так называемым ассоциативным микроорганизмам. Эта группа включает виды, не являющиеся необходимыми для растений, но способствующие их адаптации к различным условиям окружающей среды, усиливая фотосинтез и продуктивность, устойчивость к действию фитопатогенов и др. ризосфера филлосфера В последнее время в мировой практике разработан ряд биопрепаратов, основу которых составляют полезные штаммы эндофитных и ризобактерий из родов Azospirillum, Pseudomonas, Bacillus, Herbaspirillum, Acetobacter. Широко применяются микробные средства биофунгицидного действия: например, Интеграл, Фитоспорин на основе Bacillus subtilis, RhizoStarR на основе Serratia plymuthica. Вместе с тем вопросы о совместимости эндофитных бактерий с ризобиями мало изучены, хотя объединение свойств азотфиксирующей, рострегулирующей и биоконтрольной функций микробного сообщества эндофитных бактерий является ценным с хозяйственной точки зрения. Разработка микробных препаратов и удобрений на основе эндофитных бактерий является актуальным направлением с/х микробиологии. Установлено, что ризобии являются эндофитами не только бобовых, но и других видов растений, выполняя функции ростстимулирующих ризобактерий без образования клубеньков. Компания «Адаптивные симбиотические технологии» (Adaptive Symbiotic Technologies) из Сиэтла вывела на рынок первый коммерческий продукт, использующий для улучшения сельскохозяйственных культур микроорганизмы, известные как эндофиты. Продукт используется для обработки семян риса и кукурузы, повышает урожайность культур и снижает потребление воды даже в суровых условиях. Использование ризобий для стимуляции роста пшеницы Основным механизмом формирования эндофитной микрофлоры служит инфицирование растений через разрывы эпидермиса, возникающие при росте боковых корней. Поэтому наиболее богатая микрофлора выявляется в корнях, из которых микроорганизмы мигрирует (главным образом, по проводящим сосудам) в надземные органы. В надземных органах имеются и собственные очаги проникновения инфекции: например, микроорганизмы могут попадать в растения через устьица, включаясь в состав микрофлоры листьев и стеблей. Существенную роль в формировании эндофитной микрофлоры играет вертикальная передача микроорганизмов через семена, а также их интродукция проникающими в растение векторными организмами — беспозвоночными или грибами. Флуоресцентная микроскопия корня, бактерии окрашены зеленым Защитные эндофиты, как и азотфиксирующие, обычно проникают в растение-хозяина с помощью организмов-векторов, которые представляют собой регулярных сожителей растений. Примером служит коринеформная бактерия Clavibacter toxicus: она проникает в растение вместе с нематодой Anguina, колонизируя образуемые ею галлы, откуда затем системно распространяется по всему растению. Присутствие этих эндофитов делает растение токсичным для животных, и таким образом Clavibacter «охраняет» его как удобную нишу для нематоды-вектора. Clavibacter michiganensis Нематода Anguina в корнях растения Микроорганизмы-эндофиты живут в тканях растения и снабжают его полезными веществами, например, фитогормонами, веществами, убивающими патогенные грибы, или фиксированным азотом. Так, азотфиксирующие бактерии сахарного тростника покрывают до 80% его потребности в азоте. В свою очередь растения снабжают микроорганизмы органическими веществами. Особенность эндофитного симбиоза состоит в том, что азотфиксирующие бактерии не образуют специальных структур, подобно клубенькам бобовых. Они живут внутри стебля, корней и листьев. Эндофитная колонизация растений риса Бактерии в ксилеме тополя Почвенные бактерии Klebsiella ( Raoultella) terrigena активно фиксируют молекулярный азот, синтезируют растительные гормоны ауксины и подавляют развитие фитопатогенных грибов. Инокуляция этими бактериями семян ярового ячменя и подсолнечника стимулировала рост и развитие растений. За 50 дней заселенный бактериями подсолнечник достиг высоты 80 см. Эндофиты облюбовали главным образом нижнюю часть подсолнечника. Там их может быть до 18000 на 1 грамм сухой массы. Внутри растений ячменя бактерии распределялись более равномерно и ускоряли его развитие на всех этапах. Они стимулировали прорастание семян, увеличивали высоту растения и биомассу всех его частей. Бактерии Klebsiella terrigena хорошо колонизируют растение и положительно влияют на его рост и развитие. Очевидно, это происходит благодаря способности эндофита снабжать растение физиологически активными веществами и фиксированным азотом. Колонизация корней кукурузы Klebsiella pneumoniae Исследованиями последних лет, показано, что некоторые эндофитные бактерии, относятся к видам, которые в медицинской микробиологии принято называть условно-патогенными. Эти виды могут длительное время находиться в организме человека, не принося вреда, и вызывать заболевания при ослаблении его организма. Условнопатогенные микроорганизмы обладают широкой специализацией и высокой адаптационной способностью. Пребывание патогенов человека в растениях является частью цикла их циркуляции во внешней среде. Вероятно, они используют растения в качестве альтернативного хозяина и переносчика в организм животного. Из растительных тканей были выделены следующие виды условнопатогенных бактерий – Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Burkholderia cepacia. Enterococcus faecalis проникает через устьица и поранения листьев Arabidopsis thaliana, колонизируя межклеточные пространства и вызывая повреждение клеточных стенок и мембранных структур. Подобная ситуация сходна для другого бактериального патогена животных Staphylococcus aureus. Burkholderia cepacia Serratia marcescens Enterobacter aerogenes Staphylococcus aureus Показано, что клинический изолят Pseudomonas aeruginosa способен контаминировать разные виды растений. Такие исследования показывают возможность контаминации продуктов питания растительного происхождения истинными патогенами человека, что подтверждается многими публикациями. Энтерогеморрагическая E. coli O157:H7 найдена в тканях поверхностностерилизованных листьев салата-латука, проростках редиса, моркови, люцерны, бобов. Salmonella enterica серовар Typhimurium обнаружена в поверхностностерилизованном салате-латуке. Изображения интактных корней проростков A. thaliana, полученные при помощи конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) показывающие локализацию Pseudomonas fluorescens PICF7 (EGFP-labeled). Микрофотографии показывают, что PICF7 успешно колонизирует поверхность корней Arabidopsis (белые стрелки) но не корни внутри. При изучении эндофитной колонизации плодов яблок E. coli O157:H7 с помощью сканирующей конфокальной лазерной микроскопии было показано, что на поверхности плода бактерии прикреплялись преимущественно к местам разрыва кутикулы. Патоген также колонизировал чечевички яблока, в некоторых случаях на глубине 40 мм. E. coli O157:H7 может колонизировать внутренние части яблок. Escherichia coli O157:H7 Колонизация корней шпината E. coli O157:H7 Корни и ксилема цитрусовых растений могут также колонизироваться энтеробактериями. Klebsiella pneumoniae (штамм Kp342) была способна эндофитно колонизировать Citrus sinensis и Catharanthus roseus. Бактерии, которые инокулировались в корни были впоследствии найдены с помощью флуоресцентной микроскопии в ксилеме корней и ветвей обоих тестируемых видов. E. coli O157:H7 и Salmonella могут обитать внутри плода апельсина. Klebsiella pneumoniae Важнейшим источником контаминации сельскохозяйственных растений является органическое удобрение, которое, как правило, содержит бактерии кишечной группы, особенно если оно получено от больного животного. При попадании в навоз или почву S. enterica серовар Weltevreden выделяется из корней и проростков шпината в течение длительного времени. Это свидетельствует о необходимости строгой проверки необработанного навоза животных перед его внесением в почву. Общепринятым методом удаления патогенных микроорганизмов является компостирование. Salmonella enterica Попадая в растение бактерии, патогенные для человека быстро распространяются по нему. Изучение динамики колонизации штаммами Enterococcus faecalis V583 и OG1RF показало, что на 2-3 сутки – бактерии инфицировали зону корневой шейки и полностью развитые листья, располагающиеся вблизи основания растения. На 4 день инфекция системно распространялась до верхушки растения, на 7 день растения погибали. Это свидетельствует о чрезвычайной теоретической и практической важности проблемы взаимоотношений между растениями и бактериями, патогенными для человека и необходимости дальнейших исследований в этом направлении. Enterococcus faecalis
