Научные исследования ЛИТЕРАТУРА 1. Ариэль Б.М. Саркоидоз: от морфологии к этиологии и патогенезу // Актуальные вопросы диагностики и лечения туберкулеза: Труды Всероссийской науч.практич. конфер. – СПб., 2005. – С.239–243. 2. Бакенова Р.А., Тусупбекова М.М. // Морфология и доказательная медицина. – 2011. – №3–4. – С.68–70. 3. Тусупбекова М.М. и др. // Клинич. медицина Казахстана. – 2011. – №3, 4 (22, 23). – С.17. 4. Двораковская И.В. Диагностика саркоидоза / И.В. Двораковская, Б.М. Ариэль. – СПб., 2005. – 44 с. 5. Коган Е.А., Корнев Б.М., Попова Е.Н. Интерстициальные болезни легких: Практич. рук-во / Н.А. Мухин. – М., 2007. – 432 с. 6. Мухин Н.А. Интерстициальные болезни легких. – М., 2007. – С.120–155. 7. Терпигорев С.А. и др. // Вестник РАМН. – 2012. – №5. – С.30–37. 8. Тусупбекова М.М., Бакенова Р.А., Досмагамбетова Р.С. // Медицина и экология. – 2011. – №4 (61). – С.75–80. 9. Тусупбекова М.М. Основы гистологической техники и методы гистологического исследования аутопсийного, операционно-биопсийного и экспе- м н риментального материала. Метод. реком. – 2005. – С.4–44. 10. Goknar N., Cakir Er., Cakir F.B., et al. // Hematology reports. – 2015. – Vol.7, Issue 2. – P.5644. 11. Шмелев Е.И. // Consilium medicum. – 2003. – Т.5, №4. – С.176–181. 12. Черняев А.Л., Самсонова М.В. Патологическая анатомия легких: Атлас / Под ред. А.Г. Чучалина. – М., 2011. – 112 с. Поступила 27.05.2016 г. Статья размещена на сайте www.mednovosti.by (Архив МН) и может быть скопирована в формате Word. Оценка цитотоксичности субстанции повиаргол in vitro Довнар А.Г.1, Свирчевская Е.Ю.2, Ржеусский С.Э.3, Самойлович Е.О.2 Белорусский государственный медицинский университет, Минск Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии, Минск, Беларусь 3 Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, Беларусь 1 2 Dounar H.G.1, Svircheuskaya E.Y.2, Rzheussky S.E.3, Samailovich E.O.2 2 1 Belarussian State Medical University, Minsk Republican Scientific and Practical Centre of Epidemiology and Microbiology, Minsk, Belarus 3 Vitebsk State Order of Peoples’ Friendship Medical University, Belarus Cytotoxicity assessment of poviargol substance in vitro Резюме. Одним из этапов фармацевтической разработки новых лекарственных средств является их токсическая оценка, к которой относится изучение цитотоксичности. В статье представлены результаты исследования in vitro цитотоксичности фармацевтической субстанции повиаргол, представляющей собой металлическое высокодисперсное серебро. Оценку цитотоксичности повиаргола проводили на клетках эпидермоидной карциномы гортани человека HEp-2C с использованием световой микроскопии и МТТ-теста. Установлено, что IC50 для субстанции повиаргол равнялась 0,0044±0,00096%, что в пересчете на содержание серебра составляет 2,9 мкг/мл. Ключевые слова: цитотоксичность, повиаргол, протаргол, наночастицы серебра. Медицинские знания. – 2016. – №9. – С. 62–64. Summary. One of the stages of the development of new pharmaceutical drugs is their toxicological assessment, and cytotoxicity study is a part of it. The article presents the results of in vitro cytotoxicity study of pharmaceutical substance poviargol, which is a highly dispersed metallic silver. Poviargol assessment of cytotoxicity was performed on HEp-2C cells of human epidermoid larynx carcinoma using light microscopy and MTT assay. It was found that the half maximum inhibitory concentration of poviargol substance was 0,0044±0,00096%, or 2.9 mg / ml calculated for silver content. Keywords: сytotoxicity, poviargol, protargol, silver nanoparticles. В Meditsinskie novosti. – 2016. – N9. – P. 62–64. настоящее время для лечения инфекционных заболеваний и поражений используются различные противомикробные препараты. В связи с развитием микробной резистентности к антибактериальным препаратам, токсическим действием антибиотиков на внутренние органы, подавлением иммунитета, дисбиотическими состояниями после их длительного применения становится актуальной разработка альтернативных антибактериальных и противогрибковых агентов. Вследствие этого большой интерес вызывают наночастицы серебра, обладающие широким спектром антимикробной активности [5, 8]. Одним из этапов фармацевтической разработки новых соединений является их токсическая оценка, к которой в рамках системы GLP относится изучение цитотоксичности [2]. Использование клеточных культур для оценки цитотоксичности in vitro обладает рядом преимуществ, таких как дешевизна, простота применения, 62 МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ неограниченный запас материала, возможность решить этические проблемы, связанные с исследованиями на животных и сократить их число в последующих доклинических испытаниях in vivo. Кроме того, исследования цитотоксичности фармацевтических субстанций in vivo осложняются наличием структурной и функциональной гетерогенности клеток, что затрудняет изучение точных молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов [2]. При изучении цитотоксичности следует учитывать, что различные клетки организма человека и животных проявляют разную чувствительность к воздействию химических соединений. Клеточная модель в условиях in vitro более чувствительна к действию раздражающих веществ в виду отсутствия факторов защиты (слизь, тканевая жидкость, слюна), барьера слизистых оболочек, разбавления и ингибирования препаратов слюной, что имеет значение in vivo. № 9 · 2016 В литературе описаны исследования цитотоксичности препаратов, содержащих наночастицы серебра, при воздействии на различные клеточные культуры. Д.С. Савченко определил появление цитотоксичности высокодисперсного кремнезема с наночастицами серебра после обработки им клеток HEp2-C при концентрации 0,007% [6]. F. Taleghani и др. установили отсутствие токсических эффектов на клетки эпителия десны у наночастиц со средним размером 10 нм при внесении их в концентрациях меньше 10 мкг/мл [10]. Авторы также отмечают увеличение токсического эффекта с течением времени. В доступной нам литературе данных по цитотоксичности повиаргола in vitro не обнаружено. Цель настоящего исследования – оценка цитотоксического действия субстанции повиаргол на клетках эпидермоидной карциномы гортани человека HEp-2C. Материалы и методы В качестве объекта исследования использовали фармацевтическую м Научные исследования н субстанцию повиаргол (НД №1781/13), представляющую собой металлическое высокодисперсное серебро, стабилизированное поливинилпирролидоном низкомолекулярным медицинским (произведено ФГУП «Специальное конструкторско-технологическое бюро «Технолог», Санкт-Петербург). Для анализа токсичности изучаемой субстанции повиаргол проводилось сравнение его воздействия на клетки с протарголом (производство Германия) – подобной по химическому составу лекарственной субстанцией с уже известными фармакологическими эффектами и длительным сроком существования на фармацевтическом рынке. Цитотоксичность изучали на перевиваемой культуре клеток эпидермоидной карциномы человека HEp-2C. Оценку цитотоксичности проводили с использованием двух методов: – по влиянию на морфологию клеток с визуальной оценкой с помощью световой микроскопии; – МТТ-теста – теста, позволяющего определить жизнеспособность клеток по функциональной активности митохондрий. Для постановки эксперимента готовили ряд последовательных разведений обеих субстанций на дистиллированной воде до конечных концентраций 0,5%; 0,1%; 0,05%; 0,01%; 0,005%, 0,001%, 0,0005%, 0,0001%. Клетки HEp-2C культивировали на культуральных флаконах (Sarstedt, Германия) со средой роста: питательная среда ДМЕМ (Sigma, Германия) c добавлением 200 мМ L-глютамина (Sigma, Германия), 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки (Hy Clone, Индия), 100 мг/мл гентамицина (Белмедпрепараты, РУП). Для постановки эксперимента по оценке цитотоксичности клетки готовили за 24 часа до тестирования. Клеточную суспензию с посевной дозой 250–300 тыс./мл по 100 мкл на лунку рассевали в плоскодонные культуральные 96-луночные планшеты (Corning, США) и инкубировали в термостате при 37°С в атмосфере с 5% СО 2. На следующие сутки после посева клеток проводили их микроскопию с использованием светового инвертированного микроскопа (Olympus, Япония, увеличение ×100) для оценки качества сформировавшегося монослоя. Когда монослой сформировался полностью, из всех лунок удаляли среду роста и вносили по 100 мкл поддерживающей среды: питательная среда ДМЕМ c добавлением 200 мМ L-глютамина, 2%-й эмбриональной телячьей сыворотки (Hy Clone, Индия), 100 мг/мл гентамицина. Рисунок 1 Оценка влияния субстанции повиаргол на морфологию клеток HEp-2C через 72 часа наблюдения с использованием световой микроскопии (ув. 10×10). А. – контроль монослоя культуры клеток HEp-2C. Б. – сплошной монослой клеток при обработке 0,0005% раствором субстанции повиаргол. В. – деструкция 50% клеточного монослоя при обработке 0,005% раствором повиаргола. Г. – 100% деструкция монослоя клеток при обработке 0,5% раствором повиаргола А Б В Г Далее в лунки планшета вносили по 100 мкл соответствующего разведения субстанции (четыре лунки для каждого разведения). Контрольными являлись лунки, где к 100 мкл поддерживающей среды было добавлено 100 мкл растворителя (дистиллированной воды). Планшет инкубировали в термостате при 37°С в атмосфере с 5% СО2. Влияние субстанции на морфологию клеток оценивали по степени изменения монослоя с использованием инвертированного микроскопа, через 24, 48 и 72 часа. Цитодеструктивное действие препарата оценивали по 4-крестовой системе по методу Финтера: «+» – поражение до 25% монослоя, «2+» – до 50%, «3+» – до 75% и «4+» – до 100% монослоя [1]. Для оценки жизнеспособности клеток в культуре и напряженности окислительных процессов с помощью МТТ-теста через 72 часа наблюдения за клетками во все лунки планшета (опытные и контрольные) вносили по 20 мкл МТТ (Sigma, Германия). Планшет инкубировали в термостате при 37°С 4 часа. После инкубации из всех лунок планшета аккуратно удаляли надосадочную среду. Образовавшийся на дне лунок нерастворимый осадок формазана растворяли в 150 мкл DMSO. Оптическую плотность регистрировали при длине волны 550 нм с отсекающей длиной волны 630 нм на спектрофотометре (Thermo Scientific Multiskan EX, Финляндия). Исходя из 4 повторных значений оптической плотности, для каждой испытуемой концентрации повиаргола определялась средняя ингибирующая концентрация, т.е. концентрация вещества, которая подавляет на 50% данную клеточную функцию (IC50). Для построения кривой зависимости между дозой (концентрацией) повиаргола и производимым эффектом (изменение оптической плотности вследствие токсичности) использовалась модель логистической регрессии с тремя переменными: 𝑌=𝑑/(𝑡+(𝑋/𝑐)𝑏)+𝑑 где Y – оптическая плотность, Х – концентрация, d – верхняя асимптота (максимальное значение) соответственно. Крутизна линейной части кривой описывается коэффициентом наклона b, параметр с отражает значение IC50. Для проведения статистического анализа использовались пакеты Microsoft Excel 2007 и «drc» для языка программирования R. Результаты и обсуждение Оценка цитотоксичности по влиянию на морфологию клеток HEp-2C Анализ данных световой микроскопии выявил сходную цитологическую картину воздействия повиаргол и протаргола. Через 24 часа наблюдения в контроле сформировался плотный монослой клеток № 9 · 2016 МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ 63 Научные исследования ем МТТ-теста подтвердили результаты пр е д в а р и т е ль н о й оценки этой субстанции по влиянию на морфологию клеток. Влияние различных концентраций повиаргола на жизнедеятельность клеток с использованием МТТ-теста представлено на рис. 2. Было установлено, что при воздействии субстанции в концентрации 0,0001% влияния на жизнеспособность клеток практически не отмечалось. Субстанция в концентрациях 0,0005% и 0,001% вызывала незначительное ингибирование жизнеспособности клеток, на 10% и 20% соответственно. Под влиянием повиаргола в концентрациях, превышающих 0,05%, жизнеспособность клеток снижалась на 80% и более. По расчетным данным, полученным с использованием пакета «drc» для языка программирования R, средняя ингибирующая концентрация повиаргола, определяющая индекс цитотоксичности IC50, равнялась 0,0044±0,00096%, что в пересчете на содержание серебра составляет 2,9 мкг/мл. Таким образом, IC50, рассчитанная визуально по влиянию на морфологию клеток и с использованием МТТ теста, практически совпадали. Изучению цитотоксичности серебросодержащих препаратов и ее механизмов посвящены многие исследования. Доказано, что наночастицы серебра не накапливаются в значительном количестве во внутренних органах и тканях ни при многократном, ни при однократном применении [7]. Показано, что, несмотря на определенную токсичность наночастиц серебра, его токсические дозы отличаются от терапевтических на 5–6 порядков [3]. Анализ данных литературы по цитотоксичности широко используемых в настоящее время препаратов с иным механизмом действия (не содержащих серебро), в частности антисептика хлоргексидина биглюконата, свидетельствуют о том, что цитотоксичность данного препарата является сравнимой с цитотоксичностью повиаргола. Так, по данным Е.В. Багаевой и соавт., жизнеспособность клеток эпидермоидной карциномы полости рта после обработки их 0,005% хлоргексидином, по Рисунок 2 Влияние концентрации субстанции повиаргол на подавление жизнедеятельности клеток HEp-2C C o n ce n tra tio n округлой формы, плотно прилегающих друг к другу. В результате воздействия на клетки высоких концентраций (0,1–0,5%) повиаргола и протаргола полная дегенерация клеток отмечалась уже через 24 часа. В низких концентрациях (0,0001%, 0,0005%, 0,001%) дегенерации монослоя в течение всего периода наблюдения (24–72 часа) не отмечалось, морфологическая картина соответствовала контролю. В среднем диапазоне концентраций (0,005%, 0,01% и 0,05%) наблюдалось некоторое увеличение цитотоксичности с течением времени. Средней ингибирующей концентрацией являлась концентрация 0,005%, при воздействии которой через 24 часа отмечалась деструкция 25% клеточного монослоя, через 72 часа деструкция монослоя составляла 50% (рис. 1). Оценка цитотоксичности с использованием МТТ-теста Для оценки жизнеспособности клеток в культуре и напряженности окислительных процессов был использован МТТтест, который показывает изменение энергетического потенциала клетки. Метод основывается на способности митохондриальных дегидрогеназ живых, метаболически активных клеток конвертировать водорастворимый желтый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в синий формазан, растворимый в среде культивирования. Таким образом, поглощение клетками формазана, которое регистрируется значением оптической плотности, прямо пропорционально количеству жизнеспособных клеток в культуре. Результаты оценки цитотоксичности субстанции повиаргол с использовани- 64 МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ № 9 · 2016 м н данным МТТ-теста, составила 98%, в то время как более высокие концентрации угнетали клеточный рост [4]. Другие исследователи определили среднюю ингибирующую концентрацию хлоргексидина на линию остеобластов человека U2OS, равную 0,005% [9]. Заключение В рамках проведенного исследования было впервые изучено цитотоксическое влияние повиаргола с наночастицами серебра на клетки. Проведенное исследование показало, что цитотоксичность субстанции повиаргол является сравнимой с цитотоксичностью протаргола – лекарственного препарата, который широко используется в медицинской практике. Обе субстанции в концентрациях, превышающих 0,05%, вызывали цитодеструктивный эффект, в концентрациях менее 0,001% не влияли на морфологию клеток. IC50 для субстанции повиаргол, рассчитанная по результатам МТТ-теста, равнялась 0,0044±0,00096%, что в пересчете на содержание серебра составляет 2,9 мкг/мл. Эта концентрация может явиться «отправной» концентрацией для изучения токсичности субстанции повиаргол на животных. ЛИТЕРАТУРА 1. Водорастворимое средство, обладающее противовирусной и иммуномодулирующей активностью, на основе соединения ионного серебра с метиленовым синим и способ его получения: пат. 2390343 РФ, МПК51 С1 A61K33/38 (2006.01), A61K31/5415 (2006.01), A61K31/28 (2006.01), A61P37/02 (2006.01), A61P31/12 (2006.01) / В.В. Третьяков, В.Н. Сильников, В.Ф. Кулагин, В.В. Власов, В.А. Рихтер, О.В. Третьякова, В.Л. Тихонов, Т.И. Глотова; заявка 2008149356/15; опубл. 27.05.2010 / Закрытое акционерное общество «БиоАргоФарм». – 2010. 2. Данченко Е.О. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2012. – №2. – С.22–231. 3. Ефимочкина Н.Р. // ЖМЭИ. – 2009. – №4. – С.120–125. 4. Багаева В.В. и др. // Исследования и практика в медицине. – 2015. – Т.2, №3. – С.35–42. 5. Ржеусский С.Э., Довнар А.Г., Кугач В.В. // Вестник Витебкого гос. мед. ун-та. – 2015. – Т.14, №6. – С.120–126. 6. Савченко Д.С. // Вестник новых мед. технологий. – 2013 – Т.20, №4. – С.44. 7. Шкиль Н.Н. // Научный журнал КубГАУ. – 2011. – №68 (04). – С.1–11. 8. Kim J.H. et al. // Nanomedicine. – 2007. – Vol.3, iss.1. – P.95–101. 9. Lee T.H. et al. // Int. Еndodontic J. – 2010. – Vol.43, N5. – P.430–435. 10. Taleghani F. et al. // J. Dent. Sch. – 2013. – Vol.31, N3. – P.220–226. Поступила 02.05.2016 г.
